JP4247361B2 - Temperature sensitive liposome - Google Patents

Description

【００１０】
（式中、R¹は水素原子、以下の式４に示す置換基又はリビングカチオン重合の開始剤として従来公知の化合物から得られる置換基であり、R²は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のハロゲン化アルキル基、炭素数１〜４のエステル基、アルデヒド基、フェニル基、ビフェニル基又は炭素数７〜１４のアラルキル基であり、R³は炭素数4〜30の炭化水素基であり、R⁴は水素原子又は炭素数１〜１０のアルコキシ基又はリビングカチオン重合の停止剤として従来公知の化合物から得られる置換基である。mは5〜５００、nは１〜１０、yは0〜100である。）
【００１１】
【式４】

【００１２】
（式中、Ｘは同一又は異なって、水素原子またはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子である。R¹¹は水素原子、炭素数1〜20のアルキル基、エーテル基、オキシエチレン基又はアリール基である。）
項４． 高分子化合物の感熱応答性部分の数平均分子量が1000〜30000である項１、２又は３に記載の温度感受性リポソーム。
項５． 高分子化合物の数平均分子量が2000〜50000である項１から4のいずれかに記載の温度感受性リポソーム。
項６． 高分子化合物の重量平均分子量／数平均分子量の比率が1〜4である項１から５のいずれかに記載の温度感受性リポソーム。
項７． リポソームの全体重量に対する高分子化合物の重量の比率が30〜60重量％である項１から6のいずれかに記載の温度感受性リポソーム。
項８． 高分子化合物が、リビングカチオン重合により合成されたものである項１から７のいずれかに記載の温度感受性リポソーム。
項９． 内部に目的物質が封入された項1から８のいずれかに記載の温度感受性リポソーム。
項１０． 目的物質が、遺伝子、医薬品、化粧品、香料、香辛料、色素、染料、２液性髪染め料又は脱色剤の１成分、２液性硬化剤の１成分からなる群より選ばれた物質である項9に記載の温度感受性リポソーム。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の温度感受性リポソームは、感熱応答性部分と疎水性部分とを有する高分子化合物を、少なくともその疎水性部分を介してリポソーム膜に保持したリポソームである。
【００１５】
本発明のリポソームにおいて、高分子化合物は、少なくともその疎水性部分がリポソームの脂質２重層内に埋入され、感熱応答性部分が膜外に存在していると考えられる。また、高分子化合物の疎水性部分が非常に小さい場合には、感熱応答性部分が脂質２重層表面と相互作用することにより脂質膜に保持されていると考えられる。
構造等
本発明のリポソームは、粒径0.05〜10μm程度の範囲内であればよく、使用目的に応じて種々の粒径とすることができる。ヒトの血管内に投与する目的の場合には、通常0.05〜0.2μｍ程度、特に0.05〜0.1μm程度であることが好ましい。リポソームの粒径は、従来公知の方法で調節できる。例えばエクストルーダー法でリポソームを調製する場合にはエクストルーダーに装着するフィルターの孔径を調節することにより、任意に設定することができる。リポソームの粒径は、動的光散乱法又は電子顕微鏡観察により測定された値である。
【００１６】
本発明のリポソームは、前記粒径の範囲内であれば、単層リポソームまたは多重層リポソームのいずれであってもよい。
【００１７】
本発明のリポソームは、使用目的によっても異なるが、通常10〜100℃程度、好ましくは20〜80℃程度の温度範囲内で内包物を放出できるものである。使用する脂質によっても異なるが、10〜100℃程度の範囲内であれば、リポソーム自体が不安定になる可能性がない又は低い。内包物の放出温度は、高分子化合物の感熱応答性部分の構造、すなわち親水性部分と疎水性部分の割合及び官能基の種類等を設計することにより、この範囲内で任意に設定できる。ガンや炎症の治療等のためにヒトに投与する目的で用いる場合には、通常40〜45℃程度、特に40〜42℃程度で内包物を放出できるものであることが好ましい。
【００１８】
また、本発明のリポソームは、後述する方法により狭い温度範囲で内包物を放出するものにすることができるが、必ずしも、このように狭い温度範囲で内包物を放出するものでなくてもよい。例えば、芳香剤等を封入したリポソームなどは徐々に芳香剤を放出することが好ましい場合もある。
脂質
本発明のリポソームの主成分は両親媒性の脂質であり、両親媒性の脂質としては、リポソームの膜脂質として従来公知の脂質を用いることができる。このような脂質として、例えばホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、大豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂質が挙げられる。これらのリン脂質において、脂肪酸部分はラウリル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、オレイル、リノイル、リノレイル等の任意の組み合わせとすることができる。これらは単独で又は２以上組み合わせて使用できる。特に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン等が好ましい。
【００１９】
また、遺伝子の運搬体としてのリポソームとする場合には、前記例示したリン脂質の他、従来公知のカチオン性の人工脂質を用いることができる。このようなカチオン性の人工脂質としては、例えばＮ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシルグルタメート、Ｎ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド及び１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン等の第４級アンモニウム塩が挙げられる。これらの脂質は、単独でまたは２以上組み合わせて用いることができる。
【００２０】
リポソームを構成する脂質には、コレステロール、ラノステロール、エルゴステロール等のステロールが含まれていてもよい。
高分子化合物
＜構造＞
温度感受性リポソームに含まれる高分子化合物は、感熱応答性部分を有する高分子化合物である。特に、感熱応答性部分と疎水性部分とを有する高分子化合物であることが好ましい。このような、高分子化合物の種類は特に限定されないが、例えば、水和可能なヘテロ原子を１個以上含む感熱応答性ビニル系モノマーと、疎水性ビニル系モノマーとのブロック共重合体が挙げられる。
【００２１】
水和可能なヘテロ原子としては、酸素原子、窒素原子等が挙げられる。水和可能なヘテロ原子の数の上限は、重合を行える範囲であれば特に限定されない。水和可能なヘテロ原子を含む置換基としては、−CH₂−CH₂−O−、−CO−、―COO―、―CONH―、−NHCOO−等が挙げられる。
【００２２】
また、疎水性ビニル系モノマーとしては、炭素数３〜40個程度、特に炭素数４〜30個程度の各種の脂肪族、脂環族又は芳香族の炭化水素基を有するビニル系モノマーを使用できる。
【００２３】
前記のブロック共重合体において、ヘテロ原子を１個以上含む感熱応答性ビニル系モノマーと疎水性ビニル系モノマーとの共重合比率は、各モノマーの種類によっても異なるが、通常300：1〜3：1程度、特に200：1〜10：1程度が好ましい。この範囲内であれば、高分子化合物をリポソームの膜に安定に保持できる。
＜分子量＞
高分子化合物の数平均分子量のうち感熱応答性部分に該当する量は、特に制限されないが、通常数百〜数十万程度とすればよい。特に、1000〜30000程度、さらに特に10000〜20000程度とすることが好ましく、これにより狭い温度範囲で内包物を放出できるものとなる。
【００２４】
また、この高分子化合物全体の分子量は、特に制限されないが、数平均分子量で、通常数百〜数十万程度とすればよい。この範囲内であれば、脂質膜に安定に保持される。特に2000〜50000程度、さらに特に10000〜20000程度（特に11000〜21000程度）とすることが好ましく、これにより狭い温度範囲で内包物を放出できるものとなる。
【００２５】
また、高分子化合物の分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、通常1〜4程度、特に1.0〜1.5程度であることが好ましい。この範囲内であれば、得られるリポソームが実用上十分に狭い温度範囲で内包物を放出できるものとなる。
【００２６】
本発明において、数平均分子量及び重量平均分子量は、それぞれ実施例に記載の方法により測定した値である。
＜含有量＞
本発明のリポソームにおける高分子化合物の含有量は、通常10〜60重量％程度、特に30〜60重量％程度とすることが好ましい。高分子化合物の含有量が多い方が、得られるリポソームの温度感受性が高くなるが、含有量が余りに多いとリポソームを調製すること自体が困難になってくる。前記の範囲内であれば、リポソームを十分に温度感受性とすることができるとともに、実用上十分に安定なリポソームが得られる。
＜高分子化合物の具体例＞
高分子化合物の好適な具体例としては、以下の化合物が挙げられる。
【００２７】
【式５】

【００２８】
（式中、R¹は水素原子、以下の式６に示す置換基又はリビングカチオン重合の開始剤として従来公知の化合物から得られる置換基であり、R²は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のハロゲン化アルキル基、炭素数１〜４のエステル基、アルデヒド基、フェニル基、ビフェニル基又は炭素数７〜１４のアラルキル基であり、R³は炭素数4〜30の炭化水素基であり、R⁴は水素原子又は炭素数１〜１０のアルコキシ基又はリビングカチオン重合の停止剤として従来公知の化合物から得られる置換基である。mは5〜５００、nは１〜１０、yは0〜100である。）
式５において、R¹として例示した式６の置換基は以下の通りである。
【００２９】
【式６】

【００３０】
（式中、Ｘは同一又は異なって、水素原子またはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子である。R¹¹は水素原子、炭素数1〜20のアルキル基、エーテル基、オキシエチレン基又はアリール基である。）
リビングカチオン重合の開始剤として従来公知の化合物としては、例えば特開平1-108202号公報又は特開平1-108203号公報に記載の開始剤、イニファー法（米国特許4276394号）で用いられている開始剤（α位に芳香環を有する塩素化合物）から得られる置換基（特開2001-055408）、東村らによりMacromolecules,17,265,1984において報告されている開始剤(ヨウ化水素とヨウ素とを組み合わせた開始剤)、特開昭62−48704、特開昭64−62308に記載されている開始剤から得られる置換基等が挙げられる。
【００３１】
R²は、上記列挙した置換基のうち、特に炭素数１〜４個程度のアルキル基であることが好ましい。
【００３２】
R³は、炭素数４〜30個程度の炭化水素基であるが、このような置換基としては、アルキル基、アリール基、アラルキル基等が挙げられる。特に、炭素数８〜30個程度の直鎖アルキル基が好ましい。
【００３３】
mとnとの比率については、R¹、R²、R³、R⁴の種類及びオキシエチレン鎖の長さ等によっても異なるが、m：nが300：1〜3：1程度、特に200：1〜10：１程度となるようにすればよい。
【００３４】
前述したように、yは0〜100程度であり、y＝0の場合にはオキシエチレンは存在しない。yは特に０〜１０程度であることが好ましい。オキシレチレン鎖が長いほど、内包物の放出温度が高くなるが、この範囲内であれば、リポソームを10〜100℃程度の温度範囲で内包物を放出させることができる。
＜合成方法＞
この高分子化合物は、ビニルモノマーの種類によっても異なるが、カチオン重合等の公知の方法でモノマーを重合させることにより得られる。特に、リビングカチオン重合によることが好ましい。リビングカチオン重合法は、例えば特開平1-108202号公報、特開平1-108203号公報、特開2001-055408号公報、特開2000-198825号公報、特開平8-269118号公報に記載されている。
【００３５】
リビングカチオン重合によると、モノマーが無くなるか又は停止剤を添加するまで成長末端が消滅しないため、感熱応答性部分及び疎水性部分の各鎖長ひいては高分子化合物の分子量を容易に所望の値にすることができる。また、他の重合法に比べて、狭い分子量分布の高分子材料を得ることができる。従って、得られる高分子化合物を用いて調製したリポソームは、狭い温度範囲で内包物を放出できるものとなる。
内包物
本発明のリポソームは、内部に遺伝子、医薬品、化粧品、色素、染料、香料、香辛料、２液性髪染め料又は脱色剤の１成分、２液性硬化剤の１成分等を含んでいてもよい。
【００３６】
遺伝子としては、それには限定されないが、例えば、重症複合型免疫不全症の治療のためのアデノシンデアミナーゼ遺伝子、家族性高コレステロール血症の治療のためのLDL受容体遺伝子、癌治療のためのインターフェロン(IFN)−α、β又はγ遺伝子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CFS）遺伝子、各種インターロイキン（IL）遺伝子、腫瘍壊死因子(TNF)−α遺伝子、リンホトキシン(LT)−β遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）遺伝子、T細胞活性化共刺激因子遺伝子等が挙げられる。その他、アルツハイマー病、脊椎損傷、パーキンソン病、動脈硬化症、糖尿病、高血圧症等の治療のための遺伝子も挙げられる。
【００３７】
医薬品としては、それには限定されないが、例えば温熱療法と併用される抗腫瘍剤、抗炎症剤等が挙げられる。抗腫瘍剤の具体例としては、シスプラチン、カルボプラチン、テトラプラチン、イプロプラチン等の金属錯体、アドリアマイシン、マイトマイシン、アクチノマイシン、アンサマイトシン、ブレオマイシン、Ara-C、ダウノマイシン等の制癌抗生物質、5-FU、メトトレキセート、TAC-788等の代謝拮抗剤、BCNU、CCNU等のアルキル化剤、インターフェロン（α、β、γ）、各種インターロイキン等のリンホカイン等が挙げられる。また、抗炎症剤の具体例としては、プレドニン、リンデロン、セレスタミン等を例示できる。これらの医薬品を内包したリポソームは、ヒトに投与後、患部を温めることによりその部分で内包物を放出して薬効を表す。
【００３８】
化粧品としては、それには限定されないが、例えば長時間皮膚に付けると炎症等を引き起こしやすい日焼け止め等が挙げられる。このような化粧品は本発明のリポソームに封入することにより日光が当たったときに初めて内包物を放出するようになるため、皮膚に対するダメージを最小限に抑えることができる。
【００３９】
色素は食用のものでもそうでなくてもよい。色素及び染料は、必要時にのみ加熱してリポソーム外に放出させ、発色させることができる。これにより取り扱い時に意図しない部分に付着して発色することがない。意図しない部分に付着した色素又は染料は水で洗い流せばよい。
【００４０】
香料及び香辛料は、揮発性のものであってもそうでなくてもよい。それには限定されないが、揮発性の香料又は香辛料である場合には、必要時まではリポソーム内に封入されているため減量せず、必要時にリポソームから放出されて十分に芳香を放つことができる。例えば、清涼感のある香料を封入したリポソームは、室温が高くなると香料を放出して清涼感のある香りを周囲に漂わせることができる。
【００４１】
髪染め料及び脱色剤の中には、２液性であって使用時に２成分を混合するものがあるが、このような髪染め料又は脱色剤は、一方の成分を本発明のリポソームに封入した上で他方成分との混合物にしておくことができる。そして、使用時に加熱することにより両成分を反応させればよい。これにより、混合する手間が省け、また容器を汚すことがない。
【００４２】
２液性硬化剤としては、例えばシリコーン系樹脂、ポリサルファイド系樹脂、ポリウレタン系樹脂又はエポキシ系樹脂のように反応硬化型の樹脂が挙げられる。このような２液性硬化剤は、一方の成分を本発明のリポソームに封入した上で他方成分との混合物にしておくことができる。そして、塗布した後に加熱することにより両成分を反応させて硬化させればよい。これにより２成分を混合した後に、素早く塗布しなくてもよくなり、作業が簡単になる。これは、家庭用接着剤、建設用接着剤又は建設用シーリング剤等のいずれとしても使用できる。
【００４３】
内包物の量は、リポソームの使用目的、リポソームの使用環境の浸透圧等を考慮して適宜選択すればよいが、通常0.1mol／l〜0.4mol／l程度の濃度で薬物等を内包することができる。
リポソームの製造方法
本発明のリポソームは、従来公知のリポソームの製造方法において、脂質とともに本発明の高分子化合物を添加することにより製造することができる。従来公知のリポソーム製造方法としては、エクストルーダー法、超音波法、フレンチプレス法等が挙げられる。これらの方法の詳細は、「リポソーム」（野島小七、砂本順三、井上圭三編、南江堂）及び「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京）に記載されている。
【００４４】
例えば、エクストルーダー法により本発明のリポソームを製造する方法について説明すると、全体量に対して10〜60重量％程度の高分子化合物をクロロホルム等の適当な有機溶媒に溶解させた溶液を容器内に入れる。次いで、エバポレーターを用いて溶媒を除去し、容器壁に脂質と高分子化合物とからなる膜を形成させる。好ましくは、さらに3〜12時間程度真空乾燥させた後、この容器内に、内包化合物を水や適当なバッファーに溶解した溶液を入れる。内包化合物の溶液の濃度は、目的に応じて異なるが、通常、リポソーム作製時に使用する化合物溶液濃度を0.1mol／l〜0.4mol／l程度にすることができる。次いで、溶液を超音波処理またはボルテックスミキサー等を用いて強く攪拌することにより、溶媒中に分散したリポソームが得られる。さらに、リポソーム分散液をエクストルーダーに通すが、そのフィルター孔径を適宜設定することにより、粒径0.05〜0.5μm程度のリポソームが得られる。この方法により、通常１~数層程度のリポソームが得られる。
最後に、得られたリポソームから、担持されなかった高分子化合物及び内包化合物を除去する。残余の高分子化合物及び内包化合物は、通常ゲルろ過法、透析法等により除去すればよい。電荷を有する化合物の場合には、イオン交換クロマトグラフィーによることもできる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によると、放出温度を自由に設定できる温度感受性リポソームが得られる。
詳述すれば、本発明のリポソームは、感熱応答性部分と疎水性部分とを有する高分子化合物を、少なくともその疎水性部分が脂質膜に埋入されることにより保持している。このリポソームの温度を上げることにより感熱応答性部分に水和していた水が脱水和し、感熱応答性部分が疎水性となって膜内に入り脂質２重層が乱れて内包物が放出される。
ここで、高分子化合物の感熱応答性部分の置換基の種類を選択することにより内包物の放出温度を調節することができる。
また、高分子化合物の分子量分布を狭くしたり、感熱応答性部分の分子量を大きくするほど、狭い温度で内包物を放出するようになる。
また、従来使用されている遺伝子の運搬体としてのリポソームは、カチオン性の人工脂質からなるリポソームに遺伝子を内包させ、負に荷電した細胞表面に静電的相互作用によりその遺伝子を運搬するものであった。この方法では、細胞選択性がなく、注入した部位の細胞にのみ遺伝子が運搬される。この点、本発明の温度感受性リポソームを、カチオン性の人工脂質を用いて調製する場合には、リポソーム表面に中性の高分子化合物の感熱応答性部分が存在するために、その表面は中性になる。このリポソームをヒトに投与後、所定部位を暖めることにより、その部位で感熱応答性部分の水和水が脱水和し、高分子鎖の全体又は略全体がリポソーム膜内に入るため、リポソーム表面がカチオン性となって負荷電した細胞表面と相互作用できるようになる。これにより、所望の細胞に選択的に遺伝子を運搬することができる。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜分子量の測定方法＞
高分子化合物の重量平均分子量（Mw）及び数平均分子量（Mn）は、それぞれゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)の結果から算出した。GPCは、高速液体クロマトグラフ（東ソー社製のTSKgelカラムG-200_HXL+G-3000 _HXL+G-４000 _HXL、溶離液はクロロホルム）を用いて行い、そのクロマトグラフィーの結果から、被験化合物の分子量をポリスチレンを標準物質として算出することにより、ポリスチレン換算Mw及びMnとして求めた。
＜内包物質放出試験＞
試験的内包物質として蛍光物質であるカルセインを用いて、以下の方法でリポソームからのカルセインの放出温度を調べた。
【００４７】
カルセインを封入したリポソームを、所定の低い温度のTris-HCl（140mM Tris-HCl, 100mM NaCl）緩衝溶液中に分散させ(脂質濃度にして10μM)、この緩衝液の温度を徐々に上げていき、分散液の蛍光強度を分光蛍光光度計（島津製作所社製、RF5300）を用いて経時的に測定した。
【００４８】
カルセインは高濃度において消光するため、リポソーム内部に封入されているときには蛍光を出さないが、リポソームから緩衝液中に放出されると蛍光を発する。したがって、緩衝液を昇温させつつリポソーム分散液のカルセインの蛍光をモニターすることによって、リポソームからのカルセインの放出温度を調べることができる。カルセインの励起波長およびモニター波長はそれぞれ490nmおよび520nmとした。
【００４９】
リポソームからのカルセインの放出率は以下の式によって算出した。
【００５０】
放出率=(Ft-Fi)/(Ff-Fi)×100
Ft：測定温度におけるリポソーム分散液のカルセイン蛍光強度
Fi：昇温開始前の温度におけるリポソーム分散液のカルセイン蛍光強度
Ff：界面活性剤トリトン-X100 (0.2v/v%)を加えてリポソームを破壊したときのカルセイン蛍光強度
＜リポソームの調製＞
卵黄ホスファチジルコリン（EYPC）（3ｍｇ）、オイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)（4.5ｍｇ）および高分子化合物(3.8mg〜11.3mg)をクロロホルム2mlに溶解した溶液を、10ml容のフラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを除去することにより、フラスコ内壁にリン脂質と高分子化合物との混合薄膜を形成させた。さらに１晩真空乾燥した後、蛍光色素カルセイン(63 mmol/l)の水溶液(0.75 ml, pH7.4)を加え、１分間バス型超音波照射器（Branson, B-32)で超音波照射して脂質/高分子複合体を分散させ、リポソームを得た。さらにこのリポソーム分散液を、エクストルーダー(Avestin, フィルター孔径100nm）を用いて、リポソームの粒径をそろえた。担持されてない高分子化合物およびカルセインは、10mM Tris-HCl+100mM NaCl緩衝液（ｐH7.4、４℃)を溶離液とするゲル濾過（Sephadex G-75, Pharmacia Biotech)により除去した。
実施例１
感熱応答性部分のみ有する高分子化合物を溶解させた水溶液を調製し、この水溶液の温度を上昇させることにより、感熱応答性部分が親水性から疎水性となる温度を調べた。水溶液の温度を上昇させると、水和水が外れ又は水和水塊が小さくなり、その結果高分子化合物が分子内又は分子間で会合して沈殿を生じる。従って、水溶液に波長500nmの光を照射して波長500nmの光の透過率をモニターしながら、水溶液の温度を上昇させ、当該透過率が急激に低下するときの温度を臨界溶液温度とした。
【００５１】
感熱応答性部分のみ有する高分子化合物を用いたのは、疎水性部分が含まれていると、疎水性部分が会合体を作るため、感熱応答性部分から水和水が外れることによる透過率の低下を正確に検出することができないからである。
＜感熱応答性高分子化合物の合成＞
三方活栓を取り付けたガラス容器を窒素雰囲気下250℃で加熱し、容器内を十分に乾燥した。系を室温に戻した後、（２−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテル４mmol、酢酸エチル10mmol、1−イソブトキシエチルアセテート0.04mmol及びトルエン6.2mlを加え、系内温度が0℃に達したところでエチルアルミニウムセスキクロライドを0.2mmol加え重合を開始した。重合の停止は、系内に少量のアンモニア水を含んだメタノール3mlを加えて行った。反応を終えた混合溶液中にジクロロメタンを加えて希釈し、0.6Nの塩酸溶液で３回、次いで蒸留水で３回洗浄した。得られた反応物をエバポレーターで濃縮した後、真空乾燥させ、目的物のポリマーを得た。化合物の同定はNMR及びGPCを用いて行った。これによりMn=15800、Mw／Mn＝1.16のポリマーが得られた。
【００５２】
前記説明したMn=15800のポリマーの合成において、（２−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの量を2.6mmolとした他は同様にしてMn=8300、Mw／Mn＝1.15のポリマーを得た。また、前記説明したMn=15800のポリマーの合成において、（２−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの量を1.3mmolとした他は同様にしてMn=5300、Mw／Mn＝1.14のポリマーを得た。
＜臨界溶液温度の測定＞
数平均分子量5300、8300及び15800の各ポリ（2-エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルについて、それぞれ1.0重量％、0.5重量％、0.2重量％及び0.1重量％の水溶液を調製した。各ポリビニルエーテル水溶液を30℃から50℃まで徐々に昇温させ、その間の500nmにおける透過率をモニターした。
【００５３】
結果を図１に示す。(A)は数平均分子量5300の各ポリ（2-エトキシ）エトキシエチルビニルエーテル、(B)は数平均分子量8300の各ポリ（2-エトキシ）エトキシエチルビニルエーテル、(C)は数平均分子量15800の各ポリ（2-エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルを用いた場合の結果である。
【００５４】
図１から、いずれの分子量でも40〜45℃程度の範囲内で高感度で使用液が白濁しており、親水性から疎水性に変化していることが分かる。特に分子量がある程度（ここでは8300）以上大きくなると、その感度は極めて高くなることが分かる。
【００５５】
また、図２は、図１において、熱感応性高分子化合物の濃度に対して臨界溶液温度（500nmにおける透過率が急に低下する温度）をプロットしたグラフである。図２から、いずれの分子量、濃度においても高感度な相分離が見られることが分かる。さらに詳しく検討すると、親水性高分子化合物の分子量が大きいほど臨界溶液温度が概ね高くなることが分かる。
実施例２
＜高分子化合物の合成＞
ブロックコポリマーの合成は、逐次モノマー添加法により行った。先ず、三方活栓を取り付けたガラス容器を窒素雰囲気下250℃で加熱し、容器内を十分に乾燥した。系を室温に戻した後、（２−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテル４mmol、酢酸エチル10mmol、1−イソブトキシエチルアセテート0.04mmol及びトルエン6.2mlを加え、系内温度が0℃に達したところでエチルアルミニウムセスキクロライドを0.2mmol加え重合を開始した。重合がほぼ終了した時点で、第2のモノマーとしてオクタデシルビニルエーテル0.2mmolを含んだトルエン溶液3mlを加えてブロック共重合を行った。重合の停止は、系内に少量のアンモニア水を含んだメタノール3mlを加えて行った。反応を終えた混合溶液中にジクロロメタンを加えて希釈し、0.6Nの塩酸溶液で３回、次いで蒸留水で３回洗浄した。得られた反応物をエバポレーターで濃縮した後、真空乾燥させ、目的物のポリマーを得た。化合物の同定はNMR及びGPCを用いて行った。これによりMn=16700、Mw／Mn＝1.14のポリマーが得られた。得られたポリマーにおいて、オクタデシルビニルエーテル／（2−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの共重合比率は、100／5であった。
【００５６】
前記説明したMn=16700のポリマーの合成において、（２−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの量を2.6mmolとした他は同様にしてMn=9300、Mw／Mn＝1.16のポリマーを得た。得られたポリマーにおいて、オクタデシルビニルエーテル／（2−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの共重合比率は、66／5であった。
【００５７】
また、前記説明したMn=16700のポリマーの合成において、（２−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの量を1.3mmolとした他は同様にしてMn=6900、Mw／Mn＝1.13のポリマーを得た。得られたポリマーにおいて、オクタデシルビニルエーテル／（2−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの共重合比率は、33／5であった。
＜カルセイン放出温度＞
分子量6900、9300及び16700の各オクタデシルビニルエーテル−（2−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテル共重合体を保持し、カルセインを内包したリポソームの分散液をそれぞれ調製し、各分散液の温度を10℃から50℃まで徐々に上げていき、カルセインの放出率をモニターした。
【００５８】
結果を図３に示す。図３から、高分子化合物の分子量が大きいほど、狭い温度範囲でカルセインを放出することが分かる。
【００５９】
また、前記の各リポソーム分散液を25℃及び40℃でインキュベートし、カルセインの放出率をモニターした。結果を図４に示す。図４から、分子量が大きいほど、短時間でカルセインを放出できることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】数平均分子量5300（A）、8300(B)及び15800(C)の各ポリ（2-エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの水溶液の温度と500nmにおける透過率との関係を示すグラフである。
【図２】ポリ（2−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの水溶液の臨界溶液温度の濃度と臨界溶液温度との関係を示すグラフである。
【図３】オクタデシルビニルエーテル−（2−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテル共重合体を保持し、蛍光物質のカルセインを内包したリポソームについての、温度とカルセイン放出温度との関係を示すグラフである。
【図４】オクタデシルビニルエーテル−（2−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテル共重合体を保持し、蛍光物質のカルセインを内包したリポソームの25℃及び40℃における経時的なカルセイン放出率を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a temperature-sensitive liposome capable of releasing a substance encapsulated therein at a specific temperature.
[0002]
[Prior art]
Liposomes are composed of lipid bilayers such as phospholipids and are metabolized in vivo, and thus have an application value as a safe carrier for drugs such as anticancer agents and antibacterial agents and genes.
[0003]
In particular, thermosensitive liposomes that disintegrate and release their contents at a predetermined temperature have been reported to have excellent therapeutic effects by using thermosensitive liposomes encapsulating anticancer agents in combination with cancer thermotherapy. ("Clinical Cancer" Vol. 32, No. 13 (1986), "General Clinic" Vol. 37, No. 1 (1988)).
[0004]
Conventional temperature-sensitive liposomes generally contain phospholipids with a phase transition temperature as the main component, change from a gel state to a liquid crystal state at the phase transition temperature, and disturb the membrane structure to release encapsulated substances. It is.
[0005]
However, since the phase transition temperature of the liposome membrane consisting only of lipid is determined by the lipid, the degree of freedom in setting the release temperature of the inclusion is low.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The main object of the present invention is to provide a temperature sensitive liposome capable of freely setting the release temperature of the inclusion.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventor has conducted research and found the following findings.
{Circle around (1)} In addition to membrane lipids such as phospholipids, liposomes holding this polymer compound can be obtained by preparing liposomes using a polymer compound having a thermosensitive response part and a hydrophobic part. Although not limited to this theory, the present inventor believes that in this liposome, the hydrophobic portion of the polymer compound is embedded in the lipid membrane of the liposome and the thermosensitive portion exists outside the membrane. ing.
{Circle around (2)} When the target substance is encapsulated in the liposome and heated in a state of being dispersed in water, the inclusion is released at a certain temperature. Although not limited to this theory, the present inventor thinks as follows. That is, the thermosensitive part of the polymer compound is hydrated at a low temperature, but dehydration occurs when the temperature is raised, and as a result, the hydrophobicity of the thermosensitive part increases, and it is initially outside the lipid membrane. All or part of the existing portion enters the liposome membrane, and the lipid bilayer membrane is disturbed. Since the target substance is encapsulated by arranging the lipids in the liposome membrane in an orderly manner, the inclusion is released when the membrane is disturbed in this way.
(3) The release temperature of the liposome inclusion can be arbitrarily set within the temperature range in which the liposome itself is stably maintained by designing the structure of the polymer compound. For example, the inclusion is released at a higher temperature as the hydrophilic portion of the thermosensitive monomer unit is increased.
(4) Inclusion can be released in a narrower temperature range by increasing the molecular weight of this polymer compound, particularly its heat-sensitive part, to a certain extent.
(5) When this polymer compound is synthesized by living cationic polymerization, a polymer compound having a desired molecular weight can be obtained by setting the initiator amount and the monomer amount. Moreover, according to living cationic polymerization, the ratio of the heat-responsive part and the hydrophobic part in the polymer compound can be easily set to a desired value. In addition, monomers having various heat sensitive temperatures can be polymerized and copolymerized. Therefore, the use of the polymer compound obtained by living cationic polymerization makes it easier to set the release temperature of the liposome inclusion. In addition, the polymer compound obtained by living cationic polymerization has a narrow molecular weight distribution compared to radical polymerization or normal ionic polymerization, and liposomes using this can release inclusions in a narrower temperature range. .
[0008]
The present invention has been completed by further research based on the above findings, and provides temperature-sensitive liposomes of the following items.
Item 1. A temperature-sensitive liposome in which a polymer compound having a heat-sensitive part and a hydrophobic part is held on a liposome membrane via at least the hydrophobic part.
Item 2. Item 2. The temperature-sensitive liposome according to item 1, wherein the polymer compound is a block copolymer of a thermosensitive vinyl monomer containing at least one hydratable heteroatom and a hydrophobic vinyl monomer.
Item 3. Item 3. The temperature-sensitive liposome according to item 2, wherein the polymer compound is a compound of the following formula 3.
[0009]
[Formula 3]

[0010]
(Where R¹Is a hydrogen atom, a substituent represented by the following formula 4 or a substituent obtained from a conventionally known compound as an initiator for living cationic polymerization, and R²Is an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a halogenated alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an ester group having 1 to 4 carbon atoms, an aldehyde group, a phenyl group, a biphenyl group, or an aralkyl group having 7 to 14 carbon atoms, R^ThreeIs a hydrocarbon group having 4 to 30 carbon atoms, R^FourIs a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms or a substituent obtained from a conventionally known compound as a terminator for living cationic polymerization. m is 5 to 500, n is 1 to 10, and y is 0 to 100. )
[0011]
[Formula 4]

[0012]
Wherein X is the same or different and is a hydrogen atom or a halogen atom such as a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.¹¹Is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, an ether group, an oxyethylene group or an aryl group. )
Item 4. Item 4. The temperature-sensitive liposome according to item 1, 2, or 3, wherein the number-average molecular weight of the heat-sensitive portion of the polymer compound is 1000 to 30000.
Item 5. Item 5. The temperature-sensitive liposome according to any one of Items 1 to 4, wherein the polymer compound has a number average molecular weight of 2,000 to 50,000.
Item 6. Item 6. The temperature-sensitive liposome according to any one of Items 1 to 5, wherein the polymer compound has a weight average molecular weight / number average molecular weight ratio of 1 to 4.
Item 7. Item 7. The temperature-sensitive liposome according to any one of Items 1 to 6, wherein the ratio of the weight of the polymer compound to the total weight of the liposome is 30 to 60% by weight.
Item 8. Item 8. The temperature-sensitive liposome according to any one of Items 1 to 7, wherein the polymer compound is synthesized by living cationic polymerization.
Item 9. Item 9. The temperature sensitive liposome according to any one of Items 1 to 8, wherein a target substance is encapsulated therein.
Item 10. A term in which the target substance is a substance selected from the group consisting of a gene, a pharmaceutical, a cosmetic, a fragrance, a spice, a pigment, a dye, a two-component hair dye or a decoloring agent, and a two-component curing agent. 9. The temperature-sensitive liposome according to 9.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0014]
The temperature-sensitive liposome of the present invention is a liposome in which a polymer compound having a thermosensitive responsive part and a hydrophobic part is held on the liposome membrane via at least the hydrophobic part.
[0015]
In the liposome of the present invention, it is considered that at least the hydrophobic part of the polymer compound is embedded in the lipid bilayer of the liposome, and the heat-responsive part exists outside the membrane. Moreover, when the hydrophobic part of a high molecular compound is very small, it is thought that a thermosensitive response part is hold | maintained at the lipid membrane by interacting with the lipid bilayer surface.
Structure etc.
The liposome of the present invention may be in the range of about 0.05 to 10 μm in particle size, and can have various particle sizes depending on the purpose of use. For the purpose of administration into human blood vessels, it is usually about 0.05 to 0.2 μm, particularly about 0.05 to 0.1 μm. The particle size of the liposome can be adjusted by a conventionally known method. For example, when preparing liposomes by the extruder method, it can be arbitrarily set by adjusting the pore size of a filter attached to the extruder. The particle size of the liposome is a value measured by dynamic light scattering or electron microscope observation.
[0016]
The liposome of the present invention may be either a unilamellar liposome or a multilamellar liposome as long as it falls within the above particle size range.
[0017]
Although the liposome of the present invention varies depending on the purpose of use, it is generally capable of releasing inclusions within a temperature range of about 10 to 100 ° C, preferably about 20 to 80 ° C. Although it varies depending on the lipid to be used, if it is in the range of about 10 to 100 ° C., the liposome itself is unlikely or unstable. The release temperature of the inclusion can be arbitrarily set within this range by designing the structure of the thermosensitive part of the polymer compound, that is, the ratio between the hydrophilic part and the hydrophobic part, the type of the functional group, and the like. When used for the purpose of administering to humans for the treatment of cancer or inflammation, it is preferable that the inclusion can be released usually at about 40 to 45 ° C, particularly at about 40 to 42 ° C.
[0018]
Moreover, although the liposome of the present invention can release inclusions in a narrow temperature range by the method described later, it does not necessarily have to release inclusions in such a narrow temperature range. For example, it may be preferable to gradually release the fragrance for liposomes encapsulating the fragrance or the like.
Lipid
The main component of the liposome of the present invention is an amphiphilic lipid. As the amphiphilic lipid, conventionally known lipids can be used as the membrane lipid of the liposome. Examples of such lipids include phospholipids such as phosphatidic acid, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, cardiolipin, sphingomyelin, soybean lecithin, and egg yolk lecithin. In these phospholipids, the fatty acid moiety can be any combination of lauryl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl, arachidoyl, oleyl, renoyl, linoleyl and the like. These can be used alone or in combination of two or more. In particular, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and the like are preferable.
[0019]
Moreover, when it is set as the liposome as a gene carrier, conventionally well-known cationic artificial lipid other than the illustrated phospholipid can be used. Examples of such cationic artificial lipids include N- (α-trimethylammonioacetyl) -didodecylglutamate, N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N- And quaternary ammonium salts such as trimethylammonium chloride and 1,2-bis (oleoyloxy) -3- (trimethylammonio) propane. These lipids can be used alone or in combination of two or more.
[0020]
Lipids constituting the liposome may contain sterols such as cholesterol, lanosterol and ergosterol.
High molecular compound
<Structure>
The polymer compound contained in the temperature-sensitive liposome is a polymer compound having a heat-sensitive responsive part. In particular, a polymer compound having a thermosensitive portion and a hydrophobic portion is preferable. The kind of the polymer compound is not particularly limited, and examples thereof include a block copolymer of a thermosensitive vinyl monomer containing at least one hydratable heteroatom and a hydrophobic vinyl monomer. .
[0021]
Examples of the hydratable hetero atom include an oxygen atom and a nitrogen atom. The upper limit of the number of hydratable heteroatoms is not particularly limited as long as the polymerization can be performed. Substituents containing hydratable heteroatoms include —CH₂−CH₂-O-, -CO-, -COO-, -CONH-, -NHCOO- and the like.
[0022]
In addition, as the hydrophobic vinyl monomer, vinyl monomers having various aliphatic, alicyclic or aromatic hydrocarbon groups having about 3 to 40 carbon atoms, particularly about 4 to 30 carbon atoms can be used. .
[0023]
In the block copolymer, the copolymerization ratio of the heat-responsive vinyl monomer containing one or more heteroatoms and the hydrophobic vinyl monomer varies depending on the type of each monomer, but is usually 300: 1 to 3: About 1 is preferable, especially about 200: 1 to 10: 1. Within this range, the polymer compound can be stably retained on the liposome membrane.
<Molecular weight>
The amount corresponding to the heat-sensitive responsive portion in the number average molecular weight of the polymer compound is not particularly limited, but it may be usually several hundred to several hundred thousand. In particular, it is preferably about 1000 to 30000, more preferably about 10000 to 20000, so that the inclusions can be released in a narrow temperature range.
[0024]
The molecular weight of the entire polymer compound is not particularly limited, but may be a number average molecular weight of usually several hundred to several hundred thousand. Within this range, the lipid membrane is stably held. In particular, it is preferably about 2000 to 50000, more preferably about 10000 to 20000 (particularly about 11000 to 21000), so that inclusions can be released in a narrow temperature range.
[0025]
Further, the molecular weight distribution (weight average molecular weight / number average molecular weight) of the polymer compound is usually about 1 to 4, particularly preferably about 1.0 to 1.5. Within this range, the resulting liposome can release inclusions in a practically sufficiently narrow temperature range.
[0026]
In the present invention, the number average molecular weight and the weight average molecular weight are values measured by the methods described in the examples.
<Content>
The content of the polymer compound in the liposome of the present invention is usually about 10 to 60% by weight, preferably about 30 to 60% by weight. The higher the content of the polymer compound, the higher the temperature sensitivity of the resulting liposome. However, when the content is too high, it becomes difficult to prepare the liposome itself. If it is in the said range, while being able to make a liposome fully temperature-sensitive, a liposome sufficiently practically stable is obtained.
<Specific examples of polymer compounds>
Preferable specific examples of the polymer compound include the following compounds.
[0027]
[Formula 5]

[0028]
(Where R¹Is a hydrogen atom, a substituent represented by the following formula 6 or a substituent obtained from a conventionally known compound as an initiator for living cationic polymerization, and R²Is an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a halogenated alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an ester group having 1 to 4 carbon atoms, an aldehyde group, a phenyl group, a biphenyl group, or an aralkyl group having 7 to 14 carbon atoms, R^ThreeIs a hydrocarbon group having 4 to 30 carbon atoms, R^FourIs a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms or a substituent obtained from a conventionally known compound as a terminator for living cationic polymerization. m is 5 to 500, n is 1 to 10, and y is 0 to 100. )
In Equation 5, R¹The substituents of the formula 6 exemplified as are as follows.
[0029]
[Formula 6]

[0030]
Wherein X is the same or different and is a hydrogen atom or a halogen atom such as a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.¹¹Is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, an ether group, an oxyethylene group or an aryl group. )
As a conventionally known compound as an initiator of living cationic polymerization, for example, an initiator described in JP-A-1-108202 or JP-A-1-108203, an initiator used in the inifer method (US Pat. No. 4,276,394) Substituents obtained from agents (chlorine compounds having an aromatic ring at the α-position) (JP 2001-055408), initiators reported by Higashimura et al. In Macromolecules, 17, 265, 1984 (combined hydrogen iodide and iodine) Initiators), substituents obtained from the initiators described in JP-A-62-48704 and JP-A-64-62308, and the like.
[0031]
R²Is preferably an alkyl group having about 1 to 4 carbon atoms among the substituents listed above.
[0032]
R^ThreeIs a hydrocarbon group having about 4 to 30 carbon atoms, and examples of such a substituent include an alkyl group, an aryl group, and an aralkyl group. In particular, a linear alkyl group having about 8 to 30 carbon atoms is preferable.
[0033]
For the ratio of m to n, R¹, R², R^Three, R^FourHowever, the m: n may be about 300: 1 to 3: 1, particularly about 200: 1 to 10: 1.
[0034]
As described above, y is about 0 to 100, and oxyethylene does not exist when y = 0. y is particularly preferably about 0 to 10. The longer the oxyretylene chain, the higher the release temperature of the inclusion. Within this range, the liposome can be released in a temperature range of about 10 to 100 ° C.
<Synthesis method>
Although this polymer compound varies depending on the type of vinyl monomer, it can be obtained by polymerizing the monomer by a known method such as cationic polymerization. In particular, it is preferable to use living cationic polymerization. Living cationic polymerization methods are described, for example, in JP-A-1-108202, JP-A-1-108203, JP-A-2001-055408, JP-A-2000-198825, and JP-A-8-269118. Yes.
[0035]
According to the living cationic polymerization, the growth ends do not disappear until the monomer disappears or the terminator is added, so that the chain lengths of the thermosensitive part and the hydrophobic part and thus the molecular weight of the polymer compound are easily set to the desired values. be able to. In addition, a polymer material having a narrow molecular weight distribution can be obtained as compared with other polymerization methods. Accordingly, liposomes prepared using the resulting polymer compound can release inclusions in a narrow temperature range.
Inclusion
The liposome of the present invention may contain a gene, a drug, a cosmetic, a pigment, a dye, a fragrance, a spice, a two-component hair dye or a decoloring agent, a two-component curing agent, and the like. .
[0036]
Examples of the gene include, but are not limited to, for example, an adenosine deaminase gene for the treatment of severe combined immunodeficiency, an LDL receptor gene for the treatment of familial hypercholesterolemia, and an interferon ( IFN) -α, β or γ genes, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CFS) gene, various interleukin (IL) genes, tumor necrosis factor (TNF) -α gene, lymphotoxin (LT) -β gene, granules Examples thereof include a sphere colony stimulating factor (G-CSF) gene and a T cell activation costimulatory factor gene. Other examples include genes for treatment of Alzheimer's disease, spinal cord injury, Parkinson's disease, arteriosclerosis, diabetes, hypertension and the like.
[0037]
Although it is not limited to it as a pharmaceutical, For example, the antitumor agent used together with a thermotherapy, an anti-inflammatory agent, etc. are mentioned. Specific examples of antitumor agents include metal complexes such as cisplatin, carboplatin, tetraplatin, and iproplatin, anticancer antibiotics such as adriamycin, mitomycin, actinomycin, ansamitocin, bleomycin, Ara-C, and daunomycin, 5-FU Antimetabolites such as methotrexate and TAC-788, alkylating agents such as BCNU and CCNU, interferons (α, β and γ), and lymphokines such as various interleukins. Specific examples of the anti-inflammatory agent include predonin, Linderon, and Celestamine. Liposomes encapsulating these pharmaceuticals exhibit drug efficacy by heating the affected area after administration to humans and releasing the encapsulated material at that part.
[0038]
Examples of cosmetics include, but are not limited to, sunscreens that tend to cause inflammation and the like when applied to the skin for a long time. Since such cosmetics are encapsulated in the liposomes of the present invention, the inclusions are only released when exposed to sunlight, so that damage to the skin can be minimized.
[0039]
The dye may or may not be edible. The dye and the dye can be heated only when necessary to be released from the liposome to develop a color. Thereby, it does not adhere to an unintended part at the time of handling and does not color. The pigment or dye adhering to the unintended part may be washed away with water.
[0040]
Perfumes and spices may or may not be volatile. Although it is not limited to this, when it is a volatile fragrance | flavor or a spice, since it is enclosed in the liposome until it is needed, it is not reduced in weight, but when it is needed, it can be released from the liposome and release a fragrance sufficiently. For example, a liposome encapsulating a fragrance with a refreshing sensation can release the fragrance and cause a scent with a refreshing sensation to drift around the room temperature.
[0041]
Some hair dyes and depigmenting agents are two-component and mix two components at the time of use. Such hair dyes or depigmenting agents enclose one component in the liposome of the present invention. In addition, it can be made into a mixture with the other component. And what is necessary is just to make both components react by heating at the time of use. Thereby, the trouble of mixing is saved and the container is not soiled.
[0042]
Examples of the two-component curing agent include a reaction curable resin such as a silicone resin, a polysulfide resin, a polyurethane resin, or an epoxy resin. Such a two-component curing agent can be made into a mixture with the other component after enclosing one component in the liposome of the present invention. And what is necessary is just to make both components react and harden | cure by heating after apply | coating. This eliminates the need for quick application after mixing the two components, and simplifies the operation. This can be used as any of household adhesives, construction adhesives, construction sealants and the like.
[0043]
The amount of inclusion may be appropriately selected in consideration of the purpose of use of the liposome, the osmotic pressure of the environment in which the liposome is used, etc. Usually, the drug etc. should be included at a concentration of about 0.1 mol / l to 0.4 mol / l. Can do.
Method for producing liposome
The liposome of the present invention can be produced by adding the polymer compound of the present invention together with a lipid in a conventionally known liposome production method. Examples of conventionally known liposome production methods include an extruder method, an ultrasonic method, and a French press method. Details of these methods are described in “Liposomes” (Shoji Nojima, Junzo Sunamoto, Junzo Inoue, Nanedo) and “Liposomes in Life Science” (Hiroshi Terada, Tetsuro Yoshimura, Springer Fairlark Tokyo). ing.
[0044]
For example, the method for producing the liposome of the present invention by the extruder method will be described. A solution in which a polymer compound of about 10 to 60% by weight with respect to the total amount is dissolved in a suitable organic solvent such as chloroform is placed in a container. Put in. Next, the solvent is removed using an evaporator, and a film made of a lipid and a polymer compound is formed on the container wall. Preferably, after further vacuum drying for about 3 to 12 hours, a solution in which the inclusion compound is dissolved in water or a suitable buffer is placed in this container. The concentration of the encapsulated compound solution varies depending on the purpose, but the concentration of the compound solution used at the time of preparing the liposome can usually be about 0.1 mol / l to 0.4 mol / l. Next, the solution is vigorously stirred using sonication or a vortex mixer to obtain liposomes dispersed in the solvent. Furthermore, the liposome dispersion is passed through an extruder, and liposomes having a particle size of about 0.05 to 0.5 μm can be obtained by appropriately setting the filter pore size. By this method, about 1 to several liposomes are usually obtained.
Finally, the unsupported polymer compound and inclusion compound are removed from the obtained liposome. The remaining polymer compound and encapsulated compound may be usually removed by gel filtration, dialysis or the like. In the case of a compound having a charge, it can also be performed by ion exchange chromatography.
[0045]
【The invention's effect】
According to the present invention, a temperature sensitive liposome capable of freely setting the release temperature is obtained.
More specifically, the liposome of the present invention holds a polymer compound having a heat-sensitive responsive portion and a hydrophobic portion by at least the hydrophobic portion being embedded in a lipid membrane. By raising the temperature of the liposome, the water hydrated in the thermosensitive part is dehydrated, the thermosensitive part becomes hydrophobic, enters the membrane, disturbs the lipid bilayer, and releases inclusions. .
Here, the release temperature of the inclusions can be adjusted by selecting the type of substituent of the thermosensitive portion of the polymer compound.
In addition, the inclusion is released at a narrower temperature as the molecular weight distribution of the polymer compound is narrowed or the molecular weight of the heat-sensitive responsive portion is increased.
In addition, liposomes that are conventionally used as gene carriers are those in which genes are encapsulated in liposomes made of cationic artificial lipids, and the genes are transported to the negatively charged cell surface by electrostatic interaction. there were. In this method, there is no cell selectivity, and the gene is delivered only to the cells at the site of injection. In this regard, when the temperature-sensitive liposome of the present invention is prepared using a cationic artificial lipid, the surface of the liposome is neutral due to the presence of a thermosensitive portion of a neutral polymer compound. become. After the liposome is administered to a human, the hydrated water of the heat-sensitive part is dehydrated by warming a predetermined site, and the whole or almost the entire polymer chain enters the liposome membrane. It becomes cationic and can interact with the negatively charged cell surface. Thereby, a gene can be selectively delivered to a desired cell.
[0046]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated, this invention is not limited to these.
<Measurement method of molecular weight>
The weight average molecular weight (Mw) and the number average molecular weight (Mn) of the polymer compound were calculated from the results of gel permeation chromatography (GPC), respectively. GPC is a high performance liquid chromatograph (TSKgel column G-200 manufactured by Tosoh Corporation)._HXL+ G-3000_HXL+ G-4000_HXLThe chloroform was used as the eluent, and the molecular weight of the test compound was calculated as polystyrene as a standard substance from the chromatographic results, and was calculated as polystyrene converted Mw and Mn.
<Internal substance release test>
Using calcein, which is a fluorescent substance, as a test inclusion substance, the release temperature of calcein from liposomes was examined by the following method.
[0047]
Disperse the liposome encapsulating calcein in a predetermined low temperature Tris-HCl (140 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl) buffer solution (lipid concentration 10 μM), and gradually raise the temperature of this buffer solution. The fluorescence intensity of the dispersion was measured over time using a spectrofluorometer (manufactured by Shimadzu Corporation, RF5300).
[0048]
Since calcein is quenched at a high concentration, it does not emit fluorescence when encapsulated inside the liposome, but emits fluorescence when released from the liposome into a buffer solution. Therefore, the calcein release temperature from the liposome can be examined by monitoring the fluorescence of calcein in the liposome dispersion while raising the temperature of the buffer solution. The excitation wavelength and monitor wavelength of calcein were 490 nm and 520 nm, respectively.
[0049]
The release rate of calcein from the liposome was calculated by the following formula.
[0050]
Release rate = (Ft-Fi) / (Ff-Fi) x 100
Ft: Calcein fluorescence intensity of liposome dispersion at measurement temperature
Fi: Calcein fluorescence intensity of liposome dispersion at the temperature before the start of temperature increase
Ff: Calcein fluorescence intensity when liposomes are broken by adding surfactant Triton-X100 (0.2v / v%)
<Preparation of liposome>
A solution of egg yolk phosphatidylcholine (EYPC) (3 mg), oil phosphatidylethanolamine (DOPE) (4.5 mg) and a polymer compound (3.8 mg to 11.3 mg) in 2 ml of chloroform is placed in a 10 ml flask, and a rotary evaporator is used. By using this to remove chloroform, a mixed thin film of phospholipid and polymer compound was formed on the inner wall of the flask. Furthermore, after vacuum drying overnight, an aqueous solution (0.75 ml, pH 7.4) of fluorescent dye calcein (63 mmol / l) was added and sonicated with a bath-type ultrasonic irradiator (Branson, B-32) for 1 minute. Thus, the lipid / polymer complex was dispersed to obtain liposomes. Furthermore, the liposome dispersion liquid was made to have the same particle size by using an extruder (Avestin, filter pore size: 100 nm). Unsupported polymer compound and calcein were removed by gel filtration (Sephadex G-75, Pharmacia Biotech) using 10 mM Tris-HCl + 100 mM NaCl buffer (pH 7.4, 4 ° C.) as an eluent.
Example 1
An aqueous solution in which a polymer compound having only a thermosensitive portion was dissolved was prepared, and the temperature at which the thermosensitive portion became hydrophilic to hydrophobic was examined by increasing the temperature of the aqueous solution. When the temperature of the aqueous solution is increased, the hydrated water is removed or the hydrated water mass is reduced, and as a result, the polymer compound associates within the molecule or between the molecules and precipitates. Therefore, the temperature of the aqueous solution was raised while irradiating the aqueous solution with light having a wavelength of 500 nm and monitoring the transmittance of the light with a wavelength of 500 nm, and the temperature at which the transmittance rapidly decreased was defined as the critical solution temperature.
[0051]
The polymer compound having only the thermosensitive part was used because, when the hydrophobic part is included, the hydrophobic part forms an aggregate, so that the transmittance of the hydrated water is removed from the thermosensitive part. This is because the decrease cannot be accurately detected.
<Synthesis of thermosensitive polymer compound>
A glass container equipped with a three-way stopcock was heated at 250 ° C. in a nitrogen atmosphere to sufficiently dry the inside of the container. After returning the system to room temperature, 4 mmol of (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether, 10 mmol of ethyl acetate, 0.04 mmol of 1-isobutoxyethyl acetate and 6.2 ml of toluene were added, and when the system temperature reached 0 ° C., ethylaluminum sesquioxide was added. Polymerization was started by adding 0.2 mmol of chloride. The polymerization was stopped by adding 3 ml of methanol containing a small amount of aqueous ammonia in the system. Dichloromethane was added to the mixed solution after the reaction to dilute, and the mixture was washed 3 times with a 0.6N hydrochloric acid solution and then 3 times with distilled water. The obtained reaction product was concentrated with an evaporator and then vacuum-dried to obtain a target polymer. The compound was identified using NMR and GPC. As a result, a polymer having Mn = 15800 and Mw / Mn = 1.16 was obtained.
[0052]
A polymer with Mn = 8300 and Mw / Mn = 1.15 was obtained in the same manner as in the synthesis of the polymer with Mn = 15800 described above, except that the amount of (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether was 2.6 mmol. Further, in the synthesis of the polymer with Mn = 15800 described above, a polymer with Mn = 5300 and Mw / Mn = 1.14 was obtained in the same manner except that the amount of (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether was 1.3 mmol.
<Measurement of critical solution temperature>
For poly (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ethers having number average molecular weights of 5300, 8300 and 15800, aqueous solutions of 1.0 wt%, 0.5 wt%, 0.2 wt% and 0.1 wt% were prepared, respectively. Each polyvinyl ether aqueous solution was gradually heated from 30 ° C. to 50 ° C., and the transmittance at 500 nm was monitored during that time.
[0053]
The results are shown in FIG. (A) each poly (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether having a number average molecular weight of 5300, (B) each poly (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether having a number average molecular weight of 8300, and (C) each having a number average molecular weight of 15800 This is the result when poly (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether is used.
[0054]
From FIG. 1, it can be seen that the used liquid is cloudy with high sensitivity within the range of about 40 to 45 ° C. at any molecular weight, and the hydrophilic liquid is changed to hydrophobic. In particular, when the molecular weight is increased to some extent (here, 8300) or more, the sensitivity becomes extremely high.
[0055]
FIG. 2 is a graph in which the critical solution temperature (temperature at which the transmittance at 500 nm suddenly decreases) is plotted against the concentration of the thermosensitive polymer compound in FIG. FIG. 2 shows that highly sensitive phase separation is observed at any molecular weight and concentration. Further examination reveals that the critical solution temperature generally increases as the molecular weight of the hydrophilic polymer compound increases.
Example 2
<Synthesis of polymer compounds>
The block copolymer was synthesized by a sequential monomer addition method. First, a glass container equipped with a three-way stopcock was heated at 250 ° C. in a nitrogen atmosphere to sufficiently dry the inside of the container. After returning the system to room temperature, 4 mmol of (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether, 10 mmol of ethyl acetate, 0.04 mmol of 1-isobutoxyethyl acetate and 6.2 ml of toluene were added, and when the system temperature reached 0 ° C., ethylaluminum sesquioxide was added. Polymerization was started by adding 0.2 mmol of chloride. When the polymerization was almost completed, block copolymerization was performed by adding 3 ml of a toluene solution containing 0.2 mmol of octadecyl vinyl ether as the second monomer. The polymerization was stopped by adding 3 ml of methanol containing a small amount of aqueous ammonia in the system. Dichloromethane was added to the mixed solution after the reaction to dilute, and the mixture was washed 3 times with a 0.6N hydrochloric acid solution and then 3 times with distilled water. The obtained reaction product was concentrated with an evaporator and then vacuum-dried to obtain a target polymer. The compound was identified using NMR and GPC. As a result, a polymer having Mn = 16700 and Mw / Mn = 1.14 was obtained. In the obtained polymer, the copolymerization ratio of octadecyl vinyl ether / (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether was 100/5.
[0056]
A polymer with Mn = 9300 and Mw / Mn = 1.16 was obtained in the same manner as in the synthesis of the polymer with Mn = 16700 described above, except that the amount of (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether was 2.6 mmol. In the obtained polymer, the copolymerization ratio of octadecyl vinyl ether / (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether was 66/5.
[0057]
Further, in the synthesis of the polymer having Mn = 16700 described above, a polymer having Mn = 6900 and Mw / Mn = 1.13 was obtained in the same manner except that the amount of (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether was changed to 1.3 mmol. In the obtained polymer, the copolymerization ratio of octadecyl vinyl ether / (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether was 33/5.
<Calcein release temperature>
Each of the octadecyl vinyl ether- (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether copolymers having molecular weights of 6900, 9300, and 16700 is retained, and a dispersion of liposomes encapsulating calcein is prepared, and the temperature of each dispersion is 10 ° C. to 50 ° C. The calcein release rate was monitored.
[0058]
The results are shown in FIG. FIG. 3 shows that calcein is released in a narrow temperature range as the molecular weight of the polymer compound increases.
[0059]
The liposome dispersions were incubated at 25 ° C. and 40 ° C., and the calcein release rate was monitored. The results are shown in FIG. FIG. 4 shows that calcein can be released in a shorter time as the molecular weight increases.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between the temperature of an aqueous solution of poly (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether having number average molecular weights of 5300 (A), 8300 (B) and 15800 (C) and the transmittance at 500 nm.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between the critical solution temperature concentration and the critical solution temperature of an aqueous solution of poly (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether.
FIG. 3 is a graph showing the relationship between temperature and calcein release temperature for liposomes holding an octadecyl vinyl ether- (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether copolymer and encapsulating calcein as a fluorescent substance.
FIG. 4 is a graph showing calcein release rates over time at 25 ° C. and 40 ° C. of liposomes holding octadecyl vinyl ether- (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether copolymer and encapsulating calcein as a fluorescent substance.

Claims (4)

The following formula 1:
[Formula 1]

(In the formula, R ¹ is a hydrogen atom, a substituent represented by the following formula 2 or a substituent obtained from a conventionally known compound as an initiator for living cationic polymerization, and R ² is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. R ³ is a hydrocarbon group having 8 to 30 carbon atoms, R ⁴ is a hydrogen atom, an alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, or a substituent obtained from a conventionally known compound as a terminator for living cationic polymerization. M is 5 to 500, n is 1 to 10, and y is 0 to 100.)
[Formula 2]

Wherein X is the same or different and is a hydrogen atom or a halogen atom such as a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom. R ¹¹ is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, an ether group, An oxyethylene group or an aryl group.)
The temperature sensitive liposome which hold | maintained the high molecular compound which has a heat-responsive part represented by these, and a hydrophobic part to the liposome membrane through the hydrophobic part at least . The temperature-sensitive liposome according to claim 1, wherein the polymer compound is synthesized by living cationic polymerization. The temperature-sensitive liposome according to claim 1 or 2 , wherein a target substance is encapsulated therein. The target substance is a substance selected from the group consisting of a gene, a pharmaceutical, a cosmetic, a fragrance, a spice, a pigment, a dye, a two-component hair dye or a decoloring agent, and a two-component curing agent. Item 4. The temperature-sensitive liposome according to item 3 .

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