JP4227339B2

JP4227339B2 - Exfoliated cell recovery device, exfoliated cell recovery method and program thereof

Info

Publication number: JP4227339B2
Application number: JP2002043550A
Authority: JP
Inventors: 良太梅垣; 正博紀ノ岡; 正仁田谷
Original assignee: 正仁田谷; 株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング
Priority date: 2002-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2009-02-18
Anticipated expiration: 2022-02-20
Also published as: JP2003235541A; US20030157714A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、剥離細胞回収装置、剥離細胞回収方法及びそのプログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒト組織をインビトロ(in vitro)で培養し、培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されている。特にヒト皮膚組織については、欧米において商品化レベルにまで達している。ここで、ヒト皮膚組織、例えばヒト表皮角化細胞(Keratinocyte)による培養細胞シートの製品化のフローを図５に基づいて説明する。まず、患者又はドナーの健康な部位から少量の組織片を採取し、酵素処理によって細胞を分散させた後、角化細胞を分離・回収する（ステップＳ１）。次に、その角化細胞を用いて初代培養を行う（ステップＳ２）。その後、初代培養で増殖させた細胞を別の複数の培養容器に分けて接種（播種）し（ステップＳ３）、培地交換等の操作を必要に応じて行うと、細胞が培養面に接着したあと増殖して培養面での細胞の占める面積が徐々に増加し、所定面積に達してコンフルエントな状態となる（ステップＳ４）。このとき、製品として総合的に必要となる十分な面積（細胞数）が確保されたか否かをチェックし（ステップＳ５）、確保されていなければ培地を除去したあと培養面に接着している細胞をトリプシンなどのプロテアーゼによって培養面から剥離させたあと回収し（ステップＳ６）、必要な面積が確保されるまで継代培養を繰り返し行うことで面積を増やす。一方、必要な面積が確保されたならば、組織構築のために三次元培養（重層化）を施し（ステップＳ７）、これを移植用の培養細胞シートとして病院へ輸送し、移植を行う（ステップＳ８）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ステップ６の剥離操作において、プロテアーゼの処理時間が長いと、細胞がダメージを受けてその後の継代培養に支障が生じることがある。このため、剥離操作において、時間経過に伴って細胞の剥離状況を逐次把握することにより、プロテアーゼ処理時間の最適化を図ることが望ましい。
【０００４】
一方、ステップ６の剥離操作におけるプロテアーゼの処理では、細胞が剥離するまでに要する時間が個々の細胞で異なるため、この点も考慮して培養面から剥離した細胞を回収することが望ましい。
【０００５】
本発明は上述した問題点を解決することを課題とするものであり、接着面から剥離した細胞を適切に回収できる剥離細胞回収装置、剥離細胞回収方法及びそのプログラムを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
本発明は上述した目的を達成するために以下の構成を採用した。
【０００７】
本発明の第１は、接着依存性細胞が接着している培養容器に剥離剤を投入したあとの経過時間を計測する計時手段と、前記培養容器内の細胞を回収可能な細胞回収手段と、前記計時手段によって計測された前記経過時間に基づいて、前記剥離剤によって前記培養容器から剥離した接着依存性細胞を前記細胞回収手段に分類分けして回収させる分類回収制御手段とを備えた剥離細胞回収装置に関する。この剥離細胞回収装置では、接着依存性細胞が接着している培養容器に剥離剤を投入したあとの経過時間に基づいて、その剥離剤によって培養容器から剥離した接着依存性細胞を分類分けして回収する。したがって、剥離剤によって培養容器から早期に剥離する細胞やある程度時間が経過してから剥離する細胞を適切に分類し、回収することができる。また、剥離した細胞から順に回収することで剥離剤による細胞ダメージを抑えることができる。
【０００８】
ここで、「接着依存性細胞」とは、まず培養容器の所定の面に直接接着するか又は細胞外マトリックスを介して間接的に接着し、次いでその接着面積が広がっていき、その後細胞分裂する細胞のことをいう。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が挙げられる。この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、胚性幹細胞を使用することもできる。或いは、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチゲーター、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロモータを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。また、細胞外マトリックスとしては、例えば、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等が挙げられる。
【０００９】
また、「培養容器」としては、細胞が培養できるものであれば特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン等の合成樹脂、ヒドロキシアパタイトセラミックス、アルミナセラミックス、ガラス等から構成されたものが好適に使用される。
【００１０】
本発明の第１の剥離細胞回収装置において、前記培養容器内に新たな剥離剤を投入する剥離剤投入手段を備え、前記分類回収制御手段は、前記経過時間に基づいて、前記細胞回収手段に前記剥離剤を全量回収させることによりその時点で前記培養容器から剥離した接着依存性細胞を全量回収したあと前記剥離剤投入手段に新たな剥離剤を前記培養容器へ投入させてもよい。こうすれば、剥離剤によって剥離するまでに要した時間がほぼ同じ接着依存性細胞を回収することができる。例えば、培養容器内の剥離剤の全量を回収したあと新たな剥離剤を投入するという工程を時間経過に伴って繰り返し実行してもよい。
【００１１】
本発明の第１の剥離細胞回収装置において、前記培養容器内に新たな剥離剤を投入する剥離剤投入手段を備え、前記分類回収制御手段は、前記経過時間に基づいて、前記細胞回収手段に前記剥離剤の一部を回収させることにより該剥離剤に含まれる前記培養容器から剥離した接着依存性細胞を回収しつつ前記剥離剤投入手段に新たな剥離剤を前記培養容器に投入させてもよい。こうすれば、液体クロマトグラフィのフラクションコレクタと同様の原理を用いて、剥離剤によって剥離するまでに要した時間がほぼ同じ接着依存性細胞を回収することができる。
【００１２】
本発明の第１の剥離細胞回収装置において、前記分類回収制御手段は、前記計時手段によって計測された経過時間が予め定めた所定の初期時間に達したとき前記培養容器から剥離した接着依存性細胞を前記細胞回収手段に初期分類として回収させ、その後前記剥離剤によって前記培養容器から剥離した接着依存性細胞を前記細胞回収手段に本分類として回収させてもよい。こうすれば、例えば剥離剤によって培養容器から早期に剥離する細胞とある程度時間が経過してから剥離する細胞との間に能力（例えば増殖能等）の差があるような場合に、その能力差に応じて細胞を分取することができる。
【００１３】
本発明の第１の剥離細胞回収装置において、前記分類回収制御手段は、前記計時手段によって計測された経過時間が予め定めた所定の初期時間に達したとき前記培養容器から剥離した接着依存性細胞を前記細胞回収手段に初期分類として回収させ、その後前記経過時間が予め定めた所定の後期時間に達するまで前記剥離剤によって前記培養容器から剥離した接着依存性細胞を前記細胞回収手段に中期分類として回収させ、その後前記剥離剤によって前記培養容器から剥離した接着依存性細胞を前記細胞回収手段に終期分類として回収させてもよい。こうすれば、例えば剥離剤によって培養容器から早期に剥離する細胞と中程度の時間が経過してから剥離する細胞と長時間経過してから剥離する細胞との間に能力差や細胞へのダメージ差があるような場合に、その能力差やダメージの程度に応じて細胞を分取することができる。なお、本発明ではこのように初期、中期、終期分類の３つに分けてもよいが、必要に応じて経過時間を細分化して分類数を４つ以上に増やしてもよい。
【００１４】
本発明の第２は、コンピュータを、本発明の第１の剥離細胞回収装置の少なくとも前記分類回収制御手段として機能させるためのプログラムに関する。また、本発明の第３は、コンピュータに、接着依存性細胞が接着している培養容器に剥離剤を投入したあとの経過時間に基づいて、前記剥離剤によって前記培養容器から剥離した接着依存性細胞を、前記培養容器内の細胞を回収可能な細胞回収手段によって分類分けして回収させる工程を実行させるためのプログラムに関する。これらのプログラムは、コンピュータが読み取り可能な記録媒体（例えばハードディスク、ＲＯＭ、ＦＤ、ＣＤ、ＤＶＤなど）に記録されていてもよいし、伝送媒体（インターネットやＬＡＮなどの通信網）を介してあるコンピュータから別のコンピュータへ送信されてもよいし、その他どのような形で授受されてもよい。これらのプログラムをコンピュータに実行させれば、本発明の第１の剥離細胞回収装置と同様の作用効果を得ることができる。
【００１５】
本発明の第４は、接着依存性細胞が接着している培養容器に剥離剤を投入したあとの経過時間に基づいて、前記剥離剤によって前記培養容器から剥離した接着依存性細胞を分類分けして回収する工程を含む剥離細胞回収方法に関する。この方法によれば、剥離剤によって培養容器から早期に剥離する細胞やある程度時間が経過してから剥離する細胞を適切に分類し、回収することができる。また、剥離した細胞から順に回収することで剥離剤による細胞ダメージを抑制することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
［第１実施形態］
図１は本実施形態の剥離細胞回収装置の概略構成図である。本実施形態の剥離細胞回収装置５０は、支持台５１と、培養容器６０と、計時手段及び分類回収制御手段としての制御装置５７とを備えている。
【００１７】
支持台５１は、培養容器６０を固定して支持し、一端に回動軸５１ａが設けられ、他端に電動シリンダ５６のロッドの先端が取り付けられている。電動シリンダ５６は制御装置５７からの指令信号によってロッドを伸縮させ、ロッドが伸長すると支持台５１は水平状態となり（図１（ａ）参照）、ロッドが没入すると支持台５１は傾斜状態となる（図１（ｂ）参照）。
【００１８】
培養容器６０は、底面に接着し培地内で増殖して継代培養に適した状態になった接着依存性細胞（以下単に細胞という）６１を有している。この培養容器６０の近傍には、培養容器６０内に剥離剤であるトリプシン溶液を注入可能な注入管５２が設けられ、この注入管５２には注入管５２を開閉するソレノイドバルブ５３が取り付けられている。また、培養容器６０は内容物を排出可能な排出管５４を備えており、この排出管５４には排出管５４を開閉するソレノイドバルブ５５が取り付けられ、排出管５４の出口には回収容器６５が設置されている。各ソレノイドバルブ５３，５５は、制御装置５７からの指令信号に基づいて開閉が制御される。なお、ソレノイドバルブ５３及び注入管５２が剥離剤投入手段に相当し、支持台５１、電動シリンダ５６、ソレノイドバルブ５５の付いた排出管５４及び回収容器６５が細胞回収手段に相当する。
【００１９】
制御装置５７は、周知のＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、タイマ等で構成されている。この制御装置５７は、タイマにより計時すると共に、各ソレノイドバルブ５３，５５や電動シリンダ５６に指令信号を出力する。
【００２０】
次に、トリプシン処理時間と細胞の増殖能力との関係について説明する。まず培養容器として７５ｃｍ²のＴ型フラスコ（ヌンク社）、細胞としてヒト角化細胞である０才（包皮）ドナー由来の細胞（ＫＫ−４００９，倉敷紡績（株））、培地としてヒト角化細胞用無血清培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２，倉敷紡績（株））を用いて、温度３７℃、５％ＣＯ₂含有エアという条件下でコンフルエント状態になるまで培養した。このような底面に細胞が接着している培養容器を複数作製した。続いて、各培養容器に培地を排出しリンスしたあとトリプシン溶液を滴下し、トリプシン溶液滴下後の経過時間（以下、トリプシン処理時間という）が３分、６分、９分、１２分、１５分となった時点で各１つの培養容器にトリプシンインヒビタを投入してトリプシンの作用を停止させ、その後溶液（剥離状態の細胞を含む）を培養容器から回収し遠心分離したあと得られた剥離細胞につき増殖能力の一指標である倍加時間を調べたところ、表１に示す結果が得られた。この表１から分かるように、トリプシン処理時間が３分及び１５分の剥離細胞では増殖能力が低くなっている。これは、処理時間が３分では分化により接着能力や増殖能力の低くなった細胞群が優先的に浮遊し、１５分では過度のトリプシン処理による障害で活性の低下が引き起こされたためと考えられる。このようにトリプシン処理時間は細胞の増殖能力と密接に関係していることから、トリプシン処理時間を細胞増殖能力の一指標と見ることができる。したがって、トリプシン処理時間に応じて剥離細胞を分類分けして回収すれば、同様の細胞増殖能力を持つ細胞ごとの回収が可能となる。
【００２１】
【表１】

【００２２】
次に、この剥離細胞回収装置５０の動作について説明する。オペレータにより入力装置であるキーボードから制御装置５７に剥離操作開始の指令が入力されると、制御装置５７は内部メモリに記憶されている剥離操作プログラムを読み出してこれを実行する。図２はこの剥離操作プログラムのフローチャートである。このプログラムが開始されると、制御装置５７は、まず排出管５４のソレノイドバルブ５５を閉鎖し注入管５２のソレノイドバルブ５３を開放してトリプシン溶液を培養容器６０内に所定量投入したあとソレノイドバルブ５３を閉鎖し（ステップＳ２００）、ソレノイドバルブ５３を閉鎖すると同時にタイマによりトリプシン処理時間の計測を開始する（ステップＳ２１０）。なお、培養容器６０はトリプシン溶液を投入する前に培地を排出しリンスしておく。そして、トリプシン処理時間が予め定めた時間ｔ１となった時点で電動シリンダ５６のロッドを没入させて支持台５１を傾斜させると共に、排出管５４のソレノイドバルブ５５を開放して培養容器６０のトリプシン溶液を剥離細胞６１と共に排出管５４から回収容器６５へ回収する（ステップＳ２２０）。ここで、時間ｔ１は比較的短い時間（例えば３分とか５分）に設定されており、回収容器６５には早期に剥離した細胞６１が初期分類として回収される。
【００２３】
そして、回収終了後、電動シリンダ５６のロッドを伸長させて支持台５１を水平状態に戻すと共に新たな回収容器６５を設置し（ステップＳ２３０）、次いで排出管５４のソレノイドバルブ５５を閉鎖し注入管５２のソレノイドバルブ５３を開放してトリプシン溶液を培養容器６０内に所定量投入したあとソレノイドバルブ５３を閉鎖し（ステップＳ２４０）、ソレノイドバルブ５３を閉鎖すると同時にトリプシン処理時間の計測を再開する（ステップＳ２５０）。そして、トリプシン処理時間がトータルで予め定めた時間ｔ２となった時点で電動シリンダ５６のロッドを没入させて支持台５１を傾斜させると共に、排出管５４のソレノイドバルブ５５を開放して培養容器６０のトリプシン溶液を剥離細胞６１と共に排出管５４から回収容器６５へ回収する（ステップＳ２６０）。ここで、時間ｔ２は比較的長い時間（例えば１２分とか１５分）に設定されており、回収容器６５にはある程度時間が経過してから剥離した細胞６１が本分類として回収される。そして、回収終了後、電動シリンダ５６のロッドを伸長させて支持台５１を水平状態に戻すと共に新たな回収容器６５を設置し（ステップＳ２７０）、このプログラムを終了する。
【００２４】
以上詳述した本実施形態の剥離細胞回収装置５０によれば、トリプシンによって培養容器６０の底面から早期に剥離する細胞やある程度時間が経過してから剥離する細胞を適切に分類分けして回収することができる。また、０才ドナー由来の細胞のように、トリプシンによって培養容器６０から早期に剥離した細胞とある程度時間が経過してから剥離した細胞との間に増殖能力に差があるような場合に、その増殖能力の差に応じて細胞を分取することができるため好ましい。
【００２５】
なお、図２のフローチャートにおいて、必要に応じてステップＳ２７０のあとに更にステップＳ２４０〜Ｓ２７０の処理を１回以上繰り返し実行してもよい。このときステップＳ２６０の時間ｔ２を時間ｔ３等に適宜変更する。こうすれば、０才ドナー由来の細胞のように、トリプシンによって培養容器６０から早期に剥離した細胞と中程度の時間が経過してから剥離した細胞と長時間経過してから剥離した細胞との間に増殖能力に差があるような場合に、その増殖能力の差に応じて細胞を分取することができるため好ましい。
【００２６】
［第２実施形態］
図３は本実施形態の剥離細胞回収装置の概略構成図である。本実施形態の剥離細胞回収装置７０は、支持台７１と、培養容器８０と、計時手段及び分類回収制御手段としての制御装置７７とを備えている。
【００２７】
支持台７１は、培養容器８０を傾斜した状態で固定して支持している。
【００２８】
培養容器８０は、底面に接着し培地内で増殖してコンフルエントな状態になった細胞８１を有している。支持台７１に傾斜した状態で支持されている培養容器８０の最も高い位置の近傍には、培養容器８０内に剥離剤であるトリプシン溶液を注入可能な注入管７２が設けられ、この注入管７２には注入管７２を開閉するソレノイドバルブ７３が取り付けられている。また、培養容器８０の最も低い位置の近傍には、内容物を排出可能な排出管７４が設けられ、この排出管７４には排出管７４を開閉するソレノイドバルブ７５が取り付けられている。各ソレノイドバルブ７３，７５は、制御装置７７からの指令信号に基づいて開閉が制御される。
【００２９】
回収容器９１〜９３は、駆動輪９５と従動輪９６との間に架け渡されたベルトコンベア９７に載置され、制御装置７７の指令信号に応じて駆動輪９５が回転しベルトコンベア９７が移動するのに伴って移動する。ここでは、当初、排出管７４の出口と合致した位置には回収容器９１が配置され、時間の経過に伴って回収容器９２、回収容器９３が同位置に配置される。ここで、支持台７１、ソレノイドバルブ７５の付いた排出管７４、回収容器９１〜９３、駆動輪９５、従動輪９６及びベルトコンベア９７が細胞回収手段に相当する。
【００３０】
制御装置７７は、周知のＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、タイマ等で構成されている。この制御装置７７は、タイマにより計時すると共に、各ソレノイドバルブ７３，７５や駆動輪９５に指令信号を出力する。
【００３１】
次に、この剥離細胞回収装置７０の動作について説明する。オペレータにより入力装置であるキーボードから制御装置７７に剥離操作開始の指令が入力されると、制御装置７７は内部メモリに記憶されている剥離操作プログラムを読み出してこれを実行する。なお、培養容器８０は予め培地を排出しリンスしておく。図４はこの剥離操作プログラムのフローチャートである。このプログラムが開始されると、制御装置７７は、まず注入管７２のソレノイドバルブ７３及び排出管７４のソレノイドバルブ７５の開度を調節してトリプシン溶液が培養容器８０内に所定流量で流れるようにし（ステップＳ３００）、同時にタイマによりトリプシン処理時間の計測を開始する（ステップＳ３１０）。すると、排出管７４の出口と合致する位置の回収容器９１には培養容器８０からの流出液が溜まっていく。なお、ステップＳ３００では、培養容器８０内に当初の液量がほぼ維持されるようにバルブ７３，７５を調節する。
【００３２】
そして、トリプシン処理時間が時間ｔ１１となった時点で回収容器９１を回収容器９２に更新する（ステップＳ３２０）。即ち、駆動輪９５に指令信号を出力して駆動輪９５を回転させベルトコンベア９７を移動させることにより、次の回収容器９２が排出管７４の出口と合致する位置に来るようにする。すると、回収容器９２には培養容器８０からの流出液が溜まっていく。なお、回収容器９１にはトリプシンインヒビタを添加してトリプシンの作用を停止させる。
【００３３】
そして、トリプシン処理時間が時間ｔ１２（＞ｔ１１）となった時点で回収容器９２を回収容器９３に更新する（ステップＳ３３０）。即ち、駆動輪９５に指令信号を出力して駆動輪９５を回転させベルトコンベア９７を移動させることにより、次の回収容器９３が排出管７４の出口と合致する位置に来るようにする。すると、回収容器９３には培養容器８０からの流出液が溜まっていく。なお、回収容器９２にはトリプシンインヒビタを添加してトリプシンの作用を停止させる。
【００３４】
そして、トリプシン処理時間が予め定めた終了時間となった時点でソレノイドバルブ７３を閉鎖してトリプシン溶液の供給を停止し、培養容器８０の内部が空になったあとソレノイドバルブ７５を閉鎖し（ステップＳ３４０）、このプログラムを終了する。なお、回収容器９３にはトリプシンインヒビタを添加してトリプシンの作用を停止させる。また、終了時間は、培養容器８０の底面に接着した細胞８１のすべてがトリプシンの作用により剥離するのに要する時間として予め経験的に定められたものである。
【００３５】
以上詳述した本実施形態の剥離細胞回収装置７０によれば、トリプシンによって培養容器８０の底面から早期に剥離する細胞やある程度時間が経過してから剥離する細胞を適切に分類分けして回収することができる。また、０才ドナー由来の細胞のように、トリプシンによって培養容器８０の底面から早期に剥離した細胞と中程度の時間が経過してから剥離した細胞と長時間経過してから剥離した細胞との間に増殖能力に差があるような場合に、その増殖能力の差に応じて細胞を分取することができるため好ましい。
【００３６】
なお、図４のフローチャートにおいて、必要に応じてステップＳ３４０のあとに更にトリプシン処理時間が所定時間となった時点で回収容器を更新してもよく、この更新操作を何度か繰り返し行ってもよい。こうすれば、トリプシン処理時間をより細分化して細胞を回収することができる。
【００３７】
以上、本発明の実施の形態や実施例について説明したが、本発明はこれらに何等限定されるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施し得ることはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１実施形態の剥離細胞回収装置の概略構成図である。
【図２】第１実施形態の剥離操作プログラムのフローチャートである。
【図３】第２実施形態の剥離細胞回収装置の概略構成図である。
【図４】第２実施形態の剥離操作プログラムのフローチャートである。
【図５】培養細胞シートの製品化のフローである。
【符号の説明】
５０…剥離細胞回収装置、５１…支持台、５１ａ…回動軸、５２…注入管、５３…ソレノイドバルブ、５４…排出管、５５…ソレノイドバルブ、５６…電動シリンダ、５７…制御装置、６０…培養容器、６１…接着依存性細胞、６５…回収容器。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a detached cell collection device, a detached cell collection method, and a program thereof.
[0002]
[Prior art]
In recent years, many techniques for culturing human tissue in vitro and applying the cultured tissue to a patient have been reported. In particular, human skin tissue has reached the level of commercialization in the West. Here, the flow of commercializing a cultured cell sheet using human skin tissue, for example, human keratinocytes, will be described with reference to FIG. First, after collecting a small amount of tissue pieces from a healthy part of a patient or donor and dispersing the cells by enzyme treatment, keratinocytes are separated and collected (step S1). Next, primary culture is performed using the keratinocytes (step S2). After that, the cells grown in the primary culture are inoculated (seeded) separately in a plurality of other culture containers (step S3), and if necessary, such as medium exchange, the cells adhere to the culture surface. It grows and the area occupied by cells on the culture surface gradually increases, reaches a predetermined area, and becomes confluent (step S4). At this time, it is checked whether or not a sufficient area (number of cells) necessary for the product as a whole has been secured (step S5). If not secured, the cells adhered to the culture surface after removing the medium Is removed from the culture surface with a protease such as trypsin and then recovered (step S6), and the subculture is repeated until the required area is ensured to increase the area. On the other hand, if the necessary area is secured, three-dimensional culture (stratification) is performed for tissue construction (step S7), and this is transported to the hospital as a cultured cell sheet for transplantation, and transplantation is performed (step S7). S8).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
By the way, in the peeling operation of Step 6, if the protease treatment time is long, the cells may be damaged and the subsequent subculture may be hindered. For this reason, in the detachment operation, it is desirable to optimize the protease treatment time by sequentially grasping the state of detachment of cells with time.
[0004]
On the other hand, in the protease treatment in the detaching operation in step 6, since the time required for the cells to detach differs for each individual cell, it is desirable to collect the cells detached from the culture surface in consideration of this point.
[0005]
An object of the present invention is to solve the above-described problems, and an object of the present invention is to provide a detached cell collection apparatus, a detached cell collection method, and a program thereof that can appropriately collect cells detached from an adhesive surface. .
[0006]
[Means for Solving the Problems and Effects of the Invention]
The present invention employs the following configuration in order to achieve the above-described object.
[0007]
The first of the present invention is a time measuring means for measuring the elapsed time after putting the release agent into the culture container to which the adhesion-dependent cells are adhered, a cell recovery means capable of recovering the cells in the culture container, Exfoliated cells comprising classification recovery control means for classifying and recovering the adhesion-dependent cells that have been detached from the culture vessel by the release agent based on the elapsed time measured by the timing means to the cell recovery means. It relates to a recovery device. In this exfoliated cell recovery device, the adhesion-dependent cells exfoliated from the culture container by the exfoliant are classified based on the elapsed time after the exfoliant is introduced into the culture vessel to which the adhesion-dependent cells adhere. to recover. Therefore, cells that peel off early from the culture vessel by the release agent and cells that peel after a certain amount of time can be appropriately classified and collected. Moreover, the cell damage by a peeling agent can be suppressed by collect | recovering in order from the peeled cell.
[0008]
Here, “adhesion-dependent cells” are first directly adhered to a predetermined surface of a culture vessel or indirectly adhered via an extracellular matrix, and then the adhesion area expands, and then cell division occurs. Refers to cells. Examples thereof include various cells collected from warm-blooded animals such as humans, mice, rats, guinea pigs, hamsters, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, horses, dogs, cats, monkeys, and the like. Examples of the warm-blooded animal cells include keratinocytes, spleen cells, neurons, glial cells, pancreatic β cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, Muscle cells, adipocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells or adhesion-dependent cancer cells Is mentioned. Embryonic stem cells can also be used. Or an erythropoietin, growth hormone, granulocyte colony-stimulating factor, insulin, interferon, blood coagulation factors such as blood coagulation factor VIII, glucagon, tissue plasminogen activator, dopamine, oncogene, cancer suppressor gene, etc. You may use the transformed cell which introduce | transduced the gene into the said cell, and was configured so that those genes may be forcedly expressed under various conditions using various promoters. Examples of the extracellular matrix include integrin, collagen, elastin, proteoglycan, glycosaminoglycan, glycoprotein and the like.
[0009]
The “culture vessel” is not particularly limited as long as cells can be cultured. For example, synthetic resins such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polycarbonate, polyvinyl chloride, polytetrafluoroethylene, hydroxyapatite ceramics, alumina What consists of ceramics, glass, etc. is used suitably.
[0010]
The first exfoliated cell recovery device of the present invention comprises a exfoliant input means for introducing a new exfoliant into the culture container, and the classification and recovery control means controls the cell recovery means based on the elapsed time. By collecting the entire amount of the release agent and collecting the entire amount of adhesion-dependent cells that have been detached from the culture container at that time, a new release agent may be introduced into the culture container in the release agent feeding means. By doing so, it is possible to recover the adhesion-dependent cells having substantially the same time required for peeling with the release agent. For example, you may repeatedly perform the process of throwing in a new release agent after collect | recovering the whole quantity of the release agent in a culture container with progress of time.
[0011]
The first exfoliated cell recovery device of the present invention comprises a exfoliant input means for introducing a new exfoliant into the culture container, and the classification and recovery control means controls the cell recovery means based on the elapsed time. By collecting a part of the release agent and collecting the adhesion-dependent cells peeled from the culture vessel contained in the release agent, a new release agent can be introduced into the culture vessel while the release agent input means is recovered. Good. In this way, using the same principle as the fraction collector of liquid chromatography, it is possible to collect adhesion-dependent cells that have approximately the same time required for peeling with the release agent.
[0012]
In the first detached cell collection device of the present invention, the classification collection control means includes an adhesion-dependent cell detached from the culture container when the elapsed time measured by the time measuring means reaches a predetermined initial time. May be collected as the initial classification by the cell collection means, and then the adhesion-dependent cells detached from the culture container by the release agent may be collected as the main classification by the cell collection means. In this way, for example, when there is a difference in ability (for example, proliferation ability) between a cell that peels early from the culture vessel by a release agent and a cell that peels after a certain amount of time has elapsed, such as a difference in ability. The cells can be sorted according to
[0013]
In the first detached cell collection device of the present invention, the classification collection control means includes an adhesion-dependent cell detached from the culture container when the elapsed time measured by the time measuring means reaches a predetermined initial time. The cell collection means collects the adhesion-dependent cells detached from the culture container by the release agent until the elapsed time reaches a predetermined later time as the medium classification. The adhesion-dependent cells that have been collected and then detached from the culture vessel by the release agent may be collected by the cell collection means as a terminal classification. In this way, for example, the ability difference between the cells that peel early from the culture vessel by the release agent and the cells that peel after a moderate amount of time and the cells that peel after a long time, or damage to the cells. When there is a difference, cells can be sorted according to the ability difference and the degree of damage. In the present invention, it is possible to divide into three categories, initial, middle and final, as described above. However, if necessary, the elapsed time may be subdivided to increase the number of classifications to four or more.
[0014]
2nd of this invention is related with the program for functioning a computer as at least the said classification | category collection | recovery control means of the 1st detached cell collection | recovery apparatus of this invention. In addition, according to a third aspect of the present invention, based on the elapsed time after the release agent is introduced into the culture vessel in which the adhesion-dependent cells are attached to the computer, the adhesion dependency is released from the culture vessel by the release agent. The present invention relates to a program for executing a step of classifying and collecting cells by a cell collecting means capable of collecting the cells in the culture container. These programs may be recorded on a computer-readable recording medium (for example, hard disk, ROM, FD, CD, DVD, etc.), or a computer via a transmission medium (communication network such as the Internet or LAN). May be sent to another computer, or may be exchanged in any other form. If these programs are executed by a computer, the same effects as those of the first detached cell collection device of the present invention can be obtained.
[0015]
According to a fourth aspect of the present invention, the adhesion-dependent cells detached from the culture container by the release agent are classified based on the elapsed time after the release agent is put into the culture container to which the adhesion-dependent cells are attached. The present invention relates to a detached cell recovery method including a step of recovering. According to this method, it is possible to appropriately classify and collect cells that are peeled off early from the culture container by the peeling agent and cells that are peeled after a certain amount of time has passed. Moreover, the cell damage by a peeling agent can be suppressed by collect | recovering in order from the peeled cell.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[First Embodiment]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a detached cell collection device of the present embodiment. The detached cell collection device 50 according to the present embodiment includes a support base 51, a culture vessel 60, and a control device 57 as a time measuring unit and a classification collection control unit.
[0017]
The support base 51 fixes and supports the culture vessel 60, is provided with a rotating shaft 51a at one end, and is attached with the tip of the rod of the electric cylinder 56 at the other end. The electric cylinder 56 expands and contracts the rod in response to a command signal from the control device 57. When the rod is extended, the support base 51 is in a horizontal state (see FIG. 1A), and when the rod is immersed, the support base 51 is in an inclined state ( (Refer FIG.1 (b)).
[0018]
The culture vessel 60 has an adhesion-dependent cell (hereinafter simply referred to as a cell) 61 that adheres to the bottom surface and grows in the medium and is in a state suitable for subculture. In the vicinity of the culture vessel 60, an injection tube 52 capable of injecting a trypsin solution as a release agent into the culture vessel 60 is provided, and a solenoid valve 53 for opening and closing the injection tube 52 is attached to the injection tube 52. Yes. The culture vessel 60 is provided with a discharge pipe 54 that can discharge the contents. A solenoid valve 55 that opens and closes the discharge pipe 54 is attached to the discharge pipe 54, and a recovery container 65 is provided at the outlet of the discharge pipe 54. is set up. The

solenoid valves

53 and 55 are controlled to open and close based on a command signal from the control device 57. The solenoid valve 53 and the injection pipe 52 correspond to the release agent charging means, and the support base 51, the electric cylinder 56, the discharge pipe 54 with the solenoid valve 55 and the recovery container 65 correspond to the cell recovery means.
[0019]
The control device 57 includes a known CPU, ROM, RAM, timer, and the like. The control device 57 counts time with a timer and outputs a command signal to the

solenoid valves

53 and 55 and the electric cylinder 56.
[0020]
Next, the relationship between trypsin treatment time and cell growth ability will be described. First, a 75 cm ² T-shaped flask (Nunk Co., Ltd.) as a culture container, a human keratinocyte cell derived from a 0-year-old (foreskin) donor (KK-4009, Kurashikibo Co., Ltd.), and a human keratinocyte as a medium Using a serum-free medium (Humdia-KG2, Kurashiki Boseki Co., Ltd.), the cells were cultured until they became confluent under conditions of a temperature of 37 ° C. and air containing 5% CO ₂ . A plurality of culture containers having cells adhered to the bottom surface were prepared. Subsequently, the medium is discharged into each culture vessel and rinsed, and then a trypsin solution is dropped. The elapsed time after the trypsin solution is dropped (hereinafter referred to as trypsin treatment time) is 3, 6, 9, 12, 15 minutes. At this point, trypsin inhibitor is put into each culture container to stop the action of trypsin, and then the detached cells obtained after collecting the solution (including detached cells) from the culture container and centrifuging are collected. When the doubling time, which is an index of proliferation ability, was examined, the results shown in Table 1 were obtained. As can be seen from Table 1, the proliferative capacity of the exfoliated cells with trypsin treatment times of 3 minutes and 15 minutes is low. This is presumably because the cell group having decreased adhesion ability and proliferation ability due to differentiation floated preferentially at the treatment time of 3 minutes, and the activity decreased due to the damage caused by excessive trypsin treatment at 15 minutes. Thus, since the trypsin treatment time is closely related to the cell growth ability, the trypsin treatment time can be regarded as an index of the cell growth ability. Therefore, if the detached cells are classified and collected according to the trypsin treatment time, it is possible to collect each cell having the same cell proliferation ability.
[0021]
[Table 1]

[0022]
Next, the operation of the detached cell collection device 50 will be described. When an operator inputs an instruction to start the peeling operation from the keyboard as an input device to the control device 57, the control device 57 reads the peeling operation program stored in the internal memory and executes it. FIG. 2 is a flowchart of the peeling operation program. When this program is started, the control device 57 first closes the solenoid valve 55 of the discharge pipe 54, opens the solenoid valve 53 of the injection pipe 52, and puts a predetermined amount of trypsin solution into the culture vessel 60, and then solenoid valve. 53 is closed (step S200), and at the same time as the solenoid valve 53 is closed, the timer starts measuring the trypsin processing time (step S210). The culture container 60 is drained and rinsed before the trypsin solution is added. When the trypsin treatment time reaches a predetermined time t1, the rod of the electric cylinder 56 is immersed to tilt the support base 51, and the solenoid valve 55 of the discharge pipe 54 is opened to open the trypsin solution in the culture vessel 60. Are collected together with the detached cells 61 from the discharge pipe 54 to the collection container 65 (step S220). Here, the time t1 is set to a relatively short time (for example, 3 minutes or 5 minutes), and the cells 61 that have been detached early are collected in the collection container 65 as an initial classification.
[0023]
Then, after the collection is completed, the rod of the electric cylinder 56 is extended to return the support base 51 to the horizontal state and a new collection container 65 is installed (step S230), and then the solenoid valve 55 of the discharge pipe 54 is closed to close the injection pipe. The solenoid valve 53 of 52 is opened and a predetermined amount of trypsin solution is put into the culture vessel 60, then the solenoid valve 53 is closed (step S240), and simultaneously the measurement of the trypsin treatment time is restarted (step S240). S250). Then, when the total trypsin treatment time reaches a predetermined time t2, the rod of the electric cylinder 56 is immersed to incline the support base 51, and the solenoid valve 55 of the discharge pipe 54 is opened to open the culture vessel 60. A trypsin solution is collect | recovered to the collection | recovery container 65 from the discharge pipe 54 with the peeling cell 61 (step S260). Here, the time t2 is set to a relatively long time (for example, 12 minutes or 15 minutes), and the detached cells 61 are collected in the collection container 65 as a main classification after a certain amount of time has passed. Then, after the collection is completed, the rod of the electric cylinder 56 is extended to return the support base 51 to the horizontal state and a new collection container 65 is installed (step S270), and this program is terminated.
[0024]
According to the exfoliated cell recovery device 50 of this embodiment described in detail above, cells that exfoliate early from the bottom surface of the culture vessel 60 by trypsin or cells that exfoliate after a certain amount of time are appropriately classified and recovered. be able to. In addition, when there is a difference in proliferation ability between cells detached early from the culture vessel 60 by trypsin and cells detached after a certain amount of time, such as cells derived from a 0-year-old donor, This is preferable because cells can be sorted according to the difference in proliferation ability.
[0025]
In the flowchart of FIG. 2, the processes in steps S240 to S270 may be repeated once or more after step S270 as necessary. At this time, time t2 in step S260 is appropriately changed to time t3 or the like. In this way, cells that have been detached early from the culture vessel 60 by trypsin, cells that have been detached after an intermediate period of time, and cells that have been detached after a long time have passed, such as cells from a 0-year-old donor. When there is a difference in proliferation ability between the cells, it is preferable because cells can be sorted according to the difference in proliferation ability.
[0026]
[Second Embodiment]
FIG. 3 is a schematic configuration diagram of the detached cell collection device of the present embodiment. The detached cell collection device 70 of the present embodiment includes a support base 71, a culture vessel 80, and a control device 77 as a time measuring unit and a classification collection control unit.
[0027]
The support base 71 fixes and supports the culture vessel 80 in an inclined state.
[0028]
The culture vessel 80 has cells 81 that adhere to the bottom surface and grow in the culture medium to become a confluent state. In the vicinity of the highest position of the culture vessel 80 that is supported on the support stand 71 in an inclined state, an injection tube 72 capable of injecting a trypsin solution as a release agent into the culture vessel 80 is provided. Is attached with a solenoid valve 73 for opening and closing the injection pipe 72. A discharge pipe 74 capable of discharging the contents is provided in the vicinity of the lowest position of the culture vessel 80, and a solenoid valve 75 for opening and closing the discharge pipe 74 is attached to the discharge pipe 74. The

solenoid valves

73 and 75 are controlled to open and close based on a command signal from the control device 77.
[0029]
The collection containers 91 to 93 are placed on a belt conveyor 97 spanned between the driving wheel 95 and the driven wheel 96, and the driving wheel 95 rotates and the belt conveyor 97 moves in response to a command signal from the control device 77. Move as you do. Here, the recovery container 91 is initially disposed at a position that matches the outlet of the discharge pipe 74, and the recovery container 92 and the recovery container 93 are disposed at the same position as time elapses. Here, the support base 71, the discharge pipe 74 with the solenoid valve 75, the collection containers 91 to 93, the drive wheels 95, the driven wheels 96, and the belt conveyor 97 correspond to the cell collection means.
[0030]
The control device 77 includes a known CPU, ROM, RAM, timer, and the like. The control device 77 counts time with a timer and outputs command signals to the

solenoid valves

73 and 75 and the drive wheels 95.
[0031]
Next, the operation of the detached cell collection device 70 will be described. When an operator inputs an instruction to start the peeling operation from the keyboard as an input device to the control device 77, the control device 77 reads the peeling operation program stored in the internal memory and executes it. In addition, the culture container 80 discharges | emits a culture medium beforehand and rinses it. FIG. 4 is a flowchart of this peeling operation program. When this program is started, the control device 77 first adjusts the opening degree of the solenoid valve 73 of the injection pipe 72 and the solenoid valve 75 of the discharge pipe 74 so that the trypsin solution flows into the culture vessel 80 at a predetermined flow rate. (Step S300) At the same time, the timer starts measuring the trypsin processing time (Step S310). Then, the effluent from the culture vessel 80 accumulates in the collection vessel 91 at a position that matches the outlet of the discharge pipe 74. In step S300, the

valves

73 and 75 are adjusted so that the initial amount of liquid in the culture vessel 80 is substantially maintained.
[0032]
Then, when the trypsin processing time reaches time t11, the collection container 91 is updated to the collection container 92 (step S320). That is, a command signal is output to the drive wheel 95 to rotate the drive wheel 95 and move the belt conveyor 97 so that the next collection container 92 comes to a position that matches the outlet of the discharge pipe 74. Then, the effluent from the culture vessel 80 accumulates in the collection vessel 92. A trypsin inhibitor is added to the collection container 91 to stop the action of trypsin.
[0033]
Then, when the trypsin processing time reaches time t12 (> t11), the collection container 92 is updated to the collection container 93 (step S330). That is, a command signal is output to the drive wheel 95 to rotate the drive wheel 95 and move the belt conveyor 97 so that the next collection container 93 comes to a position that matches the outlet of the discharge pipe 74. Then, the effluent from the culture vessel 80 accumulates in the collection vessel 93. A trypsin inhibitor is added to the collection container 92 to stop the action of trypsin.
[0034]
When the trypsin treatment time reaches a predetermined end time, the solenoid valve 73 is closed to stop the supply of the trypsin solution, and the solenoid valve 75 is closed after the inside of the culture vessel 80 is emptied (step S340), this program is terminated. A trypsin inhibitor is added to the collection container 93 to stop the action of trypsin. The end time is empirically determined in advance as the time required for all the cells 81 adhered to the bottom surface of the culture vessel 80 to be detached by the action of trypsin.
[0035]
According to the exfoliated cell recovery device 70 of the present embodiment described in detail above, cells that exfoliate early from the bottom surface of the culture vessel 80 by trypsin or cells that exfoliate after a certain amount of time are appropriately classified and recovered. be able to. In addition, cells that have been detached early from the bottom of the culture vessel 80 by trypsin, cells that have been detached after an intermediate period of time, and cells that have been detached after a long time have passed, such as cells from a 0-year-old donor. When there is a difference in proliferation ability between the cells, it is preferable because cells can be sorted according to the difference in proliferation ability.
[0036]
In the flowchart of FIG. 4, the collection container may be updated when the trypsin processing time reaches a predetermined time after step S340 as necessary, and this updating operation may be repeated several times. . By doing so, the trypsin treatment time can be further subdivided to recover the cells.
[0037]
Although the embodiments and examples of the present invention have been described above, the present invention is not limited to these embodiments and can be implemented in various forms without departing from the technical scope of the present invention. Needless to say.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a detached cell collection device according to a first embodiment.
FIG. 2 is a flowchart of a peeling operation program according to the first embodiment.
FIG. 3 is a schematic configuration diagram of a detached cell collection device according to a second embodiment.
FIG. 4 is a flowchart of a peeling operation program according to the second embodiment.
FIG. 5 is a flow chart of commercialization of cultured cell sheets.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 50 ... Exfoliated cell collection | recovery apparatus, 51 ... Support stand, 51a ... Turning axis, 52 ... Injection pipe, 53 ... Solenoid valve, 54 ... Discharge pipe, 55 ... Solenoid valve, 56 ... Electric cylinder, 57 ... Control apparatus, 60 ... Culture container, 61 ... adhesion-dependent cells, 65 ... collection container.

Claims

A time measuring means for measuring the elapsed time after putting the release agent into the culture vessel to which the adhesion-dependent cells are adhered;
A cell recovery means capable of recovering cells in the culture vessel;
Based on the elapsed time measured by the time measuring means, the classification collection control means for classifying and collecting the adhesion-dependent cells detached from the culture container by the release agent in the cell collection means,
The adhesion-dependent cells are those that have a difference in proliferation ability depending on the time until detachment after adding the release agent,
The classifying and collecting control means has an adhesion ability and a proliferation ability of the adhesion-dependent cells detached from the culture container when the elapsed time measured by the time measuring means reaches a predetermined initial time. The cell-recovering means collects the adhesion-dependent cells separated from the culture container by the release agent until the elapsed time reaches a predetermined later time set in advance, which is collected as an initial classification including a lowered cell group. As an end-stage classification that includes cells that have been recovered as, and then the adhesion-dependent cells detached from the culture container by the release agent are caused by a failure due to excessive contact with the release agent in the cell recovery means. An exfoliated cell recovery device for recovery.

The exfoliated cell recovery device according to claim 1,
A release agent charging means for supplying a new release agent into the culture container is provided. The classification and recovery control means is bonded to the cell recovery means after the elapsed time reaches the predetermined time. An exfoliated cell recovery apparatus in which after the entire amount of exfoliant in the culture vessel containing dependent cells is recovered, a new exfoliant is introduced into the culture vessel by the exfoliant input means.

The exfoliated cell recovery device according to claim 1,
A release agent input means for supplying a new release agent into the culture container is provided. The classification recovery control means includes an input amount of a new release agent by the release agent input means and adhesive cells released from the culture container. The flow rate of the release agent in the culture vessel flowing out to the cell recovery means is adjusted so that the initial liquid amount is substantially maintained in the culture vessel, and the release agent is supplied to the culture vessel at a predetermined flow rate. And the cell collection means is updated each time the elapsed time reaches the predetermined time.
Peeled cell collection device.

The program for functioning a computer as at least the said classification | category collection | recovery control means of the detached cell collection | recovery apparatus in any one of Claims 1-3 .