JP2004059589A

JP2004059589A - Stably preservable oxygen transfusion

Info

Publication number: JP2004059589A
Application number: JP2003196623A
Authority: JP
Inventors: Hidetoshi Tsuchida; 土田　英俊; Hiromi Sakai; 酒井　宏水; Kenichi Tomiyama; 富山　賢一; Shinji Takeoka; 武岡　真司; Keitaro So; 宗　慶太郎
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-07-14
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2004-02-26

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for preserving an oxygen transfusion for a long term, to prepare an oxygen transfusion suitable for long term preservation and to provide a method for producing the oxygen treasfusion. <P>SOLUTION: The method for preserving the oxygen transfusion comprises preserving an aqueous solution of albumin-heme, wherein the method comprises removing oxygen from the solution, deoxidizing the solution to make the heme or its derivative a deoxi-type and preserving the deoxidized aqueous solution in an inert gas atmosphere. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸素輸液剤を長期保存する方法、長期保存に適した酸素輸液剤、および該酸素輸液剤の製造方法に関する。
【０００２】
本発明の酸素輸液剤は医学および薬学での広い応用が可能であり、また輸血用血液と同様、そのまま或いは必要に応じ添加物を加えた状態で、血液代替物として臨床治療に利用される。
【０００３】
【従来の技術】
人血を血管内に注入する現行の輸血システムには、次のような問題点が指摘されている：
１）感染（肝炎、エイズヴィルスなど）の可能性があること；
２）赤血球の保存期限が３週間であること；
３）高齢化社会の到来で、輸血患者のうち高齢者の割合が高くなる一方、健康献血者総数が低下し続けているため、献血の一回当たりの量を４００ｍＬ迄に増やしても需要を満たせなくなる可能性があること；
４）保存中に汚染の危険があること；
５）信仰上の理由で輸血を拒否する患者に対して適用できないこと；
６）災害時の緊急需要に対し、大量供給ができないこと。
【０００４】
従って、血液型に関係なく何時でも即応できる代替物に対する要求が大きく、その一つとして、電解質輸液、膠質輸液等の輸液製剤が従来広く使用されてきた。しかし、これらの輸液製剤は血液の最も重要な機能、即ち酸素を運搬する赤血球機能の代替機能を有してないため、この酸素運搬機能をも代替できる酸素輸液剤（人工赤血球）の開発が極めて重要になっている。従来の酸素輸液剤としては、パーフルオロカーボン誘導体が高い酸素溶解度を示すことから、これを懸濁させた酸素輸液剤が知られており、これについては現在臨床試験が進んでいる。また、酸素の結合および解離能を有するヘムタンパク質であるヘモグロビン（ヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、および組換えヘモグロビン）を用いた酸素輸液剤の開発も進められており、分子内架橋ヘモグロビン、水溶性高分子結合ヘモグロビン、分子間架橋重合ヘモグロビンなどの臨床試験が欧米で進行しているが、非細胞型構造に起因する各種の副作用が明らかにされている。
【０００５】
ヘモグロビン（Ｈｂ）が本来赤血球膜に包まれている理由として、下記の事項が考えられる：
１）３５％濃度の濃厚Ｈｂ溶液による高い粘度および膠質浸透圧の影響を抑制すること；
２）生理活性の高いヘモグロビンを膜内に封じ込めることにより、その逸脱を抑制すること；
３）Ｈｂ機能を維持するための各種リン酸、解糖・還元酵素系を同一系内に保持すること；および
４）血球分散系は非ニュートン性流体であり、体内（特に末梢血管）循環において特色ある流動形式により生理作用を示す利点があること。
【０００６】
上記のような赤血球構造の本来の役割を考慮すれば、酸素輸液剤としては、ヘモグロビンをカプセル封入した粒子の分散系が適切であることは明らかである。一方、生体成分であるリン脂質が単独で小胞構造を形成することが発見され、ＤｊｏｒｄｊｅｖｉｃｈとＭｉｌｌｅｒがリン脂質／コレステロール／脂肪酸から成るリポソームを利用したヘモグロビン小胞体の検討を開始して以来、多くの機関でヘモグロビン小胞体の研究が進められてきた。ヘモグロビン小胞体の使用には、１）天然のヘモグロビンがそのまま使えること、２）ヘモグロビン由来の副作用を抑制できること、３）粘度や膠質浸透圧、酸素親和度を任意の値に調節できること、４）体内血中滞留時間を延長できること等の利点がある。
【０００７】
ヘモグロビンの酸素結合部位であるヘム（プロトポルフィリンＩＸ）は、グロビンから逸脱すると同時に酸素結合能を失うことは当業者には周知であり、グロビン鎖の構築する立体枠組みの役割と疎水場の重要性は良く認識されていた。そこで、グロビンの機能代替ができる系の開発に力が注がれてきた。本発明者らは、各種ポルフィリン誘導体について検討した結果、水相系で可逆的に酸素を結合する能力を有するリピドヘム（ヘム結合脂質）：５，１０，１５，２０−テトラキス［α，α，α，α−ｏ−｛２’，２’−ジメチル−２０’（２”−トリメチルアミノエチル）　ホスホナトキシエイコサナミド｝−フェニル］ポルフィナト鉄（ＩＩ）［５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ［α，α，α，α−ｏ−｛２’，２’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２０’（２”−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔ−ｏｘｙｅｉｃｏｓａｎａｍｉｄｏ｝−ｐｈｙｅｎｙｌ］ｐｏｒｐｈｙｎａｔｏ　ｉｒｏｎ（ＩＩ）］およびその他の合成に成功した。このリピドヘムをリン脂質と混合して水相に分散処理することにより構成されるリピドヘム小胞体では、リピドヘムがリン脂質膜疎水場に包埋され分散配向している。水相分散系にある粒径の揃ったリピドヘム小胞体では、生理条件下にある赤血球内ヘモグロビンと同様に、可逆的な酸素配位が可能となることが観測されている。かくして、血液と同じヘム濃度の赤い色をしたこの水相系は、全合成による酸素輸液剤として誕生した（Ｅ．Ｈａｓｅｇａｗａ，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｊｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　ｖｏｌ．１０５，　１４１６−１４１９，　１９８２）。動物投与試験も詳細になされ、出血ショックモデル犬の蘇生試験では、ヘム濃度に応じた酸素運搬力が確認された。栄養油剤（精製大豆油、トリグリセリド）の油滴小球の周りをリピドヘムで覆ったリピドヘム−トリグリセリド小胞体の酸素輸送能も確認されている（小松ら、人工臓器，　ｖｏｌ．　２２，　５５０−５５３，　１９９３）。また、ヘム誘導体である２−［８−｛Ｎ−（２−メチルイミダゾリル）｝オクタノイロキシメチル］−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバラミド）フェニルポルフィナト鉄（ＩＩ）（２−［８−｛Ｎ−（２−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）｝ｏｃｔａｎｏｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ］　−５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ（α，α，α，α−ｏ−ｐｉｖａｌａｍｉｄｏ）ｐｈｅｎｙｌｐｏｒｐｈｙｎａｔｏｉｒｏｎ（ＩＩ））等を、ヒト由来アルブミンまたは組換えアルブミンの疎水ポケットに吸着させた酸素輸液剤（アルブミン−ヘムと称する）が合成され、その酸素運搬能が確認されている（Ｅ．Ｔｓｕｃｈｉｄａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　ｖｏｌ．８，　５３４−５３８，　１９９７）。
【０００８】
欧米における酸素輸液剤の開発は、当初は軍事目的の色彩を帯びていたが、冷戦後の医療現場においては、単なる出血ショック蘇生の目的だけでなく、様々な使用目的（術前血液希釈、体外循環、鎌形赤血球貧血病、卒中、臓器保存、昇圧剤、一酸化炭素中毒、癌治療、液体換気、動物臨床医療など）での適用が考慮されている。また、献血・輸血システムの整備が遅れ、輸血用血液が慢性的に不足している途上国で大きな需要があることから、その研究開発は世界規模に拡大されている。日本では、期限切れ赤血球の有効利用の意味もあり、本研究を推進している現状である。
【０００９】
酸素輸液剤の保存形態としては、冷蔵保存、凍結保存、および凍結乾燥した粉末状態での保存が知られている。一般にリン脂質小胞体は構造が不安定であり、またオキシヘモグロビンやオキシ型ヘム誘導体の酸素結合部位であるヘムは酸化反応を受けやすい。従って酸素輸液剤を冷蔵保存すると、粒子の凝集と融合、また構成成分が酸化され、過酸化脂質の生成、メトヘモグロビンやヘム誘導体の酸化体の生成などの劣化反応が起り、投与が出来ない状態になる場合がある。
【００１０】
ヘモグロビン小胞体やリピドヘム小胞体において、重合性のリン脂質を小胞体の構成成分とし、γ線や紫外線照射によってこれを重合することにより小胞体構造を極めて安定にすることができる。この場合、分散液を液体窒素で急速冷凍して長期保存が可能となる。凍結融解を１０回繰り返してもヘモグロビンの漏出はなく、また粒径も変化せず、酸素結合解離曲線にも変動が無い（Ｓａｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，　ＡＳＡＩＯ　Ｊｏｕｎａｌ，　ｖｏｌ．３８，　Ｍ５８０−Ｍ５８４，　１９９２）。また、この系にマルトースやスクロースなどの糖を添加し、凍結乾燥して得られる粉末は極めて安定である。例えばヘモグロビン小胞体の場合、２０週間４℃で保存した後、純水を添加して再溶解させた後の物性解析では、メトヘモグロビン含量の増大は認められず、ヘモグロビンの漏出も無く、また小胞体の粒径が変化しておらず、凍結乾燥前の状態とほぼ同等であることが確認されている（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ａｄｖ．　Ｔｅｃｈｎｏｌ．，　ｖｏｌ．４，　８−１１，　１９９２）。
【００１１】
ポリオキシエチレンを結合した脂質を、リン脂質小胞体の表面に導入する方法は良く知られている。その目的は、血中滞留時間を延長させて封入した抗癌剤を腫瘍組織に効率良く運搬することであり、既に臨床試験も最終段階となり、その安全性は充分に認められている。また、ヘモグロビン小胞体と血中蛋白質との相互作用を抑制させることを目的として、ヘモグロビン小胞体の表面にポリオキシエチレンを結合させている報告もある（リポソーム表面への蛋白質吸着抑制剤、公開特許公報、平３−２１８３０９；リポソームおよびその製法、公開特許公報、平７−２０８５７）。また、ポリオキシエチレンで表面修飾することにより、血中での血流動態が改善されることも確認されている（Ｓａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　ｖｏｌ．８，　２３−３０，　１９９７）。しかし、酸素輸液剤の保存に関して、このポリオキシエチレン修飾法を利用することは知られていなかった。
【００１２】
ヘモグロビン、リピドヘム、およびヘム誘導体は、そのヘムの中心元素である鉄が二価鉄（Ｆｅ^２＋）のときには酸素を可逆的に結合するのに対して、酸化型の三価鉄（Ｆｅ^３＋）であるときは酸素結合能が無い。また酸素を結合した二価鉄錯体でも、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ_２ ⁻）を遊離して次第に自動酸化し、三価鉄（メト体）となって酸素結合能を失う。更に、メト体からはヘムおよび鉄イオンが遊離し易くなるので、生体への悪影響が懸念される。この酸化反応を抑制する方法としては、単に冷蔵保存して反応速度を低下させることも可能であるが、次第に三価鉄が増大する。これに対する対策として、赤血球に本来存在しているメトヘモグロビン還元酵素系や、カタラーゼおよびスーパーオキサイドディスムターゼなどの活性酸素を消去する酵素を添加する方法も知れている。また、ヘモグロビンおよびヘム誘導体に対して酸素の２００倍の親和度を示す一酸化炭素（ＣＯ）を結合させて二価鉄の状態を保ち、極めて長期間に亘って酸化を抑制することもできる。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
酸素輸液剤（ヘモグロビン小胞体、リピドヘム小胞体、リピドヘム−トリグリセリド小球体、アルブミン−ヘムなど）のこれまでの保存方法には以下に示す問題があり、酸素輸液剤としての本来の開発目的にはそぐわない。
【００１４】
保存形態として、凍結保存、凍結乾燥粉末としての保存がある。しかし、凍結体はこれを融解する手間がかかり、また粉末を溶解させる際には溶解までに時間を必要とする上に、気泡が発生してこれを除去する必要があるなどの煩雑さを伴う等の問題点が指摘されている。従って、凍結保存、凍結乾燥粉末保存は好ましくない。
【００１５】
メトヘモグロビン還元酵素系や活性酸素消去酵素を添加する方法では、長期保存中に酵素活性が低下し、一定の値を取らない場合がある。また、酸素輸液剤を一酸化炭素雰囲気で冷蔵保存すると、ヘムの二価鉄の状態が保たれ、三価鉄への酸化反応は抑制されるが、大量の一酸化炭素は有害であり、また結合した一酸化炭素を除去しない限り酸素結合能が無いので、このままでの投与はできない。オキシ型に変換した後の冷蔵保存では、三価鉄状態への酸化が次第に進行し、酸素運搬能の低下が著しい。二価鉄状態のヘモグロビンの酸素分圧と酸化速度の相関は良く知られており、デオキシヘモグロビン小胞体では酸化反応が進行しないことは実験的に確認されている（Ｓａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｕｌｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｊｐｎ．，　１９９４，　１１２０−１１２５；　Ｔａｋｅｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，　ｖｏｌ．８，　５３９−５４４，　１９９７）。
【００１６】
また、ヘモグロビンおよびヘム誘導体の酸化反応が抑制されたとしても、酸素輸液剤の保存にはもう一つ別の障害がある。即ち、ヘモグロビン小胞体、リピドヘム小胞体、リピドヘム−トリグリセリド小球体のように、ヘムの周囲環境を形成している脂質分子集合体構造は、共有結合を介さずに成分分子間の相互作用力（疎水性相互作用、静電的相互作用、水素結合など）から構成されているため不安定な場合が多く、生理塩水に分散させて冷蔵保存すると、次第に凝集体を形成し、融合して粒径が変化するので、何らかの構造安定化が望まれていた。
【００１７】
本発明者等は、酸素輸液剤について永年にわたり系統的な研究を重ねているものであるが、酸素輸液剤の長期室温棚置き保存の技術手段を確立することを課題として鋭意努力した結果、上記諸問題を解決し、当該課題を達成したものである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は、水性媒質中に分散された脂質分子集合体と、該脂質分子集合体に含まれるヘムまたはヘム誘導体を含有する水性分散液からなる酸素輸液剤の保存方法であって：
前記水性分散液から酸素を除去した、前記ヘムまたはヘム誘導体のデオキシ型にすることを特徴とする酸素輸液剤の保存方法によって達成される。
【００１９】
本発明のもう一つの側面によれば、アルブミン−ヘムを含有する水溶液からなる酸素輸液剤の保存方法であって：
前記水溶液から酸素を除去して、前記ヘムまたはヘム誘導体をデオキシ型にすることと；
この酸素を除去された水溶液を不活性ガス雰囲気中で保存することを特徴とする酸素輸液剤の保存方法が提供される。
【００２０】
本発明のもう一つ側面によれば、水性媒質中に分散された脂質分子集合体と、該脂質分子集合体に含まれるヘムまたはヘム誘導体を含有する酸素輸液剤であって：
前記脂質分子集合体体表面がポリオキシエチレンで修飾されていることと；
前記ヘムまたはヘム誘導体がデオキシ型であることと；
前記酸素輸液剤が、不活性ガスを充填した酸素不透過性の容器内に充填されていることを特徴とする長期保存性に優れた酸素輸液剤が提供される。
【００２１】
本発明の別の側面によれば、水性媒質中に分散された脂質分子集合体と、該脂質分子集合体に含まれるヘムまたはヘム誘導体を含有する水性分散液からなる酸素輸液剤の製造方法であって：
表面がポリオキシエチレンで修飾され、且つ前記ヘムまたはヘム誘導体を含んだ前記脂質分子集合体の水性分散液を調製する工程と；
該水性分散液から酸素を除去することにより、前記ヘムまたはヘム誘導体をデオキシ型にする工程と；
前記ヘムまたはヘム誘導体をデオキシ型にした水性分散液を酸素不透過性の容器に収容するとともに、該容器内に不活性ガスを充填する工程を具備したことを特徴とする長期保存性に優れた酸素輸液剤の製造方法が提供される。
【００２２】
本発明の更に別の側面によれば、アルブミン−ヘムを含有する水溶液からなる酸素輸液剤の製造方法であって：
アルブミン−ヘムを含有する水溶液を調製する工程と；
該水溶液から酸素を除去することにより、前記ヘムまたはヘム誘導体をデオキシ型にする工程と；
前記ヘムまたはヘム誘導体をデオキシ型にした水溶液を酸素不透過性の容器に収容するとともに、該容器内に不活性ガスを充填する工程を具備したことを特徴とする酸素輸液剤の製造方法が提供される。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明において。「脂質分子集合体」とは、脂質および／またはリポタンパク質によって、共有結合を介さずに、水性媒質中における分子間の相互作用（疎水性相互作用、静電気的相互作用、水素結合など）により構成された膜構造体を言う。典型的には小胞体（リポソーム）および小球体（マイクロスフィア）が挙げられるが、広義には赤血球膜等の細胞膜も含まれる。更に、ヘモグロビン小胞体、リピドヘム小胞体、リピドヘム−トリグリセリド小球体もまた、脂質分子集合体からなる小胞体の典型例である。
【００２４】
本発明において、「ヘムまたはその誘導体」とは、ヘムだけでなく、ヘムのポルフィリン環が変形されたヘム誘導体のうち、酸素との可逆的な結合能を有するもの全てを包含する。
【００２５】
本発明における「水性媒質」には、水および全ての生理学的に許容可能な全ての水溶液、例えば、電解質水溶液、緩衝液、タンパク質水溶液、脂質エマルジョン水溶液、血漿およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００２６】
本発明における不活性ガスとは、化学的に不活性なガスを意味し、例えばヘリウム、アルゴン、ネオンなどの希ガスに加えて、窒素が含まれる。経済的な理由からは窒素ガスが好ましい。
【００２７】
次に、本発明の構成を詳しく説明すれば次の通りである。
【００２８】
既報に従って調製したヘモグロビン小球体（Ｓａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｇｒｅｓ，　ｖｏｌ．　１２，　１１９−１２５，　１９９６）、リピドヘム小胞体（Ｅ．　Ｈａｓｅｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　ｖｏｌ．　１０５，　１４１６−１４１９，　１９８２）、リピドヘム−トリグリセリド小胞体（小松ら、人工臓器，　ｖｏｌ．　２２，　５５０−５５３，　１９９３）、およびアルブミン−ヘム（Ｅ．　Ｔｓｕｃｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　ｖｏｌ．　８，　５３４−５３８，　１９９７）の生理塩水溶液について、ヘムが鉄二価の状態であることを確認した後、この分散液を所定の成分濃度（例えばヘモグロビン濃１０ｇ／ｄＬ、ヘム濃度６．２ｍＭ）に調節し、分散液から酸素を除去する。除去方法としては、酸素を含まない窒素またはその他の不活性ガス（アルゴン、ヘリウムなど）に曝して、溶解している酸素を排気させる。この操作をすることによりオキシ型のヘムは酸素を結合していないデオキシ型ヘムに変換させる。このためには、上記酸素輸液剤を硝子瓶などの酸素を透過しない密封性の容器に封入後、容器内でこの気体の気泡を発生させて通気することで溶存酸素を排気する。
【００２９】
溶存酸素濃度は、クラーク式酸素電極を分散液に漬けて酸素分圧をモニターする方法、容器内の気相を採取してこれをガスクロマトグラフィーにて測定する方法、または容器内のヘモグロビンおよびヘムの特徴ある可視もしくは近赤外スペクトルの測定から、オキシ型とデオキシ型の比率を算出する方法により知ることもできる。このようにして得られたデオキシ型の各酸素輸液剤は、酸素を遮断して保存することにより、ヘモグロビンおよびヘムの酸化、また脂質などその他の成分の酸素酸化を抑制することができる。
【００３０】
酸素除去操作後に、溶液中に残存している微量の酸素を更に除去することを目的として、小胞体中、或いは溶液中に適量のチオール類（ホモシステイン、アセチルシステイン、グルタチオンなど）、アスコルビン酸、亜ニチオン酸などのような酸素と反応する試薬を少量溶存させても良い。
【００３１】
上記のようにして得られたデオキシ型の各酸素輸液剤は、酸素を遮断して保存するために、例えば硝子瓶に直接封入したり、アルミニウム／ポリエチレン層状バッグ（ａｌｕｍｉｎｉｚｅｄ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｂａｇ）や、ポリ塩化ビニリデン系、エチレン−ビニルアルコール共重合体系など、酸素透過性が極めて低い材質から成る容器に入れて封入したり、またはプラスチック製バックに封入しこれを更に酸素を透過しない容器に入れる。保存温度は、−２０℃〜６０℃の間で可能であるが、好ましくは４〜２５℃の冷暗所保存をする。以上の操作により、ヘモグロビンおよびヘムの酸化、また脂質などその他の成分の酸素酸化を抑制することができる。
【００３２】
上記の酸素除去に加えて、ヘモグロビン小胞体、リピドヘム小胞体、およびリピドヘム−トリグリセリド小球体の場合は、粒子表面に保存安定度向上のためにポリオキシエチレンを予め結合させるのが好ましい。このためには、ポリオキシエチレンを結合した脂質（ポリオキシエチレン脂質）の分散液を４〜３７℃で添加する。本脂質の疎水性部分は粒子表面の脂質膜中に挿入され、親水性のポリオキシエチレン鎖が水相に伸びた状態で固定される（Ｓａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，　ｖｏｌ．　８，　２３−３０，　１９９７）。操作温度が高いほど導入速度が速いが、冷却して行っても良い。また小胞体の膜成分としてコレステロールを多く含むため、明確な相転移温度は無いが、成分リン脂質の相転移温度以下でも十分に導入される。ポリオキシエチレン脂質のポリオキシエチレン鎖分子量は、１，０００〜２０，０００で良く、導入量は、粒子の外層に面している脂質総量に対して、０．０１〜３ｍｏｌ％、好ましくは０．０５〜０．３ｍｏｌ％導入する。ポリオキシエチレン脂質の疎水性部分はエタノールアミン型リン脂質、コレステロール、アルキル鎖結合グルタミン酸、アルキル鎖結合リジンなどがある。ポリオキシエチレンと脂質部分の結合様式は、エステル結合、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合などがある。ポリオキシエチレンを粒子表面に導入することで保存中の凝集と融合による粒径変化を抑え、またヘモグロビン小胞体の場合、ヘモグロビンをはじめとする内包物の漏出を防ぐことができる。
【００３３】
上記の構成からなる本発明の作用は次の通りである。本発明は、酸素を除去することで酸素輸液剤中のヘモグロビンおよびヘム誘導体の酸化を抑制する。この酸化抑制の効果により、保存中のスーパーオキサイドアニオンや過酸化水素の発生が防止され、従って、ヘムおよびヘム誘導体を担持する脂質分子集合体の酸化および変性が防止される。その結果、脂質分子集合体の物理的安定性が向上し、粒径変化および凝集体の形成が防止されるので、脂質分子集合体からなる酸素輸液剤の保存寿命が向上する。
【００３４】
加えて、分子集合体であるヘモグロビン小胞体、リピドヘム小胞体、およびリピドヘム−トリグリセリド小球体の表面にポリオキシエチレンを導入することにより、これら粒子の脂質分子集合体を更に安定化させることができる。従って、保存中の粒子の凝集と融合による粒径変化や、ヘモグロビンをはじめとする内包物の漏出等を効果的に防止し、酸素輸液剤の保存安定性を更に向上させることができる。
【００３５】
本発明において留意すべきことは、ヘム鉄の二価から三価への酸化と脂質分子集合体構造の不安定性との間には、相互に他を助長する関係が存在することである。即ち、ヘム鉄の酸化に伴って発生したスーパーオキサイドアニオン（Ｏ_２ ⁻）や過酸化水素、およびそれによって生じるフェリルヘモグロビンは、リン脂質等の脂質分子集合体の構成成分を酸化して、脂質分子集合体の崩壊を助長する。また、脂質分子集合体の崩壊は、ヘム鉄の存在環境を悪化させて酸化を助長する可能性がある。本発明はこの点に着目し、ヘムおよびヘム誘導体の酸化抑制と、ヘムおよびヘム誘導体のキャリアである脂質分子集合体の安定化とを同時に達成することにより、従来達成され得なかった酸素輸液剤の室温棚置き保存を可能とする。
【００３６】
なお、アルブミン−ヘム水溶液を用いた酸素輸液剤は溶液の状態で安定であるため、脂質分子集合体構造は採用されない。従って、脂質分子集合体構造の安定化という作用効果とは直接関係はないが、酸素を除去した状態で保存することによりヘムのメト化を防止し、保存性を顕著に向上できる点においては同様である。
【００３７】
得られる脱酸素型の酸素輸液剤は長期保存が可能となるので、医療機関の各部署、救急車、医療機関が無い遠隔地などに常備することにより、必要時に直ちに体内投与することが可能になる。デオキシ型とした各酸素輸液剤は、空気に曝すと直ちに酸素を結合してオキシ型となる。また、デオキシ型のまま静脈内投与しても、先ず肺を通過するときに直ちに酸素と結合してオキシ型となり、末梢にて酸素を放出する。
【００３８】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。
【００３９】
参考例１
無菌的雰囲気において、献血液由来のヒト赤血球から精製して得た高純度ストロマフリーヘモグロビン溶液（４０ｇ／ｄＬ）に、ピリドキサル　５’−リン酸を、ヘモグロビンに対して３倍モルとなるように添加した。また、ホモシステインを濃度５ｍＭとなるように添加し、更に１Ｍ−Ｎａ_２ＣＯ_３によりｐＨを７．４とした。Ｒｅｍｏｌｉｎｏ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて孔径０．２２μｍのＦＭミクロフィルター（富士フィルム）で濾過し、仕込みヘモグロビン溶液を得た。次いで、混合脂質粉末Ｐｒｅｓｏｎｅ　ＰＰＧ−Ｉ（ホスファチジルコリン／コレステロール／ホスファチジルグリセロールの混合物）を脂質濃度が４．５ｗｔ％となるように少量ずつ添加し、４℃で終夜撹拌して、ヘモグロビン内包多重層小胞体を得た。Ｒｅｍｏｌｉｎｏを用いたエクストルージョン法により、これら小胞体の粒径及び被覆総数の制御を行った。ステンレス製焼結板（孔径１０μｍ）を使用し、ＦＭミクロフィルターを孔径３，　０．８，　０．６５，　０．４５，　０．３，　０．２２μｍの順に使用した。得られたヘモグロビン小胞体溶液を生理食塩水で希釈し、超遠心分離（５０，０００ｇ，　４０　ｍｉｎ）後に上澄みヘモグロビン溶液を吸引除去した。
【００４０】
生理食塩水に溶解させたポリオキシエチレン結合脂質、Ｎ−（モノメトキシポリオキシエチレン−カルバミル）ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン［Ｎ−（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ　ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｃａｒｂａｍｙｌ）ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａ　ｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ］（ポリオキシエチレン鎖の分子量は５３００）を、小胞体外表面の脂質の０．３ｍｏｌ％分に対応する量で滴下した。これを２５℃で２時間撹拌した後、４℃で終夜撹拌して、ヘモグロビン小胞体の表面をポリオキシエチレンで修飾した。
【００４１】
円筒型フラスコにヘモグロビン小胞体分散液（０．５ｇ／ｄＬ，　２００ｍＬ）を入れ、これをロータリーエバポレータに装填して回転（５６　ｒｐｍ）させた。これによって形成された液膜に、ハロゲンランプ（５００Ｗ）を用いて酸素通気下（１Ｌ／ｍｉｎ）で３分間可視光を照射し、一酸化炭素結合ヘモグロビン（ＨｂＣＯ）からオキシヘモグロビン（ＨｂＯ_２）への配位子交換を行った。該分散液を超遠心分離（５０，０００ｇ，　６０　ｍｉｎ）してヘモグロビン小胞体粒子を沈降させ、外水相生理食塩水を除去した後、分散媒としてリン酸緩衝生理食塩水を加えて再分散させた。ヘモグロビン濃度を１０ｇ／ｄＬとし、Ｄｉｓｍｉｃ−２５：　０．４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）で濾過して、ポリオキシエチレン修飾ヘモグロビン小胞体を得た。
【００４２】
上記で得たポリオキシエチレン修飾ヘモグロビン小胞体分散液３０ｍＬを、１００ｍＬ容量のバイアル瓶に入れて密封した。滅菌ディスクフィルターを通し更に水蒸気飽和させた窒素ガスを瓶内に導き、小胞体分散液中でバブリングさせて、溶解している酸素を除去した。系内の酸素分圧をクラーク型酸素電極（酸素分圧測定装置，　＝Ｐｏ_２−１００，　Ｉｎｔｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ）によってモニターしたところ、酸素分圧が１ｍｍＨｇまで低下した。この操作により、オキシヘモグロビンはデオキシヘモグロビンに変換されたと判断した。
【００４３】
こうして得られた本発明の酸素輸液剤について、保存試験を行った。保存条件としては冷蔵保存（４℃）、室温保存（２３℃）、恒温槽保存（４０℃）を設定し、それぞれの試料について１年後まで、以下の測定を行って保存前の試料と比較した。
【００４４】
▲１▼試料３０μＬを生理食塩水で１００倍に希釈し、室温において１　ｍｍセルを用いて３００〜９００ｎｍまで紫外可視吸収スペクトル測定を行った。保存前の試料と比較して、新たな吸収極大の出現の有無や、Ｑ帯ピークの出現波長のずれについて検討した。
【００４５】
▲２▼試料の沈澱形成の有無を目視により確認した。また試料３０μＬを生理食塩水で１０倍に希釈し、室温において１ｍｍセルを用いて９００ｎｍの吸光度を測定した。生理食塩水の９００ｎｍの吸光度をリファレンスとして差し引き、試料の濁度とした。
【００４６】
▲３▼試料約０．２ｍＬをりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２００倍に希釈し、超遠心分離（１００，０００ｇ，　１５ｍｉｎ）を行った後、上澄み液のヘモグロビン定量を行って溶血の有無を確認した。
【００４７】
▲４▼粒径分布は、２５℃において、Ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏｎ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ａｎａｌｙｚｒ　Ｍｏｄｅｌ　Ｎ４−ＳＤ　（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）を用いて動的光散乱法により測定した。
【００４８】
▲５▼Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｄｕｃｔｓ　Ｃｏ．）を用いて酸素結合解離曲線を測定し、その解析から酸素親和度（Ｐ_５０）、酸素運搬効率（ＯＴＥ）、Ｈｉｌｌ係数を算出した。
【００４９】
▲６▼脂質の分解を検討するため、試料約０．２ｍＬを凍結乾燥させた後、ＣＨＣｌ_３により脂質を抽出し、展開溶媒としてクロロホルム／メタノール／２８％アンモニア＝１３／７　／１（容量比）　および、クロロホルム／アセトン／メタノール／酢酸／水＝１０／４／２　／２／１（容量比）を用いて二次元薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート）を測定した。
【００５０】
▲７▼試料約０．２ｍＬを凍結乾燥させた後で、約１ｍＬのＣＤＣｌ_３により膜成分を抽出し、フィルター濾過した後、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＪＮＭ−ＬＡ５００、日本電子）を測定した。また外水相に遊離したポリオキシエチレン鎖を除去するため、試料約０．２　ｍＬをＰＢＳで約２００倍に希釈し、超遠心分離（１００，０００ｇ，　１５ｍｉｎ）を行って上澄み液を除去した。沈澱をＰＢＳで再分散させた後で凍結乾燥させ、約１ｍＬのＣＤＣｌ_３により膜成分を抽出し、フィルター濾過をした後に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。ポリオキシエチレン脂質のポリオキシエチレン鎖メチレン基プロトンのピークは、δ：３．６３ｐｐｍに、ホスファチジルコリンのコリンメチルプロトンのピークはδ：３．３９ｐｐｍに出現する。各々のプロトン数の比が積分比Ｂ／Ａに等しいとして、ポリオキシエチレン鎖の導入率は次式に従って算出した。
【００５１】
（外水相除去後の積分比Ｂ／Ａ）÷　（仕込みの積分比）×１００　　　　。
【００５２】
図１に、保存中におけるヘモグロビン小胞体分散液の諸物性値の推移を示す。いずれの試料についても、１年の保存期間中に、紫外可視吸収スペクトルにおけるメト体由来の６３０ｎｍの新たなピークの出現、Ｑ帯およびＳｏｒｅｔ帯の吸光度の変化、および波長のずれはいずれも確認されなかった。また溶血は認められず、二次元薄層クロマトグラフィーにおいて遊離の脂肪酸は観察されなかった。いずれの試料においても、保存６カ月後では、凝集による沈澱は観測されず、粒径や濁度も殆ど変化しなかった。また、４０℃・６カ月後のポリオキシエチレン鎖の導入率は、保存前と比較して７％程度の低下に留まった。Ｐ_５０の減少傾向は、４０℃・６カ月後でも保存前と比較して５．５Ｔｏｒｒの減少に過ぎず、この程度の減少ではヘモグロビン小胞体の酸素運搬機能に問題は無いと判断された。しかし４０℃・１年後では、脂質の分解と、Ｐ_５０が４３Ｔｏｒｒにまで増大する現象が観測された。保存後の初期メト化率はいずれの試料においても低下し、保存１カ月後までには１％未満となる傾向が認められた。これはホモシステインにより酸化型メトヘモグロビンが還元されたためである。以上から、窒素雰囲気下ではポリオキシエチレン鎖で表面修飾したヘモグロビン小胞体は、４０℃では６カ月間、２３℃では１年間は棚置き保存が可能であることが判明した。
【００５３】
参考例２
ポリオキシエチレン修飾をしていないヘモグロビン小胞体分散液を参考例１と同様に調製し、バイアル瓶に入れて密封し、滅菌ディスクフィルターを通した窒素をバブリングさせて通気し、溶解している酸素を完全に除去した。系内の酸素分圧を酸素分圧測定装置（Ｐｏ_２−１００，　Ｉｎｔｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌｓ社）でモニターし、２　Ｔｏｒｒにまで低下したことを確認した。この操作により、オキシヘモグロビンはデオキシヘモグロビンにほぼ変換された。
【００５４】
こうして得られた比較例酸素輸液剤について保存試験を行った。保存条件として冷蔵保存（４℃）、室温保存（２３℃）、恒温槽内保存（４０℃）を設定し、それぞれの試料について６カ月後まで以下の測定を行い、保存前の試料と比較した。試料の沈澱形成の有無を目視により確認した。また試料３０μＬを生理食塩水で１０倍に希釈し、室温において１ｍｍセルを用いて９００ｎｍの吸光度を測定した。生理食塩水の９００ｎｍの吸光度をリファレンスとして差し引き、試料の濁度とした。粒径分布測定は、２５℃において、Ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏｎ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　Ｎ４　ＳＤ　（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）を用いて動的散乱法により測定した。
【００５５】
メトヘモグロビン含量の増大は全く認められず、保存１カ月後はほぼ一定に推移した。粒径の増大についは、保存１週間後には８％程度増大して凝集による沈澱も若干観察されたが、未だ使用可能な状態であった。これに対して、酸素除去を行わなかった場合には、保存１週間後には最早使用不能な状態にまで沈殿を生じるから、酸素除去がヘモグロビン小胞体の安定化にも寄与したことが分かる。
【００５６】
しかし、参考例１の結果との比較においては、いずれの試料も保存に伴って粒径が急激に増大している。この結果は、ヘモグロビン小胞体の表面をポリオキシエチレンで修飾することと、無酸素の条件下で保存することとが相乗的に作用して、更に顕著な保存安定性が得られたことを示している。
【００５７】
参考例３
参考例１と同様にして調製したポリオキシエチレン修飾ヘモグロビン小胞体分散液（ポリオキシエチレンの分子量は２０００）を参考例１記載の方法と同様に調製した。このデオキシ体を窒素雰囲気下でアルミニウムバッグ（Ａｌｕｍｉｎｉｚｅｄ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｂａｇ，　ジーエルサイエンス社製）の中に移して酸素を遮断し、冷蔵保存（４℃）、室温保存（２３℃）、恒温槽内保存（４０℃）を行った。それぞれの試料について１年後まで参考例１と同様の測定を行い、同様の結果を得た。
【００５８】
参考例４
参考例１の調製法に記載のホモシステインをグルタチオンに換え、またポリオキシエチレン脂質のポリオキシエチレン鎖分子量を１０，０００とし、同様にしてポリオキシエチレン修飾ヘモグロビン小胞体分散液（５０ｍＬ）を調製した。これを円筒型フラスコ（２Ｌ）に入れ、ロータリーエバポレータに装填して回転（６０ｒｐｍ）させることにより生じるヘモグロビン小胞体分散液の液膜に窒素を通気（１．０Ｌ／ｍｉｎ）し、酸素を除去した。近赤外非侵襲酸素モニタ（ＯＭ−２００型、島津）によって、全ヘモグロビンの９８％以上がデオキシヘモグロビンであることを確認した。これを凍結保存用パックＣｒｙｏｃｙｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ）に密封し、更にこれをアルミ缶に封入して酸素の透過を遮断し、保存試験を行った。保存条件としては、冷蔵保存（４℃）、室温保存（２３℃）、恒温槽内保存（４０℃）を設定し、それぞれの試料について１年後まで参考例１と同様の測定を行い、同様の結果を得た。
【００５９】
参考例５
リピドヘム小胞体分散液の調製には、リピドヘム（５，１０，１５，２０−テトラキス［α，α，α，α−ｏ−｛２’，２’−ジメチル−２０’（２”−トリメチルアンモニオエチル）ホスホナトキシエイコサナミド｝−フェニル］ポルフィナト鉄（ＩＩ））／１−ステアリルイミダゾール／ジパルミトイルホスファチジルコリン／コレステロール／ポリオキシエチレン型リン脂質（Ｎ−（モノメトキシポリオキシエチレンカルバミル）ジホスファチジルエタノールアミン）を、モル比１／３／４０／２０／２．５で用いた。ポリオキシエチレン鎖の平均分子量は５０００とした。これに生理食塩水を添加して、リピドヘム濃度を５ｍＭとした溶液を調製した。これを参考例１記載のエクストルージョン法により粒径の制御を行った後、アスコルビン酸を６ｍＭ添加して硝子容器に封入した。参考例１と同じ方法で窒素を通気することにより、三価鉄のヘムは全て還元されて二価鉄のヘムとなり、また酸素分圧は３Ｔｏｒｒにまで低下し、容器内はほぼデオキシ型のリピドヘム小胞体となった。これを室温にて３カ月保存した後の分析では、三価鉄ヘムの増大は認められなかった。また、粒子径は保存前の４２±２１ｎｍに対して、保存後は４５±２８ｎｍであり、殆ど変化は見られなかった。濁度の上昇は特に認められなかった。
【００６０】
参考例６
リピドヘム−トリグリセリド小球体分散液の調製は、リピドヘム（５，１０，１５，２０−テトラキス［α，α，α，α−ｏ−｛２’，２’−ジメチル−２０’（２”−トリメチルアンモニオエチル）ホスホナトキシエイコサナミド｝−フェニル］ポルフィナト鉄（ＩＩ））／１−ステアリルイミダゾール（モル比１／２．５）に、大豆油（［大豆油］／［ヘム］＝２〜４重量比）を添加し、更に２％グリセリン水溶液を加えた後、窒素雰囲気下において水浴下で超音波撹拌することにより行った。この分散液に平均分子量２０００のポリオキシエチレン結合脂質（Ｎ−（モノメトキシポリオキシエチレンカルバミル）　ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）を、リピドヘムに対して０．０２ｍｏｌ％添加してポリオキシエチレン修飾した。分散液１８０ｍＬを２００ｍＬの硝子容器に小過剰のアスコルビン酸と共に封入し、参考例１記載の方法と同様にして窒素バブルして酸素分圧を２Ｔｏｒｒにまで低下させ、デオキシ型のリピドヘム−トリグリセリド小球体を得た。これを室温にて４カ月間保存した後の分析では、鉄三価のヘムの増大は認められず、また粒子径は保存前の８５±２５ｎｍに対して、保存後８６±２８ｎｍであり、殆ど変化は見られなかった。
【００６１】
実施例１
アルブミン−ヘムの調製は、ヘム誘導体（２−［８−｛Ｎ−（２−メチルイミダゾリル）｝オクタノイロキシメチル］−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバラミド）フェニルポルフィナト鉄（ＩＩ））とヒト血清アルブミンをもとに、既報に従って行った（小松ら、人工血液，　ｖｏｌ．６，　１１０−１１４，　１９９８）。ヘムが二価鉄の状態で酸素を結合していることを確認した後、アルブミン−ヘム溶液を硝子容器に封入し、参考例１に記載の方法で窒素を通気することにより酸素分圧を３Ｔｏｒｒにまで低下させて、デオキシ型のアルブミンヘムを得た。これを２０℃にて５カ月間保存した後の分析では、三価鉄のヘムの増大は認められず、不溶物の増大は認められなかった。
【００６２】
参考例７
参考例１と同様にして調製したポリオキシエチレン修飾ヘモグロビン小胞体分散液の酸素分圧を、無菌的雰囲気下において、大気と同じ１４９Ｔｏｒｒとした。これをバイアル瓶に密封し、酸素除去を行うことなく、オキシヘモグロビンのままで恒温槽内保存（４０℃）を行った。保存１，４，２４時間後にメト化率を紫外可視吸収スペクトルから測定した。保存に伴ってメト化率は上昇し、保存前の２．７％から保存１時間後には５％に、保存４時間後には１２％に、保存２４時間後には３６％に増大した。
【００６３】
この結果は、ポリオキシエチレン修飾したヘモグロビン小胞体分散液でも、酸素を除去しない場合にはメトヘモグロビンの増大が著しく、本発明と同様の保存安定性が得られないことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリオキシエチレン修飾デオキシ型ヘモグロビン小胞体の保存安定度を示した図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for long-term storage of an oxygen infusion, an oxygen infusion suitable for long-term storage, and a method for producing the oxygen infusion.
[0002]
The oxygen infusion of the present invention can be applied to a wide range of applications in medicine and pharmacy, and is used in clinical treatment as a blood substitute as it is or in the state of adding an additive as needed, similarly to blood for blood transfusion.
[0003]
[Prior art]
Current transfusion systems that inject human blood into blood vessels have identified the following problems:
1) Possible infection (hepatitis, AIDS virus, etc.);
2) shelf life of red blood cells is 3 weeks;
3) With the advent of an aging society, the proportion of elderly patients among transfused patients will increase, while the total number of healthy blood donors will continue to decrease. May not be met;
4) Risk of contamination during storage;
5) Not applicable to patients who reject blood transfusions for religious reasons;
6) Inability to supply large quantities in response to emergency demand during a disaster.
[0004]
Therefore, there is a great demand for a substitute that can respond immediately regardless of blood type, and as one of them, infusion preparations such as electrolyte infusion and colloid infusion have been widely used. However, since these infusion preparations do not have the most important function of blood, that is, the function of replacing red blood cells that transport oxygen, the development of oxygen infusions (artificial red blood cells) that can also replace this oxygen transport function is extremely important. It has become important. As a conventional oxygen infusion agent, a perfluorocarbon derivative shows high oxygen solubility, and thus an oxygen infusion agent in which the perfluorocarbon derivative is suspended is known, and clinical trials on this are currently in progress. In addition, the development of oxygen infusions using hemoglobin (human hemoglobin, bovine hemoglobin, and recombinant hemoglobin), which is a hemoprotein that has the ability to bind and dissociate oxygen, has been developed, and intramolecularly crosslinked hemoglobin, water-soluble polymer Clinical trials of conjugated hemoglobin, intermolecularly crosslinked polymerized hemoglobin, and the like are ongoing in Europe and the United States, but various side effects due to non-cellular structures have been revealed.
[0005]
The following can be considered as reasons why hemoglobin (Hb) is originally enveloped in the erythrocyte membrane:
1) To suppress the effects of high viscosity and oncotic pressure due to 35% concentrated Hb solution;
2) containment of highly bioactive hemoglobin in the membrane to suppress its deviation;
3) maintaining various phosphate and glycolytic / reductase systems in the same system for maintaining Hb function; and
4) The blood cell dispersion system is a non-Newtonian fluid, and has the advantage of exhibiting a physiological effect by a characteristic flow form in the circulation in the body (particularly, peripheral blood vessels).
[0006]
Considering the essential role of the red blood cell structure as described above, it is clear that a hemoglobin-encapsulated particle dispersion is appropriate as an oxygen infusion agent. On the other hand, it has been discovered that phospholipids, which are biological components, alone form vesicle structures, and since Djjordevich and Miller began studying hemoglobin vesicles using liposomes composed of phospholipids / cholesterol / fatty acids, many studies have been conducted. Hemoglobin endoplasmic reticulum research has been promoted by these institutions. The use of hemoglobin endoplasmic reticulum is 1) that natural hemoglobin can be used as it is, 2) that side effects derived from hemoglobin can be suppressed, 3) viscosity, oncotic pressure, and oxygen affinity can be adjusted to arbitrary values. There are advantages such as a longer residence time in blood.
[0007]
It is well known to those skilled in the art that heme (protoporphyrin IX), which is the oxygen binding site of hemoglobin, deviates from globin and simultaneously loses oxygen binding ability. The role of the steric framework for building globin chains and the importance of hydrophobic field Was well recognized. Therefore, efforts have been made to develop a system that can substitute the function of globin. The present inventors have studied various porphyrin derivatives and found that lipidheme (heme-binding lipid) having the ability to reversibly bind oxygen in an aqueous phase system: 5,10,15,20-tetrakis [α, α, α , Α-o- {2 ′, 2′-dimethyl-20 ′ (2 ″ -trimethylaminoethyl)} phosphonatoeicosanamide} -phenyl] porphinatoiron (II) [5,10,15,20-tetrakis [α , Α, α, α-o- ｛2 ', 2'-dimethyl-20' (2 "-trimethylammonioethyl) phosphonat-oxyeicosanamidido｝ -phynyl] porphynatato iron (II)] and other compounds were successfully synthesized. In a lipid hem vesicle constituted by mixing this lipid heme with a phospholipid and dispersing it in an aqueous phase, the lipid heme is embedded in the hydrophobic field of the phospholipid membrane and is dispersed and oriented. It has been observed that lipidheme vesicles having a uniform particle size in the aqueous phase dispersion system are capable of reversible oxygen coordination, similar to hemoglobin in erythrocytes under physiological conditions. Thus, this aqueous phase, which has the same heme concentration as blood and has a red color, was born as an oxygen infusion by total synthesis (E. Hasegawa, @et. @Al., \ Biochem. \ Biopsys. Res. \ Commun. \ Vol. 105, \ 1416). -1419, @ 1982). An animal administration test was also performed in detail, and a resuscitation test of a bleeding shock model dog confirmed oxygen carrying capacity according to the heme concentration. The oxygen-transporting ability of lipid heme-triglyceride vesicles in which lipid droplets of a nutritional oil (refined soybean oil, triglyceride) are covered with lipid heme has also been confirmed (Komatsu et al., Artificial Organs, vol. # 22, 550-553). 1993). Also, a heme derivative, 2- [8- {N- (2-methylimidazolyl)} octanoyloxymethyl] -5,10,15,20-tetrakis (α, α, α, α-o-pivalamide) phenyl Porfinatoiron (II) (2- [8- {N- (2-methylimidazole)} octanoyloxymethyl]}-5,10,15,20-tetrakis (α, α, α, α-o-pivalamido) phenylporironatoiron II ) Is adsorbed to the hydrophobic pocket of human-derived albumin or recombinant albumin (referred to as albumin-heme), and its oxygen carrying ability has been confirmed (E. Tsuchida, et al., Bioconjugate Chemistry, vol. , $ 534-538, $ 1997).
[0008]
At first, the development of oxygen infusions in Europe and the United States was colored for military purposes, but in the post-Cold War medical setting, it is not only intended for bleeding shock resuscitation, but also for various purposes (preoperative blood dilution, extracorporeal Applications in circulation, sickle cell anemia, stroke, organ preservation, vasopressors, carbon monoxide poisoning, cancer treatment, liquid ventilation, veterinary clinical care, etc.) are considered. In addition, the development of blood donation and transfusion systems has been delayed, and there is a great demand in developing countries where blood for transfusion is chronically in short supply. In Japan, this research is being promoted because of the effective use of expired red blood cells.
[0009]
As a storage form of the oxygen infusion agent, refrigerated storage, frozen storage, and storage in a lyophilized powder state are known. In general, the structure of phospholipid vesicles is unstable, and heme, which is the oxygen-binding site of oxyhemoglobin and oxy-type heme derivatives, is susceptible to oxidation. Therefore, when the oxygen infusion is refrigerated and stored, the particles cannot coagulate and fuse, or the constituents are oxidized, causing degradation reactions such as the formation of lipid peroxides and the formation of oxidized forms of methemoglobin and heme derivatives. In some cases.
[0010]
In the hemoglobin endoplasmic reticulum and lipid heme endoplasmic reticulum, a polymerizable phospholipid is used as a component of the endoplasmic reticulum, and the vesicle structure can be extremely stabilized by polymerizing the component by irradiation with γ-rays or ultraviolet rays. In this case, the dispersion liquid can be rapidly frozen in liquid nitrogen for long-term storage. There is no leakage of hemoglobin, no change in particle size, and no change in the oxygen-binding dissociation curve even after repeated freeze-thawing 10 times (Satoh et al., ASAIO Journal, vol. 38, M580-M584, 1992). . Further, a powder obtained by adding a sugar such as maltose or sucrose to this system and freeze-drying is extremely stable. For example, in the case of hemoglobin endoplasmic reticulum, after storing at 4 ° C. for 20 weeks, physical properties analysis after adding and re-dissolving with pure water showed no increase in methemoglobin content, no leakage of hemoglobin, and no hemoglobin leakage. It has been confirmed that the particle size of the endoplasmic reticulum does not change and is substantially the same as that before freeze-drying (Wang et al., Polymer Adv. Technol., Vol. 4, 8-11, 1992).
[0011]
Methods of introducing polyoxyethylene-bound lipids onto the surface of phospholipid vesicles are well known. The purpose is to efficiently transport the encapsulated anticancer drug to the tumor tissue by extending the residence time in the blood, and the clinical trial has already reached the final stage, and its safety has been sufficiently recognized. In addition, there is a report that polyoxyethylene is bonded to the surface of hemoglobin vesicles for the purpose of suppressing the interaction between hemoglobin vesicles and proteins in blood (protein adsorption inhibitor on liposome surface, published patent Publication, Hei 3-218309; liposome and its production method, published patent publication, Hei 7-20857). It has also been confirmed that surface modification with polyoxyethylene improves blood flow dynamics in blood (Sakai et al., Bioconjugate Chemistry, vol. 8, vol. 23-30, 1997). However, it has not been known to use this polyoxyethylene modification method for preserving an oxygen infusion.
[0012]
Hemoglobin, lipid heme, and heme derivatives are obtained by using iron, which is the central element of the heme, as ferrous iron (Fe²⁺), Oxygen reversibly binds, whereas oxidized ferric iron (Fe³⁺), There is no oxygen binding ability. In the case of a divalent iron complex to which oxygen is bonded, a superoxide anion (O₂ ⁻) Is liberated and gradually autoxidized, becoming trivalent iron (meth), and losing its oxygen binding ability. Furthermore, since heme and iron ions are easily released from the met form, there is a concern that the living body may be adversely affected. As a method of suppressing the oxidation reaction, it is possible to simply reduce the reaction rate by refrigerated storage, but trivalent iron gradually increases. As a countermeasure against this, a method of adding an enzyme that eliminates active oxygen such as methemoglobin reductase system originally present in red blood cells and catalase and superoxide dismutase is also known. In addition, carbon monoxide (CO) having an affinity 200 times higher than that of oxygen for hemoglobin and a heme derivative can be bound to maintain the state of ferrous iron, and oxidation can be suppressed for an extremely long time.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
The conventional storage methods of oxygen infusion agents (hemoglobin vesicles, lipidhem vesicles, lipidheme-triglyceride microspheres, albumin-heme, etc.) have the following problems and are not suitable for the original development purpose of oxygen infusion agents .
[0014]
The storage form includes cryopreservation and storage as a lyophilized powder. However, the frozen body takes time and effort to thaw it, and when dissolving the powder, it takes time to dissolve, and in addition, it involves the trouble that bubbles need to be removed because bubbles are generated. And other problems have been pointed out. Therefore, cryopreservation and lyophilized powder storage are not preferred.
[0015]
In the method of adding a methemoglobin reductase system or an active oxygen scavenging enzyme, the enzyme activity may be reduced during long-term storage and may not take a certain value. When the oxygen infusion is stored in a carbon monoxide atmosphere under refrigeration, the state of ferric iron in heme is maintained and the oxidation reaction to ferric iron is suppressed, but a large amount of carbon monoxide is harmful. Since there is no oxygen binding ability unless the bound carbon monoxide is removed, the administration cannot be performed as it is. In refrigerated storage after conversion to the oxy form, oxidation to the ferric iron state gradually progresses, and the oxygen carrying capacity is significantly reduced. The correlation between the oxygen partial pressure of hemoglobin in the ferrous state and the oxidation rate is well known, and it has been experimentally confirmed that the oxidation reaction does not proceed in the deoxyhemoglobin vesicle (Sakai et al., Bull. Chem.). @ Soc. @ Jpn., 1994, 1120-1125; Takeoka et al., Bioconjugate Chem., Vol. 8, 539-544, 1997).
[0016]
Further, even if the oxidation reaction of hemoglobin and heme derivatives is suppressed, there is another obstacle to the preservation of oxygen infusions. That is, as in the hemoglobin vesicle, lipidheme vesicle, lipidheme-triglyceride microsphere, the structure of the lipid molecule aggregate forming the surrounding environment of heme, the interaction force between the component molecules (hydrophobicity) does not go through a covalent bond. Sexual interactions, electrostatic interactions, hydrogen bonding, etc.), and is often unstable. When dispersed in physiological saline and stored refrigerated, aggregates are gradually formed and fused to reduce the particle size. Since it changes, some sort of structural stabilization has been desired.
[0017]
The present inventors have been conducting systematic research on oxygen infusions for many years, but as a result of earnestly working to establish technical means for long-term storage at room temperature of oxygen infusions, It has solved the problems and achieved the task.
[0018]
[Means for Solving the Problems]
The above object is a method for storing an oxygen infusion agent comprising a lipid molecule aggregate dispersed in an aqueous medium and an aqueous dispersion containing heme or a heme derivative contained in the lipid molecule aggregate:
This is achieved by a method for preserving an oxygen infusion agent, characterized in that the oxygen is removed from the aqueous dispersion, and the heme or heme derivative is deoxy-type.
[0019]
According to another aspect of the present invention, there is provided a method for storing an oxygen infusion comprising an aqueous solution containing albumin-heme, comprising:
Removing oxygen from the aqueous solution to render the heme or heme derivative into a deoxy form;
A method for storing an oxygen infusion agent is provided, wherein the aqueous solution from which oxygen has been removed is stored in an inert gas atmosphere.
[0020]
According to another aspect of the present invention, there is provided an oxygen infusion agent comprising a lipid molecule aggregate dispersed in an aqueous medium and heme or a heme derivative contained in the lipid molecule aggregate:
The lipid molecule aggregate surface is modified with polyoxyethylene;
The heme or heme derivative is of the deoxy type;
The oxygen infusion agent excellent in long-term storage characteristics is provided, wherein the oxygen infusion agent is filled in an oxygen-impermeable container filled with an inert gas.
[0021]
According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing an oxygen infusion agent comprising a lipid molecule aggregate dispersed in an aqueous medium and an aqueous dispersion containing heme or a heme derivative contained in the lipid molecule aggregate. There:
Preparing an aqueous dispersion of the lipid molecule aggregate having a surface modified with polyoxyethylene and containing the heme or heme derivative;
Removing said oxygen from said aqueous dispersion to render said heme or heme derivative deoxy-type;
The heme or heme derivative is stored in a deoxy-type aqueous dispersion in an oxygen-impermeable container, and the container is filled with an inert gas. A method for producing an oxygen infusion is provided.
[0022]
According to yet another aspect of the present invention, there is provided a method for producing an oxygen infusion comprising an aqueous solution containing albumin-heme, comprising:
Preparing an aqueous solution containing albumin-heme;
Removing the oxygen from the aqueous solution to convert the heme or heme derivative into a deoxy form;
A method for producing an oxygen infusion agent, comprising the steps of: accommodating a deoxy-type aqueous solution of the heme or heme derivative in an oxygen-impermeable container, and filling the container with an inert gas. Is done.
[0023]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention. The “lipid molecular assembly” is constituted by interactions between molecules (hydrophobic interaction, electrostatic interaction, hydrogen bond, etc.) in an aqueous medium without intervening covalent bonds by lipids and / or lipoproteins. Refers to the film structure that has been made. Typically, they include vesicles (liposomes) and microspheres (microspheres), but in a broad sense also include cell membranes such as erythrocyte membranes. Furthermore, hemoglobin endoplasmic reticulum, lipidheme endoplasmic reticulum, and lipidheme-triglyceride microsphere are also typical examples of the endoplasmic reticulum composed of lipid molecule aggregates.
[0024]
In the present invention, “heme or a derivative thereof” includes not only heme but also all heme derivatives in which the porphyrin ring of heme has been modified and which have a reversible binding ability to oxygen.
[0025]
The "aqueous medium" in the present invention includes water and all physiologically acceptable aqueous solutions, such as aqueous electrolyte solution, buffer solution, aqueous protein solution, aqueous lipid emulsion solution, plasma and combinations thereof.
[0026]
The inert gas in the present invention means a chemically inert gas, and includes, for example, nitrogen in addition to rare gases such as helium, argon, and neon. Nitrogen gas is preferred for economic reasons.
[0027]
Next, the configuration of the present invention will be described in detail as follows.
[0028]
Hemoglobin microspheres (Sakai et al., Biotechnology Progres, Vol. 12, Vol. 119-125, 1996), lipidhem vesicles (E. Hasegawa, et al., Biochem. Biol. Biol. Biol. Biol. Biol. Biol. Biol. Lipidheme-triglyceride endoplasmic reticulum (Komatsu et al., Artificial organs, vol. 22, 550-553, 1993), and albumin-heme (E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chemistry.8). 534-538, 1997), after confirming that heme is in a divalent state of iron, Dispersion liquid is adjusted to a predetermined component concentration (e.g. hemoglobin conc 10 g / dL, heme concentration 6.2 mM), to remove oxygen from the dispersion. As a removal method, dissolved oxygen is evacuated by exposing to oxygen-free nitrogen or other inert gas (argon, helium, or the like). By performing this operation, oxy-type heme is converted into deoxy-type heme without oxygen. For this purpose, the oxygen infusion agent is sealed in a hermetically sealed container such as a glass bottle that does not allow oxygen to pass through, and then the dissolved oxygen is exhausted by generating gas bubbles in the container and ventilating the gas.
[0029]
The dissolved oxygen concentration can be measured by immersing the Clark-type oxygen electrode in the dispersion to monitor the oxygen partial pressure, collecting the gas phase in the vessel and measuring it by gas chromatography, or hemoglobin and hem in the vessel. It can also be known by measuring the ratio of the oxy-type to the deoxy-type from the measurement of the visible or near-infrared spectrum having the above characteristic. Each of the deoxy-type oxygen infusions obtained in this manner can suppress the oxidation of hemoglobin and heme, and the oxygen oxidation of other components such as lipids by storing oxygen in a blocked state.
[0030]
After the oxygen removing operation, an appropriate amount of thiols (homocysteine, acetylcysteine, glutathione, etc.), ascorbic acid, or the like in the endoplasmic reticulum or in the solution for the purpose of further removing a trace amount of oxygen remaining in the solution. A small amount of a reagent that reacts with oxygen, such as nitrous acid, may be dissolved.
[0031]
Each of the deoxy-type oxygen infusions obtained as described above is sealed directly in a glass bottle, for example, in an aluminum / polyethylene layered bag (aluminized polyethylene bag), or polychlorinated, in order to prevent oxygen from being stored. It is sealed in a container made of a material having extremely low oxygen permeability, such as vinylidene or ethylene-vinyl alcohol copolymer, or sealed in a plastic bag and further sealed in a container that does not transmit oxygen. The storage temperature can be between -20 ° C and 60 ° C, but preferably it is stored in a cool and dark place at 4 to 25 ° C. By the above operation, oxidation of hemoglobin and heme, and oxygen oxidation of other components such as lipids can be suppressed.
[0032]
In addition to the above-described oxygen removal, in the case of hemoglobin vesicles, lipidheme vesicles, and lipidheme-triglyceride microspheres, it is preferable to previously bind polyoxyethylene to the particle surface for improving storage stability. To this end, a dispersion of polyoxyethylene-bound lipid (polyoxyethylene lipid) is added at 4-37 ° C. The hydrophobic portion of the present lipid is inserted into the lipid membrane on the particle surface, and is fixed in a state where the hydrophilic polyoxyethylene chain is extended into the aqueous phase (Sakai et al., Bioconjugate Chemistry, vol. 8, 8, 23-30). , @ 1997). The higher the operating temperature, the faster the introduction speed, but the cooling may be performed. Further, since the vesicle contains a large amount of cholesterol as a membrane component, there is no clear phase transition temperature, but it is sufficiently introduced even at a phase transition temperature lower than that of the component phospholipid. The molecular weight of the polyoxyethylene chain of the polyoxyethylene lipid may be from 1,000 to 20,000, and the amount introduced is 0.01 to 3 mol%, preferably 0 to 3 mol%, based on the total amount of lipid facing the outer layer of the particles. 0.05-0.3 mol% is introduced. The hydrophobic portion of the polyoxyethylene lipid includes ethanolamine-type phospholipid, cholesterol, alkyl chain-linked glutamic acid, and alkyl chain-linked lysine. The bonding mode between the polyoxyethylene and the lipid moiety includes an ester bond, a urethane bond, an amide bond, an ether bond, and the like. By introducing polyoxyethylene to the particle surface, it is possible to suppress a change in particle size due to aggregation and fusion during storage, and in the case of hemoglobin vesicles, it is possible to prevent leakage of inclusions such as hemoglobin.
[0033]
The operation of the present invention having the above configuration is as follows. The present invention suppresses the oxidation of hemoglobin and heme derivatives in an oxygen infusion by removing oxygen. Due to this effect of suppressing oxidation, generation of superoxide anion and hydrogen peroxide during storage is prevented, and thus oxidation and denaturation of heme and a lipid molecule aggregate carrying heme derivatives are prevented. As a result, the physical stability of the lipid molecule aggregate is improved, and the change in particle size and the formation of aggregates are prevented, so that the storage life of the oxygen infusion agent comprising the lipid molecule aggregate is improved.
[0034]
In addition, by introducing polyoxyethylene onto the surface of the hemoglobin vesicle, lipidhem vesicle, and lipidheme-triglyceride sphere that are molecular aggregates, the lipid molecular aggregates of these particles can be further stabilized. Therefore, it is possible to effectively prevent a change in particle size due to aggregation and fusion of particles during storage, leakage of inclusions such as hemoglobin, and the like, and further improve storage stability of the oxygen infusion solution.
[0035]
It should be noted in the present invention that there is a mutually beneficial relationship between the divalent to trivalent oxidation of heme iron and the instability of the lipid molecular assembly structure. That is, the superoxide anion (O 2) generated with the oxidation of heme iron₂ ⁻) And hydrogen peroxide, and the resulting ferrylhemoglobin, oxidize the constituents of lipid molecular aggregates such as phospholipids and promote the collapse of lipid molecular aggregates. Further, the disintegration of the lipid molecule aggregate may worsen the environment in which heme iron exists and promote oxidation. The present invention focuses on this point, and simultaneously achieves the inhibition of oxidation of heme and heme derivatives and the stabilization of lipid molecule aggregates that are carriers of heme and heme derivatives, thereby achieving an oxygen infusion agent that could not be achieved conventionally. At room temperature on a shelf.
[0036]
In addition, since the oxygen infusion using the albumin-heme aqueous solution is stable in a solution state, the lipid molecule aggregate structure is not adopted. Therefore, although it is not directly related to the effect of stabilizing the structure of the lipid molecule assembly, it is similar in that storage in a state in which oxygen is removed prevents heme methoxide and can significantly improve the storage stability. It is.
[0037]
The resulting deoxygenated oxygen infusion can be stored for a long period of time, so that it can be administered immediately in the body when needed by keeping it in each department of the medical institution, ambulance, remote place without medical institution, etc. . Each deoxy-type oxygen infusion agent binds oxygen immediately upon exposure to air and becomes oxy-type. Also, even when intravenous administration is performed in the deoxy form, it first binds to oxygen immediately after passing through the lungs to become oxy form and releases oxygen in the periphery.
[0038]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[0039]
Reference Example 1
In a sterile atmosphere, pyridoxal 5'-phosphate is added to a high-purity stromal-free hemoglobin solution (40 g / dL) obtained by purifying human erythrocytes derived from donated blood in a molar concentration of 3 times the amount of hemoglobin. did. Further, homocysteine was added to a concentration of 5 mM, and 1 M-Na was further added.₂CO₃Brought the pH to 7.4. The solution was filtered through an FM microfilter (Fuji Film) having a pore size of 0.22 μm using Remolino (Millipore) to obtain a charged hemoglobin solution. Next, a mixed lipid powder Preson @ PPG-I (a mixture of phosphatidylcholine / cholesterol / phosphatidylglycerol) was added little by little so that the lipid concentration became 4.5 wt%, and the mixture was stirred overnight at 4 ° C. to give hemoglobin-encapsulated multilayer vesicles. Got. The particle size of these vesicles and the total number of coatings were controlled by an extrusion method using Remolino. A sintered plate made of stainless steel (pore diameter: 10 μm) was used, and FM microfilters were used in the order of pore diameter: 3, 0.8, 0.65, 0.45, 0.3, 0.22 μm. The obtained hemoglobin vesicle solution was diluted with physiological saline, and after ultracentrifugation (50,000 g, {40} min), the supernatant hemoglobin solution was removed by suction.
[0040]
Polyoxyethylene-bound lipid dissolved in physiological saline, N- (monomethoxypolyoxyethylene-carbamyl) distearoylphosphatidyl-ethanolamine [N- (monomethyoxy-polyoxyethylene-carbamyl) distearoyl @ phospha @ tidyl-ethyleneoxy ethylene chain] Was added dropwise in an amount corresponding to 0.3 mol% of the lipid on the outer surface of the endoplasmic reticulum. This was stirred at 25 ° C. for 2 hours and then at 4 ° C. overnight to modify the surface of hemoglobin vesicles with polyoxyethylene.
[0041]
A hemoglobin vesicle dispersion (0.5 g / dL, 200 mL) was placed in a cylindrical flask, and the mixture was charged into a rotary evaporator and rotated (56 rpm). The liquid film thus formed was irradiated with visible light for 3 minutes under oxygen ventilation (1 L / min) using a halogen lamp (500 W) to convert carbon monoxide-bound hemoglobin (HbCO) to oxyhemoglobin (HbO).₂) Was performed. The dispersion is subjected to ultracentrifugation (50,000 g, {60} min) to precipitate hemoglobin vesicle particles, remove the saline in the outer aqueous phase, and redisperse by adding phosphate buffered saline as a dispersion medium. I let it. The hemoglobin concentration was adjusted to 10 g / dL, and the mixture was filtered through a Dismic-25: 0.45 μm filter (ADVANTEC) to obtain polyoxyethylene-modified hemoglobin vesicles.
[0042]
30 mL of the polyoxyethylene-modified hemoglobin vesicle dispersion obtained above was placed in a 100 mL vial and sealed. Nitrogen gas further saturated with water vapor was passed through a sterile disk filter, introduced into the bottle, and bubbled in the vesicle dispersion to remove dissolved oxygen. The oxygen partial pressure in the system is measured using a Clark-type oxygen electrode (oxygen partial pressure measuring device, = Po₂-100, {Inter Medical}, the oxygen partial pressure dropped to 1 mmHg. By this operation, it was determined that oxyhemoglobin was converted to deoxyhemoglobin.
[0043]
The thus obtained oxygen infusion solution of the present invention was subjected to a storage test. The storage conditions are refrigerated storage (4 ° C), room temperature storage (23 ° C), and constant temperature bath storage (40 ° C). The following measurements are performed on each sample until one year later and compared with the sample before storage. did.
[0044]
{Circle around (1)} 30 μL of the sample was diluted 100-fold with physiological saline, and the ultraviolet-visible absorption spectrum was measured at room temperature from 300 to 900 nm using a 1 mm cell. Compared with the sample before storage, the presence or absence of a new absorption maximum and the shift of the wavelength of appearance of the Q band peak were examined.
[0045]
{Circle around (2)} The presence or absence of precipitate formation in the sample was visually confirmed. Further, 30 μL of the sample was diluted 10-fold with physiological saline, and the absorbance at 900 nm was measured at room temperature using a 1 mm cell. The absorbance at 900 nm of physiological saline was subtracted as a reference to obtain the turbidity of the sample.
[0046]
{Circle around (3)} About 0.2 mL of the sample was diluted 200-fold with phosphate buffered saline (PBS), ultracentrifuged (100,000 g, @ 15 min), and the hemoglobin of the supernatant was quantified to determine the hemolysis. The presence or absence was checked.
[0047]
{Circle around (4)} The particle size distribution was measured at 25 ° C. by a dynamic light scattering method using a Sub-micron Particle Analyzr Model N4-SD (Coulter Corporation Communications).
[0048]
(5) The oxygen bond dissociation curve was measured using Hemox-Analyzer (TCS Medical Products Co.), and the oxygen affinity (P₅₀), Oxygen transport efficiency (OTE), and Hill coefficient were calculated.
[0049]
{Circle around (6)} In order to examine the decomposition of lipid, about 0.2 mL of the sample was freeze-dried, and₃And chloroform / methanol / 28% ammonia = 13/7/1 (volume ratio) as a developing solvent and chloroform / acetone / methanol / acetic acid / water = 10/4/2/2/1 (volume ratio) ) Was used to measure two-dimensional thin layer chromatography (silica gel plate).
[0050]
{Circle around (7)} After freeze-drying about 0.2 mL of the sample, about 1 mL of CDCl₃After extracting the membrane components by and filtering through a filter,¹1 H-NMR spectrum (JNM-LA500, JEOL) was measured. Further, in order to remove the polyoxyethylene chains released in the external aqueous phase, about 0.2 mL of the sample was diluted about 200 times with PBS, and ultracentrifugation (100,000 g, 15 minutes) was performed to remove the supernatant. . The precipitate was re-dispersed in PBS and then lyophilized, about 1 mL of CDCl₃After extracting the membrane components by filtration and filtering through a filter, the 1H-NMR spectrum was measured. The peak of the polyoxyethylene chain methylene group proton of the polyoxyethylene lipid appears at δ: 3.63 ppm, and the peak of the choline methyl proton of phosphatidylcholine appears at δ: 3.39 ppm. Assuming that the ratio of each proton number is equal to the integration ratio B / A, the introduction ratio of the polyoxyethylene chain was calculated according to the following equation.
[0051]
(Integral ratio B / A after removal of external water phase) {(integral ratio of charge) × 100}.
[0052]
FIG. 1 shows changes in various physical property values of the hemoglobin vesicle dispersion during storage. For each sample, during the storage period of one year, the appearance of a new peak at 630 nm derived from the met form, a change in the absorbance in the Q band and the Soret band, and a shift in the wavelength were confirmed in the ultraviolet-visible absorption spectrum. Did not. No hemolysis was observed, and no free fatty acids were observed in the two-dimensional thin-layer chromatography. In all samples, no precipitate due to aggregation was observed and the particle size and turbidity hardly changed after storage for 6 months. Further, the introduction rate of polyoxyethylene chains after 6 months at 40 ° C. was only about 7% lower than before storage. P₅₀The tendency of decrease was only 5.5 Torr after storage at 40 ° C. for 6 months compared to that before storage, and it was judged that there was no problem in the oxygen carrying function of hemoglobin vesicles with such a decrease. However, after one year at 40 ° C, decomposition of lipids and P₅₀Was observed to increase to 43 Torr. The initial metformation rate after storage decreased in all samples, and tended to be less than 1% by one month after storage. This is because oxidized methemoglobin was reduced by homocysteine. From the above, it was found that hemoglobin vesicles surface-modified with polyoxyethylene chains under nitrogen atmosphere can be stored on shelves at 40 ° C. for 6 months and at 23 ° C. for 1 year.
[0053]
Reference Example 2
A hemoglobin vesicle dispersion liquid not modified with polyoxyethylene was prepared in the same manner as in Reference Example 1, sealed in a vial, and bubbled with nitrogen through a sterilized disk filter, and aerated to remove dissolved oxygen. Was completely removed. The oxygen partial pressure in the system is measured by an oxygen partial pressure measuring device (Po₂-100, {Inter Medical Co., Ltd.), and it was confirmed that the temperature had dropped to 2 Torr. By this operation, oxyhemoglobin was almost converted to deoxyhemoglobin.
[0054]
A storage test was performed on the thus obtained comparative oxygen infusion agent. Refrigerated storage (4 ° C.), room temperature storage (23 ° C.), and storage in a constant temperature bath (40 ° C.) were set as storage conditions. . The presence or absence of precipitate formation in the sample was confirmed visually. Further, 30 μL of the sample was diluted 10-fold with physiological saline, and the absorbance at 900 nm was measured at room temperature using a 1 mm cell. The absorbance at 900 nm of physiological saline was subtracted as a reference to obtain the turbidity of the sample. The particle size distribution was measured at 25 ° C. by a dynamic scattering method using a Sub-micron Particle Analyzer Model N4 SD (Coulter Corporation Communications).
[0055]
No increase in the methemoglobin content was observed at all and remained almost constant after one month of storage. Regarding the increase in particle size, one week after storage, the increase was about 8%, and some precipitation due to aggregation was observed, but it was still in a usable state. On the other hand, when the oxygen was not removed, the precipitate was no longer used after one week of storage, indicating that the oxygen removal also contributed to the stabilization of the hemoglobin vesicle.
[0056]
However, in comparison with the results of Reference Example 1, the particle size of all samples sharply increased with storage. This result indicates that modification of the surface of hemoglobin vesicles with polyoxyethylene and storage under oxygen-free conditions act synergistically, resulting in more remarkable storage stability. ing.
[0057]
Reference Example 3
A polyoxyethylene-modified hemoglobin vesicle dispersion (polyoxyethylene having a molecular weight of 2000) prepared in the same manner as in Reference Example 1 was prepared in the same manner as in Reference Example 1. This deoxy compound was transferred into an aluminum bag (Aluminized polyethylene bag, manufactured by GL Sciences) under a nitrogen atmosphere to cut off oxygen, and was stored refrigerated (4 ° C), stored at room temperature (23 ° C), and stored in a thermostat (40). ° C). The same measurement as in Reference Example 1 was performed on each sample until one year later, and similar results were obtained.
[0058]
Reference example 4
The homocysteine described in the preparation method of Reference Example 1 was replaced with glutathione, and the polyoxyethylene lipid polyoxyethylene chain molecular weight was set to 10,000, and a polyoxyethylene-modified hemoglobin vesicle dispersion (50 mL) was prepared in the same manner. did. This was placed in a cylindrical flask (2 L), charged into a rotary evaporator, and rotated (60 rpm). Nitrogen was passed through the liquid membrane of the hemoglobin vesicle dispersion liquid (1.0 L / min) to remove oxygen. . Near-infrared non-invasive oxygen monitor (OM-200, Shimadzu) confirmed that 98% or more of the total hemoglobin was deoxyhemoglobin. This was sealed in a cryocyte (Baxter) pack for cryopreservation, and further sealed in an aluminum can to block permeation of oxygen, and a storage test was performed. As storage conditions, refrigerated storage (4 ° C.), room temperature storage (23 ° C.), and storage in a constant temperature bath (40 ° C.) were set. Was obtained.
[0059]
Reference example 5
For the preparation of lipidheme vesicle dispersion, lipidheme (5,10,15,20-tetrakis [α, α, α, α-o- ｛2 ′, 2′-dimethyl-20 ′ (2 ″ -trimethylammonio) Ethyl) phosphonatoxyeicosanamide {-phenyl] porphinatoiron (II)) / 1-stearylimidazole / dipalmitoylphosphatidylcholine / cholesterol / polyoxyethylene phospholipid (N- (monomethoxypolyoxyethylenecarbamyl) diphosphatidylethanol Amine) was used in a molar ratio of 1/3/40/20 / 2.5, the average molecular weight of the polyoxyethylene chain was 5000, and physiological saline was added to the solution to adjust the lipid heme concentration to 5 mM. After the particle size was controlled by the extrusion method described in Reference Example 1, 6 mM of boric acid was added and sealed in a glass container, and nitrogen was aerated in the same manner as in Reference Example 1 to completely reduce ferric heme to divalent iron heme, and the oxygen partial pressure was reduced to 3 Torr. And the inside of the container became almost deoxy-type lipid heme vesicles.Analysis after storing this at room temperature for 3 months showed no increase in ferric heme. It was 45 ± 28 nm after storage, compared to 42 ± 21 nm before storage, and almost no change was observed, and no particular increase in turbidity was observed.
[0060]
Reference Example 6
The preparation of lipidheme-triglyceride microsphere dispersion is carried out using lipidheme (5,10,15,20-tetrakis [α, α, α, α-o- ｛2 ′, 2′-dimethyl-20 ′ (2 ″ -trimethylammonium). Oethyl) phosphonatoxyeicosanamide {-phenyl] porphinato iron (II)) / 1-stearyl imidazole (molar ratio 1 / 2.5) and soybean oil ([soybean oil] / [heme] = 2-4 weight) After adding a 2% glycerin aqueous solution, the mixture was ultrasonically stirred in a water bath under a nitrogen atmosphere, and the dispersion was mixed with polyoxyethylene-bound lipid having an average molecular weight of 2,000 (N- (mono)). Methoxypolyoxyethylenecarbamyl) {dipalmitoylphosphatidylethanolamine) was added at 0.02 mol% to lipid heme to obtain polyoxyethylene. 180 mL of the dispersion was sealed in a 200 mL glass container together with a small excess of ascorbic acid, and nitrogen bubbles were bubbled to reduce the oxygen partial pressure to 2 Torr as in the method described in Reference Example 1. Triglyceride microspheres were obtained, which were analyzed after storage at room temperature for 4 months and showed no increase in iron trivalent heme, and had a particle size of 85 ± 25 nm before storage and 86 μm after storage. ± 28 nm, and almost no change was observed.
[0061]
Example 1
The preparation of albumin-heme is based on the heme derivative (2- [8- {N- (2-methylimidazolyl)} octanoyloxymethyl] -5,10,15,20-tetrakis (α, α, α, α-o). -Pivalamide) phenylporphinato iron (II)) and human serum albumin, according to a previous report (Komatsu et al., Artificial blood, vol. 6, 110-114, 1998). After confirming that the heme binds oxygen in the state of ferrous iron, the albumin-heme solution is sealed in a glass container, and nitrogen partial pressure is reduced to 3 Torr by bubbling nitrogen through the method described in Reference Example 1. To obtain a deoxy-type albumin heme. Analysis after storage at 20 ° C. for 5 months showed no increase in heme of ferric iron and no increase in insolubles.
[0062]
Reference Example 7
The oxygen partial pressure of the polyoxyethylene-modified hemoglobin vesicle dispersion prepared in the same manner as in Reference Example 1 was set to 149 Torr as in the atmosphere under a sterile atmosphere. This was sealed in a vial bottle, and stored in a thermostat (40 ° C.) with oxyhemoglobin as it was without removing oxygen. After storage for 1, 4, and 24 hours, the methation ratio was measured from the ultraviolet-visible absorption spectrum. The methation rate increased with storage, increasing from 2.7% before storage to 5% after 1 hour storage, to 12% after 4 hours storage, and to 36% after 24 hours storage.
[0063]
This result indicates that even when the hemoglobin vesicle dispersion liquid modified with polyoxyethylene does not remove oxygen, methemoglobin significantly increases and storage stability similar to that of the present invention cannot be obtained.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the storage stability of polyoxyethylene-modified deoxy-type hemoglobin vesicles.

Claims

A method for storing an oxygen infusion comprising an aqueous solution containing albumin-heme, comprising:
Removing oxygen from the aqueous solution to render the heme or heme derivative into a deoxy form;
A method for storing an oxygen infusion agent, comprising storing the aqueous solution from which oxygen has been removed under an inert gas atmosphere.

2. The method according to claim 1, wherein the removal of oxygen is performed by gas exchange with an inert gas.

An oxygen infusion comprising an aqueous solution containing albumin-heme,
The heme or heme derivative is of the deoxy type;
The oxygen infusion agent, wherein the oxygen infusion agent is contained in an oxygen-impermeable container filled with an inert gas.

The oxygen infusion according to claim 3, further comprising a physiologically acceptable reducing agent.