JP4226294B2

JP4226294B2 - Recombinant herpes simplex virus, E. coli, and methods for obtaining them

Info

Publication number: JP4226294B2
Application number: JP2002273215A
Authority: JP
Inventors: 寧川口; 道子田中; 裕司山梨; 裕之香川
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2001-10-16
Filing date: 2002-09-19
Publication date: 2009-02-18
Anticipated expiration: 2022-09-19
Also published as: JP2003189882A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現やワクチン開発のためのベクター及び基礎研究に有用な、組換え単純ヘルペスウイルス、大腸菌、並びにこれらを得る方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヒトに様々な疾患を引き起こす重要なウイルスであるが、一方でその神経指向性を利用した遺伝子ベクター（ウイルスベクター）としても注目されている。ＨＳＶ自体の基礎研究や、遺伝子治療ベクターの開発においては、組換えＨＳＶの作製技術が極めて重要な要素である。
【０００３】
組換えＨＳＶの作製技術の従来の手法としては、マーカー（ＴＫ、ＬａｃＺ）遺伝子を利用した培養細胞内での相同組換え法（Post L. E. et al. Cell24:555-565, 1981）や、コスミドを利用した培養細胞内での相同組換え法（Cunningham C. et al. Virol. 197:116-124, 1993）等が知られているが、これらの手法は煩雑であり作製に長時間を要することから、より簡便な技術の開発が望まれていた。
【０００４】
近年、大型のＤＮＡ cloning systemであるbac system（bacterial artificial chromosome system）を利用し、大腸菌内で相同組換えを行う手法が報告され、従来よりも組換えウイルスの作製が迅速かつ簡便に行えるようになりつつある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
bac systemにおいて中核をなす材料は、HSVゲノムを保持する大腸菌である。この大腸菌を得ることができれば、大腸菌の遺伝学を用いて、様々なHSVゲノムの改変が可能となる。しかしながら、bac systemを利用してHSVゲノムを保持する大腸菌の作製に関する従来の報告例においては、bacmidの挿入によってPackagin signalが欠損していたり（Saeki Y. et al.Hum. Gen. Ther. 9:2787-2794，1998、Tom A. S. et al． J． Virol． 72:7137-7143, 1998、Suter M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12697-12702, 1999）、あるいはＴＫ（非必須なＨＳＶ遺伝子）にbacmidが挿入されており（Horsburgh B. C. et al. Gene Ther. 6:922-930, 1999）、ゲノムの全長を実質的に保持した組換えＨＳＶを維持しうる大腸菌は得られていなかった。
【０００６】
このような欠損や挿入が存在していると、多目的なベクターの作製に適さない場合があり、また、ＨＳＶ自体の基礎研究に用いる上で障害となっていた。また、bacmidは7kbpと比較的大きいので、組換えウイルスの病原性やその組換えウイルスが保持しうる外来遺伝子の長さを限定してしまう。
【０００７】
そこで、本発明は、野生型ＨＳＶのゲノムの全長を保持したＨＳＶを維持する大腸菌を提供することを目的とする。また、得られた大腸菌由来の感染性組換えＨＳＶはbacmidが挿入されているが、これらの組換えＨＳＶより容易にbacmidを除去しうる系を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は鋭意研究の結果、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持した組換え単純ヘルペスウイルス及び大腸菌を得ることに成功した。
【０００９】
すなわち、本発明に係る組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルス（野生株の単純ヘルペスウイルス）のゲノムの全長を実質的に保持することを特徴とする。
【００１０】
上記組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の病原性を有するものである。
【００１１】
また、本発明に係る組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ（ＴＫ）部位に欠損を有することを特徴とする。
【００１２】
上記組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能を有するものである。
【００１３】
上記組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間にlox P配列で挟まれたbacmidが挿入されてもよい。
【００１４】
上記組換え単純ヘルペスウイルスは、Creリコンビナーゼによって容易にそのゲノムよりbacmidの除去が可能である。
Creリコンビナーゼによってbacmidを除去された組換え単純ヘルペスウイルスは、ウイルスベクターとして用いることが可能である。
上記組換え単純ヘルペスウイルスより、Creリコンビナーゼによってbacmidが除去された結果得られる組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能及び／又は病原性を有し、ウイルスベクターとして用いることが可能である。
本発明に係る大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持した組換え単純ヘルペスウイルスに感染した細胞から抽出した環状ウイルスＤＮＡが導入されたものである。
【００１６】
また、本発明に係る大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持し、そのゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間にlox P配列で挟まれたbacmidが挿入された組換え単純ヘルペスウイルスに感染した細胞から抽出した環状ウイルスＤＮＡが導入されたものである。
【００１７】
上記の大腸菌が保持するウイルスゲノムを、培養細胞に導入して再構築された組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能及び／又は病原性を有するものである。
また、上記の大腸菌が保持するウイルスゲノムを培養細胞に導入して再構築された組換え単純ヘルペスウイルスは、Creリコンビナーゼによって容易にそのゲノムよりbacmidの除去が可能である。
【００１８】
また、上記の大腸菌が保持するウイルスゲノムを培養細胞に導入することによって再構築された組換え単純ヘルペスウイルスからCreリコンビナーゼによってbacmidが除去された結果得られる組換え単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスと同程度の増殖能及び／又は病原性を有するものである。
また、上記の大腸菌は、当該大腸菌が保持するウイルスゲノムに、目的の変異を導入することができる。すなわち、任意の変異についてウイルスゲノムに変異導入することが可能である。
【００１９】
本発明に係る別の大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのチミヂンキナーゼ部位に欠損を有する組換え単純ヘルペスウイルスのゲノムを保持することを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのチミヂンキナーゼ部位に欠損を有する組換え単純ヘルペスウイルスに感染した細胞から抽出した環状ウイルスＤＮＡが導入されたものである。
【００２１】
また、本発明に係る大腸菌は、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのチミヂンキナーゼ部位に欠損を有し、そのゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間にlox P配列で挟まれたbacmidが挿入された組換え単純ヘルペスウイルスに感染した細胞から抽出した環状ウイルスＤＮＡが導入されたものである。
【００２２】
上記大腸菌は、当該大腸菌が保持するウイルスゲノムを培養細胞に導入することによって再構築された組換え単純ヘルペスウイルスからCreリコンビナーゼによってbacmidの除去が可能である。
【００２３】
上記大腸菌は、ウイルスベクター又はワクチンの開発に有用である。
【００２４】
本発明に係る組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、上記大腸菌に保持されたものである。
本発明に係るワクチンは、上記組換え単純ヘルペスウイルスを有効成分として含み、毒性単純ヘルペスウイルスに対して有効である。
【００２５】
本発明に係る野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持した大腸菌を得る方法は、（ａ）野生型単純ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間に、ｌｏｘＰ配列で挟まれたbacmidを挿入して、第一の組換えウイルスを得る工程と、（ｂ）第一の組換えウイルス感染細胞から環状ウイルスＤＮＡを抽出して第一の大腸菌に導入する工程と、（ｃ）該大腸菌からゲノムを抽出しこれをＲＳＣ細胞（rabbit skin cell）に導入して、第二の組換えウイルスを得る工程と、（ｄ）第二の組換えウイルスをチミヂンキナーゼにより修復して第三の組換えウイルスを得る工程と、（ｅ）第三の組換えウイルス感染細胞から環状ウイルスＤＮＡを抽出しこれを第二の大腸菌に導入する工程と、からなる。
【００２６】
本発明に係る感染性の組換え単純ヘルペスウイルスを得る方法は、野生型単純ヘルペスウイルスのゲノムの全長を実質的に保持した大腸菌からウイルスＤＮＡを抽出しこれをＲＳＣ細胞（rabbit skin cell）に導入するプロセスから成る。本発明に係るbacmidを有する組換え単純ヘルペスウイルスよりbacmidを除去する方法は、bacmidが挿入された組換え単純ヘルペスウイルスとCreリコンビナーゼを発現する組換えアデノウイルスをVero細胞に重感染させた後、挿入されたbacmidを組換え単純ヘルペスウイルスから除去するプロセスから成る。
本発明に係る単純ヘルペスウイルスゲノムの全長を実質的に保持する大腸菌内において目的の変異をウイルスゲノムに導入する方法は、(a) RecAを発現するプラスミドに変異導入およびそのflanking領域をクローニングしたものを大腸菌に導入後、第一の選択によって、このプラスミドがウイルスゲノムに挿入された大腸菌を得る工程と、(b) 第二の選択によって、目的の変異を有するウイルスゲノムを有する大腸菌を得る工程より成る。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明の実施例を、図面を参照しつつ説明する。なお、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
【００２８】
本実施例においては、遺伝子クローニング及びその解析は、マニアティス（Maniates）らのモレキュラー・クローニング・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning-A Laboratory Manual），及びコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）(1982)に基づいて行った。実験方法は、Ausubel. FらのCurrent Protocols in Molecular Biology(1987)中に詳細に記載されているような標準の実験室的方法に従った。
【００２９】
〔プラスミドｐＢ２の創製〕
図１は、プラスミドｐＢ２の創製手順を表すフローシートである。以下に、図１を参照しながらプラスミドｐＢ２の創製について説明する。
【００３０】
まず、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Research Genetics, Huntsville, USA）の６．８ｋｂｐ NotI fragmentを平滑末端化し、これをｐＲＢ５１９８のHincII部位にクローニングし、ｐＢ１を得た。用いたｐＲＢ５１９８は、ＨＳＶ−１ＵＬ２１及びＵＬ２２の双方向ｐｏｌｙＡシグナルを含む約２７０ｂｐ断片をＰＣＲにて増幅し、pBluescript II KS+ (Stratagene, La Jolla CA, USA)のXhoI，KpnI部位にクローニングしたプラスミドである。
【００３１】
一方、LoxP配列の両端にBamHI部位及びBgIII部位を有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、BamHI部位及びBgIII部位で消化後、ｐＲＢ４４２（J. Virol.65: 938-944, 1991）のBamHI部位にクローニングし、ｐＢ０を得た。２つの相補的なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１のものと配列番号２のものを用いた。
【００３２】
ＨＳＶ−１（Ｆ）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ７３３）感染Vero細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５８７）からウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、HindIIIで消化後、HindIIIＯ断片をアガロースゲル電気泳動にて分離・精製した。ｐＢ０のHindIII部位に、精製されたＨＳＶ−１（Ｆ）HindIIIＯ断片をクローニングし、ｐＢ０−１を得た。
【００３３】
次に、ｐＢ１のBamHI−SphI断片を平滑末端化し、これをｐＢ０−１のBamHI部位を平滑末端化したところにクローニングし、ｐＢ２を得た。
【００３４】
〔ＨＳＶ−１ゲノムの全長を保持する大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）の創製〕
図２は、ＹＫ３０４の創製手順を表すフローシートである。以下に、図２を参照しながらＹＥｂａｃ１０２を得る工程、及びＹＥｂａｃ１０２からＹＫ３０４を得る工程について説明する。
【００３５】
なお、組換えウイルスの作製は、ポスト（Post）及びロイズマン（Roizman）が報告した論文（Cell 25: 227-232）に記載の作製方法に従い、以下の工程により行った。
【００３６】
（ｉ）まず、Ｒ７２０５(J. Virol. 65: 938-944, 1991)感染Vero細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５８７）からウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、これをｐＢ２とrabbit skin cell（ＲＳＣ細胞）にコトランスフェクションした。その後、相同組換えによって生産されたｐＢ２プラスミドに含まれるbacmidがゲノムに挿入されたＴＫ−組換え体（thymidine kinase negative組換え体）を、ＴＫ＋ウイルス（thymidine kinase positive virus）を不活化するＢｕＤＲ存在下においてＴＫ−細胞である143ＴＫ−細胞にて培養することによって選択した。これにより、loxP配列で挟まれたbacmidをＵＬ３及びＵＬ４遺伝子間に挿入した組換えＨＳＶ（ＹＫ３０１）を得た。
【００３７】
（ｉｉ）得られたＹＫ３０１をVero細胞に感染させ、そのＹＫ３０１感染細胞から、Hint法により環状ウイルスＤＮＡを抽出した。抽出した環状ウイルスＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０Ｂ（GibcoBRL Tokyo Japan）にエレクトロポーション法によって導入した。これをクロラムフェニコール（Chloramphenicol）添加培地にて選択して、bacmidにＹＫ３０１ゲノムを保持する大腸菌（ＹＥｂａｃ１０１）を得た。
【００３８】
得られた大腸菌（ＹＥｂａｃ１０１）から抽出されたウイルスＤＮＡと、野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）ＤＮＡについて、アガロース電気泳動上の制限酵素（BamHI）切断（消化）パターンを図３に示す。図３において、ａはbacmid挿入によって見られるバンドであり、ｂはＴＫが修復されたときに見られるバンドであり、ｃはＴＫが欠損しているときに見られるバンドである。図３に示すように、ＹＥｂａｃ１０１のパターンは、ＴＫ領域及びbacmid挿入領域を除いて、野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）のパターンとほぼ一致した。
【００３９】
これより、大腸菌（ＹＥｂａｃ１０１）内において、野生型ＨＳＶ−１のゲノムの全長が保持されていることが確認された。
【００４０】
（ｉｉｉ）大腸菌（ＹＥｂａｃ１０１）から、アルカリＳＤＳ法によって感染性ＨＳＶのＤＮＡを抽出し、これをリン酸カルシウム法によってＲＳＣ細胞に導入したところ、感染性の組換えＨＳＶ（ＹＫ３０２）の産生が確認された。
【００４１】
得られたＹＫ３０２は、ＵＬ３及びＵＬ４遺伝子のジャンクション領域にbacmidが挿入され、かつ、ＴＫ−の組換えウイルスである。
【００４２】
得られたＹＫ３０２、及びＹＫ３０２と同じくＴＫ−の組換えウイルスであるＨＳＶ−１（Ｆ）Δ３０５（Cell 24: 555-565, 1981）について、Vero感染細胞内に２４時間放置して増殖を比較した結果を表１に示す。このVero感染細胞内での増殖比較実験においては、ＭＯＩ（感染多重度；multiplicity of infection）１とＭＯＩ０．０１の２種類の条件で実験を行った。表１において、数値はウイルス価を表す。
【００４３】
【表１】

表１に示すように、ＹＫ３０２は、少なくともin vitroでは、コントロールのΔ３０５と同程度の増殖能を発揮することが確認された。
【００４４】
（ｉｖ）ＹＫ３０２感染細胞からウイルスＤＮＡを抽出し、これとｐＲＢ４８６７（J. Virol. 70:84-90, 1996）をＲＳＣ細胞にコトランスフェクションした。その後、相同組換えによって生産されたＴＫが修復されたＴＫ＋組換え体を、ＴＫ−ウイルスを不活化するＨＡＴ存在下においてＴＫ−細胞である143ＴＫ−細胞にて培養することによって選択した。これにより、組換えＨＳＶ（ＹＫ３０３）を得た。
【００４５】
（ｖ）ＹＫ３０３感染細胞から、Hint法により環状ウイルスＤＮＡを抽出した。これを、大腸菌ＤＨ１０Ｂにエレクトロポーション法によって導入した。これをクロラムフェニコール添加培地にて選択して、bacmidにＹＫ３０３ゲノムを保持する大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）を得た。
【００４６】
得られた大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）から抽出されたウイルスＤＮＡと、野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）ＤＮＡについて、アガロース電気泳動上の制限酵素（BamHI）切断パターンを測定した（図３）。図３に示すように、ＹＥｂａｃ１０２のパターンは、bacmid挿入領域を除いて、野生型ＨＳＶ（Ｆ）のパターンとほぼ一致した。
【００４７】
これより、大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）内において、野生型ＨＳＶのゲノムの全長が保持されていることが確認された。この大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）は、遺伝子治療用ベクターやワクチンの開発、並びに基礎研究に有用である。
【００４８】
（ｖｉ）大腸菌（ＹＥｂａｃ１０２）から、アルカリＳＤＳ法によって感染性ＨＳＶのＤＮＡを抽出し、これをリン酸カルシウム法によってＲＳＣ細胞に導入したところ、感染性の組換えＨＳＶ（ＹＫ３０４）の産生が確認された。
【００４９】
得られたＹＫ３０４は、ＵＬ３及びＵＬ４遺伝子のジャンクション領域にbacmidが挿入され、いかなる既知のＨＳＶ−１オープンリーディングフレームも欠損しない全長のＨＳＶ−１ゲノムＤＮＡを有していた。
【００５０】
得られたＹＫ３０４、及び野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）について、Vero感染細胞内に２４時間放置した結果を表２に示す。このVero感染細胞内での増殖比較実験においては、ＭＯＩ１とＭＯＩ０．０１の２種類の条件で実験を行った。表２において、数値はウイルス価を表す。
【００５１】
【表２】

また、ＹＫ３０４、及び野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）について、Vero感染細胞内に６，１２，２４時間放置した結果を図４に示す。このVero感染細胞内での増殖比較実験においてはＭＯＩ１０とＭＯＩ０．０１の２種類の条件で実験を行った。
【００５２】
図４及び表２に示すように、ＹＫ３０４は、少なくともin vitroでは、野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）と同程度の増殖能を発揮することが確認された。
【００５３】
（ｖｉｉ）Ｃｒｅリコンビナーゼ（causes recombination相同組換え酵素）を発現する組換えアデノウイルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）は、ＡｘＣＡＮＣｒｅＤＮＡ−ＴＰＣ（Takara Tokyo Japan）を、293細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７３）に導入することによって得た。293細胞にＡｘＣＡＮＣｒｅをＭＯＩ100以上で感染させ、２４時間後にＹＫ３０４をＭＯＩ０．０５で重感染させた。ＹＫ３０４感染後２４時間後に感染細胞を回収し、ウイルスＤＮＡを抽出した。ＹＫ３０４感染細胞、及びＹＫ３０４及びＡｘＣＡＮＣｒｅ重感染細胞のそれぞれからウイルスＤＮＡを抽出し、ＲｃｏＲＩで消化後、サザン法によって解析した。プローブとしては、ｐＲＢ４４２のＥｃｏＲＶ断片を用いた。
【００５４】
サザン法によって解析した結果を図５に示す。図５において、lane１はＹＫ３０４感染細胞を表し、lane２はＹＫ３０４及びＡｘＣＡＮＣｒｅ重感染細胞を表す。図５に示すように、Creリコンビナーゼによって、ＹＫ３０４のゲノムよりbacmidが効率良く除去可能であることが明らかになった。
ＹＫ３０４よりCreリコンビナーゼによりbacmidが除去された組換え単純ヘルペスウイルスＹＫ３１１及び野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）について、Vero感染細胞内に６，１２，２４時間放置した結果を図６に示す。このVero感染細胞内での増殖比較実験においてはＭＯＩ１０とＭＯＩ０．０１の２種類の条件で実験を行った。
【００５５】
図６に示すように、ＹＫ３１１は、少なくともin vitroでは、野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）と同程度の増殖能を発揮することが確認された。
【００５６】
また、ＹＫ３０４、ＹＫ３１１および野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）についてBALB/Cマウスの脳内に接種し、２週間マウスの生死を観察した結果を表３に示す。数値は、PFU/LD50の値（死亡率は、接種後２日〜１４日で評価した。PFU/LD50はbehrens-Karber法によって計算した）を示す。
【００５７】
【表３】

表３に示すように、ＹＫ３０４およびＹＫ３１１は野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）とマウス動物モデルにおいて同等な病原性を発揮することが確認された。
〔大腸菌内における単純ヘルペスウイルスゲノムへの目的変異の導入〕
pKO3 (J. Bacteriol. 179: 6228-6237)をBstBI処理後、ライゲーション反応を行うことによってクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去し、さらに、NaeI部位にpcDNA4/HisMax C(Invitrogen)のBclI-FokI断片を平滑末端化したものをクローニングし、ゼオシン耐性遺伝子を導入したプラスミドpKO5Mを構築した。さらに、pK05MのSalI部位に大腸菌由来のrecA遺伝子をPCRで増幅したものをクローニングし、pKO5MRAを構築した。単純ヘルペスウイルスICP6遺伝子を含む約10kbpのNotI断片のXmnI部位に85bpのオリゴヌクレオチドを挿入したものを平滑末端化し、pKO5MRAのSalI部位にクローニングし、pKO5MRA-ICP6-FRTを作製した。
【００５８】
pKO5MRA-ICP6-FRTをYEbac102に導入後、クロラムフェニコールおよびゼオシン添加培地に接種し、４３度（℃）にて１晩培養した。できた大腸菌コロニーをシュークロースおよびゼオシン添加培地に接種し、３０度（℃）で１晩培養した。クロラムフェニコールおよびシュークロース耐性、ゼオシン感受性のコロニーをPCRにて解析し、目的の変異を有する単純ヘルペスウイルスゲノムを保持する大腸菌を選択した。
【００５９】
その大腸菌よりウイルスゲノムを抽出し、RSCに導入したところ、感染性の組換え単純ヘルペスウイルス(YK351)の産生が確認された。このYK351感染細胞中よりウイルスゲノムを抽出し、オリゴヌクレオチド挿入部位をPCRで解析した結果を図７に示す。図７に示すように、野生型HSV-1(F)と比して、YK351ゲノムではオリゴヌクレオチドが挿入された分だけサイズの大きなPCR産物が検出された。
【００６０】
以上より、YEbac102内において目的の変異が単純ヘルペスウイルスゲノムに導入可能であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＢ２の創製手順を表すフローシートである。
【図２】ＹＫ３０４の創製手順を表すフローシートである。
【図３】野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）、ＹＥｂａｃ１０１、及びＹＥｂａｃ１０２に保持されたＨＳＶゲノムＤＮＡのBamHI制限酵素消化パターンを表す写真である。
【図４】野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）及びＹＫ３０４のVero感染細胞内での増殖比較実験データである。
【図５】 Creリコンビナーゼによるbacmidの除去に関する解析パターンを表す写真である。
【図６】野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）及びＹＫ３１１のVero感染細胞内での増殖比較実験データである。
【図７】野生型ＨＳＶ−１（Ｆ）及びＹＫ３５１のICP6遺伝子内XmnI部位付近のPCR解析結果を表す写真である。
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a recombinant herpes simplex virus, Escherichia coli, a method for obtaining them, and the like useful for gene expression and vaccine development vectors and basic research.
[0002]
[Prior art]
Herpes simplex virus (HSV) is an important virus that causes various diseases in humans, but has also attracted attention as a gene vector (viral vector) utilizing its neurotropism. In the basic research of HSV itself and the development of gene therapy vectors, the technology for producing recombinant HSV is an extremely important element.
[0003]
Conventional techniques for producing recombinant HSV include homologous recombination methods (Post LE et al. Cell 24: 555-565, 1981) in cultured cells using marker (TK, LacZ) genes, and cosmids. Known methods for homologous recombination in cultured cells (Cunningham C. et al. Virol. 197: 116-124, 1993) are known, but these methods are complicated and require a long time for preparation. Therefore, development of simpler technology has been desired.
[0004]
In recent years, a method for homologous recombination in Escherichia coli using the large DNA cloning system bac system (bacterial artificial chromosome system) has been reported, so that recombinant virus can be produced more quickly and easily than before. It is becoming.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The core material in the bac system is E. coli that retains the HSV genome. If this E. coli can be obtained, various HSV genome modifications can be made using E. coli genetics. However, in the conventional reports on the production of E. coli that retains the HSV genome using the bac system, the Packagin signal is missing due to the insertion of bacmid (Saeki Y. et al. Hum. Gen. Ther. 9: 2787-2794, 1998, Tom AS et al. J. Virol 72: 7137-7143, 1998, Suter M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 12697-12702, 1999), or TK ( A non-essential HSV gene) is inserted into bacmid (Horsburgh BC et al. Gene Ther. 6: 922-930, 1999), and E. coli capable of maintaining a recombinant HSV substantially retaining the full length of the genome is obtained. It was not done.
[0006]
If such a deletion or insertion exists, it may not be suitable for the production of a multipurpose vector, and has become an obstacle to use for basic research of HSV itself. Moreover, since bacmid is relatively large at 7 kbp, it limits the pathogenicity of the recombinant virus and the length of the foreign gene that the recombinant virus can hold.
[0007]
Therefore, an object of the present invention is to provide E. coli that maintains HSV that retains the full length of the wild-type HSV genome. The obtained infectious recombinant HSV derived from Escherichia coli has bacmid inserted therein, and an object thereof is to provide a system capable of removing bacmid more easily than these recombinant HSV.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventor succeeded in obtaining recombinant herpes simplex virus and E. coli substantially retaining the full length of the wild type herpes simplex virus genome.
[0009]
That is, the recombinant herpes simplex virus according to the present invention is characterized by substantially retaining the entire genome of a wild type herpes simplex virus (wild-type herpes simplex virus).
[0010]
The recombinant herpes simplex virus has a pathogenicity comparable to that of the wild type herpes simplex virus.
[0011]
In addition, the recombinant herpes simplex virus according to the present invention is characterized by having a deletion in the thymidine kinase (TK) site of the wild-type herpes simplex virus genome.
[0012]
The recombinant herpes simplex virus has the same ability to grow as wild-type herpes simplex virus.
[0013]
In the recombinant herpes simplex virus, a bacmid sandwiched between lox P sequences may be inserted between the UL3 gene and UL4 gene of the wild-type herpes simplex virus genome.
[0014]
The recombinant herpes simplex virus can be easily removed from its genome by Cre recombinase.
Recombinant herpes simplex virus from which bacmid has been removed by Cre recombinase can be used as a viral vector.
The recombinant herpes simplex virus obtained as a result of removal of bacmid by Cre recombinase from the above recombinant herpes simplex virus has the same growth ability and / or pathogenicity as wild type herpes simplex virus, and is used as a viral vector. It is possible.
The Escherichia coli according to the present invention is characterized in that it substantially retains the full length of the wild type herpes simplex virus genome.
[0015]
The Escherichia coli according to the present invention is one into which circular viral DNA extracted from a cell infected with a recombinant herpes simplex virus that substantially retains the full length of the wild-type herpes simplex virus genome is introduced.
[0016]
The Escherichia coli according to the present invention substantially retains the entire genome of the wild-type herpes simplex virus, and is a set in which a bacmid sandwiched between lox P sequences is inserted between the UL3 gene and the UL4 gene of the genome. A circular viral DNA extracted from cells infected with the herpes simplex virus is introduced.
[0017]
The recombinant herpes simplex virus reconstructed by introducing the viral genome held by the above-mentioned Escherichia coli into cultured cells has the same growth ability and / or pathogenicity as wild-type herpes simplex virus.
In addition, the recombinant herpes simplex virus reconstructed by introducing the viral genome held by the above-mentioned Escherichia coli into cultured cells can easily remove bacmid from the genome by Cre recombinase.
[0018]
In addition, the recombinant herpes simplex virus obtained as a result of removing bacmid by Cre recombinase from the recombinant herpes simplex virus reconstructed by introducing the viral genome held by the above-mentioned E. coli into a cultured cell is a wild-type herpes simplex virus. It has the same growth ability and / or pathogenicity as a virus.
In addition, the above-mentioned E. coli can introduce the desired mutation into the viral genome held by the E. coli. That is, any mutation can be introduced into the viral genome.
[0019]
Another Escherichia coli according to the present invention is characterized in that it retains the genome of a recombinant herpes simplex virus having a defect in the thymidine kinase site of the wild type herpes simplex virus genome.
[0020]
The Escherichia coli according to the present invention is one into which circular viral DNA extracted from a cell infected with a recombinant herpes simplex virus having a defect in the thymidine kinase site of the wild-type herpes simplex virus genome is introduced.
[0021]
In addition, the Escherichia coli according to the present invention is a recombinant having a deletion in the thymidine kinase site of the wild-type herpes simplex virus genome and having a bacmid inserted between the UL3 gene and the UL4 gene of the genome and sandwiched between lox P sequences. A circular viral DNA extracted from cells infected with herpes simplex virus is introduced.
[0022]
In the above-mentioned E. coli, bacmid can be removed by Cre recombinase from a recombinant herpes simplex virus reconstructed by introducing a viral genome held by the E. coli into cultured cells.
[0023]
The E. coli is useful for the development of viral vectors or vaccines.
[0024]
The recombinant herpes simplex virus genome according to the present invention is retained in the aforementioned E. coli.
The vaccine according to the present invention contains the above recombinant herpes simplex virus as an active ingredient and is effective against virulent herpes simplex virus.
[0025]
The method for obtaining Escherichia coli substantially retaining the full length of the wild type herpes simplex virus genome according to the present invention comprises (a) sandwiching a loxP sequence between the UL3 gene and the UL4 gene of the wild type herpes simplex virus genome. Inserting a bacmid to obtain a first recombinant virus, (b) extracting a circular viral DNA from the first recombinant virus-infected cell and introducing it into the first E. coli, (c) Extracting the genome from the E. coli and introducing it into RSC cells (rabbit skin cells) to obtain a second recombinant virus; and (d) repairing the second recombinant virus with thymidine kinase and A step of obtaining a recombinant virus; and (e) a step of extracting circular viral DNA from a third recombinant virus-infected cell and introducing it into a second E. coli.
[0026]
In the method for obtaining an infectious recombinant herpes simplex virus according to the present invention, viral DNA is extracted from Escherichia coli substantially retaining the full length of the wild type herpes simplex virus genome and introduced into RSC cells (rabbit skin cells). Process. The method for removing bacmid from a recombinant herpes simplex virus having bacmid according to the present invention comprises: superinfecting Vero cells with a recombinant herpes simplex virus into which bacmid is inserted and a recombinant adenovirus expressing Cre recombinase; It consists of the process of removing the inserted bacmid from the recombinant herpes simplex virus.
The method of introducing the desired mutation into the viral genome in Escherichia coli that substantially retains the full length of the herpes simplex virus genome according to the present invention is as follows: (a) Mutation introduced into a plasmid expressing RecA and cloning of its flanking region From the first selection to obtain E. coli with this plasmid inserted in the viral genome, and (b) the second selection to obtain E. coli having the viral genome having the desired mutation. Become.
[0027]
【Example】
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings. In addition, this invention is not limited at all by these.
[0028]
In this example, gene cloning and analysis is performed by the Molecular Cloning-A Laboratory Manual of Manates and the Cold Spring Harbor Laboratory. (1982). The experimental method followed standard laboratory methods as described in detail in Ausubel. F et al. Current Protocols in Molecular Biology (1987).
[0029]
[Creation of plasmid pB2]
FIG. 1 is a flow sheet showing the procedure for creating plasmid pB2. The creation of plasmid pB2 will be described below with reference to FIG.
[0030]
First, a 6.8 kbp NotI fragment of pBeloBAC11 (Research Genetics, Huntsville, USA) was blunt-ended and cloned into the HincII site of pRB5198 to obtain pB1. The pRB5198 used was a plasmid obtained by amplifying an approximately 270 bp fragment containing the bidirectional polyA signal of HSV-1 UL21 and UL22 by PCR and cloning it into the XhoI and KpnI sites of pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla CA, USA). is there.
[0031]
On the other hand, two complementary oligonucleotides having a BamHI site and a BgIII site at both ends of the LoxP sequence were annealed, digested at the BamHI site and the BgIII site, and then BamHI of pRB442 (J. Virol. 65: 938-944, 1991). Cloning into the site gave pB0. As two complementary oligonucleotides, those of SEQ ID NO: 1 and those of SEQ ID NO: 2 were used.
[0032]
Viral genomic DNA was extracted from HSV-1 (F) (ATCC accession number VR733) -infected Vero cells (ATCC accession number CRL1587), digested with HindIII, and then the HindIIIO fragment was separated and purified by agarose gel electrophoresis. The purified HSV-1 (F) HindIIIO fragment was cloned into the HindIII site of pB0 to obtain pB0-1.
[0033]
Next, the BamHI-SphI fragment of pB1 was blunt-ended and cloned into the BBHI-1 site of pB0-1 blunt-ended to obtain pB2.
[0034]
[Creation of E. coli that retains the full length of the HSV-1 genome (YEbac102)]
FIG. 2 is a flow sheet showing the creation procedure of YK304. Hereinafter, the process of obtaining YEbac 102 and the process of obtaining YK 304 from YEbac 102 will be described with reference to FIG.
[0035]
The recombinant virus was prepared according to the following steps according to the preparation method described in a paper (Cell 25: 227-232) reported by Post and Roizman.
[0036]
(I) First, viral genomic DNA was extracted from R7205 (J. Virol. 65: 938-944, 1991) -infected Vero cells (ATCC accession number CRL1587), and this was cotransfected into pB2 and rabbit skin cells (RSC cells). Erected. Subsequently, a TK-recombinant (thymidine kinase negative recombinant) in which bacmid contained in the pB2 plasmid produced by homologous recombination was inserted into the genome, and a BuDR that inactivates TK + virus (thymidine kinase positive virus) exist. Below, it selected by culture | cultivating by 143TK-cell which is TK-cell. As a result, recombinant HSV (YK301) was obtained in which the bacmid sandwiched between the loxP sequences was inserted between the UL3 and UL4 genes.
[0037]
(Ii) Vero cells were infected with the obtained YK301, and circular viral DNA was extracted from the YK301-infected cells by the Hint method. The extracted circular viral DNA was introduced into E. coli DH10B (GibcoBRL Tokyo Japan) by electroporation. This was selected in a medium supplemented with chloramphenicol to obtain Escherichia coli (YEbac101) having the YK301 genome in bacmid.
[0038]
FIG. 3 shows the restriction enzyme (BamHI) cleavage (digestion) pattern on agarose electrophoresis for the obtained viral DNA extracted from E. coli (YEbac101) and wild-type HSV-1 (F) DNA. In FIG. 3, a is a band seen by insertion of bacmid, b is a band seen when TK is repaired, and c is a band seen when TK is deficient. As shown in FIG. 3, the pattern of YEbac101 almost matched the pattern of wild type HSV-1 (F) except for the TK region and the bacmid insertion region.
[0039]
From this, it was confirmed that the entire length of the wild-type HSV-1 genome was maintained in E. coli (YEbac101).
[0040]
(Iii) When infectious HSV DNA was extracted from Escherichia coli (YEbac101) by alkaline SDS method and introduced into RSC cells by the calcium phosphate method, production of infectious recombinant HSV (YK302) was confirmed.
[0041]
The obtained YK302 is a recombinant virus of TK- in which bacmid is inserted into the junction region of UL3 and UL4 genes.
[0042]
The obtained YK302 and HSV-1 (F) Δ305 (Cell 24: 555-565, 1981), which is a TK-recombinant virus similar to YK302, were allowed to stand in Vero-infected cells for 24 hours to compare their proliferation. The results are shown in Table 1. In this comparative experiment of proliferation in Vero-infected cells, the experiment was conducted under two conditions of MOI (multiplicity of infection) 1 and MOI 0.01. In Table 1, numerical values represent virus titers.
[0043]
[Table 1]

As shown in Table 1, it was confirmed that YK302 exhibits a growth ability comparable to that of Δ305 of the control at least in vitro.
[0044]
(Iv) Viral DNA was extracted from YK302-infected cells and co-transfected with pRB4867 (J. Virol. 70: 84-90, 1996) into RSC cells. Thereafter, TK + recombinants in which TK produced by homologous recombination was repaired were selected by culturing in 143TK-cells, which are TK-cells, in the presence of HAT which inactivates TK-virus. Thereby, recombinant HSV (YK303) was obtained.
[0045]
(V) Circular virus DNA was extracted from YK303-infected cells by the Hint method. This was introduced into E. coli DH10B by electroporation. This was selected in a chloramphenicol-supplemented medium to obtain Escherichia coli (YEbac102) having the YK303 genome in bacmid.
[0046]
The restriction enzyme (BamHI) cleavage pattern on agarose electrophoresis was measured for the viral DNA extracted from the obtained Escherichia coli (YEbac102) and wild-type HSV-1 (F) DNA (FIG. 3). As shown in FIG. 3, the pattern of YEbac102 almost matched the pattern of wild-type HSV (F) except for the bacmid insertion region.
[0047]
From this, it was confirmed that the full length of the wild type HSV genome was retained in E. coli (YEbac102). This E. coli (YEbac102) is useful for the development of gene therapy vectors and vaccines, as well as basic research.
[0048]
(Vi) DNA of infectious HSV was extracted from Escherichia coli (YEbac102) by alkaline SDS method and introduced into RSC cells by calcium phosphate method, and production of infectious recombinant HSV (YK304) was confirmed.
[0049]
The obtained YK304 had full-length HSV-1 genomic DNA in which bacmid was inserted into the junction region of the UL3 and UL4 genes and did not lack any known HSV-1 open reading frame.
[0050]
Table 2 shows the results of leaving the obtained YK304 and wild-type HSV-1 (F) in Vero-infected cells for 24 hours. In this comparative experiment of proliferation in Vero-infected cells, the experiment was performed under two conditions of MOI1 and MOI0.01. In Table 2, the numerical values represent virus titers.
[0051]
[Table 2]

FIG. 4 shows the results of leaving YK304 and wild-type HSV-1 (F) in Vero-infected cells for 6, 12, and 24 hours. In this comparative experiment for proliferation in Vero-infected cells, the experiment was performed under two conditions of MOI10 and MOI0.01.
[0052]
As shown in FIG. 4 and Table 2, it was confirmed that YK304 exhibits a growth ability comparable to that of wild-type HSV-1 (F) at least in vitro.
[0053]
(Vii) A recombinant adenovirus (AxCANCre) expressing Cre recombinase (causes recombination homologous recombination enzyme) is obtained by introducing AxCANCre DNA-TPC (Takara Tokyo Japan) into 293 cells (ATCC accession number CRL1573). It was. 293 cells were infected with AxCANCre at MOI 100 or higher, and 24 hours later, YK304 was superinfected with MOI 0.05. Infected cells were collected 24 hours after YK304 infection, and viral DNA was extracted. Viral DNA was extracted from each of YK304 infected cells and YK304 and AxCANCre superinfected cells, digested with RcoRI, and analyzed by the Southern method. As the probe, the EcoRB fragment of pRB442 was used.
[0054]
The result analyzed by the Southern method is shown in FIG. In FIG. 5, lane 1 represents YK304 infected cells, and lane 2 represents YK304 and AxCANCre superinfected cells. As shown in FIG. 5, it was revealed that Cre recombinase can efficiently remove bacmid from the genome of YK304.
FIG. 6 shows the results of recombinant herpes simplex virus YK311 and wild-type HSV-1 (F) from which bacmid was removed from YK304 by Cre recombinase and left in Vero-infected cells for 6, 12, and 24 hours. In this comparative experiment for proliferation in Vero-infected cells, the experiment was conducted under two conditions of MOI10 and MOI0.01.
[0055]
As shown in FIG. 6, it was confirmed that YK311 exhibits a growth ability comparable to that of wild-type HSV-1 (F) at least in vitro.
[0056]
Table 3 shows the results of inoculating YK304, YK311 and wild-type HSV-1 (F) into the brain of BALB / C mice and observing the survival of the mice for 2 weeks. The numerical value shows the value of PFU / LD50 (mortality was evaluated from 2 to 14 days after inoculation. PFU / LD50 was calculated by the behrens-Karber method).
[0057]
[Table 3]

As shown in Table 3, it was confirmed that YK304 and YK311 exert equivalent pathogenicity in wild-type HSV-1 (F) and a mouse animal model.
[Introduction of target mutations into the herpes simplex virus genome in Escherichia coli]
pKO3 (J. Bacteriol. 179: 6228-6237) was treated with BstBI, followed by ligation reaction to remove the chloramphenicol resistance gene, and the BclI-FokI fragment of pcDNA4 / HisMax C (Invitrogen) at the NaeI site Was blunt-ended, and a plasmid pKO5M into which a zeocin resistance gene was introduced was constructed. Further, the PCR-amplified recA gene derived from E. coli was cloned into the SalI site of pK05M to construct pKO5MRA. An approximately 10 kbp NotI fragment containing the herpes simplex virus ICP6 gene having an 85 bp oligonucleotide inserted into the XmnI site was blunt-ended and cloned into the SalI site of pKO5MRA to prepare pKO5MRA-ICP6-FRT.
[0058]
After introducing pKO5MRA-ICP6-FRT into YEbac102, it was inoculated into a medium supplemented with chloramphenicol and zeocin and cultured at 43 ° C. overnight. The resulting Escherichia coli colony was inoculated into a medium supplemented with sucrose and zeocin and cultured overnight at 30 ° C. (° C.). Chloramphenicol and sucrose resistant and zeocin sensitive colonies were analyzed by PCR, and Escherichia coli carrying the herpes simplex virus genome having the desired mutation was selected.
[0059]
When the viral genome was extracted from the E. coli and introduced into RSC, the production of infectious recombinant herpes simplex virus (YK351) was confirmed. FIG. 7 shows the result of extracting the viral genome from the YK351-infected cells and analyzing the oligonucleotide insertion site by PCR. As shown in FIG. 7, compared with wild type HSV-1 (F), a PCR product having a size larger than that of the oligonucleotide was detected in the YK351 genome.
[0060]
From the above, it was revealed that the target mutation can be introduced into the herpes simplex virus genome in YEbac102.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a flow sheet showing a procedure for creating plasmid pB2.
FIG. 2 is a flow sheet showing a creation procedure of YK304.
FIG. 3 is a photograph showing a BamHI restriction enzyme digestion pattern of HSV genomic DNA retained in wild-type HSV-1 (F), YEbac101, and YEbac102.
FIG. 4 shows experimental data for comparison of growth of wild-type HSV-1 (F) and YK304 in Vero-infected cells.
FIG. 5 is a photograph showing an analysis pattern regarding removal of bacmid by Cre recombinase.
FIG. 6 shows experimental comparative data of growth of wild-type HSV-1 (F) and YK311 in Vero-infected cells.
FIG. 7 is a photograph showing the results of PCR analysis in the vicinity of the XmnI site in the ICP6 gene of wild-type HSV-1 (F) and YK351.
[Sequence Listing]

Claims

A recombinant herpes simplex virus retaining the full length of the wild-type herpes simplex virus genome ,
UL3 gene bacmid sandwiched between lox P sequences between UL4 genes (bacmid) is inserted recombinant herpes simplex virus wild-type herpes simplex virus genome.

The recombinant herpes simplex virus according to claim 1, which has the same level of pathogenicity as wild-type herpes simplex virus.

The recombinant herpes simplex virus according to claim 1, which has a defect in the thymidine kinase site of the wild-type herpes simplex virus genome.

The recombinant herpes simplex virus according to any one of claims 1 to 3, which has a growth ability comparable to that of a wild type herpes simplex virus.

Bacmid by Cre recombinase (bacmid) recombinant herpes simplex virus according to any one of removal capable claim 1-4 in.

Claim 1 from a recombinant herpes simplex virus according to any one of 5, recombinant herpes simplex virus obtained as a result of bacmid (bacmid) is removed by the Cre recombinase.

The recombinant herpes simplex virus according to claim 6, which has the same ability to grow as wild-type herpes simplex virus.

The recombinant herpes simplex virus according to claim 6 or 7 , which has the same pathogenicity as that of a wild-type herpes simplex virus.

The recombinant herpes simplex virus according to any one of claims 1 to 8 , which is used as a viral vector.

From holding the entire length of the genome of wild-type herpes simplex virus, infected with recombinant herpes simplex virus bacmid sandwiched between lox P sequence (bacmid) is inserted between the UL3 gene and UL4 genes of its genome cell E. coli introduced with the extracted circular viral DNA.

The viral genome in which the Escherichia coli is retained, reconstructed recombinant herpes simplex virus by introducing into cultured cells, according to claim 10 having the ability to grow and / or pathogenicity comparable to the wild-type herpes simplex virus E. coli.

The viral genome in which the Escherichia coli is retained, recombinant herpes simplex virus reconstructed by introducing into cultured cells, Escherichia coli according to claim 10 or 11 by the Cre recombinase are possible removal of bacmid (bacmid).

The viral genome in which the Escherichia coli is retained as a result of bacmid (bacmid) is removed from the reconstructed recombinant herpes simplex virus by Cre recombinase resulting recombinant herpes simplex virus by introducing into cultured cells, wild-type simple The Escherichia coli according to any one of claims 10 to 12 , which has the same growth ability and / or pathogenicity as herpes virus.

14. The Escherichia coli according to any one of claims 10 to 13, wherein a target mutation can be introduced into the viral genome.

Having a defect in Chimidjinkinaze site of wild-type herpes simplex virus genome, were infected with recombinant herpes simplex virus bacmid sandwiched between lox P sequence (bacmid) is inserted between the UL3 gene and UL4 genes of its genome E. coli introduced with circular viral DNA extracted from cells.

The viral genome in which the Escherichia coli is retained, Escherichia coli according to claim 15 it is possible to remove the bacmid (bacmid) from reconstructed recombinant herpes simplex virus by Cre recombinase by introducing into cultured cells.

The E. coli according to claim 15 or 16 , which is used in developing a viral vector or a vaccine.

(A) between the UL3 gene and UL4 genes of the wild-type herpes simplex virus genome, and inserting a bacmid (bacmid) sandwiched between loxP sequences, a step of obtaining a first recombinant virus, (b) second Extracting the circular viral DNA from one recombinant virus-infected cell and introducing it into the first E. coli; (c) extracting the genome from the E. coli and introducing it into an RSC cell (rabbit skin cell); Obtaining a second recombinant virus; (d) repairing the second recombinant virus with thymidine kinase to obtain a third recombinant virus; and (e) a circular virus from the third recombinant virus-infected cell. A method for obtaining E. coli that retains the full length of the wild-type herpes simplex virus genome, comprising: extracting DNA and introducing it into a second E. coli.