JP4217061B2

JP4217061B2 - Fluorescence reader

Info

Publication number: JP4217061B2
Application number: JP2002361161A
Authority: JP
Inventors: 新一土坂
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-12-12
Filing date: 2002-12-12
Publication date: 2009-01-28
Anticipated expiration: 2022-12-12
Also published as: JP2004191252A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、担体上もしくは溶液中に存在する試料からの蛍光を検出する蛍光読み取り装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
この種の装置には、特に検出目的である核酸の特異的な配列の一部に、相補的な配列（以下、プローブ）をガラスやシリコン、プラスチックなどの担体上に固相した、いわゆるＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイの蛍光を測定する装置がある。この装置では、各プローブに蛍光を標識することにより測定が行われる。しかし、ここで検出すべき蛍光量は、他の細胞や組織を検出対象とした蛍光量に比較して非常に微量であることが知られている。
【０００３】
そこで、蛍光量の高感度な検出を行う必要がある。そのための蛍光読み取り装置の方式は、
（１）共焦点／光電子増倍管／スキャンニング方式
（２）冷却ＣＣＤ方式
などがある。
【０００４】
（１）の方式は、共焦点レーザー光学系を用いて、標本上または標本内をスキャンニングして、主にガラス担体上の核酸の結合反応を検出する用途に用いられる。共焦点方式の特徴である外乱光ノイズの除去ができること、および微小領域に大きな光量を集中できることから、微弱な蛍光標本の測定が高精度で可能となる。
【０００５】
しかし、対物レンズの焦点深度が浅く、標本にわずかなゆがみや撓みがある場合、および標本がステージに対して傾いて置かれた場合に、正確な測定結果が得られない。つまり、対物レンズの焦点深度内に標本がないと、標本から蛍光が出ているにも関わらず、これを検出することができなくなる。また、担体の材質が自家蛍光を持つ場合、対物レンズのピント位置が担体内に入ると、自家蛍光のみを検出する結果となり、正確な蛍光測光ができなくなる。
【０００６】
ちなみに、波長６３３ｎｍのレーザーとＮＡ０．３の対物レンズとの組み合わせでの焦点深度は、下式から約４μｍである。
【０００７】
焦点深度＝（０．６×波長）／（ＮＡ）^２
この問題は、ステージのスキャニングに同調する正確なオートフォーカス装置があれば解消できるが、蛍光読み取り装置の大型化と価格上昇は避けられない。
【０００８】
（１）の方式は、以上述べた理由から、微小な領域の蛍光色素が点在するような蛍光標本の測光には適しているものの、ＤＮＡチップのような大きな標本のスキャニング蛍光測光には適していない。
【０００９】
（２）の方式は、超高感度の冷却ＣＣＤカメラを用いて、広い範囲を１度に測光できる。また、水銀ランプなど多色光源を用いるので、多種の蛍光励起フィルターを用いて、使用する蛍光物質に合わせた測光ができる。しかし、測定感度はまだ必要なレベルに達していない。
【００１０】
以上説明したように、各方式の装置には、検出対象として適切、不適切な標本があり、同一の装置で様々な標本に対応することはできなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
現在、分子生物学の分野を中心に用いられているチップやマイクロアレーは、０．１〜３ｍｍ程度のハイブリダイゼーション反応用のＤＮＡ貼着部（プローブ）が、数十から数百個、担体に０．３〜５ｍｍ間隔で規則正しく設けられている。担体は、ガラス板、シリコン板、ニトロセルロースやナイロン製の多孔質フィルターなどの材質からなる。
【００１２】
これらの担体材料には、いずれも微妙なゆがみ、撓み、および自家蛍光が存在する。したがって、これらの大きな材料の表面上の微量蛍光を均一に測定しようとすると、従来の共焦点方式では、ゆがみ等により測定面全面について均一な蛍光測光が行なえなかった。逆に、従来の照射方式では、反応のあったプローブをより精密に測定することは困難であった。
【００１３】
また、溶液中に浮遊させた蛍光分子付きＤＮＡの揺らぎを計測してＤＮＡの結合状況を解析するＦＣＳ（蛍光コリレーション）等では、ピンホール方式で大容積の溶液の蛍光量を測定し、ＤＮＡの密度を検知してから、共焦点光学系に切り替え、対物レンズのビームウエストに出入りするＤＮＡの揺らぎを測定したいとの要望もある。
【００１４】
従来技術（１）で示した共焦点レーザー方式は、合焦時には正確な測定が可能であるが、非合焦時には読み取り感度が低下する。この課題を克服するためにオートフォーカス方式を取り入れることも考えられるが、装置の大型化や価格の上昇に繋がる。また、担体の形状によっては隔壁などの突起があり、オートフォーカス装置を取り付けられない場合もある。
【００１５】
本発明の目的は、簡単な光学系の切り替えで異なる方式による測光を行なえる蛍光読み取り装置を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
課題を解決し目的を達成するために、本発明の蛍光読み取り装置は以下の如く構成されている。
【００１７】
（１）本発明の蛍光読み取り装置は、担体上もしくは溶液中に存在する試料からの蛍光を検出する蛍光読み取り装置であり、平行光束を照射する光源と、前記平行光束の光路中に配置された励起ピンホールと、前側焦点位置が前記励起ピンホールの位置と一致するよう配置された着脱可能な投光レンズと、後側焦点位置が前記投光レンズの後側焦点位置と一致するよう配置され、前記試料に平行光束を照射する対物レンズと、前記投光レンズと前記対物レンズの間に配置され、平行光束を反射するとともに蛍光を透過する波長選択ミラーと、前記試料から発し前記対物レンズと前記波長選択ミラーを通った蛍光を結像するよう配置された結像レンズと、この結像レンズの結像位置に配置された受光ピンホールと、この受光ピンホールを通った前記蛍光を検出する検出手段と、を備え、コリメート光照射方式で前記蛍光を検出する場合、前記投光レンズを前記平行光束の光路に入れ、前記光源から照射された前記平行光束を、前記励起ピンホール、前記投光レンズ、前記波長選択ミラー、及び前記対物レンズを介して前記試料に照射し、前記試料からの蛍光を、前記対物レンズ、前記波長選択ミラー、前記結像レンズ、及び前記受光ピンホールを介して前記検出手段で検出し、共焦点方式で前記蛍光を検出する場合、前記投光レンズを前記平行光束の光路から外し、前記光源から照射された前記平行光束を、前記励起ピンホール、前記波長選択ミラー、及び前記対物レンズを介して前記試料に照射し、前記試料からの蛍光を、前記対物レンズ、前記波長選択ミラー、前記結像レンズ、及び前記受光ピンホールを介して前記検出手段で検出する。
【００１９】
（２）本発明の蛍光読み取り装置は上記（１）に記載の装置であり、かつ前記励起ピンホールと受光ピンホールとはそれぞれ板部材に設けられ、その径が選択的に可変である。
【００２０】
（３）本発明の蛍光読み取り装置は上記（１）に記載の装置であり、かつ前記光源と前記投光レンズとの間に、平行光束の径を調整するビームエキスパンダーを配置した。
【００２１】
（４）本発明の蛍光読み取り装置は上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の装置であり、かつ前記試料は、核酸または核酸と結合した試薬に結合した蛍光色素からなる。
【００２２】
（５）本発明の蛍光読み取り装置は上記（４）に記載の装置であり、かつ前記核酸の少なくとも一部が前記担体上に一つ以上固定化されており、前記核酸と特異的に結合する試薬に蛍光色素が結合している。
【００２３】
（６）本発明の蛍光読み取り装置は上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の装置であり、かつ前記試料を前記試料が配置されている一定間隔毎または連続的に移動し、前記蛍光を検出する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
【００２５】
図１は、本発明の実施の形態に係る微量蛍光読み取り装置の光学系を示す図である。この微量蛍光読み取り装置は、担体上もしくは溶液中に存在する試料からの蛍光を測定、定量する。
【００２６】
図１に示すように、平行光束光源１の光路上には、可変ビームエキスパンダー１２、励起ピンホール（励起ピンホールディスク）５、光路から着脱可能な投光レンズ２、および波長選択ミラー（ダイクロイックミラー）７が備えられている。なお、励起ピンホール５は様々な径のピンホール（励起ピンホール）が円盤上に一定間隔で設けられ、かつ、一定間隔で停止する装置の付いたターレット（板部材）からなっている。これにより、励起ピンホール５に設けられた様々な径のピンホール（受光ピンホール）が選択的に光路に入る。この励起ピンホール５は、投光レンズ２の前側焦点位置に設置されている。
【００２７】
また、波長選択ミラー７の反射光路上には、対物レンズ３と、担体１０に多数の試料（プローブ）１１が貼着された標本とが備えられている。波長選択ミラー７の透過光路上には、投光レンズ２と同じレンズからなる結像レンズ４、受光ピンホール（受光ピンホールディスク）６、および光検出器８が備えられている。受光ピンホール６は励起ピンホール５と同じもので、様々な径のピンホール（受光ピンホール）が選択的に光路に入るようなターレットからなっている。この受光ピンホール６は、結像レンズ４の後側焦点位置に設置されている。
【００２８】
まず、テレセン照射光学系で試料を測光する場合の形態を説明する。平行光束光源１は、一般にレーザー光源が用いられる。この光源１から照射された平行光束は、その一部がビームエキスパンダー１２を介して励起ピンホール５のピンホールを通り、投光レンズ２を介して波長選択ミラー７でほぼ直角に反射され、対物レンズ３の後側焦点９（物体面から見て後側の意味）付近に集光された後、対物レンズ３を介して担体１０上（もしくは液体中）の試料１１にコリメート光としてテレセントリックに照射される。すなわち、投光レンズ２の後側焦点位置と対物レンズ３の後側焦点位置は一致している。この時、励起光束は円筒状の平行光束となっている。試料１１から発した蛍光は、対物レンズ３を介して波長選択ミラー７を透過して、結像レンズ４によって結像され、その結像位置に配置された受光ピンホール６のピンホールを通り、光検出器８に入射され検出される。
【００２９】
このように本実施の形態の構成では、投光レンズ２と結像レンズ４に同じレンズを使用しているので、励起ピンホール５のピンホールと同じ大きさの像が結像レンズ４によって作られる。これにより、励起ピンホール５と受光ピンホール６の双方のピンホールの操作上、同じ径のピンホールを光路上に入れればよく、操作上簡易になり、価格上も利点が生じる。
【００３０】
なお、結像レンズ４によって結像された蛍光像と同じ大きさのピンホールを有する受光ピンホール６を用いる理由は、励起光が照射している試料１１の部分の蛍光だけを検出し、外乱光が測定値に入ることを防ぐためである。
【００３１】
本実施の形態の光学系は、小穴直良光学系と呼ばれる光学系と似ているが、励起光をコリメート光として照明しているところに特徴がある。具体的には、平行光束を励起ピンホール５で整形し、投光レンズ２により対物レンズ３の瞳位置９に集光させることで、試料１１へ照射する励起光を一定の断面積を有する平行光束とすることができる。これは、対物レンズ３と試料１１とのなす距離に関わらず、試料１１を照射する励起光の形状とエネルギーが変わらないことを意味し、ひいては安定な励起を可能にしており、共焦点／小穴直良方式では実現できない機能である。
【００３２】
また、このとき励起ピンホール５のピンホールのエッジから発生した回折光は、対物レンズ３のピント位置に励起ピンホール５のピンホールの像を形成する。これは、試料１１の表面にピントを合わせるときに有効であり、正確なピント合わせによる測光が可能になる。
【００３３】
ただし本実施の形態では、励起ピンホール径を２ｍｍ、対物レンズを１０倍／ＮＡ０．３程度の構成としている。この場合の励起光束径は０．２ｍｍ、受光ピンホール径は２ｍｍである。この構成の焦点深度は、一般顕微鏡として用いる場合と同じで１５μｍ、測光時の焦点深度は、図２に示す焦点位置に対する蛍光量の変化から、３０μｍ程度となる。よって担体に自家蛍光があると、これを検出してしまう。この自家蛍光の傾向も図２から読み取ることができる。基本的に自家蛍光は、焦点が担体内に入り込んでいるときに大きく、担体から遠のくと小さくなる傾向にあるが、ほぼ一定と考えることができる。
【００３４】
本実施の形態における標本となる主な測定対象は、担体１０上に試料１１（プローブ）として１つ以上固定化された核酸であり、該核酸と特異的に結合する試薬に蛍光色素が結合している。このため、試料１１からの蛍光を検出することで、目的の核酸が存在するか否かを判定し、また存在した場合にはその蛍光量を測定することができる。なお標本は、２０ｍｍ（Ｗ）×６０ｍｍ（Ｌ）×１ｍｍ（Ｔ）のスライドガラスに、０．３５ｍｍ径のプローブを０．６ｍｍピッチで貼着させたものである。
【００３５】
こうした構成をなす本実施の形態の微量蛍光読み取り装置による測光は、以下の様に行なわれる。試料１１が貼着された担体１０は、スキャニングステージ上に置かれ、励起光束下でスキャニングされ、ステージに取り付けられたエンコーダからの信号に応じてプローブが配置されているピッチ（一定間隔）毎にステップ移動、または連続的に移動し、測光される。この装置では、０．０５ｍｍ毎にデータが取り込まれ、コンピュータに記憶される。その後、二つのプローブ間の本来蛍光が無い部分の測光データを幾つか取り出し、平均化して、全体のデータからこの量を減算し、試料１１のデータとする。
【００３６】
一般にＤＮＡチップは、プローブの蛍光量が所定値より大きいか（陽性）あるいは小さいか（陰性）を判断できればよく、プローブの蛍光量の絶対値を測光する必要は無い。よって、このようなスキャニング方式が実行できる場合、測光のピッチは小さい方が良いが、測定時間との関係で０．０５ｍｍピッチと設定してある。
【００３７】
絶対蛍光量の測定では、受光ピンホール径を結像レンズ４が作る蛍光像より大きくし、受光ピンホール６をプローブが配置されているピッチ毎にステップ移動、または連続移動させる。この場合、プローブと受光ピンホールの位置を合わせるアライメント作業が必要になるが、測定時間は測定点が少ない分短くなる。自家蛍光の除去は、プローブの無い部分の蛍光データをあらかじめ測定しておき、その値をプローブの蛍光量から差し引くことで行なわれる。または、ピンホールを矩形とみなして担体全面を測光してもよい。
【００３８】
一般に蛍光の測定には、ＮＡの大きい対物レンズが選ばれる。その理由は、対物レンズの集光能力はＮＡの２乗に比例するからである。そこで、同一倍率の対物レンズであればＮＡの大きいものが選ばれる。対物レンズは、高倍率になるほどＮＡは大きいが逆に測光面積は小さくなるので、測光時間との関係を考慮して選択される。
【００３９】
次に、共焦点方式で試料を測光する場合の形態を説明する。まず、選択される対物レンズ３の瞳径に合うように、光源１からの平行光束の径はビームエキスパンダー１２によって調整される。例えば、５０倍でＮＡ０．７の対物レンズの場合は、約１０ｍｍに設定される。この場合、励起ピンホール径も１０ｍｍに設定される。
【００４０】
次に、投光レンズ２が光路から取り除かれる。受光ピンホール径は、結像レンズ４の射出側のＮＡから計算される径より若干大きく設定される。つまり、

となり、本構成では４０μｍに設定される。この場合、試料１１上の励起スポット径は、
ｄ＝１．２λ／ＮＡ＝１μｍ
である。
【００４１】
本方式によれば、ピントが合っている場合、励起エネルギーを微小な点に集中でき、蛍光分子が散在するような標本にも対応できる。また、ノイズの無い測定を行なえることから、微小部分、例えば１個のプローブの精密測定や、液中の蛍光分子を取り付けたＤＮＡの定点観測、つまり対物レンズのビームウエスト中に出入りするＤＮＡの動きを観察することができる。
【００４２】
また、本実施の形態で使用できる平行光束光源１に制限はないが、よく用いられる光源としてレーザー光源がある。光検出器８にも制限はないが、高感度な検出を行うためには、フォトマルチメーターやアバランシェフォトダイオードなどが良く用いられる。波長選択ミラー７も励起光と蛍光を分離することが可能であれば制限はないが、ダイクロイックミラーが良く用いられる。また、テレセントリック光学系は必ずしも完全に正確な構成でなくても、上述の特徴を得ることができるため、試料１１の近傍(±５μｍ程度)の範囲において平行光束が集光されないよう構成すればよい。この場合、平行光束の大きさ（幅）は、３μｍ〜２００μｍとすることが可能であるが、実際には５μｍ〜５０μｍが適切な大きさである。
【００４３】
また本実施の形態では、試料１１が担体１０の上下どちら側に付いても、対物レンズ３に担体１０の厚さを補正したものを用いれば、測光は可能である。この対応は、高い隔壁などを持った担体１０を用い、隔壁の形成されている側に試料が付いている場合などにも好適である。
【００４４】
本発明の蛍光読み取り装置によれば、投光レンズ２が光路に入っている場合、光学系はコリメート光照射方式となり、測定対象のＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレーのゆがみ、撓み等の平坦性に影響されず、かつチップがステージ上にわずかに傾いて置かれた場合にも、標本全面で良好な蛍光測光を行なえる。また、励起光学系はテレセントリックに構成されており、標本を照射する励起光束は断面が円形の平行光束となっており、対物レンズと標本との距離に関係無く、標本を励起する励起光の形状とエネルギーは常に一定であり、安定した励起を行なえる。
【００４５】
また、励起ピンホール５のピンホールのエッジからの回折光が対物レンズ３のピント位置にピンホール像を作ることから、精密なピント合わせができる。よって、核酸の結合反応のような微弱な蛍光しか得られないような試料からの微量な蛍光を、安定して検出できる。
【００４６】
投光レンズ２が光路からはずれた場合、光学系は共焦点方式となり、微小部分に散在する極微量の蛍光を測定できる。例えば、コリメート光照射方式でアレーを全面測定した後に、特定のプローブを精密に測定することができる。
【００４７】
また、投光レンズ２と結像レンズ４が同一のレンズからなるため、励起ピンホール５のピンホールと同径の像が結像レンズ４によって結像される。よって、様々な径のピンホールが円盤に設けられている同じターレットを投光側と結像側で使えることになり、装置の操作上便利なものとなる。
【００４８】
さらに、励起ピンホール径と受光ピンホール径が可変であるので、標本に照射する励起光束の径を変更して、測光領域を適切な大きさに変化させ測光することができる。
【００４９】
また、共焦点光学系にした時には、励起ピンホール径は対物レンズ３の瞳径に等しいことが望ましく、受光ピンホール径は結像レンズ４の作るエアリーデスクより若干大きい程度が良いとされる。この径は、コリメート光照射方式に比べ、投光側では大きく、受光側では小さい。これに対しては、ピンホール径が可変であるため対応できる。
【００５０】
また、平行光束光源１と投光レンズ２との間にビームエキスパンダー１２を配置したので、共焦点光学系に対応できる。何故なら、共焦点光学系において対物レンズ３が標本上に作るスポット径（エアリーデスク）Φｄは、
Φｄ＝１．２λ／ＮＡ（ＮＡ：対物レンズの開口数 λ:波長）
である。ここで重要なのは、励起平行光束が対物レンズ３の開口を満たす光束でなければならない。例えば５０倍対物レンズで、ＮＡ＝０．７、ｆ＝３．６ｍｍとすると、瞳径は
ΦＤ＝２×ＮＡ×ｆ＝２×０．７×３．６＝１０（ｍｍ）
となる。つまり、約１０ｍｍの光束径が必要である。
【００５１】
一方、コリメート光照射光学系では、標本への励起光の照射の考え方は、励起ピンホール５のピンホールを、投光レンズ２と対物レンズ３で標本上に投影するものとしている。標本上の励起光束の径Φｄは、
Φｄ＝投光ピンホール径／対物レンズ倍率
であり、２０倍対物レンズで標本上に０．１ｍｍ径の励起照射をするとき、投光ピンホール径は２ｍｍとなる。平行光束光源１のパワーを十分に使用するためには、光束径を変化できる可変エキスパンダーが必要であるが、投光ピンホール径を５ｍｍ程度に固定してもよい。
【００５２】
一般的なＤＮＡアレーは試料が一定間隔で並んでいるが、このような標本をコリメート光照射光学系で測光すれば、試料の近傍での外乱光や自家蛍光を測光でき、正確な測光を行なえる。
【００５３】
以上のように本発明では、二つの異なる方式による蛍光測光が、基本的に投光レンズの着脱とピンホールの選択で可能となる。エキスパンダーは光学系の最適化のため用いられるので、標本によっては必要でない。コリメート光照射方式では、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイに撓みがあっても、均一な蛍光測光を行なえる。この方式では焦点深度が深く、ピントずれによる測光の不安定さが無くなる。一方、焦点深度が深くなる分、担体の自家蛍光を拾うことになるが、プローブ近傍の自家蛍光を測定し、この値をプローブ部の測光量から引くことにより、正確な蛍光を得ることができる。また共焦点方式では、ピントずれの無い部分、ピントずれの生じない標本で、ノイズの無い正確な蛍光測光を行なえる。
【００５４】
これら二つの方式の切り替えは、投光レンズを光路から外すだけなので、操作が簡単で、かつ安価な蛍光読み取り装置を実現できる。
【００５５】
なお、本発明は上記実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、簡単な光学系の切り替えで異なる方式による測光を行なえる蛍光読み取り装置を提供できる。
【００５７】
すなわち本発明によれば、検出対象の適切、不適切さが異なる二つの方式、例えばコリメート光照射方式と共焦点方式による測定を、一つの装置で簡単な光学系の切り替えにより行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る微量蛍光読み取り装置の光学系を示す図。
【図２】本発明の実施の形態及び従来例に係る焦点位置に対する蛍光量の変化を示す図。
【符号の説明】
１…平行光束光源
２…投光レンズ
３…対物レンズ
４…結像レンズ
５…励起ピンホール
６…受光ピンホール
７…波長選択ミラー
８…光検出器
９…後側焦点
１０…担体
１１…試料
１２…ビームエキスパンダー[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a fluorescence reader that detects fluorescence from a sample present on a carrier or in a solution.
[0002]
[Prior art]
In this type of apparatus, a so-called DNA chip in which a complementary sequence (hereinafter referred to as a probe) is solid-phased on a carrier such as glass, silicon or plastic, in particular to a part of a specific sequence of a nucleic acid to be detected. There is an apparatus for measuring the fluorescence of a DNA microarray. In this apparatus, measurement is performed by labeling each probe with fluorescence. However, it is known that the amount of fluorescence to be detected here is very small compared to the amount of fluorescence with other cells or tissues as detection targets.
[0003]
Therefore, it is necessary to detect the fluorescence amount with high sensitivity. For that purpose, the fluorescence reading system is
(1) Confocal / photomultiplier tube / scanning method (2) Cooling CCD method.
[0004]
The method (1) is mainly used for detecting a nucleic acid binding reaction on a glass carrier by scanning a specimen or the inside of a specimen using a confocal laser optical system. Since disturbance light noise, which is a feature of the confocal method, can be removed, and a large amount of light can be concentrated in a minute region, measurement of a weak fluorescent sample can be performed with high accuracy.
[0005]
However, when the focal depth of the objective lens is shallow and the specimen has slight distortion or deflection, and when the specimen is placed at an inclination with respect to the stage, an accurate measurement result cannot be obtained. In other words, if there is no sample within the focal depth of the objective lens, it becomes impossible to detect this even though the sample emits fluorescence. Further, when the material of the carrier has autofluorescence, when the focus position of the objective lens enters the carrier, only autofluorescence is detected, and accurate fluorescence photometry cannot be performed.
[0006]
Incidentally, the depth of focus in the combination of a laser with a wavelength of 633 nm and an objective lens with NA of 0.3 is about 4 μm from the following equation.
[0007]
Depth of focus = (0.6 × wavelength) / (NA) ²
This problem can be solved if there is an accurate autofocus device that synchronizes with the scanning of the stage, but an increase in the size and price of the fluorescence reader is inevitable.
[0008]
The method (1) is suitable for photometry of fluorescent specimens scattered with a small area of fluorescent dye for the reasons described above, but suitable for scanning fluorescence photometry of large specimens such as DNA chips. Not.
[0009]
The method (2) can measure light over a wide range at once using a super-sensitive cooled CCD camera. In addition, since a multicolor light source such as a mercury lamp is used, photometry according to the fluorescent substance to be used can be performed using various fluorescent excitation filters. However, the measurement sensitivity has not yet reached the required level.
[0010]
As described above, each type of apparatus has appropriate and inappropriate specimens as detection targets, and the same apparatus cannot handle various specimens.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
Currently, chips and microarrays used mainly in the field of molecular biology have tens to hundreds of DNA sticking parts (probes) for hybridization reaction of about 0.1 to 3 mm on the carrier. It is regularly provided at intervals of 0.3 to 5 mm. The carrier is made of a material such as a glass plate, a silicon plate, a porous filter made of nitrocellulose or nylon.
[0012]
These carrier materials all have subtle distortions, deflections, and autofluorescence. Therefore, when trying to uniformly measure a small amount of fluorescence on the surface of these large materials, the conventional confocal method cannot perform uniform fluorescence photometry over the entire measurement surface due to distortion or the like. On the other hand, with the conventional irradiation method, it was difficult to measure the probe that had reacted more precisely.
[0013]
In addition, in FCS (fluorescence correlation) that measures the fluctuation of DNA with fluorescent molecules suspended in the solution and analyzes the binding state of the DNA, the fluorescence amount of a large volume solution is measured by the pinhole method, There is also a demand to measure the fluctuation of DNA entering and exiting the beam waist of the objective lens after switching to the confocal optical system.
[0014]
In the confocal laser system shown in the prior art (1), accurate measurement is possible at the time of focusing, but the reading sensitivity is lowered at the time of non-focusing. In order to overcome this problem, it may be possible to adopt an autofocus method, but this leads to an increase in the size and price of the apparatus. Further, depending on the shape of the carrier, there are protrusions such as a partition wall, and the autofocus device may not be attached.
[0015]
An object of the present invention is to provide a fluorescence reading apparatus capable of performing photometry by different methods by simply switching an optical system.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the problems and achieve the object, the fluorescence reading apparatus of the present invention is configured as follows.
[0017]
(1) A fluorescence reading apparatus of the present invention is a fluorescence reading apparatus that detects fluorescence from a sample present on a carrier or in a solution, and is disposed in a light source that irradiates a parallel light beam and an optical path of the parallel light beam. An excitation pinhole, a detachable projection lens arranged so that the front focal position coincides with the position of the excitation pinhole, and a rear focal position arranged so as to coincide with the rear focal position of the projection lens An objective lens that irradiates the sample with a parallel light beam, a wavelength selection mirror that is disposed between the light projecting lens and the objective lens, reflects the parallel light beam and transmits fluorescence, and emits from the sample the objective lens. An imaging lens arranged to form an image of fluorescence passing through the wavelength selection mirror, a light receiving pinhole arranged at an imaging position of the imaging lens, and the light passing through the light receiving pinhole And a detection means for detecting the serial fluorescence, when detecting the fluorescence with collimated light irradiation method, put the projection lens in the optical path of the parallel beam, the parallel light beam emitted from said light source, said excitation The sample is irradiated through the pinhole, the light projecting lens, the wavelength selection mirror, and the objective lens, and the fluorescence from the sample is converted into the objective lens, the wavelength selection mirror, the imaging lens, and the light reception. When detecting by the detection means through a pinhole and detecting the fluorescence by a confocal method, the projection lens is removed from the optical path of the parallel light beam, and the parallel light beam emitted from the light source is converted into the excitation pin. Irradiating the sample through a hole, the wavelength selection mirror, and the objective lens, and fluorescence from the sample is converted into the objective lens, the wavelength selection mirror, the imaging lens, Detected by the detecting means through the fine light receiving pinhole.
[0019]
( 2 ) The fluorescence reading apparatus of the present invention is the apparatus described in (1) above, and the excitation pinhole and the light receiving pinhole are respectively provided in the plate member, and the diameter thereof is selectively variable.
[0020]
( 3 ) The fluorescence reading apparatus of the present invention is the apparatus described in (1) above, and a beam expander that adjusts the diameter of a parallel light beam is disposed between the light source and the light projecting lens.
[0021]
( 4 ) The fluorescence reading apparatus of the present invention is the apparatus according to any one of (1) to ( 3 ) above, and the sample is made of a fluorescent dye bound to a nucleic acid or a reagent bound to the nucleic acid.
[0022]
( 5 ) The fluorescence reading apparatus of the present invention is the apparatus according to ( 4 ) above, and at least a part of the nucleic acid is immobilized on the carrier, and specifically binds to the nucleic acid. A fluorescent dye is bound to the reagent.
[0023]
( 6 ) The fluorescence reading apparatus of the present invention is the apparatus according to any one of (1) to ( 5 ) above, and moves the sample at regular intervals or continuously where the sample is arranged, Detect fluorescence.
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0025]
FIG. 1 is a diagram showing an optical system of a microscopic fluorescence reading apparatus according to an embodiment of the present invention. This microscopic fluorescence reader measures and quantifies fluorescence from a sample present on a carrier or in a solution.
[0026]
As shown in FIG. 1, a variable beam expander 12, an excitation pinhole (excitation pinhole disk) 5, a projection lens 2 detachable from the optical path, and a wavelength selection mirror (dichroic mirror) are provided on the optical path of the parallel light source 1. ) 7 is provided. The excitation pinhole 5 is composed of a turret (plate member) with devices having various diameters of pinholes (excitation pinholes) provided on the disk at regular intervals, and stopping at regular intervals. Thereby, pinholes (light receiving pinholes) of various diameters provided in the excitation pinhole 5 selectively enter the optical path. The excitation pinhole 5 is installed at the front focal position of the light projecting lens 2.
[0027]
In addition, on the reflected light path of the wavelength selection mirror 7, an objective lens 3 and a specimen in which a large number of samples (probes) 11 are attached to a carrier 10 are provided. An imaging lens 4, a light receiving pinhole (light receiving pinhole disk) 6, and a light detector 8, which are the same lenses as the light projecting lens 2, are provided on the transmission optical path of the wavelength selection mirror 7. The light receiving pinhole 6 is the same as the excitation pinhole 5 and includes a turret in which pinholes with various diameters (light receiving pinholes) selectively enter the optical path. The light receiving pinhole 6 is installed at the rear focal position of the imaging lens 4.
[0028]
First, a mode in which a sample is measured with a telecentric optical system will be described. As the parallel light source 1, a laser light source is generally used. A part of the parallel light beam emitted from the light source 1 passes through the pinhole of the excitation pinhole 5 through the beam expander 12, is reflected by the wavelength selection mirror 7 through the light projecting lens 2, and is reflected at a right angle. After condensing near the rear focal point 9 of the lens 3 (meaning the rear side when viewed from the object surface), the sample 11 on the carrier 10 (or in the liquid) is irradiated through the objective lens 3 in a telecentric manner as collimated light. Is done. That is, the rear focal position of the projection lens 2 and the rear focal position of the objective lens 3 coincide. At this time, the excitation light beam is a cylindrical parallel light beam. The fluorescence emitted from the sample 11 passes through the wavelength selection mirror 7 through the objective lens 3, is imaged by the imaging lens 4, passes through the pinhole of the light receiving pinhole 6 disposed at the imaging position, It enters the photodetector 8 and is detected.
[0029]
As described above, in the configuration of the present embodiment, the same lens is used for the projection lens 2 and the imaging lens 4, so that an image having the same size as the pinhole of the excitation pinhole 5 is formed by the imaging lens 4. It is done. Thereby, in the operation of the pinholes of both the excitation pinhole 5 and the light receiving pinhole 6, it is only necessary to put a pinhole having the same diameter on the optical path, which is simplified in operation and has an advantage in price.
[0030]
The reason for using the light receiving pinhole 6 having a pinhole of the same size as the fluorescent image formed by the imaging lens 4 is to detect only the fluorescence of the portion of the sample 11 irradiated with the excitation light, and to disturb the disturbance. This is to prevent light from entering the measured value.
[0031]
The optical system of the present embodiment is similar to an optical system called a small hole Naoyoshi optical system, but is characterized in that excitation light is illuminated as collimated light. Specifically, the parallel light beam is shaped by the excitation pinhole 5 and condensed by the light projecting lens 2 at the pupil position 9 of the objective lens 3, so that the excitation light applied to the sample 11 has a parallel cross section having a constant cross-sectional area. It can be a luminous flux. This means that the shape and energy of the excitation light that irradiates the sample 11 does not change regardless of the distance between the objective lens 3 and the sample 11, which in turn enables stable excitation, and confocal / small holes. This is a function that cannot be realized with the Naoki method.
[0032]
At this time, the diffracted light generated from the edge of the pinhole of the excitation pinhole 5 forms an image of the pinhole of the excitation pinhole 5 at the focus position of the objective lens 3. This is effective when focusing on the surface of the sample 11 and enables photometry by accurate focusing.
[0033]
However, in the present embodiment, the excitation pinhole diameter is 2 mm, and the objective lens has a configuration of about 10 times / NA 0.3. In this case, the excitation light beam diameter is 0.2 mm, and the light receiving pinhole diameter is 2 mm. The depth of focus of this configuration is the same as that when used as a general microscope, and the depth of focus at the time of photometry is about 30 μm due to the change in the amount of fluorescence with respect to the focus position shown in FIG. Therefore, if the carrier has autofluorescence, it will be detected. This tendency of autofluorescence can also be read from FIG. Basically, auto-fluorescence tends to be large when the focal point is in the carrier and smaller when it is far from the carrier, but can be considered to be almost constant.
[0034]
The main measurement target as a specimen in the present embodiment is one or more nucleic acids immobilized as a sample 11 (probe) on the carrier 10, and a fluorescent dye is bound to a reagent that specifically binds to the nucleic acid. ing. Therefore, by detecting the fluorescence from the sample 11, it can be determined whether or not the target nucleic acid is present, and if it is present, the amount of fluorescence can be measured. The specimen is obtained by attaching probes having a diameter of 0.35 mm to a slide glass of 20 mm (W) × 60 mm (L) × 1 mm (T) at a pitch of 0.6 mm.
[0035]
Photometry by the microscopic fluorescence reading apparatus of the present embodiment having such a configuration is performed as follows. The carrier 10 to which the sample 11 is attached is placed on a scanning stage, scanned under an excitation light beam, and is arranged at every pitch (fixed interval) at which probes are arranged according to a signal from an encoder attached to the stage. Step movement or continuous movement and photometry are performed. In this apparatus, data is taken every 0.05 mm and stored in a computer. Thereafter, some photometric data of the portion where there is essentially no fluorescence between the two probes are taken out, averaged, and this amount is subtracted from the entire data to obtain the data of the sample 11.
[0036]
In general, a DNA chip only needs to be able to determine whether the fluorescence amount of a probe is larger than a predetermined value (positive) or small (negative), and it is not necessary to measure the absolute value of the fluorescence amount of the probe. Therefore, when such a scanning method can be performed, it is better that the photometric pitch is small, but the pitch is set to 0.05 mm in relation to the measurement time.
[0037]
In the measurement of the absolute fluorescence amount, the diameter of the light receiving pinhole is made larger than the fluorescent image formed by the imaging lens 4, and the light receiving pinhole 6 is moved stepwise or continuously for each pitch at which the probes are arranged. In this case, alignment work for aligning the positions of the probe and the light receiving pinhole is required, but the measurement time is shortened by the small number of measurement points. The removal of autofluorescence is performed by measuring fluorescence data of a portion without a probe in advance and subtracting the value from the fluorescence amount of the probe. Alternatively, the entire surface of the carrier may be measured by regarding the pinhole as a rectangle.
[0038]
In general, an objective lens having a large NA is selected for measuring fluorescence. The reason is that the focusing ability of the objective lens is proportional to the square of NA. Therefore, if the objective lens has the same magnification, a lens having a large NA is selected. The objective lens is selected in consideration of the relationship with the photometric time because the NA becomes larger as the magnification increases, but the photometric area becomes smaller.
[0039]
Next, a description will be given of a case where the sample is photometrically measured by the confocal method. First, the diameter of the parallel light beam from the light source 1 is adjusted by the beam expander 12 so as to match the pupil diameter of the selected objective lens 3. For example, in the case of an objective lens with 50 × and NA of 0.7, it is set to about 10 mm. In this case, the excitation pinhole diameter is also set to 10 mm.
[0040]
Next, the projection lens 2 is removed from the optical path. The diameter of the light receiving pinhole is set slightly larger than the diameter calculated from the NA on the exit side of the imaging lens 4. That means

Thus, in this configuration, it is set to 40 μm. In this case, the excitation spot diameter on the sample 11 is
d = 1.2λ / NA = 1 μm
It is.
[0041]
According to this method, when the focus is in focus, the excitation energy can be concentrated at a minute point, and it is possible to deal with a sample in which fluorescent molecules are scattered. In addition, since noise-free measurement can be performed, precise measurement of a minute portion, for example, one probe, fixed point observation of DNA with fluorescent molecules in the liquid, that is, DNA entering and exiting the beam waist of the objective lens You can observe the movement.
[0042]
The parallel light source 1 that can be used in the present embodiment is not limited, but a laser light source is a light source that is often used. The photodetector 8 is not limited, but a photomultimeter, an avalanche photodiode, or the like is often used to perform highly sensitive detection. The wavelength selection mirror 7 is not limited as long as it can separate excitation light and fluorescence, but a dichroic mirror is often used. Further, the telecentric optical system does not necessarily have a completely accurate configuration, and can obtain the above-described characteristics. Therefore, the telecentric optical system may be configured not to collect the parallel light flux in the vicinity of the sample 11 (about ± 5 μm). . In this case, the size (width) of the parallel light beam can be set to 3 μm to 200 μm, but actually 5 μm to 50 μm is an appropriate size.
[0043]
Further, in the present embodiment, photometry can be performed by using the objective lens 3 having the thickness of the carrier 10 corrected regardless of whether the sample 11 is attached to the upper or lower side of the carrier 10. This correspondence is also suitable when a carrier 10 having a high partition wall or the like is used and a sample is attached to the side where the partition wall is formed.
[0044]
According to the fluorescence reading apparatus of the present invention, when the projection lens 2 is in the optical path, the optical system is a collimated light irradiation method, which affects the flatness such as distortion or deflection of the DNA chip or DNA microarray to be measured. Even when the chip is placed slightly tilted on the stage, good fluorescence photometry can be performed on the entire specimen surface. The excitation optical system is telecentric, and the excitation beam that illuminates the sample is a parallel beam with a circular cross section, and the shape of the excitation light that excites the sample regardless of the distance between the objective lens and the sample And the energy is always constant and stable excitation can be performed.
[0045]
In addition, since the diffracted light from the edge of the pinhole of the excitation pinhole 5 forms a pinhole image at the focus position of the objective lens 3, precise focusing can be performed. Therefore, it is possible to stably detect a very small amount of fluorescence from a sample that can obtain only weak fluorescence such as a nucleic acid binding reaction.
[0046]
When the light projection lens 2 deviates from the optical path, the optical system becomes a confocal system, and a very small amount of fluorescence scattered in a minute portion can be measured. For example, a specific probe can be precisely measured after the entire surface of the array is measured by a collimated light irradiation method.
[0047]
Further, since the light projection lens 2 and the imaging lens 4 are made of the same lens, an image having the same diameter as the pinhole of the excitation pinhole 5 is formed by the imaging lens 4. Therefore, the same turret having pinholes of various diameters provided on the disk can be used on the light projecting side and the image forming side, which is convenient for operation of the apparatus.
[0048]
Further, since the excitation pinhole diameter and the light receiving pinhole diameter are variable, the photometry area can be changed to an appropriate size and the photometry can be performed by changing the diameter of the excitation light beam applied to the specimen.
[0049]
When the confocal optical system is used, the excitation pinhole diameter is preferably equal to the pupil diameter of the objective lens 3, and the light receiving pinhole diameter is preferably slightly larger than the Airy desk formed by the imaging lens 4. This diameter is larger on the light projecting side and smaller on the light receiving side than the collimated light irradiation method. This can be handled because the pinhole diameter is variable.
[0050]
In addition, since the beam expander 12 is disposed between the parallel light source 1 and the light projecting lens 2, it can cope with a confocal optical system. This is because, in the confocal optical system, the spot diameter (Airy Desk) Φd that the objective lens 3 creates on the specimen is
Φd = 1.2λ / NA (NA: numerical aperture of objective lens λ: wavelength)
It is. What is important here is that the excitation parallel light beam should satisfy the aperture of the objective lens 3. For example, when NA = 0.7 and f = 3.6 mm with a 50 × objective lens, the pupil diameter is ΦD = 2 × NA × f = 2 × 0.7 × 3.6 = 10 (mm).
It becomes. That is, a beam diameter of about 10 mm is required.
[0051]
On the other hand, in the collimated light irradiation optical system, the concept of irradiation of excitation light onto the specimen is such that the pinhole of the excitation pinhole 5 is projected onto the specimen by the projection lens 2 and the objective lens 3. The diameter Φd of the excitation light beam on the sample is
Φd = projection pinhole diameter / objective lens magnification. When a sample is irradiated with a 0.1 mm diameter excitation light with a 20 × objective lens, the projection pinhole diameter is 2 mm. In order to fully use the power of the parallel beam light source 1, a variable expander capable of changing the beam diameter is required, but the light projecting pinhole diameter may be fixed to about 5 mm.
[0052]
In general DNA arrays, samples are arranged at regular intervals. If such specimens are measured with a collimated light irradiation optical system, disturbance light and autofluorescence near the sample can be measured, and accurate photometry can be performed. The
[0053]
As described above, in the present invention, fluorescence photometry by two different methods is basically possible by attaching and detaching the light projecting lens and selecting a pinhole. Because the expander is used for optimizing the optical system, it is not necessary for some specimens. In the collimated light irradiation method, even if the DNA chip or the DNA microarray is bent, uniform fluorescence photometry can be performed. In this method, the depth of focus is deep and photometric instability due to focus shift is eliminated. On the other hand, the autofluorescence of the carrier is picked up as the depth of focus becomes deeper, but accurate fluorescence can be obtained by measuring the autofluorescence near the probe and subtracting this value from the photometric quantity of the probe part. . Further, in the confocal method, accurate fluorescence photometry without noise can be performed on a portion where there is no focus shift or a sample where no focus shift occurs.
[0054]
Switching between these two methods simply removes the light projection lens from the optical path, so that it is easy to operate and an inexpensive fluorescence reading apparatus can be realized.
[0055]
In addition, this invention is not limited only to the said embodiment, In the range which does not change a summary, it can deform | transform suitably and can be implemented.
[0056]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the fluorescence reader which can perform photometry by a different system by simple switching of an optical system can be provided.
[0057]
That is, according to the present invention, it is possible to perform measurement by two methods having different appropriateness and inappropriateness of the detection target, for example, collimated light irradiation method and confocal method by simple switching of the optical system with one apparatus.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an optical system of a microscopic fluorescence reading apparatus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a change in the amount of fluorescence with respect to a focal position according to an embodiment of the present invention and a conventional example.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Parallel beam light source 2 ... Projection lens 3 ... Objective lens 4 ... Imaging lens 5 ... Excitation pinhole 6 ... Light reception pinhole 7 ... Wavelength selection mirror 8 ... Photodetector 9 ... Back focal point 10 ... Carrier 11 ... Sample 12 ... Beam expander

Claims

A fluorescence reader that detects fluorescence from a sample present on a carrier or in solution;
A light source for irradiating a parallel light beam;
An excitation pinhole disposed in the optical path of the parallel luminous flux;
A detachable light projecting lens arranged so that the front focal position coincides with the position of the excitation pinhole,
An objective lens that is arranged so that a rear focal position coincides with a rear focal position of the light projecting lens, and irradiates a parallel light beam on the sample;
A wavelength selection mirror that is disposed between the projection lens and the objective lens, reflects a parallel light flux and transmits fluorescence;
An imaging lens arranged to image fluorescence emitted from the sample and through the objective lens and the wavelength selective mirror;
A light receiving pinhole arranged at the imaging position of the imaging lens;
Detecting means for detecting the fluorescence passing through the light receiving pinhole;
Equipped with,
When the fluorescence is detected by a collimated light irradiation method, the projection lens is placed in the optical path of the parallel light beam, and the parallel light beam irradiated from the light source is converted into the excitation pinhole, the light projection lens, and the wavelength selection mirror. Irradiating the sample through the objective lens, and detecting fluorescence from the sample by the detection means through the objective lens, the wavelength selection mirror, the imaging lens, and the light receiving pinhole,
When detecting the fluorescence by a confocal method, the projection lens is removed from the optical path of the parallel light beam, and the parallel light beam irradiated from the light source is converted into the excitation pinhole, the wavelength selection mirror, and the objective lens. Irradiating the sample through the sample, and detecting fluorescence from the sample by the detection means through the objective lens, the wavelength selection mirror, the imaging lens, and the light receiving pinhole apparatus.

The fluorescence reading apparatus according to claim 1, wherein the excitation pinhole and the light receiving pinhole are each provided in a plate member, and the diameter thereof is selectively variable.

The fluorescence reading apparatus according to claim 1, wherein a beam expander that adjusts a diameter of a parallel light beam is disposed between the light source and the light projecting lens.

The sample, the fluorescence reading device according to any one of claims 1 to 3, wherein, characterized in that it consists of a fluorescent dye attached to the reagent bound to the nucleic acid or nucleic acid.

The fluorescence reading according to claim 4 , wherein at least a part of the nucleic acid is immobilized on the carrier, and a fluorescent dye is bound to a reagent that specifically binds to the nucleic acid. apparatus.

Fluorescence reader according to any of claims 1 to 5 wherein the sample moving said sample is being or continuously at predetermined intervals are disposed, and detects the fluorescence.