JP4233160B2

JP4233160B2 - Determination of homocysteine

Info

Publication number: JP4233160B2
Application number: JP34700398A
Authority: JP
Inventors: 宏幸海老沼; 幸司牛澤
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 1998-12-07
Publication date: 2009-03-04
Anticipated expiration: 2018-12-07
Also published as: JP2000166597A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホモシステインを含む試料に、チオール化合物共存下で、ホモシステインに反応するアミノ酸合成酵素を作用させ、生成された硫化水素又はチオール化合物置換ホモシステインを測定することを特徴とする簡便で正確なホモシステインの定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体中の蛋白質を構成する硫黄含有アミノ酸としては、メチオニン、システイン、シスチンが知られており、生体内では、それぞれが一連の代謝サイクルの中で恒常性を維持している。食物中の蛋白質から由来するメチオニンは、通常上記代謝サイクルにより生体内でシステインに代謝される。しかし、代謝酵素自身やその関連因子等の異常により上記代謝サイクルに支障をきたすと、メチオニンはホモシステインに代謝される。
【０００３】
ホモシステインは、正常時にはほとんど存在しない中間代謝物であり、その血液中濃度が高値となると、冠動脈疾患や脳卒中の発生率が高くなるという報告がなされている。ホモシステインの生体内動態は、関連酵素及びその補酵素であるビタミンＢ１２や葉酸の存在と関連付けられ注目されており、心筋梗塞や脳梗塞などの血栓塞栓症あるいは動脈硬化症において、独立したリスクファクターとして確立されつつある。
【０００４】
ホモシステインの酵素的定量法において、使用される酵素としては、脱硫及び脱アミノ反応を触媒するＬ−メチオニンγ−リアーゼやホモシステインデスルフハイドラーゼなどが知られている。
【０００５】
Ｌ−メチオニンγ−リアーゼ（ＥＣ４．４．１．１１）は、ホモシステインとチオール化合物の存在下でγ置換反応を触媒し、硫化水素並びにチオール化合物置換ホモシステインを生成する作用を有すると共に、チオール化合物非存在下では脱離反応（脱硫及び脱アミノ）を触媒する作用も有する２面性を持った酵素で、一部の細菌（シュードモナス属及びクロストリジウム属）で産生が認められるのみであった。
【０００６】
更に、ホモシステインデスルフハイドラーゼ（ＥＣ４，４，１，２）に関しても、真菌類（トリコモナス属）にその存在が確認されているのみであった。
【０００７】
一方、アミノ酸合成酵素であるＯ−アセチルホモセリン−リアーゼ（Ｏ−アセチルホモセリン−スルフハイドリラーゼあるいはメチオニン合成酵素、ＥＣ４．２．９９．１０）が、Ｏ−アセチルホモセリンとメタンチオールからメチオニンと酢酸、又はＯ−アセチルホモセリンと硫化水素からホモシステインと酢酸を生成することは知られており、「酵素ハンドブック」（丸尾ら監修、朝倉書店、１９８２年）にも記載されている。
【０００８】
しかしながら、上記アミノ酸合成酵素が、ホモシステインとチオール化合物の存在下でγ置換反応を触媒し、硫化水素ならびにチオール化合物置換ホモシステインを生成する作用を有することは知られていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このように、上述したＬ−メチオニンγ−リアーゼとホモシステインデスルフハイドラーゼ以外で、ホモシステインに対して分解作用を有する酵素の存在は知られていないのが現状であった。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、ホモシステインに作用する新規な酵素反応を利用した簡便で正確なホモシステインの定量法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは、ホモシステインの分析に利用可能な酵素の探索を行った結果、アミノ酸合成酵素である酵素番号ＥＣクラス４．２．９９に属するＯ−アセチルホモセリン−リアーゼを種々のチオール化合物存在下においてホモシステインに作用させると、特異性よくホモシステインを分解することを見出した。更に、上記アミノ酸合成酵素による反応は、Ｌ−メチオニンγ−リアーゼと同様に、ホモシステインと種々のチオール化合物のγ置換反応によるものであるが、脱離反応が認められないことから、Ｌ−メチオニンγ−リアーゼとは異なる機構でホモシステインに作用することが確認された。
【００１２】
本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであり、ホモシステインを含む試料に、チオール化合物の存在下、酵素番号ＥＣクラス４．２．９９に属するＯ−アセチルホモセリン−リアーゼを作用させ、生成された硫化水素又はチオール化合物置換ホモシステインを測定することを特徴とするホモシステインの定量法を提供するものである。
【００１４】
また、ホモシステインに反応するアミノ酸合成酵素を作用させる時、共存させるチオール化合物が、メタンチオール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリセロール、システアミンから選ばれた１つであることが好ましい。
【００１５】
本発明によれば、ホモシステインを含む試料に、チオール化合物の存在下で、酵素番号ＥＣクラス４．２．９９に属するＯ−アセチルホモセリン−リアーゼを作用させることにより、ホモシステインとチオール化合物のγ置換反応によって、ホモシステインが特異性よく分解され、硫化水素及びチオール化合物置換ホモシステインが生成される。したがって、生成された硫化水素又はチオール化合物置換ホモシステインを測定することにより、試料中のホモシステイン含量を、正確にかつ簡便に定量することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるＯ−アセチルホモセリン−リアーゼは、それを産生する微生物から得ることができる。その微生物としては、細菌ではバチルス属等、酵母ではサッカロミセス属、真菌ではニューロスポラ属（Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２４６，９５−１０２，１９７１）が知られている。例えば、山縣らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８０，７７７−７８５，１９７６）によって、サッカロミセスセルビシエよりＯ−アセチルホモセリン−リアーゼを精製することができる。また、Ｏ−アセチルホモセリン−リアーゼは、市販されているものもあり、例えばユニチカ株式会社等から入手できる。ユニチカ株式会社製のバチルス属由来のＯ−アセチルホモセリン−リアーゼの理化学的性質は次の通りである。なお、下記理化学的性質のうち、分子量以外の項目は、本発明者らにより求めたものである。
【００１７】
＜理化学的性質＞
１）作用：Ｌ−ホモシステインとチオール化合物のγ置換反応を触媒し、硫化水素及びチオール化合物置換ホモシステインを生成する。また、Ｌ−メチオニンとチオール化合物の置換反応を触媒し、メタンチオール及びチオール化合物置換ホモシステインを生成する。
２）基質特異性：Ｌ−ホモシステイン、Ｌ−メチオニンに作用する。また、Ｌ−システインにはβ置換反応として若干反応する。
３）分子量：１８０，０００（ゲル濾過法）
４）至適ｐＨ：８．５〜９．０
５）Ｋｍ：０．９ｍＭ（Ｌ−ホモシステイン）
【００１８】
本発明で用いられるチオール化合物は、メタンチオール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリセロール、システアミンなど、置換反応が行えるものであれば特に制限なく、好適なものとしては、２−メルカプトエタノールやシステアミンが挙げられる。
【００１９】
本発明のホモシステインの定量法は、反応過程あるいは、反応生成物を利用して測定する方法であり、次にその内容を説明する。
【００２０】
（１）硫化水素を利用する方法
本酵素をチオール化合物共存下で、ホモシステインに作用させると硫化水素が発生する。その硫化水素を定量する方法は、公知の方法を使用することができ、硫化水素を直接定量する方法のみならず、硫化水素に起因する硫化物イオンを定量する方法であってもよい。例えば、▲１▼酸性条件下で酢酸鉛紙の黒変を検出する方法、▲２▼亜鉛を用いて、生成する硫化亜鉛の沈殿を検出する方法、さらに発色検出として、▲３▼ニトロプルシッドナトリウムとの反応では、アルカリ条件下、イオウイオンとして紫色に発色させる方法、▲４▼強酸性下で、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンと塩化第二鉄を用いてメチレンブルーを生成させ青色発色を検出する方法などがある。
【００２１】
（２）チオール化合物置換ホモシステインを利用する方法
本酵素をチオール化合物共存下で、ホモシステインに作用させるとチオール化合物置換ホモシステインが生成する。生成したチオール化合物置換ホモシステインは、後述するようにＨＰＬＣ分析を行い、そのピーク面積を数量化することにより定量できる。
【００２２】
また、より高感度に検出する場合は、ラジオアイソトープなどで標識を行ったチオール化合物を用いて標識チオール化合物置換ホモシステインのピークを同様にして検出することで可能となる。
【００２３】
【実施例】
以下、試験例及び実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下の試験例及び実施例では、Ｏ−アセチルホモセリン−リアーゼとして、バチルス属由来のＯ−アセチルホモセリン−リアーゼ（ユニチカ株式会社製）を用いた。以下の説明では、上記Ｏ−アセチルホモセリン−リアーゼを「本酵素」として説明する。
【００２４】
試験例１
２０ｍＭ２−メルカプトエタノール及び１０ｍＭＤＬ−ホモシステイン（アルドリッチ社）を含有する１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に本酵素を添加し、３７℃で反応させ、経時的に反応液中の生成物と反応のモルバランスを、表１に示す条件でＨＰＬＣにて分析した。
【００２５】
【表１】

【００２６】
その結果、反応の進行と共にリテンションタイム６．７分のＤＬ−ホモシステインのピークが減少し、新たにリテンションタイム７．８分の位置に反応生成物のピークが現れた。この反応のモルバランスは一致していた。
【００２７】
試験例２
ＤＬ−ホモシステインをＬ−メチオニンに換え、試験例１と同様の条件で反応させた。また、本酵素と同様の作用を有すると考えられるＬ−メチオニンγ−リアーゼ（和光純薬株式会社製）を本酵素に換えて添加し、同様の条件で反応させ、ＨＰＬＣで分析を行った。
【００２８】
その結果、いずれの場合もリテンションタイム７．８分の位置に反応生成物のピークが現れた。
【００２９】
試験例１及び２の結果において、本酵素をＤＬ−ホモシステイン及びＬ−メチオニンに作用させた場合の反応生成物のリテンションタイムが共に一致していること、更にＬ−メチオニンγ−リアーゼを作用させた場合の反応生成物のリテンションタイムもすべて一致していることから、本酵素の作用は、下記化学式１及び化学式２に示す通り、含硫アミノ酸とチオール化合物の置換反応であることがわかった。
【００３０】
【化１】

【００３１】
【化２】

【００３２】
実施例１（ホモシステインの定量）
２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．２５ｍｌに、２０ｍＭ２−メルカプトエタノールを０．１ｍｌ加え、さらに各種濃度（０〜１００μＭ）のＬ−ホモシスチン（シグマ社製）溶液を０．１ｍｌ加えた後、３７℃で５分間加温した。その液に、Ｏ−アセチルホモセリン−リアーゼ酵素液（２０ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた後、３％ＮａＯＨ液を０．１ｍｌ、１６ｍＭＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩溶液０．３２５ｍｌ及び１０ｍＭ塩化第二鉄塩酸溶液０．０７５ｍｌを順次添加し、室温で１５分放置後、６７０ｎｍの吸光度を測定して検量線を作成した。その結果を図１に示した。
【００３３】
図１に示されるように、この検量線は、０〜２００μＭ（Ｌ−ホモシステイン換算）まで直線となり、本酵素が触媒する置換反応を利用してホモシステインの定量が可能であることが分かった。
【００３４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、ホモシステインを含む試料に、チオール化合物の存在下で、酵素番号ＥＣクラス４．２．９９に属するＯ−アセチルホモセリン−リアーゼを作用させることにより、ホモシステインとチオール化合物のγ置換反応によって、ホモシステインが特異的に分解され、硫化水素及びチオール化合物置換ホモシステインが生成されるので、生成された硫化水素又はチオール化合物置換ホモシステインを測定することにより、試料中のホモシステイン含量を正確にかつ簡便に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法によりホモシステインを反応させて得た検量線を示す図表である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention is a simple method characterized in that an amino acid synthase that reacts with homocysteine is allowed to act on a sample containing homocysteine in the presence of a thiol compound, and the produced hydrogen sulfide or thiol compound-substituted homocysteine is measured. The present invention relates to an accurate method for determining homocysteine.
[0002]
[Prior art]
As sulfur-containing amino acids constituting proteins in living bodies, methionine, cysteine, and cystine are known, and in vivo, each maintains homeostasis during a series of metabolic cycles. Methionine derived from protein in food is normally metabolized to cysteine in vivo by the metabolic cycle. However, methionine is metabolized to homocysteine if it interferes with the metabolic cycle due to abnormalities such as metabolic enzymes themselves or related factors.
[0003]
It has been reported that homocysteine is an intermediate metabolite that hardly exists in normal times, and that the incidence of coronary artery disease and stroke increases when the blood concentration becomes high. The in vivo kinetics of homocysteine has been attracting attention in connection with the presence of related enzymes and their coenzymes, vitamin B12 and folic acid, and is an independent risk factor in thromboembolism or arteriosclerosis such as myocardial infarction and cerebral infarction. It is being established as.
[0004]
In the enzymatic determination method of homocysteine, L-methionine γ-lyase and homocysteine desulfhydrase that catalyze desulfurization and deamination reactions are known as enzymes to be used.
[0005]
L-methionine γ-lyase (EC 4.4.11.11) catalyzes a γ substitution reaction in the presence of homocysteine and a thiol compound to generate hydrogen sulfide and thiol compound substituted homocysteine, In the absence of the compound, it was a dual-sided enzyme that also acts to catalyze elimination reactions (desulfurization and deamination), and was only produced in some bacteria (genus Pseudomonas and Clostridium).
[0006]
Furthermore, the presence of homocysteine desulfhydrase (EC 4, 4, 1, 2) was only confirmed in fungi (genus Trichomonas).
[0007]
On the other hand, O-acetylhomoserine-lyase (O-acetylhomoserine-sulfhydrylase or methionine synthase, EC 4.2.9.10), which is an amino acid synthase, is methionine and acetic acid from O-acetylhomoserine and methanethiol. Alternatively, it is known to produce homocysteine and acetic acid from O-acetylhomoserine and hydrogen sulfide, and is also described in “Enzyme Handbook” (supervised by Maruo et al., Asakura Shoten, 1982).
[0008]
However, it has not been known that the amino acid synthase has an action of catalyzing a γ-substitution reaction in the presence of homocysteine and a thiol compound to generate hydrogen sulfide and thiol compound-substituted homocysteine.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, the existence of an enzyme having a decomposing action on homocysteine other than the above-described L-methionine γ-lyase and homocysteine desulfhydrase has not been known.
[0010]
Therefore, an object of the present invention is to provide a simple and accurate method for quantifying homocysteine using a novel enzyme reaction that acts on homocysteine.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, as a result of searching for an enzyme that can be used for the analysis of homocysteine, the present inventors have found that O- acetylhomoserine belonging to enzyme number EC class 4.2.99, which is an amino acid synthase. It has been found that when lyase is allowed to act on homocysteine in the presence of various thiol compounds, the homocysteine is degraded with high specificity. Furthermore, the reaction by the amino acid synthase is by γ-substitution reaction between homocysteine and various thiol compounds as in the case of L-methionine γ-lyase, but since no elimination reaction is observed, L-methionine It was confirmed that it acts on homocysteine by a mechanism different from that of γ-lyase.
[0012]
The present invention has been completed based on the above findings, and a sample containing homocysteine is allowed to act on an O-acetylhomoserine lyase belonging to enzyme number EC class 4.2.99 in the presence of a thiol compound, The present invention provides a method for quantifying homocysteine, characterized by measuring the produced hydrogen sulfide or thiol compound-substituted homocysteine.
[0014]
Further, when the amino acid synthase that reacts with homocysteine is allowed to act, the coexisting thiol compound is preferably one selected from methanethiol, 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, thioglycerol, and cysteamine.
[0015]
According to the present invention, homocysteine and thiol compound γ are reacted with a sample containing homocysteine in the presence of a thiol compound by the action of O-acetylhomoserine lyase belonging to enzyme number EC class 4.2.99. By the substitution reaction, homocysteine is decomposed with high specificity, and hydrogen sulfide and thiol compound-substituted homocysteine are produced. Therefore, by measuring the produced hydrogen sulfide or thiol compound-substituted homocysteine, the homocysteine content in the sample can be accurately and easily quantified.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
That it is used in the present invention O - acetyl homoserine - lyase may be obtained from microorganisms producing it. Known microorganisms include the genus Bacillus for bacteria, the genus Saccharomyces for yeast, and the genus Neurospora (JBC, 246, 95-102, 1971) for fungi. For example, O-acetylhomoserine-lyase can be purified from Saccharomyces cerevisiae by the method of Yamazaki et al. (J. Biochem., 80, 777-785, 1976). Some O-acetylhomoserine-lyases are commercially available, and can be obtained, for example, from Unitika Ltd. The physicochemical properties of O-acetylhomoserine lyase derived from the genus Bacillus manufactured by Unitika Ltd. are as follows. In addition, among the following physicochemical properties, items other than the molecular weight were obtained by the present inventors.
[0017]
<Physical and chemical properties>
1) Action: Catalyses a γ-substitution reaction between L-homocysteine and a thiol compound to produce hydrogen sulfide and a thiol compound-substituted homocysteine. Moreover, it catalyzes a substitution reaction between L-methionine and a thiol compound to produce methanethiol and thiol compound-substituted homocysteine.
2) Substrate specificity: acts on L-homocysteine and L-methionine. Moreover, it reacts slightly with L-cysteine as a β substitution reaction.
3) Molecular weight: 180,000 (gel filtration method)
4) Optimum pH: 8.5-9.0
5) Km: 0.9 mM (L-homocysteine)
[0018]
The thiol compound used in the present invention is not particularly limited as long as it can perform a substitution reaction, such as methanethiol, 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, thioglycerol, cysteamine, etc. An example is cysteamine.
[0019]
The method for quantifying homocysteine according to the present invention is a method of measuring using a reaction process or a reaction product, and the contents thereof will be described below.
[0020]
(1) Method using hydrogen sulfide When this enzyme is allowed to act on homocysteine in the presence of a thiol compound, hydrogen sulfide is generated. As a method for quantifying hydrogen sulfide, a known method can be used, and not only a method for directly quantifying hydrogen sulfide, but also a method for quantifying sulfide ions caused by hydrogen sulfide. For example, (1) a method for detecting blackening of lead acetate paper under acidic conditions, (2) a method for detecting precipitation of zinc sulfide formed using zinc, and (3) nitroprusside for color detection. In the reaction with sodium, a purple color is developed as a sulfur ion under alkaline conditions. (4) Under strong acidity, methylene blue is produced using N, N-dimethyl-p-phenylenediamine and ferric chloride to produce blue color. There are methods for detecting color development.
[0021]
(2) Method using thiol compound-substituted homocysteine When this enzyme is allowed to act on homocysteine in the presence of a thiol compound, thiol compound-substituted homocysteine is produced. The produced thiol compound-substituted homocysteine can be quantified by performing HPLC analysis as described later and quantifying the peak area.
[0022]
In addition, detection with higher sensitivity is possible by similarly detecting the peak of the labeled thiol compound-substituted homocysteine using a thiol compound labeled with a radioisotope or the like.
[0023]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although a test example and an Example are given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to this. In the following test examples and examples, O-acetylhomoserine-lyase (manufactured by Unitika Ltd.) derived from the genus Bacillus was used as O-acetylhomoserine-lyase. In the following description, the O-acetylhomoserine lyase is described as “the present enzyme”.
[0024]
Test example 1
The enzyme is added to 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 20 mM 2-mercaptoethanol and 10 mM DL-homocysteine (Aldrich), and reacted at 37 ° C. The molar balance of the reaction was analyzed by HPLC under the conditions shown in Table 1.
[0025]
[Table 1]

[0026]
As a result, the DL-homocysteine peak with a retention time of 6.7 minutes decreased with the progress of the reaction, and a new reaction product peak appeared at a position with a retention time of 7.8 minutes. The molar balance of this reaction was consistent.
[0027]
Test example 2
DL-homocysteine was replaced with L-methionine and reacted under the same conditions as in Test Example 1. In addition, L-methionine γ-lyase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is considered to have the same action as this enzyme, was added in place of this enzyme, reacted under the same conditions, and analyzed by HPLC.
[0028]
As a result, in all cases, a peak of the reaction product appeared at a retention time of 7.8 minutes.
[0029]
In the results of Test Examples 1 and 2, when the enzyme was allowed to act on DL-homocysteine and L-methionine, the retention times of the reaction products were identical, and further, L-methionine γ-lyase was allowed to act. Since the retention times of the reaction products in this case all coincided, it was found that the action of this enzyme is a substitution reaction between a sulfur-containing amino acid and a thiol compound as shown in Chemical Formula 1 and Chemical Formula 2 below.
[0030]
[Chemical 1]

[0031]
[Chemical formula 2]

[0032]
Example 1 (Quantification of homocysteine)
After adding 0.1 ml of 20 mM 2-mercaptoethanol to 0.25 ml of 200 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), and further adding 0.1 ml of L-homocystine (manufactured by Sigma) at various concentrations (0 to 100 μM). And warmed at 37 ° C. for 5 minutes. To the solution, 0.05 ml of O-acetylhomoserine-lyase enzyme solution (20 u / ml) was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes, then 0.1 ml of 3% NaOH solution, 16 mM N, N-dimethyl-p. -0.325 ml of a phenylenediamine / sulfate solution and 0.075 ml of 10 mM ferric chloride and hydrochloric acid solution were sequentially added and left at room temperature for 15 minutes, and then the absorbance at 670 nm was measured to prepare a calibration curve. The results are shown in FIG.
[0033]
As shown in FIG. 1, this calibration curve was a straight line from 0 to 200 μM (in terms of L-homocysteine), and it was found that homocysteine can be quantified using a substitution reaction catalyzed by this enzyme. .
[0034]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a sample containing homocysteine is allowed to react with O-acetylhomoserine-lyase belonging to enzyme number EC class 4.2.99 in the presence of a thiol compound, thereby allowing homocysteine to act. Homocysteine is specifically decomposed by the γ-substitution reaction between cysteine and thiol compound, and hydrogen sulfide and thiol compound-substituted homocysteine are produced. By measuring the produced hydrogen sulfide or thiol compound-substituted homocysteine, The homocysteine content in the sample can be accurately and easily quantified.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a chart showing a calibration curve obtained by reacting homocysteine by the method of the present invention.

Claims

O-acetylhomoserine-lyase belonging to enzyme number EC class 4.2.99 is allowed to act on a sample containing homocysteine in the presence of a thiol compound, and the generated hydrogen sulfide or thiol compound-substituted homocysteine is measured. Characteristic method for homocysteine determination.

When the action of amino acid synthetase reacting homocysteine, thiol compounds to coexist, methanethiol, 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, thioglycerol, homo claim 1 Symbol placement is one selected from cysteamine Cysteine quantification method.