JP4254662B2 - Artificial oxygen carrier and manufacturing method thereof - Google Patents
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Description
本発明は、生体内で酸素を可逆的に吸脱着できる人工酸素運搬体、人工酸素運搬体を含む人工酸素輸液製剤に関する。
さらに詳細には、医療分野において、虚血部位や腫瘍組織への酸素供給用、大量出血患者の輸血用、臓器保存灌流液、体外循環液、細胞培養液として使用され、高い安全性および高い品質を有する、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体およびその製造方法に関する。
The present invention relates to an artificial oxygen carrier capable of reversibly adsorbing and desorbing oxygen in a living body, and an artificial oxygen infusion preparation containing the artificial oxygen carrier.
More specifically, in the medical field, it is used for oxygen supply to ischemic sites and tumor tissues, for transfusion of patients with massive bleeding, organ preservation perfusate, extracorporeal circulation fluid, cell culture fluid, high safety and high quality The present invention relates to a composite of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin, and a method for producing the same.
生体の血管内における血液量の維持には、血漿コロイドである血漿蛋白質が重要な役割を果たしていることが知られている。このため、従来より、患者の出血性ショックを回復させるには、生体の血液とほぼ等しい膠質浸透圧を有する血漿増量剤を補液する手法が採られてきた。しかしながら、循環血液量の３０％以上の出血を伴う場合には、末梢組織への酸素供給が不十分となり、血漿増量剤の投与に加えて、さらに酸素運搬体の投与が必要となる。 It is known that plasma proteins, which are plasma colloids, play an important role in maintaining blood volume in the blood vessels of living bodies. For this reason, conventionally, in order to recover a patient's hemorrhagic shock, a technique of supplementing a plasma expander having a colloid osmotic pressure almost equal to that of living body blood has been employed. However, when there is bleeding of 30% or more of the circulating blood volume, oxygen supply to peripheral tissues becomes insufficient, and in addition to the administration of the plasma expander, the administration of an oxygen carrier is further required.
従来、このような酸素運搬体としては、天然赤血球を含有する天然血液あるいは赤血球濃厚液が用いられてきた。しかし、抗原抗体反応による凝血を回避するために、供血者と受血者の血液型を一致させ、使用時には交差適性試験を行う必要があり、また、このような天然血液あるいは赤血球濃厚液は、その有効保存期間が３週間（４℃）と短く、凍結保存によって長期保存可能な凍結血液は、コスト高や使用の際の浸透圧ショックによって溶血しやすいという問題があった。さらに、肝炎やエイズ等の感染症の発生も懸念されていた。 Conventionally, natural oxygen or erythrocyte concentrate containing natural red blood cells has been used as such an oxygen carrier. However, in order to avoid clotting due to antigen-antibody reaction, it is necessary to match the blood types of the donor and recipient, and to perform a cross suitability test at the time of use, and such natural blood or erythrocyte concentrate is The effective storage period is as short as 3 weeks (4 ° C.), and frozen blood that can be stored for a long time by cryopreservation has a problem of high cost and easy hemolysis due to osmotic shock during use. Furthermore, there were concerns about the occurrence of infectious diseases such as hepatitis and AIDS.
このような問題を解決する酸素運搬体として、種々の人工酸素運搬体が研究されてきた。ヘム誘導体である2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体等を、ヒト由来アルブミンまたは組換えアルブミンの疎水ポケットに吸着させた酸素輸液剤（以下、アルブミン-ヘム）が合成され、その酸素運搬能が確認されている（非特許文献１参照）。 Various artificial oxygen carriers have been studied as oxygen carriers that solve such problems. The heme derivative 2- [8- [N- (2-methylimidazolyl)] octanoyloxymethyl] -5,10,15,20-tetrakis (α, α, α, α-o-pivalamido) phenyl porfinato An oxygen infusion agent (hereinafter referred to as albumin-heme) in which an iron complex or the like is adsorbed in a hydrophobic pocket of human-derived albumin or recombinant albumin has been synthesized and its oxygen carrying ability has been confirmed (see Non-Patent Document 1).
これらの人工酸素運搬体の製造には、従来から有毒な一酸化炭素（以下、ＣＯ）が利用されてきた。
非特許文献２には、アルブミンヘムは酸素存在下では、２５℃：８時間、あるいは３７℃：２時間で、５０％のアルブミンヘムが劣化することが記載される。このように、製造工程中に酸素が存在すると２価の鉄錯体が３価になってしまい、酸素運搬体としての機能を果たさない状態になり、結果として、十分な酸素運搬能力をもつアルブミンヘムが得られない。
しかし、製造工程で完全に酸素の混入を遮断するためは、非常に高度な設備が必要であり、通常の設備では酸素の混入を防ぐことができず、従来は製造工程で酸素が混入しても酸素運搬体が劣化しないよう、ＣＯを用いて酸素運搬体を製造する方法が広く用いられてきた。ＣＯがポルフィリン鉄錯体（以下、ヘムと略記）に結合することによって、ヘムの二価鉄の状態が安定に保たれ、三価鉄への酸化反応が抑制されるからである。
In the production of these artificial oxygen carriers, toxic carbon monoxide (hereinafter, CO) has been used.
Non-Patent Document 2 describes that albumin heme degrades 50% of albumin heme at 25 ° C .: 8 hours or 37 ° C .: 2 hours in the presence of oxygen. In this way, when oxygen is present during the production process, the divalent iron complex becomes trivalent and does not function as an oxygen carrier. As a result, albumin heme having a sufficient oxygen carrying capacity is obtained. Cannot be obtained.
However, in order to completely block oxygen contamination in the manufacturing process, very advanced equipment is required, and normal equipment cannot prevent oxygen contamination. Conventionally, oxygen has not been mixed in the manufacturing process. In order to prevent the oxygen carrier from deteriorating, a method for producing an oxygen carrier using CO has been widely used. This is because when CO binds to a porphyrin iron complex (hereinafter abbreviated as heme), the state of divalent iron in heme is kept stable and the oxidation reaction to trivalent iron is suppressed.
ＣＯを用いた人工酸素運搬体の製造方法の一例を挙げると、まず、ピケットフェンスポルフィリン（以下、ＰＦＰ）をＣＯと反応させてＣＯ−ＰＦＰを形成させる。このＣＯ−ＰＦＰをさらに亜ジチオン酸塩で還元する。次にＣＯ−ＰＦＰをヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡ）と混合し、ＨＳＡとの複合体（以下、ＣＯ−ＰＦＰ−ＨＳＡ）を得る。ＣＯ−ＰＦＰ−ＨＳＡの形成は、クロマトグラフィーおよび限外濾過によって確認することができる。ＣＯの除去は、酸素を有するトノメーター中で試料に光を照射することによって行われる。結果として得られるＯ２−ＨＳＡ−ＰＦＰを、窒素置換によって酸素を除去すると、ＨＳＡ−ＰＦＰが得られる。（特許文献１参照）
しかしながら、このような製造工程をＣＯ雰囲気下に置くためには大量のＣＯが必要であり、人体に致命的な傷害を与える恐れがある。
従って、製造工程においてもＣＯを用いずに、尚かつ人工酸素運搬体の劣化が生じないような製造方法が望まれていた。
As an example of a method for producing an artificial oxygen carrier using CO, first, picket fence porphyrin (hereinafter referred to as PFP) is reacted with CO to form CO-PFP. This CO-PFP is further reduced with dithionite. Next, CO-PFP is mixed with human serum albumin (hereinafter, HSA) to obtain a complex with HSA (hereinafter, CO-PFP-HSA). The formation of CO-PFP-HSA can be confirmed by chromatography and ultrafiltration. The removal of CO is performed by irradiating the sample with light in a tonometer having oxygen. When the resulting O 2 -HSA-PFP is deoxygenated by nitrogen substitution, HSA-PFP is obtained. (See Patent Document 1)
However, in order to put such a manufacturing process in a CO atmosphere, a large amount of CO is required, which may cause fatal injury to the human body.
Therefore, there has been a demand for a production method that does not use CO in the production process and does not cause deterioration of the artificial oxygen carrier.
また、このようにして製造された人工酸素運搬体はそのままＣＯ雰囲気下で冷蔵保存すると、同様に酸化反応による劣化が抑制される。しかしながら、ＣＯが結合した状態のままでは酸素結合能が無いため、投与を行う前にＣＯを除去する操作が必要であり、この時にもＣＯが発生し、人体に影響を及ぼす恐れや、緊急時の投与に対応できないといった問題もある。
このような問題を解決する方法として、特許文献３には、アルブミン−ヘムをデオキシ型ヘムに変換させて保存する方法が記載されている。詳細には、非特許文献１に従って調製したアルブミン-ヘムの生理食塩水溶液について、ヘムが鉄二価の状態であることを確認した後、この分散液から酸素を除去する方法として、酸素を含まない窒素、その他の不活性ガス（アルゴン、ヘリウムなど）に曝して、溶解している酸素を排気させ、オキシ型のヘムを酸素が結合していないデオキシ型ヘムに変換させて保存する。
しかしながら、この特許文献３に記載の方法は、保存形態においてＣＯを用いずにデオキシ化を行っているものの、製造工程では依然としてＣＯを使用していた（例えば、特許文献３の実施例１、実施例７および非特許文献３参照）。
Further, if the artificial oxygen carrier produced in this way is refrigerated and stored in a CO atmosphere as it is, deterioration due to an oxidation reaction is similarly suppressed. However, since there is no oxygen-binding ability in the state where CO is bound, it is necessary to remove CO before administration, and at this time, CO may be generated and the human body may be affected. There is also a problem that it is not possible to respond to the administration.
As a method for solving such a problem, Patent Document 3 describes a method in which albumin-heme is converted to deoxyheme and stored. Specifically, for a physiological saline aqueous solution of albumin-heme prepared according to Non-Patent Document 1, after confirming that heme is in a divalent state of iron, a method for removing oxygen from this dispersion is described as nitrogen-free oxygen. Then, it is exposed to other inert gas (argon, helium, etc.), the dissolved oxygen is exhausted, and the oxy-type heme is converted into deoxy-type heme to which oxygen is not bonded and stored.
However, although the method described in Patent Document 3 performs deoxylation without using CO in a storage form, it still uses CO in the manufacturing process (for example, Example 1 of Patent Document 3 and Implementation) Example 7 and Non-Patent Document 3).
ＣＯを用いた人工酸素運搬体（例えば、ヘモグロビン小胞体、リピドヘム小胞体、リピドヘム−トリグリセリド小球体、アルブミン-ヘムなど）のこれまでの製造方法には上記のような問題があり、より安全で扱い易い人工酸素運搬体の製造方法が求められる。しかし、これまで、製造工程でＣＯを用いない人工酸素運搬体の製造方法は用いられていなかった。 The conventional methods for producing artificial oxygen carriers using CO (for example, hemoglobin vesicles, lipid hem vesicles, lipid hem-triglyceride globules, albumin-heme, etc.) have the above-mentioned problems and are safer to handle. An easy method for producing an artificial oxygen carrier is required. However, until now, a method for producing an artificial oxygen carrier which does not use CO in the production process has not been used.
本発明では、ＣＯを用いずに、人工酸素運搬体であるポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとの複合体を製造する方法を提供する。 The present invention provides a method for producing a complex of albumin and a metal complex having a porphyrin structure, which is an artificial oxygen carrier, without using CO.
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、本発明者らは鋭意検討した結果、ＣＯ結合していないデオキシ型のポルフィリン構造を有する金属錯体は、非常に酸化されやすく、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとの複合体の精製工程で、限外ろ過に用いる置換液や、透析に用いる透析液等によりかなりの酸化反応が起こることが分かった。そこで一酸化炭素（ＣＯ）および酸素（以下、Ｏ２）を実質的に含まないガス雰囲気下で、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を製造し、還元剤を精製工程で使用する置換液、透析液に添加することによって、上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。 The present invention has been made in view of such problems, and as a result of intensive studies, the present inventors have found that a metal complex having a deoxy-type porphyrin structure that is not CO-bonded is very easily oxidized and has a porphyrin structure. It has been found that in the purification process of the complex of a metal complex having an amino acid and albumin, a considerable oxidation reaction takes place depending on the substitution solution used for ultrafiltration and the dialysis solution used for dialysis. Therefore, a complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin is produced in a gas atmosphere substantially free of carbon monoxide (CO) and oxygen (hereinafter referred to as O 2 ), and the reducing agent is purified in the purification step. The present inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by adding to the replacement fluid and dialysis fluid to be used, and have reached the present invention.
すなわち、本発明は、
（１） 一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガス雰囲気下で、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを混合することを特徴とする、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の製造方法、
（２） ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体へ転換させ、アルブミンと混合する、上記（１）記載の製造方法、
（３） 還元剤の存在下で、ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体へ転換させる、上記（２）記載の製造方法、
（４） 窒素置換によって、ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体へ転換させる、上記（２）記載の製造方法、
（５） ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを混合する工程において、ポルフィリン構造を有する金属錯体の中心金属が還元型である、上記（１）記載の製造方法、
（６） 溶存酸素を除去したアルブミン水溶液を、一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガスで満たされた密閉容器中に添加し、ついでポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒溶液および還元剤を混合する、上記（１）記載の製造方法、
（７） ポルフィリン構造を有する金属錯体が、ヘム誘導体である、上記（１）記載の製造方法、
（８） ガスが不活性ガスである、上記（１）記載の製造方法、
（９） 不活性ガスが、水素、ヘリウム、アルゴン、窒素およびネオンからなる群から選ばれる１種または２種以上の気体からなる、上記（１）記載の製造方法、
（１０） 還元剤が、亜ジチオン酸、亜ジチオン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、システイン、チオグリセロール、アルファチオグリセリン、エデト酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸イソプロピル、ジクロルイソシアヌール酸カリウム、チオグリコール酸ナトリウム、チオリンゴ酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム１，３−ブチレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ビタミンＥ関連、ｄｌ−α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、ｄ−δ−トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレト酸、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、大豆レシチン、パルミチン酸アスコルビン酸、ベンゾトリアゾール、ペンタエリスリチル−テトラキス［３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］２−メルカプトベンズイミダゾール、エチレンジアミン四酢酸カルシウム２ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムからなる群から選ばれる１〜２種以上である、上記（３）記載の製造方法、
（１１） 有機溶媒がエタノールである、上記（６）記載の製造方法、
（１２） 還元剤が添加され、又は／および酸素が除去された水溶液を置換液として使用し、限外濾過を行うことを特徴とする、上記（１）記載の方法により得られるポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の精製方法、
（１３） 還元剤が添加され、又は／および酸素が除去された水溶液を透析液として使用し、透析を行うことを特徴とする、上記（１）記載の方法により得られるポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の精製方法、
（１４） 上記（１）記載の製造方法により得られる、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体、
（１５） 上記（１４）記載のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体をそのまま、又は一酸化炭素結合体として、又は酸素結合体として保存容器に充填してなる人工酸素輸液製剤、および
（１６） 電解質、糖類、ｐＨ調整剤、等張化剤および膠質浸透圧を付与する高分子からなる群から選ばれる１〜２種以上を含有する、上記（１５）記載の人工酸素輸液製剤
である。
That is, the present invention
(1) A composite of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin, characterized by mixing a metal complex having a porphyrin structure and albumin under a gas atmosphere substantially free of carbon monoxide and oxygen Body manufacturing method,
(2) The production method according to the above (1), wherein an oxy-type metal complex having a porphyrin structure is converted into a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and mixed with albumin.
(3) The production method according to (2), wherein an oxy-type metal complex having a porphyrin structure is converted into a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure in the presence of a reducing agent.
(4) The production method according to (2), wherein the oxy-type metal complex having a porphyrin structure is converted to a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure by nitrogen substitution,
(5) In the step of mixing the metal complex having a porphyrin structure and albumin, the production method according to the above (1), wherein the central metal of the metal complex having a porphyrin structure is a reduced type,
(6) An albumin aqueous solution from which dissolved oxygen has been removed is added to a closed container filled with a gas substantially free of carbon monoxide and oxygen, and then an organic solvent solution of a metal complex having a porphyrin structure and a reducing agent are added. The production method according to (1) above, which is mixed
(7) The production method according to (1) above, wherein the metal complex having a porphyrin structure is a heme derivative,
(8) The production method according to (1), wherein the gas is an inert gas,
(9) The production method according to (1) above, wherein the inert gas comprises one or more gases selected from the group consisting of hydrogen, helium, argon, nitrogen and neon.
(10) The reducing agent is dithionite, sodium dithionite, sodium bisulfite, sodium sulfite, dry sodium sulfite, sodium pyrosulfite, sodium metabisulfite, Rongalite, L-ascorbic acid, sodium L-ascorbate, erythorbine Acid, sodium erythorbate, cysteine, thioglycerol, alpha thioglycerin, sodium edetate, citric acid, isopropyl citrate, potassium dichloroisocyanurate, sodium thioglycolate, sodium thiomalate, sodium pyrosulfite 1,3-butylene Glycol, butylhydroxyanisole, dibutylhydroxytoluene, propyl gallate, ascorbyl palmitate, vitamin E related, dl-α-tocopherol, tocopheric acetate , Natural vitamin E, d-δ-tocopherol, concentrated mixed tocopherol, guaiac fat, nordihydroguaiaretic acid, L-ascorbic acid stearate, soy lecithin, ascorbic acid palmitate, benzotriazole, pentaerythrityl- Tetrakis [3- (3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl) propionate] 1-2 mercaptobenzimidazole, 1-2 selected from the group consisting of calcium sodium ethylenediaminetetraacetate and disodium ethylenediaminetetraacetate The production method according to (3) above,
(11) The production method according to (6), wherein the organic solvent is ethanol,
(12) It has a porphyrin structure obtained by the method described in (1) above, wherein an ultrafiltration is performed using an aqueous solution from which a reducing agent is added and / or oxygen is removed as a replacement liquid. A method for purifying a complex of deoxy-type metal complex and albumin,
(13) A deoxy form having a porphyrin structure obtained by the method according to (1) above, wherein dialysis is performed using an aqueous solution to which a reducing agent is added or / and oxygen is removed as a dialysis solution. A method for purifying a complex of a metal complex and albumin;
(14) A composite of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin obtained by the production method according to (1) above,
(15) An artificial oxygen infusion preparation obtained by filling a storage container with a complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin according to (14) as it is, as a carbon monoxide conjugate, or as an oxygen conjugate And (16) an artificial oxygen infusion according to (15) above, which contains one or more selected from the group consisting of an electrolyte, a saccharide, a pH adjuster, a tonicity agent, and a polymer that imparts a colloid osmotic pressure. It is a formulation.
本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、製造工程でＣＯを用いていないため、より安全性の高い人工酸素運搬体として使用できる。
また、本発明の製造方法を用いることによって、これまで人工酸素運搬体の製造工程において必要であった、厳重なＣＯ漏洩の管理システム等が不要となり、製造設備を簡素化、小型化することができる。
さらに、製造工程でＣＯを用いた場合、最終的に酸素運搬体として使用するためには、ＣＯを除去する工程が必要である。その際、非常に強い光と酸素を吹き込むため、ポルフィリン構造を有する金属錯体が酸化型となり、酸素運搬体としての機能を果たさない状態になる恐れがある。本発明の製造方法において、製造工程でＣＯを用いない場合には、ＣＯを除去する工程が必要なく、品質の劣化を防ぐことができる。また、緊急時使用する際には、そのまま投与することが可能となる。
Since the complex of the deoxy type metal complex having a porphyrin structure and albumin of the present invention does not use CO in the production process, it can be used as a safer artificial oxygen carrier.
In addition, by using the manufacturing method of the present invention, a strict CO leakage management system or the like, which has been necessary in the manufacturing process of the artificial oxygen carrier, is unnecessary, and the manufacturing equipment can be simplified and miniaturized. it can.
Further, when CO is used in the manufacturing process, a process for removing CO is necessary in order to finally use it as an oxygen carrier. At that time, since very strong light and oxygen are blown, the metal complex having a porphyrin structure may be in an oxidized form and may not function as an oxygen carrier. In the manufacturing method of the present invention, when CO is not used in the manufacturing process, a process for removing CO is not necessary, and quality deterioration can be prevented. Further, when used in an emergency, it can be administered as it is.
本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、酸素運搬体として、医学および薬学での広い応用が可能であり、また輸血用血液と同様、そのまま或いは必要に応じ添加物を加えた状態で、血液代替物として臨床治療に利用される。
また、本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、長期保存のためのＣＯ化処理を行わなければ、そのまま静脈内投与することが可能である。投与されたポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、先ず肺を通過するときに直ちに酸素と結合してオキシ型となり、末梢血管にて酸素を放出する。
The complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin of the present invention can be widely used in medicine and pharmacy as an oxygen carrier, and can be used as it is or as necessary as in blood for transfusion. In addition, it is used for clinical treatment as a blood substitute.
In addition, the complex of the deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin of the present invention can be intravenously administered as it is unless subjected to CO treatment for long-term storage. The complex of the administered deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin first binds to oxygen when passing through the lung to become oxy-type, and releases oxygen in the peripheral blood vessels.
本発明において、「ポルフィリン構造を有する金属錯体」とは、ポルフィリン環に中心金属が配位した金属錯体を指し、ポルフィリン環が変形したものであっても、酸素との可逆的な結合能を有するもの全てが包含される。ポルフィリン環とは、図１に示すような４つのピロール環がα位置で４つのメチン基と交互に結合した大環状化合物とその誘導体である。ポルフィリン構造を有する金属錯体としては、例えば、図２に示すようなポルフィリン環（2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィリン）の中心に鉄が配位したものが挙げられる。これらの金属錯体の中心金属は、通常、遷移元素であり、元素周期表第６〜１０族の遷移元素が好ましく、第４周期の遷移元素がより好ましい。そのうち、鉄、コバルト、クロムなどが好ましく、さらに好ましくは鉄（II）、コバルト（II）である。
また「デオキシ型金属錯体」とは、中心金属に酸素が結合していない金属錯体であり、例えば中心金属である鉄（II）に酸素が結合していない金属錯体が挙げられる。「オキシ型金属錯体」とは、中心金属に酸素が結合した金属錯体であり、例えば中心金属である鉄（II）に酸素が結合した金属錯体が挙げられる。
本発明における「ポルフィリン構造を有する金属錯体」は、好ましくは「ヘム誘導体」である。「ヘム誘導体」とは、ポルフィリン構造を有する鉄錯体を指し、ポルフィリン環が変形した誘導体等であっても、酸素との可逆的な結合能を有するもの全てが包含される。ヘム誘導体としては、例えば、テトラフェニルポルフィリン、プロトポルフィリン、オクタアルキルポルフィリンおよびそれらの誘導体などが挙げられる。この中、テトラフェニルポルフィリンが好ましい。
In the present invention, the “metal complex having a porphyrin structure” refers to a metal complex in which a central metal is coordinated to a porphyrin ring, and has a reversible binding ability to oxygen even if the porphyrin ring is deformed. Everything is included. The porphyrin ring is a macrocyclic compound in which four pyrrole rings as shown in FIG. 1 are alternately bonded to four methine groups at the α-position and derivatives thereof. As a metal complex having a porphyrin structure, for example, a porphyrin ring (2- [8- [N- (2-methylimidazolyl)] octanoyloxymethyl] -5,10,15,20-tetrakis as shown in FIG. and (α, α, α, α-o-pivalamide) phenylporphyrin) in which iron is coordinated. The central metal of these metal complexes is usually a transition element, preferably a transition element of Groups 6 to 10 of the periodic table, and more preferably a transition element of the fourth period. Of these, iron, cobalt, chromium and the like are preferable, and iron (II) and cobalt (II) are more preferable.
The “deoxy-type metal complex” is a metal complex in which oxygen is not bonded to the central metal, and examples thereof include a metal complex in which oxygen is not bonded to iron (II) which is the central metal. The “oxy-type metal complex” is a metal complex in which oxygen is bonded to a central metal, and examples thereof include a metal complex in which oxygen is bonded to iron (II) which is a central metal.
The “metal complex having a porphyrin structure” in the present invention is preferably a “heme derivative”. The “heme derivative” refers to an iron complex having a porphyrin structure, and includes all derivatives having a reversible binding ability to oxygen even if the porphyrin ring is deformed. Examples of heme derivatives include tetraphenylporphyrin, protoporphyrin, octaalkylporphyrin, and derivatives thereof. Of these, tetraphenylporphyrin is preferred.
本発明において、「ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体」は、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを結合させることによって得られ、酸素の可逆的吸脱着能を有している。例えば、ヘム誘導体とアルブミンの複合体（以下、アルブミン−ヘム）などが挙げられる。
中心金属が酸化型であるポルフィリン構造を有する金属錯体は、酸素の可逆的吸脱着能がないため、本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体においては、中心金属が還元型であることが必要である。しかしながら、ポルフィリン構造を有する金属錯体の中心金属が酸化型の状態（例えば、鉄（III））でアルブミンと結合させた場合、結合後に中心金属を還元型（例えば、鉄（II））にするのは難しい。
従って、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとを結合させる際、ポルフィリン構造を有する金属錯体の中心金属は還元型であることが好ましい。例えば、ポルフィリン構造を有する鉄錯体をアルブミンと結合させる際、錯体の中心金属は還元型の鉄（II）であることが好ましい。
なお、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体以外にも、ヘモグロビン小胞体、リピドヘム小胞体、リピドヘム−トリグリセリド小球体など、あるいはそれらの混合物や複合体などの人工酸素運搬体においても、本発明の概念を応用することが可能である。
In the present invention, a “complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin” is obtained by binding a metal complex having a porphyrin structure and albumin, and has a reversible adsorption / desorption ability of oxygen. Yes. For example, a complex of heme derivative and albumin (hereinafter, albumin-heme) and the like can be mentioned.
Since the metal complex having a porphyrin structure in which the central metal is an oxidized form does not have the ability to reversibly absorb and desorb oxygen, the center metal is reduced in the complex of deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin of the present invention. It must be a mold. However, when the central metal of a metal complex having a porphyrin structure is bound to albumin in an oxidized state (for example, iron (III)), the central metal is converted to a reduced form (for example, iron (II)) after the binding. Is difficult.
Accordingly, when the metal complex having a porphyrin structure is bound to albumin, the central metal of the metal complex having a porphyrin structure is preferably a reduced type. For example, when an iron complex having a porphyrin structure is bound to albumin, the central metal of the complex is preferably reduced iron (II).
In addition to a complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin, in an artificial oxygen carrier such as a hemoglobin vesicle, a lipid heme vesicle, a lipid heme-triglyceride spherule, or a mixture or complex thereof. It is possible to apply the concept of the present invention.
本発明で使用するアルブミンは特に限定されないが、例えば、ヒト血清アルブミン、動物由来血清アルブミン、遺伝子組換え型ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、およびそれらの多量体等が挙げられる。感染防止等の観点からは、特にｒＨＳＡが好ましい。
本発明におけるアルブミン−ヘムの一例として、テトラフェニルポルフィリン鉄誘導体である2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体等を、アルブミンの疎水ポケットに包接させたもの（非特許文献１参照）などが挙げられる。
The albumin used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include human serum albumin, animal-derived serum albumin, recombinant human serum albumin (rHSA), and multimers thereof. From the viewpoint of preventing infection, rHSA is particularly preferable.
As an example of albumin-heme in the present invention, tetraphenylporphyrin iron derivative 2- [8- [N- (2-methylimidazolyl)] octanoyloxymethyl] -5,10,15,20-tetrakis (α, (α, α, α-o-pivalamide) phenylporfinato iron complex and the like are included in the hydrophobic pocket of albumin (see Non-Patent Document 1).
本発明において、「一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガス雰囲気下」とは、ＣＯの含有量が人体に影響のある量より少なく、Ｏ２の含有量がポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を劣化させる量よりも少ないガス雰囲気下である。すなわち、人体に影響のない範囲の一酸化炭素の含有、および本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体が安定して得られる範囲の酸素の含有は許容することを意味する。具体的には、上記ガス雰囲気における一酸化炭素の濃度は、好ましくは0.1ppm以下であり、上記ガス雰囲気における酸素の濃度は、好ましくは１％（約10000ppm）以下であり、より好ましくは０．１％（約1000ppm）以下で、更に好ましくは100ppm以下である。
上記ガス雰囲気下のガスは、不活性ガスであることが好ましい。不活性ガスとは、化学的に不活性なガスを意味し、例えばヘリウム、アルゴン、ネオンなどの希ガスに加えて、窒素や水素が含まれる。工業上窒素ガスを用いることが好ましい。
In the present invention, “under a gas atmosphere substantially free of carbon monoxide and oxygen” means that the content of CO is less than the amount that affects the human body, and the content of O 2 has a porphyrin structure. The gas atmosphere is less than the amount that degrades the complex of the complex and albumin. In other words, the inclusion of carbon monoxide in a range that does not affect the human body and the inclusion of oxygen in a range in which a complex of the deoxy-type metal complex having a porphyrin structure of the present invention and albumin is stably obtained are allowed. To do. Specifically, the concentration of carbon monoxide in the gas atmosphere is preferably 0.1 ppm or less, and the concentration of oxygen in the gas atmosphere is preferably 1% (about 10000 ppm) or less, more preferably 0.8 ppm. 1% (about 1000 ppm) or less, more preferably 100 ppm or less.
The gas in the gas atmosphere is preferably an inert gas. The inert gas means a chemically inert gas, and includes nitrogen and hydrogen in addition to a rare gas such as helium, argon, and neon. Industrially, nitrogen gas is preferably used.
本発明における還元剤としては、例えば、亜ジチオン酸、亜ジチオン酸塩（亜ジチオン酸ナトリウムなど）、亜硫酸水素塩（亜硫酸水素ナトリウムなど）、亜硫酸塩（亜硫酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウムなど）、ピロ亜硫酸塩（ピロ亜硫酸ナトリウムなど）、メタ重亜硫酸塩（メタ重亜硫酸ナトリウムなど）、ロンガリット（ＣＨ２ＯＨＳＯ２Ｎａ）、アスコルビン酸またはその塩（Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムなど）、エリソルビン酸またはその塩（エリソルビン酸ナトリウムなど）、システイン（好ましくは塩酸システイン）、チオグリセロール、アルファチオグリセリン、エデト酸塩（エデト酸ナトリウムなど）、クエン酸、クエン酸イソプロピル、ジクロイソシアヌール酸塩（ジクロルイソシアヌール酸カリウムなど）、チオグリコール酸塩（チオグリコール酸ナトリウムなど）、チオリンゴ酸塩（チオリンゴ酸ナトリウムなど）、ピロ亜硫酸ナトリウム１，３−ブチレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ｄｌ−α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、ｄ−δ−トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレト酸（ＮＤＧＡ）、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、大豆レシチン、パルミチン酸アスコルビン酸、ベンゾトリアゾール、ペンタエリスリチル−テトラキス［３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］２−メルカプトベンズイミダゾール、エチレンジアミン四酢酸カルシウム２ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムが挙げられる。この中、Ｌ−アスコルビン酸またはＬ−アスコルビン酸ナトリウムが好ましい。また、これらの群から選ばれる１種の還元剤のみを用いてもよく、２種以上の還元剤を同時に用いてもよい。 Examples of the reducing agent in the present invention include dithionite, dithionite (such as sodium dithionite), bisulfite (such as sodium bisulfite), sulfite (such as sodium sulfite and dry sodium sulfite), pyrosulfite. salts (such as sodium pyrosulfite), metabisulfite salt (sodium metabisulfite and the like), Rongalite (CH 2 oHSO 2 Na), ascorbic acid or a salt thereof (L- ascorbic acid, sodium L- ascorbate), erythorbic acid Or a salt thereof (such as sodium erythorbate), cysteine (preferably cysteine hydrochloride), thioglycerol, alpha thioglycerin, edetate (such as sodium edetate), citric acid, isopropyl citrate, dicloisocyanurate (dichloro) Isocyanu Potassium oxalate), thioglycolate (such as sodium thioglycolate), thiomalate (such as sodium thiomalate), sodium pyrosulfite 1,3-butylene glycol, butylhydroxyanisole (BHA), dibutylhydroxytoluene (BHT) ), Propyl gallate, ascorbyl palmitate, dl-α-tocopherol, tocopherol acetate, natural vitamin E, d-δ-tocopherol, concentrated mixed tocopherol, guaiac fat, nordihydroguaiaretic acid (NDGA), L-ascorbic acid Stearic acid ester, soybean lecithin, ascorbic acid palmitate, benzotriazole, pentaerythrityl-tetrakis [3- (3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl) propionate] 2-mercapto Examples include benzimidazole, disodium ethylenediaminetetraacetate and disodium ethylenediaminetetraacetate. Among these, L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate is preferable. Moreover, only 1 type of reducing agents chosen from these groups may be used, and 2 or more types of reducing agents may be used simultaneously.
本発明において、「窒素置換」とは、目的物を窒素雰囲気下に置くことにより、酸素を除去する操作である。例えば、ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体を窒素雰囲気下におくことにより、酸素を除去し、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体に転換させることができる。窒素置換の方法としては、目的物の溶液に窒素ガスのバブリングを行う方法（以下、窒素バブル）や、目的物の溶液表面に窒素ガスを吹き付ける方法（窒素フロー）が挙げられる。 In the present invention, “nitrogen substitution” is an operation for removing oxygen by placing a target substance in a nitrogen atmosphere. For example, by placing an oxy-type metal complex having a porphyrin structure in a nitrogen atmosphere, oxygen can be removed and converted to a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure. Examples of the nitrogen replacement method include a method of bubbling nitrogen gas to a target solution (hereinafter referred to as nitrogen bubble) and a method of blowing nitrogen gas onto the target solution surface (nitrogen flow).
本発明の製造方法は、溶存酸素を除去したアルブミン水溶液を、一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガスで満たされた密閉容器中に添加し、ついでポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒溶液および還元剤を混合する工程を含むことが好ましい。 In the production method of the present invention, an albumin aqueous solution from which dissolved oxygen is removed is added to a closed container filled with a gas substantially free of carbon monoxide and oxygen, and then an organic solvent solution of a metal complex having a porphyrin structure And a step of mixing the reducing agent.
ポルフィリン構造を有する金属錯体を溶解させる有機溶媒としては、ポルフィリン構造を有する金属錯体が溶解できるものであれば特に限定されないが、通常、水溶性の有機溶媒が用いられ、医薬品としての使用上、好ましくはエタノールが用いられる。有機溶媒溶液中のポルフィリン構造を有する金属錯体の量は、使用目的に応じて調節できるが、好ましくはアルブミン１モル量に対して、約１〜１０モル量である。ポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒中には上記の還元剤を添加しておくことが好ましい。
ポルフィリンポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒溶液は、窒素バブル等の窒素置換を行うことによって、あらかじめアルブミン水溶液との混合前に、ポルフィリン構造を有するオキシ型金属錯体をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体に転換させておく。窒素バブルの時間は、約１〜３０分が好ましい。
The organic solvent for dissolving the metal complex having a porphyrin structure is not particularly limited as long as the metal complex having a porphyrin structure can be dissolved, but usually a water-soluble organic solvent is used, which is preferable for use as a pharmaceutical product. Ethanol is used. The amount of the metal complex having a porphyrin structure in the organic solvent solution can be adjusted according to the purpose of use, but is preferably about 1 to 10 mol relative to 1 mol of albumin. The above reducing agent is preferably added to the organic solvent of the metal complex having a porphyrin structure.
An organic solvent solution of a metal complex having a porphyrin structure is a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure in advance by mixing with an aqueous albumin solution by performing nitrogen substitution such as a nitrogen bubble. Let me convert to The nitrogen bubble time is preferably about 1 to 30 minutes.
アルブミン水溶液の濃度は、約２５％(w/w)未満であることが好ましい（濃度が薄い場合は製造効率が悪くなる）。アルブミン水溶液は、あらかじめポルフィリン構造を有する金属錯体の有機溶媒溶液と混合する前に、酸素を除去しておくことが好ましい。例えば、窒素バブル等により酸素を除去した溶媒（注射用水、生理食塩水、緩衝液など、注射剤の製造に使用できる溶媒であれば特に限定されない。）と混合し、さらに必要に応じて窒素フローすることによって、酸素を除去しておくことができる。アルブミン水溶液に窒素を直接バブリングするとアルブミンが変性してしまうため、好ましくない。窒素バブルの時間は、約１〜６０分が好ましい。 The concentration of the albumin aqueous solution is preferably less than about 25% (w / w) (when the concentration is low, the production efficiency deteriorates). It is preferable to remove oxygen from the aqueous albumin solution before mixing with the organic solvent solution of the metal complex having a porphyrin structure in advance. For example, it is mixed with a solvent from which oxygen has been removed by a nitrogen bubble or the like (it is not particularly limited as long as it is a solvent that can be used for the production of injections, such as water for injection, physiological saline, and buffer solution), and further, if necessary, nitrogen flow By doing so, oxygen can be removed. Bubbling nitrogen directly into the albumin aqueous solution is not preferable because albumin is denatured. The nitrogen bubble time is preferably about 1 to 60 minutes.
ポルフィリン構造を有する金属錯体を溶解させる有機溶媒とアルブミン水溶液の混合は、まず、アルブミン水溶液を、一酸化炭素および酸素を実質的に含まないガスで満たされた密閉容器中に添加し、次に、ポルフィリン構造を有する金属錯体を溶解させる有機溶媒を少量ずつ添加しながら攪拌混合することが好ましい。該混合は、水溶液の凍結やアルブミンの変性が起こらないよう、通常、約０〜６０℃、好ましくは約１０〜５０℃の温度条件で行われる。混合時間は、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンが均一に混合され、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンの複合体が目的量得られるために必要な時間である。 The mixing of the organic solvent for dissolving the metal complex having a porphyrin structure and the aqueous albumin solution first adds the aqueous albumin solution into a closed container filled with a gas substantially free of carbon monoxide and oxygen, and then It is preferable to stir and mix while adding an organic solvent for dissolving the metal complex having a porphyrin structure little by little. The mixing is usually performed at a temperature of about 0 to 60 ° C., preferably about 10 to 50 ° C., so that freezing of the aqueous solution and albumin denaturation do not occur. The mixing time is a time necessary for uniformly mixing the metal complex having a porphyrin structure and albumin and obtaining a target amount of a complex of the metal complex having a porphyrin structure and albumin.
本発明において、「ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の精製方法」とは、種々公知の血液浄化方法等を用いて、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を含む溶液中の溶媒あるいは不純物を、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体から分離させる方法である。例えば、種々公知の血液透析、血液透析濾過、血液濾過等の浄化方法を応用することができる。血液濾過の方法を用いて、限外濾過膜により濾過を行い、必要に応じて置換液をポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を含む溶液に補充することが好ましい。また、血液透析の方法を用いて、半透膜と透析液による透析を行ってもよい。この場合に使用する置換液または透析液は、還元剤が添加され、且つ／又は酸素が除去された水溶液であることが好ましい。還元剤としては、上記のようなポルフィリン構造を有する金属錯体の溶媒中に添加するものと同様のものを使用することができ、酸素を除去する方法としては、窒素バブル等の種々公知の方法を用いることができる。このような置換液を使用することにより、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の酸素化を防止することができる。 In the present invention, “a method for purifying a complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin” refers to a composite of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin using various known blood purification methods. In this method, the solvent or impurities in the solution containing the body is separated from the complex of albumin with a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure. For example, various known purification methods such as hemodialysis, hemodiafiltration and blood filtration can be applied. It is preferable to perform filtration through an ultrafiltration membrane using a blood filtration method, and supplement the solution containing a complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin as necessary. Further, dialysis with a semipermeable membrane and a dialysate may be performed using a hemodialysis method. The substitution solution or dialysate used in this case is preferably an aqueous solution to which a reducing agent has been added and / or from which oxygen has been removed. As the reducing agent, the same ones as those added to the solvent of the metal complex having the porphyrin structure as described above can be used. As a method for removing oxygen, various known methods such as nitrogen bubble can be used. Can be used. By using such a substitution solution, oxygenation of a complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin can be prevented.
本発明の方法により得られる人工酸素輸液製剤は、酸素運搬能を有する、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を含有する液体である。
本発明の人工酸素輸液製剤は必要に応じて、膠質浸透圧を付与しうる化合物を含有させてもよい。膠質浸透圧を付与しうる化合物としては、膠質浸透圧を有するものであれば医薬用に用いられる種々の高分子を使用することができるが、一例として、デキストラン（例えば、低分子デキストラン）、デキストラン誘導体（例えば、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシデキストラン、カチオン化デキストラン、デキストラン硫酸）、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ゼラチン（例えば、修飾ゼラチン）、アルブミン（例えば、ヒト生血漿、ヒト血清アルブミン、加熱ヒト血漿蛋白、遺伝子組み換え型ヒト血清アルブミン）、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、アカシアゴム、グルコース、デキストロース（例えば、D-ブドウ糖一水化物）、少糖類（例えば、オリゴ糖）、多糖類分解物、アミノ酸、蛋白分解物等が挙げられる。この中でも特に低分子デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、修飾ゼラチン、遺伝子組み換え型アルブミンが好ましい。
The artificial oxygen infusion preparation obtained by the method of the present invention is a liquid containing a complex of albumin and a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and having an oxygen carrying ability.
The artificial oxygen infusion preparation of the present invention may contain a compound capable of imparting colloid osmotic pressure, if necessary. As the compound capable of imparting colloid osmotic pressure, various polymers used for pharmaceuticals can be used as long as they have colloid osmotic pressure. For example, dextran (for example, low molecular weight dextran), dextran, Derivatives (eg, carboxymethyl dextran, carboxydextran, cationized dextran, dextran sulfate), hydroxyethyl starch, hydroxypropyl starch, gelatin (eg, modified gelatin), albumin (eg, live human plasma, human serum albumin, heated human plasma) Protein, recombinant human serum albumin), PEG, polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose, acacia gum, glucose, dextrose (eg, D-glucose monohydrate), oligosaccharide (eg, oligosaccharide), polysaccharide Hydrolyzate, amino acid, protein degradation product and the like. Among these, low molecular weight dextran, hydroxyethyl starch, modified gelatin, and genetically modified albumin are particularly preferable.
上記したようなポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、ポルフィリン構造を有する金属錯体が還元型のときには酸素を可逆的に結合するのに対して、酸化型であるときは酸素結合能が無い。例えば、ヘムの中心元素である鉄が二価鉄（Ｆｅ2+）のときには酸素を可逆的に結合するのに対して、酸化型の三価鉄（Ｆｅ3+）であるときには酸素結合能は無い。また酸素が結合した二価鉄錯体でも、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ2 -)を遊離して次第に自動酸化し、三価鉄（メト体）となって酸素結合能を失う。更に、メト体からはヘムおよび鉄イオンが遊離し易くなるといった、生体への悪影響が懸念される。
したがって、これらポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体を含む人工酸素輸液製剤を保存する場合には、この酸化反応を抑制する必要がある。
The complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin as described above binds oxygen reversibly when the metal complex having a porphyrin structure is in a reduced form, whereas it is oxygen in an oxidized form. There is no binding ability. For example, when iron, the central element of heme, is divalent iron (Fe 2+ ), it binds oxygen reversibly, whereas when it is oxidized trivalent iron (Fe 3+ ), the oxygen binding capacity is No. In addition, even with a divalent iron complex to which oxygen is bonded, the superoxide anion (O 2 − ) is liberated and gradually auto-oxidized to become trivalent iron (meth) and lose its oxygen binding ability. Furthermore, there are concerns about adverse effects on the living body, such as heme and iron ions being easily liberated from the meteosome.
Therefore, when storing an artificial oxygen infusion preparation containing a complex of deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin, it is necessary to suppress this oxidation reaction.
酸化反応の抑制方法としては、単に冷蔵保存して反応速度を低下させることも可能であるが、徐々に三価鉄が増大するため、これに対する対策として、赤血球に本来存在しているメトヘモグロビン還元酵素系や、カタラーゼおよびスーパーオキサイドディスムターゼなどの活性酸素を消去する酵素を添加する方法が知られている。保存温度は、-20℃〜60℃の間で可能であるが、好ましくは４〜25℃の冷暗所保存をする。
また、酸素を遮断して保存するために、例えば硝子瓶に直接封入したり、アルミニウム/ポリエチレン層状バッグ(aluminized polyethylene bag)や、ポリ塩化ビニリデン系、エチレン−ビニルアルコール共重合体系など、酸素透過性が極めて低い材質から成る容器に入れて封入したり、またはプラスチック製バックに封入しこれを更に酸素を透過しない容器に入れることが好ましい。
さらに、人工酸素輸液を収容した容器中の酸素を除去した後、酸素を遮断して保存することにより、ポルフィリン構造を有する金属錯体の酸化、また脂質などその他の成分の酸素酸化を抑制することができる。酸素除去操作後に、溶液中に残存している微量の酸素を更に除去することを目的として、人工酸素輸液を収容した容器内に、適量の酸素と反応する試薬(抗酸化剤)を分散させても良い。ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体が溶液中に分散している場合は、溶媒中に抗酸化剤を添加してもよい。
As a method of suppressing the oxidation reaction, it is possible to reduce the reaction rate simply by refrigerated storage, but since trivalent iron gradually increases, as a countermeasure against this, methemoglobin reduction that originally exists in erythrocytes Enzymatic systems and methods of adding enzymes that scavenge active oxygen such as catalase and superoxide dismutase are known. The storage temperature can be between −20 ° C. and 60 ° C., but it is preferably stored in a cool dark place at 4 to 25 ° C.
In order to block and store oxygen, for example, it can be sealed directly in a glass bottle, aluminized polyethylene bag, polyvinylidene chloride, ethylene-vinyl alcohol copolymer system, etc. It is preferable to enclose in a container made of an extremely low material, or enclose it in a plastic bag and further enclose it in a container that does not allow oxygen permeation.
Furthermore, after removing the oxygen in the container containing the artificial oxygen infusion, the oxygen is blocked and stored, thereby suppressing the oxidation of the metal complex having a porphyrin structure and the oxygen oxidation of other components such as lipids. it can. After the oxygen removal operation, a reagent (antioxidant) that reacts with an appropriate amount of oxygen is dispersed in a container containing artificial oxygen infusion for the purpose of further removing trace amounts of oxygen remaining in the solution. Also good. When a complex of deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin is dispersed in a solution, an antioxidant may be added to the solvent.
抗酸化剤としては、通常、医薬用に用いられる種々の抗酸化剤を使用することができるが、一例として、亜ジチオン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ロンガリット（CH2OHSO2Na）、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、システイン、アセチルシステイン、塩酸システイン、ホモシステイン、グルタチオン、チオグリセロール、アルファチオグリセリン、エデト酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸イソプロピル、ジクロルイソシアヌール酸カリウム、チオグリコール酸ナトリウム、チオリンゴ酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム1、3-ブチレングリコール、エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、アミノ酸亜硫酸塩（例えば、L-リジン亜硫酸塩）、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ビタミンＥおよびその誘導体（例えばdl-α-トコフェロール、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、d-δ-トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、ｔｒｏｌｏｘ）、グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレト酸(NDGA)、L-アスコルビン酸ステアリン酸エステル、大豆レシチン、パルミチン酸アスコルビン酸、ベンゾトリアゾール、ペンタエリスリチル-テトラキス[3-(3、5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)プロピオネート]2-メルカプトベンズイミダゾール等が挙げられる。このうち、亜ジチオン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、システイン、アセチルシステイン、dl-α-トコフェロール、酢酸トコフェロール、グルタチオン、ｔｒｏｌｏｘが好ましい。 As the antioxidant, various antioxidants generally used for pharmaceuticals can be used, but as an example, dithionic acid, sodium bisulfite, sodium sulfite, sodium pyrosulfite (for example, sodium metabisulfite) ), Rongalite (CH 2 OHSO 2 Na), ascorbic acid, sodium ascorbate, erythorbic acid, sodium erythorbate, cysteine, acetylcysteine, cysteine hydrochloride, homocysteine, glutathione, thioglycerol, alphathioglycerin, sodium edetate, citrate Acid, isopropyl citrate, potassium dichloroisocyanurate, sodium thioglycolate, sodium thiomalate, sodium pyrosulfite 1,3-butylene glycol, disodium calcium ethylenediaminetetraacetate, Range amine tetraacetate disodium, amino acid sulfites (eg L-lysine sulfite), butylhydroxyanisole (BHA), dibutylhydroxytoluene (BHT), propyl gallate, ascorbyl palmitate, vitamin E and its derivatives (eg dl -α-tocopherol, acetate tocopherol, natural vitamin E, d-δ-tocopherol, concentrated mixed tocopherol, trolox), guaiac fat, nordihydroguaiaretic acid (NDGA), L-ascorbic acid stearate, soy lecithin, palmitic Examples include acid ascorbic acid, benzotriazole, pentaerythrityl-tetrakis [3- (3,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl) propionate] 2-mercaptobenzimidazole. Of these, dithionite, sodium bisulfite, sodium sulfite, ascorbic acid, cysteine, acetylcysteine, dl-α-tocopherol, tocopherol acetate, glutathione, and trolox are preferred.
また、本発明のポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体は、ＣＯ化してから保存してもよい。例えば、ポルフィリン構造を有する金属錯体がヘム（鉄錯体）である場合、ヘムに対して酸素よりも２００倍の親和度を示すＣＯを結合させて、長期保存を行うことができる。
この場合、ＣＯの使用量は必要最小限に止めることが安全性の面などから好ましい。そのためには、例えば、ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体がアルブミン−ヘムの場合、従来の様にヘムエタノール溶液の調製からアルブミンへの包接までの長時間に亘り、ＣＯ雰囲気で行うよりも、包接反応後、容器へ充填し、容器内をＣＯ置換するほうが好ましい。これによって、ＣＯ使用量は従来よりも遙かに少量で済む。
具体的には、例えば、ヘム誘導体のエタノール溶液にＬ−アスコルビン酸の水溶液を添加し、密閉容器中で窒素置換しながら、溶存酸素を除去したアルブミン水溶液中に加え、攪拌混合し、デオキシ型のアルブミン−ヘムを生成させた後に、ＣＯ雰囲気下に置くことにより、アルブミン−ヘムをＣＯ化し保存する方法が挙げられる。
Further, the complex of the deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin of the present invention may be stored after being converted to CO. For example, when the metal complex having a porphyrin structure is heme (iron complex), long-term storage can be performed by binding CO having an affinity 200 times that of oxygen to heme.
In this case, it is preferable from the viewpoint of safety to keep the amount of CO used to the minimum necessary. For that purpose, for example, when the complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin is albumin-heme, as in the conventional case, CO is applied over a long period of time from preparation of heme ethanol solution to inclusion in albumin. Rather than performing in an atmosphere, it is preferable to fill the container after the inclusion reaction and replace the inside of the container with CO. As a result, the amount of CO used is much smaller than before.
Specifically, for example, an aqueous solution of L-ascorbic acid is added to an ethanol solution of a heme derivative, added to an albumin aqueous solution from which dissolved oxygen has been removed while purging with nitrogen in a sealed container, and mixed by stirring. After producing albumin-heme, the albumin-heme can be converted to CO by storing it in a CO atmosphere and stored.
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
非特許文献１記載の手法に従い、2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体を得た。
この錯体(3.0ｍＭ)のエタノール溶液(2 ｍＬ)を密閉容器中で窒素置換しながら、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(4 μL)を添加し、10分間反応させた溶液Ａを得た。
これとは別に、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン(1.5 ｍＭ、0.5 ｍＬ)を窒素バブルで溶存酸素を除去したリン酸水溶液(ｐＨ 8.1、1.0 ｍＭ、7.5 ｍＬ)に加えた溶液Ｂを調製した。
次に溶液Ａを溶液Ｂに添加し、室温で約５分間攪拌混合した。
その混合液を限外濾過装置(アドバンテック製ウルトラフィルター：限外濾過分子量50000)で5 ｍＬまで濃縮後、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(200μＬ)を添加したリン酸緩衝液(ｐＨ7.4、1.0ｍＭ、50ｍＬ)を用いて定容量限外濾過によりエタノールを除去した。これを2.0ｍＬまで濃縮した。得られた混合液をガラス製バイアル瓶に充填密封し、容器中は窒素置換した。
こうしてアルブミン濃度5.38％、ポルフィリン濃度3.24ｍＭのポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体を得た。
According to the method described in Non-Patent Document 1, 2- [8- [N- (2-methylimidazolyl)] octanoyloxymethyl] -5,10,15,20-tetrakis (α, α, α, α-o- A pivalamide) phenyl porfinato iron complex was obtained.
An aqueous solution (4 μL) of L-ascorbic acid (1.2 mM) was added while replacing the ethanol solution (2 mL) of this complex (3.0 mM) with nitrogen in a sealed container to obtain solution A that was reacted for 10 minutes. It was.
Separately, a solution B was prepared by adding genetically modified human serum albumin (1.5 mM, 0.5 mL) to a phosphoric acid aqueous solution (pH 8.1, 1.0 mM, 7.5 mL) from which dissolved oxygen was removed with a nitrogen bubble.
Next, the solution A was added to the solution B, and stirred and mixed at room temperature for about 5 minutes.
The mixture was concentrated to 5 mL with an ultrafiltration device (Advantech Ultrafilter: ultrafiltration molecular weight 50000), and then added with an aqueous solution (200 μL) of L-ascorbic acid (1.2 mM) (
Thus, a porphyrin metal complex-albumin complex having an albumin concentration of 5.38% and a porphyrin concentration of 3.24 mM was obtained.
（試験例１）
実施例1で得られた分散液に酸素をフローすると、オキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが420ｎｍであった。この分散液を希釈し、窒素雰囲気下で少量の亜ジチオン酸を添加するとデオキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが441ｎｍになった。
なお、酸素及び窒素の交互の通気を繰り返すことによって酸素の吸脱着を確認した。また、電気泳動法により、アルブミンの変性を確認した結果、変性は認められなかった。
(Test Example 1)
When oxygen was flowed into the dispersion obtained in Example 1, an oxy compound was obtained, and the visible absorption spectrum had a λ max of 420 nm. When this dispersion was diluted and a small amount of dithionite was added in a nitrogen atmosphere, a deoxy form was obtained, and its visible absorption spectrum had a λ max of 441 nm.
In addition, adsorption / desorption of oxygen was confirmed by repeating alternate aeration of oxygen and nitrogen. As a result of confirming the denaturation of albumin by electrophoresis, no denaturation was observed.
実施例１と同様にして、2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体を得た。
この錯体(1.2 ｍＭ)のエタノール溶液(5ｍＬ)を密閉容器中で窒素バブルしながら、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(10μＬ)を添加し、10分間反応させ、溶液Ａを得た。
これとは別に、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン(1.5ｍＭ、0.5ｍＬ)を窒素バブルで溶存酸素を除去したリン水溶液(ｐＨ8.1、1.0ｍＭ、24.5ｍＬ)に加え、溶液Ｂを調製した。
次に溶液Ａを溶液Ｂに添加し、室温で約５分間攪拌混合した。
その混合液を限外濾過装置(アドバンテック製ウルトラフィルター：限外濾過分子量50000)で5ｍＬまで濃縮後、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(200μL)を添加したリン酸緩衝液(ｐＨ7.4、1.0ｍＭ、50ｍＬ)を用いて定容量限外濾過によりエタノールを除去した。これを2.0ｍＬまで濃縮した。得られた混合液をガラス製バイアル瓶に充填密封し、容器中は窒素置換した。
こうして目的とする、アルブミン濃度4.344％、ポルフィリン濃度3.55ｍＭのポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体を得た。
In the same manner as in Example 1, 2- [8- [N- (2-methylimidazolyl)] octanoyloxymethyl] -5,10,15,20-tetrakis (α, α, α, α-o-pivalamide ) Phenylporfinato iron complex was obtained.
An aqueous solution (10 μL) of L-ascorbic acid (1.2 mM) was added while the ethanol solution (5 mL) of this complex (1.2 mM) was bubbled with nitrogen in a sealed container, and reacted for 10 minutes to obtain Solution A.
Separately, recombinant human serum albumin (1.5 mM, 0.5 mL) was added to an aqueous phosphorous solution (pH 8.1, 1.0 mM, 24.5 mL) from which dissolved oxygen was removed with a nitrogen bubble to prepare solution B.
Next, the solution A was added to the solution B, and stirred and mixed at room temperature for about 5 minutes.
The mixture was concentrated to 5 mL with an ultrafiltration device (Advantech Ultrafilter: ultrafiltration molecular weight 50000), and then added with an aqueous solution (200 μL) of L-ascorbic acid (1.2 mM) (pH 7.4). , 1.0 mM, 50 mL) was used to remove ethanol by constant volume ultrafiltration. This was concentrated to 2.0 mL. The obtained mixed solution was filled and sealed in a glass vial, and the container was purged with nitrogen.
Thus, a target porphyrin metal complex-albumin complex having an albumin concentration of 4.344% and a porphyrin concentration of 3.55 mM was obtained.
（試験例２）
実施例２で得られた分散液に酸素をフローすると、オキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが421.5ｎｍであり、この分散液を希釈し、窒素雰囲気下で少量の亜ジチオン酸を添加するとデオキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが441.5ｎｍに得られた。
なお、酸素及び窒素の交互の通気を繰り返すことによって酸素の吸脱着を行うことができた。また、電気泳動法により、アルブミンの変性を確認した結果、変性は認められなかった。
(Test Example 2)
When oxygen was flowed into the dispersion obtained in Example 2, an oxy product was obtained, and its visible absorption spectrum had a λ max of 421.5 nm. The dispersion was diluted and a small amount of dithionite was added under a nitrogen atmosphere. Was added to obtain a deoxy form, and a visible absorption spectrum of λ max was obtained at 441.5 nm.
In addition, adsorption / desorption of oxygen was able to be performed by repeating alternate aeration of oxygen and nitrogen. As a result of confirming the denaturation of albumin by electrophoresis, no denaturation was observed.
実施例１と同様にして、2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体を得た。
この錯体(1.5 ｍＭ)のエタノール溶液(1 ｍＬ)を密閉容器中で窒素バブルしながら、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(20 μL)を添加し、10分間反応させ、溶液Ａを得た。
これとは別に、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン(0.375 ｍＭ、0.5 ｍＬ)を窒素バブルで溶存酸素を除去したリン酸水溶液(ｐＨ8.1、1.0 ｍＭ、4.5 ｍＬ)に加え、溶液Ｂを調製した。
次に溶液Ａを溶液Ｂに添加し、室温で約５分間攪拌混合した。
その混合液を限外濾過装置(アドバンテック製ウルトラフィルター：限外濾過分子量50000)で5 ｍＬまで濃縮後、リン酸緩衝液(ｐＨ 7.4、1.0 ｍＭ、50 ｍＬ)を用いて定容量限外濾過によりエタノールを除去した。これを0.5 mLまで濃縮した。得られた混合液をガラス製バイアル瓶に充填密封し、容器中は窒素置換した。
こうして目的とする、アルブミン濃度は5.252 ％、ポルフィリン濃度は1.74ｍＭのポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体を得た。
In the same manner as in Example 1, 2- [8- [N- (2-methylimidazolyl)] octanoyloxymethyl] -5,10,15,20-tetrakis (α, α, α, α-o-pivalamide ) Phenylporfinato iron complex was obtained.
An aqueous solution (20 μL) of L-ascorbic acid (1.2 mM) was added to the ethanol solution (1 mL) of this complex (1.5 mM) in a sealed container with nitrogen bubbling, and reacted for 10 minutes to obtain solution A. It was.
Separately, recombinant human serum albumin (0.375 mM, 0.5 mL) was added to a phosphoric acid aqueous solution (pH 8.1, 1.0 mM, 4.5 mL) from which dissolved oxygen was removed with a nitrogen bubble to prepare solution B.
Next, the solution A was added to the solution B, and stirred and mixed at room temperature for about 5 minutes.
The mixture is concentrated to 5 mL with an ultrafiltration device (Advantech Ultrafilter: ultrafiltration molecular weight 50000) and then subjected to constant volume ultrafiltration using a phosphate buffer (pH 7.4, 1.0 mM, 50 mL). Ethanol was removed. This was concentrated to 0.5 mL. The obtained mixed solution was filled and sealed in a glass vial, and the container was purged with nitrogen.
Thus, a target porphyrin metal complex-albumin complex having an albumin concentration of 5.252% and a porphyrin concentration of 1.74 mM was obtained.
（試験例３）
実施例３で得られた分散液に酸素をフローすると、オキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが421.5 ｎｍであり、この分散液を1/50に希釈し、石英製分光測定用セルに移し、窒素雰囲気下で少量の亜ジチオン酸を添加するとデオキシ体の可視吸収スペクトルはλmaxが440.5 ｎｍに得られる。
なお、酸素及び窒素の交互の通気を繰り返すことによって酸素の吸脱着を行うことができた。また、電気泳動法により、アルブミンの変性を確認した結果、変性は認められなかった。
(Test Example 3)
When oxygen was flowed into the dispersion obtained in Example 3, an oxy compound was obtained, and its visible absorption spectrum had a λ max of 421.5 nm. This dispersion was diluted to 1/50 and used for quartz spectroscopic measurement. When transferred to a cell and a small amount of dithionite is added under a nitrogen atmosphere, the visible absorption spectrum of the deoxy form is obtained at λ max of 440.5 nm.
In addition, adsorption / desorption of oxygen was able to be performed by repeating alternate aeration of oxygen and nitrogen. As a result of confirming the denaturation of albumin by electrophoresis, no denaturation was observed.
実施例１と同様にして、2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体を得た。
この錯体(1.2 ｍＭ)のエタノール溶液(5 ｍＬ)を密閉容器中で窒素バブルしながら、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(4 μL)を添加し、10分間反応させ、溶液Ａを得た。
これとは別に、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン(1.5 ｍＭ、0.5 ｍＬ)を窒素バブルで溶存酸素を除去したリン酸水溶液(ｐＨ8.1、1.0ｍＭ、24.5ｍＬ)に加え、溶液Ｂを調製した。
次に溶液Ａを溶液Ｂに添加し、室温で約５分間攪拌混合した。
その後、限外濾過装置(アドバンテック製ウルトラフィルター：限外濾過分子量50000)を用いて、限外濾過を行い5ｍＬまで濃縮後、リン酸緩衝液(ｐＨ7.4、1.0ｍＭ、50ｍＬ)を用いて定容量限外濾過によりエタノールを除去した。これを2.0 mLまで濃縮した。
得られた混合液をガラス製バイアル瓶に充填密封し、容器中はＣＯで置換した。
こうして目的とする、アルブミン濃度5.041 ％、ポルフィリン濃度2.71ｍＭのポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体を得た。
In the same manner as in Example 1, 2- [8- [N- (2-methylimidazolyl)] octanoyloxymethyl] -5,10,15,20-tetrakis (α, α, α, α-o-pivalamide ) Phenylporfinato iron complex was obtained.
An aqueous solution (4 μL) of L-ascorbic acid (1.2 mM) was added to the ethanol solution (5 mL) of this complex (1.2 mM) in a sealed container with nitrogen bubbling and reacted for 10 minutes to obtain solution A. It was.
Separately, recombinant human serum albumin (1.5 mM, 0.5 mL) was added to an aqueous phosphoric acid solution (pH 8.1, 1.0 mM, 24.5 mL) from which dissolved oxygen was removed with a nitrogen bubble to prepare solution B.
Next, the solution A was added to the solution B, and stirred and mixed at room temperature for about 5 minutes.
Then, after ultrafiltration using an ultrafiltration device (Advantech Ultrafilter: ultrafiltration molecular weight 50000), concentrating to 5 mL, and then using phosphate buffer (pH 7.4, 1.0 mM, 50 mL). Ethanol was removed by volume ultrafiltration. This was concentrated to 2.0 mL.
The obtained mixed solution was filled and sealed in a glass vial, and the inside of the container was replaced with CO.
Thus, a target porphyrin metal complex-albumin complex having an albumin concentration of 5.041% and a porphyrin concentration of 2.71 mM was obtained.
（試験例４）
実施例４で得られた分散液に酸素をフローしながら、氷浴中で光照射(500Ｗ)すると、オキシ体が得られる。その可視吸収スペクトルはλmaxが421.5ｎｍであり、この分散液を希釈し、石英製分光測定用セルに移し、窒素雰囲気下で少量の亜ジチオン酸を添加するとデオキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが441.5ｎｍに得られる。
なお、酸素及び窒素の交互の通気を繰り返すことによって酸素の吸脱着を行うことができた。また、電気泳動法により、アルブミンの変性を確認した結果、変性は認められなかった。
(Test Example 4)
When oxygen is applied to the dispersion obtained in Example 4 and light irradiation (500 W) is performed in an ice bath, an oxy form is obtained. Its visible absorption spectrum has a λ max of 421.5 nm. This dispersion is diluted, transferred to a quartz spectroscopic measurement cell, and a small amount of dithionite is added in a nitrogen atmosphere to obtain a deoxy form, and its visible absorption. The spectrum is obtained at λ max of 441.5 nm.
In addition, adsorption / desorption of oxygen was able to be performed by repeating alternate aeration of oxygen and nitrogen. As a result of confirming the denaturation of albumin by electrophoresis, no denaturation was observed.
実施例１と同様にして、2-[8-[N-(2-メチルイミダゾリル)]オクタノイロキシメチル]-5,10,15,20-テトラキス(α,α,α,α-o-ピバラミド)フェニルポルフィナト鉄錯体を得た。
この錯体(1.5ｍＭ)のエタノール溶液(1 ｍＬ)を密閉容器中で窒素バブルしながら、L-アスコルビン酸(1.2ｍＭ)の水溶液(20 μL)を添加し、10分間反応させ、溶液Ａを得た。
これとは別に、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン(0.375ｍＭ、0.5 ｍＬ)を窒素バブルで溶存酸素を除去したリン酸水溶液(ｐＨ8.1、1.0 ｍＭ、4.5 ｍＬ)に加え、溶液Ｂを調製した。
次に溶液Ａを溶液Ｂに添加し、室温で約５分間攪拌混合した。
その混合液を限外濾過装置(アドバンテック製ウルトラフィルター：限外濾過分子量50000)で5 ｍＬまで濃縮後、リン酸緩衝液(ｐＨ 7.4、1.0 ｍＭ、50 ｍＬ)を用いて定容量限外濾過によりエタノールを除去した。これを0.5 mLまで濃縮した。得られた混合液をガラス製バイアル瓶に充填密封し、容器中は窒素置換した。
こうして目的とする、アルブミン濃度3.16％、ポルフィリン濃度3.90ｍＭのポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体を得た。
In the same manner as in Example 1, 2- [8- [N- (2-methylimidazolyl)] octanoyloxymethyl] -5,10,15,20-tetrakis (α, α, α, α-o-pivalamide ) Phenylporfinato iron complex was obtained.
An aqueous solution (20 μL) of L-ascorbic acid (1.2 mM) was added to an ethanol solution (1 mL) of this complex (1.5 mM) in a sealed container with nitrogen bubble, and reacted for 10 minutes to obtain solution A. It was.
Separately, recombinant human serum albumin (0.375 mM, 0.5 mL) was added to an aqueous phosphoric acid solution (pH 8.1, 1.0 mM, 4.5 mL) from which dissolved oxygen was removed with a nitrogen bubble to prepare solution B.
Next, the solution A was added to the solution B, and stirred and mixed at room temperature for about 5 minutes.
The mixture is concentrated to 5 mL with an ultrafiltration device (Advantech Ultrafilter: ultrafiltration molecular weight 50000) and then subjected to constant volume ultrafiltration using a phosphate buffer (pH 7.4, 1.0 mM, 50 mL). Ethanol was removed. This was concentrated to 0.5 mL. The obtained mixed solution was filled and sealed in a glass vial, and the container was purged with nitrogen.
Thus, a target porphyrin metal complex-albumin complex having an albumin concentration of 3.16% and a porphyrin concentration of 3.90 mM was obtained.
（試験例５）
実施例５で得られた分散液に酸素をフローすると、オキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが421.5 ｎｍであり、この分散液を希釈し、窒素雰囲気下で少量の亜ジチオン酸を添加するとデオキシ体が得られ、その可視吸収スペクトルはλmaxが442.0 ｎｍに得られる。
なお、酸素及び窒素の交互の通気を繰り返すことによって酸素の吸脱着を行うことができた。また、電気泳動法により、アルブミンの変性を確認した結果、変性は認められなかった。
(Test Example 5)
When oxygen was flowed into the dispersion obtained in Example 5, an oxy product was obtained, and its visible absorption spectrum had a λ max of 421.5 nm. The dispersion was diluted and a small amount of dithionite was added under a nitrogen atmosphere. When deoxy is added, a deoxy form is obtained, and a visible absorption spectrum of λ max is obtained at 442.0 nm.
In addition, adsorption / desorption of oxygen was able to be performed by repeating alternate aeration of oxygen and nitrogen. As a result of confirming the denaturation of albumin by electrophoresis, no denaturation was observed.
本発明の医薬組成物は、酸素運搬体を必要とするあらゆる分野に利用できる。例えば、虚血部位や腫瘍組織への酸素の供給、出血時の輸血のために生体内へ投与されるか、あるいは臓器保存灌流液、体外循環液または細胞培養液として使用することができる。 The pharmaceutical composition of the present invention can be used in any field that requires an oxygen carrier. For example, it can be administered into a living body for oxygen supply to an ischemic site or tumor tissue, blood transfusion, or used as an organ preservation perfusion solution, extracorporeal circulation solution or cell culture solution.
Claims (13)
ポルフィリン構造を有するデオキシ型金属錯体とアルブミンとの複合体の製造方法。 A metal complex having a porphyrin structure is mixed with a reducing agent under a gas atmosphere substantially free of carbon monoxide and oxygen , and then mixed with albumin.
A method for producing a complex of a deoxy-type metal complex having a porphyrin structure and albumin.
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