JP2004325396A

JP2004325396A - Sensitivity evaluation method for signal reader

Info

Publication number: JP2004325396A
Application number: JP2003123963A
Authority: JP
Inventors: Muneo Maejima; 宗郎前嶋; Satoshi Takahashi; 智高橋; Kumiko Hattori; 久美子服部
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2003-04-28
Publication date: 2004-11-18

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To accurately evaluate a signal reader (for example, signal reader for a biochemical reaction chip). <P>SOLUTION: In this method, a prescribed concentration of standard substance is introduced into a capillary having an inside diameter near to a depth of a field of an optical system of the signal reader, the capillary is arranged under the condition capable of measuring the standard substance by the optical system, and the standard substance is measured by the optical system, in a detection sensitivity confirmation method for the signal reader. Since the prescribed concentration of standard substance is introduced into the capillary having the inside diameter near to the depth of the field of the optical system of the signal reader, and since the standard substance is measured by the optical system, a signal read by the signal reader serves as a signal emitted from the optical-axis-directional substantially whole thickness of the standard sample to evaluate accurately the signal reader. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、信号読取装置の信号検出感度の評価技術に関する。例えば、蛍光分析を利用する化学反応チップの信号を読み取る信号読取装置の信号検出感度の評価技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生化学反応チップとしては、例えば核酸の塩基配列を測定するために、予め設計した塩基配列の１本鎖オリゴヌクレオチドプローブを塩基配列の種類毎に領域を分けて基板上に固定したポリヌクレオチド検出チップが知られている。このポリヌクレオチド検出チップを用いると、測定対象である１本鎖ポリヌクレオチドと１本鎖オリゴヌクレオチドプローブとの相補鎖結合（ハイブリダイゼーション）の有無を検出することができる。主に、これらの機能エレメント（以下「スポット」と称する。）は縦横にアレイ状に配置され、生化学反応チップアレイ、特に核酸の場合にはＤＮＡマイクロアレイと呼ばれている。このような生化学反応チップは、アフィメトリックス社、ナノゲン社、アジレント社など複数の会社において製品化されている。
【０００３】
上記生化学反応チップ用の基板としては、ガラス基板、Ｓｉ基板、プラスチック基板などが用いられている。１つの生化学反応アレイ全体では、スポットは５０μｍ〜５００μｍの間隔でマトリクス状に配列されている。
【０００４】
基板上にオリゴヌクレオチドを固定化する方法として、一般的には、基板上で一層ずつオリゴヌクレオチドを合成させながら固定化する方法と、予め別途合成させておいたオリゴヌクレオチドを基板上に固定化する方法とがある。前者の方法における代表例は、フォトリソグラフィー技術による方法である（例えば、アフィメトリックス社の方法である。非特許文献１参照）。
【０００５】
また、後者の方法にはメカニカルマイクロスポッティング技術がある。ナノゲン社の技術は、チップ基板表面に目的とするオリゴヌクレオチド配列を含んだ溶液を接触させて、オリゴヌクレオチドを固定化したいスポットに正の電圧を印加し、負の電荷を有するオリゴヌクレオチドをスポット上に固定化する電界制御方式技術である（例えば特許文献１参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１号、７６７頁（１９９１年）。
【特許文献１】
特表平９−５０４９１０号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
これらの生化学反応チップの信号読取には、蛍光色素を用いる方式や、インターカレーターを用いて相補鎖結合の蛍光や電位差を読み取る方式、また、相補鎖結合の電気的な抵抗値を直接読み取る方式などがある。これらの中でも、蛍光色素を用いる方式は、直接検体を蛍光色素で標識できる、蛍光波長の異なる蛍光色素を用いることにより多種類の色素を同時に独立に測定できることなどから、最も頻繁に用いられている方式である。
【０００８】
そして、多種類の蛍光色素に対応した読取装置も、アフィメトリックス社やアジレント社から市販されている。これらの読取装置は、原理的には従来の蛍光分析と同様に、励起光源としてのレーザー、蛍光を読み取るための検出器であるＰＭＴ（光電子倍増管）等により構成されている。
【０００９】
従来の蛍光分析では装置の性能指標の１つとしてＳＮ比が用いられてきた。これは、純水に励起光を照射したときのラマン散乱光を信号強度として、またその信号強度の変動を雑音として比を求めるものである。
【００１０】
通常の生化学反応チップの分析技術においては、使用する蛍光色素が固定されており、すなわち励起／検出波長が固定されているため回折格子による分光よりも、むしろ光学フィルタによる分光を採用している場合が多い。この場合には、検出用の光学フィルタは蛍光色素の波長に合わせて設計されており、読取装置が有する励起光の波長からのラマン信号を検出できない場合がほとんどである。従って、ラマン散乱光によるＳＮ比に基づく手法は、装置の性能評価には使えない。色素を固定せず、液体のままにしてチップ上に保持し、測定する方法もあるが、この場合はチップ上の色素を含んだ液体の厚さを制御する必要がある。なぜなら厚さが不定であれば、チップ上での色素の濃度を正確に求めることができないからである。また仮に色素を含んだ液体の厚さを制御できたとしても、結果的に光学系の被写界深度よりも厚い液層を形成した場合は、チップ上に存在する色素の量と光学系が見ている色素の量とが異なるため濃度は正確には求まらない。
【００１１】
また、実際の測定と同様の手法で評価するのであれば、実際は色素が固定されていることから、異なる当該色素を含む濃度系列を作成し検量線を作成し、その検出限界を求めて装置の性能の指標にすることも可能である。メカニカルマイクロスポッティング技術において、固定化したいオリゴヌクレオチドなどを含む液体の体積とその液体のオリゴヌクレオチドの濃度からスポットに固定化されるであろうオリゴヌクレオチドの分子の数を推定できる。しかしながら、蛍光色素は光に反応して容易に劣化してしまう。特に蛍光測定時には強力な励起光を照射するため、蛍光色素の劣化が顕著である。このため、メカニカルマイクロスポッティングによって得られた、基板上の蛍光色素を感度評価の基準として繰返し使用することはできない。また、スポット領域の面積が一定ではないため、データ処理が煩雑になることもある。
【００１２】
さらに、フォトリソグラフィー技術や、電界制御方式技術などを用いると、この方法により分子の数を正確に見積もることはできない。これらの技術を用いて作成された生化学反応チップに固定化された物質の量は、液体温度、ｐＨ、電界強度他、ハイブリダイズの効率、生化学反応チップ中のオリゴヌクレオチドを固定化するための部材とその表面状態、などによって決定される。そしてこれらの要因が固定化に与える効率を定量的に把握することはきわめて難しい。
【００１３】
このように、蛍光分析による従来の生化学反応チップの分析技術においては、生化学反応チップに固定化されたオリゴヌクレオチドの量を見積もることが難しい。これは、必要試料量の掌握、管理および、信号読み取り装置上における検出感度の比較が難しい。
【００１４】
そこで、このような生化学反応チップからの信号を読み取る信号読取装置の性能はより安定に規定し比較するために、生化学反応のプロセスを含むシステムの複数の要因に分析結果が左右されない技術であって、他の装置との比較のみならず、装置単体の実力や安定性を考察する技術が必要とされてきた。検出感度の評価は生化学反応チップを比較する上で重要である。なぜなら、測定対象となる蛍光分子をどれほど光学系の下に準備するかに直結しており、測定の前処理用の試薬の消費量に影響を与えるからである。試薬の消費量は、装置のランニングコストの指標でもあり、大量の試料を測定する場合は無視できない。
本発明は、信号読取装置の正確な評価方法の提供を目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の一観点によれば、生化学反応チップ用信号読取装置の検出感度確認方法であって、信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリに所定濃度の標準物質を導入し、光学系により標準物質を測定可能な状態で前記キャピラリを配置し、光学系により標準物質を測定する方法が提供される。
【００１６】
信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリに所定濃度の標準物質を導入し光学系により標準物質を測定するため、信号読み取り装置により読み取られた信号は標準試料の光学軸方向のほぼ全厚から発せられた信号となり、信号読み取り装置の評価が正確になる。
【００１７】
本発明の他の観点によれば、測定容器内の試料を所定箇所に濃縮し、濃縮試料を光学系により測定する装置の検出感度確認方法であって、光学系の光軸方向における測定容器の厚みより小さい厚みを有する確認容器に所定濃度の標準物質を導入し、光学系の光軸方向における前記確認容器の厚みが、前記光学系の光軸方向における測定容器の厚みより小さく、かつ、前記光学系により標準物質を測定可能となる状態に前記確認容器を配置し、光学系により標準物質を測定する方法が提供される。
【００１８】
上記の方法によれば、実際の測定対象となる測定容器内の濃縮試料を測定する光学系と同じ光学系を有する装置により確認容器内の標準物質を測定するため、標準物質の測定に基づいて検出感度を精度良く確認することができる。
【００１９】
本発明の別観点によれば、生化学反応チップ用信号読取装置を評価できるシステムであって、生化学反応チップを保持できる信号読取装置の保持機構と、保持機構に保持された生化学反応チップを測定できる光学系と、保持器具に保持された生化学反応チップに配置され、又は、生化学反応チップの保持されていない保持器具に配置された、信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリであって、その内部に所定濃度の標準物質が導入されたキャピラリとを含むシステムが提供される。
【００２０】
上記システムによれば、測定対象である濃縮試料と近い条件で標準物質の測定を行うことが出来るため、生化学反応チップ用信号読取装置を評価精度が高くなる。
【００２１】
本発明のさらに別の観点によれば、生化学反応チップ用信号読取装置の検査セットであって、信号読取装置の保持器具に保持された生化学反応チップに配置でき、又は、生化学反応チップの保持されていない保持器具に配置できる、信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリと、信号読取装置で測定できる標準物質とを含む検査セットが提供される。この検査セットを用いると、標準試料とキャピラリという小型化が可能（持ち運びに便利）な道具を含むセットにより生化学反応チップ用信号読取装置の検査が可能であるため、検査が大がかりにならない。
【００２２】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明に係る方法は、微細なキャピラリ管に例えば蛍光色素を導入し、既存の読取装置を用いて、キャピラリ管中の蛍光色素から発せられる蛍光の信号強度を参照して装置の感度評価を行う方法を含む。
【００２４】
本発明の実施の形態による生化学反応チップ用信号読取装置の感度評価方法について図面を参照しつつ以下に説明を行う。図１（ａ）は、一般的な明視野蛍光測定光学系を用いた生化学反応チップの信号読取装置の構成例を示す図である。
【００２５】
図１（ａ）に示すように、生化学反応チップの信号読取装置は、励起光源１０１と、ダイクロイックミラー１０２と、対物レンズ（光学系）１０３と、試料１０４と、結像レンズ１０５と、検知器１０６と、を有している。励起光源１０１から発せられた蛍光励起用の光束Ｌは、ダイクロイックミラー１０２に入射する。ダイクロイックミラー１０２の入射励起光源の波長における反射率は高く、ほぼ全ての入射光が反射して生化学反応チップ１０４に向う。その途中で、対物レンズ１０３を通りフローセル１１７（測定容器）内の所定箇所１１９において濃縮された濃縮試料を通り、生化学反応チップ１０４上に到達する。この励起光の作用によって、濃縮試料から発せられた蛍光は、対物レンズ１０３によって捕捉されダイクロイックミラー１０２の方向へ向かう。生化学反応チップ１０４の方向に入射する励起光と、濃縮試料から発せられた蛍光の波長は異なる（蛍光波長が励起光の波長よりも長い）。
【００２６】
ダイクロイックミラー１０２の蛍光波長に対する反射率が低く、透過率が高くなるように設定しておき、試料からの蛍光のほとんどがダイクロイックミラー１０２を通過するようにする。ここでは、励起光の反射率は低く抑えてあるので、励起光はほとんど通過しない。ダイクロイックミラー１０２を通過した蛍光は結像レンズ１０５によって検知器１０６上に結像する。
【００２７】
図１（ｂ）は、生化学反応チップ１０４の構成例を示す図であり、上面図と正面図とが示されている。１つの生化学反応アレイ全体では、図１（ｂ）に示すそれぞれのスポット１０９は、５０μｍ〜５００μｍの間隔でマトリクス状に配列されている。信号読取装置は、この生化学反応チップ上の各スポット１０９からの信号を読み取って区別する必要がある。スポット１０９にマイナスの電界を印加すると、フローセル１１７内の試料が濃縮され所定箇所（スポット１０９の近傍）に集められる。
【００２８】
尚、図１（ａ）及び図１（ｂ）では、励起光源１０１を試料１０４の鉛直方向から入射した明視野光学系を例にして示しているが、蛍光検出のための光学系は、励起光１０１を試料１０４に対し斜め入射させ、励起光の検出器に到達する度合いを低減させた暗視野光学系を採用しても良い。
【００２９】
また、図１（ａ）において、励起光源１０１が試料１０４に到達する際、極めて微小なスポットに結像させてもよい。仮に、微小な空間領域に結像させた場合、検知器１０６の試料側にピンホール１０７を設けることにより、共焦点光学系を形成することができ、試料上の蛍光分析の空間分解及び焦点方向の位置分解能を高めることができる。この場合、光束は相対的に試料上を走査できることが望ましい。走査の方法は、試料又は試料を搭載したステージを走査１０８してもよいし、対物レンズ１０３を走査して光束の試料上への到達位置を移動させても良い。ポリゴンミラーなどを用いて、光束の進行方向を変化させても良い。
【００３０】
励起光としては、微小なスポットを用いずに試料全体を照明するような励起光を用いてもよい。この場合は、検知器としてＣＣＤカメラなどの撮像素子を用いることもできる。試料の全体像を光束の走査なしに取得することができるという利点がある。またピンホール１０７を検知器の試料側に設け、ピンホール位置を走査した場合、励起光は試料全体を照明させかつ、共焦点の光学系を構成することもできる。
【００３１】
図１（ａ）において、レンズシステムを対物レンズ１０３と結像レンズ１０５とで構成したが、これらの各々が複数枚のレンズの組み合わせで構成されていても良い。また対物レンズと結像レンズとが、１本の鏡筒の内部に格納されて１つのレンズシステムを構成していても良い。
【００３２】
しかしながら、上記の蛍光分析による生化学反応チップの分析技術においては、生化学反応チップに固定化されたオリゴヌクレオチドの量を見積もることがきわめて難しい。これは、必要試料量の掌握、管理および、信号読み取り装置上における検出感度の比較が難しいことを意味している。なぜなら、生化学反応チップに固定化された物質の量は、液体温度、ｐＨ、電界強度他、ハイブリダイズの効率、生化学反応チップ中のオリゴヌクレオチドを固定化するための部材とその表面状態、などの様々なパラメータにより決定されるからである。
【００３３】
また、一般的な蛍光分析では、オリゴヌクレオチドを生化学反応チップに固定しなくても、溶液状態のまま複数の濃度系列を作成して検量線方式により検出感度を定義する方法も考えられるが、この場合にも、光学系の被写界深度の影響を考慮しなければならない。例えば、被写界深度５μｍの光学系で、厚さ５００μｍの溶液中の蛍光色素の信号を測定したとしても、約５μｍ厚さ分の蛍光色素からの信号しか検出しないからである。実際に５μｍの厚さのきわめて少ない蛍光分子を検出できるような優れた光学系を用いた場合でも、５００μｍの厚さに含まれた蛍光色素を検出しているように過小評価されてしまう場合がある。
【００３４】
図２は、本実施の形態によるキャピラリの構成を示す図である。図２に示すように、キャピラリの内径を符号１１０で示し、外径を符号１１１で示している。キャピラリの内部は中空である。キャピラリの最表面層は例えばポリイミドなどの保護膜１１２で覆われている。外径１１０は、通常、９０μｍ程度から８５０μｍ程度であり、内径は、２μｍから７００μｍ程度のキャプラリが入手可能である。
【００３５】
このように、キャピラリの外径が１ｍｍ以下であることから、ほぼ全ての生化学反応チップのチップ位置にキャピラリを固定することが可能である。そのまま母材上に固定しても良いし、読取装置内部のほかの部品と干渉する場合は生化学反応チップに溝を掘って、標準試料を導入したキャピラリを埋め込んでも良い。生化学反応チップの母材が金属、ガラス、プラスチックのいずれであっても１ｍｍ程度の溝を母材上に形成することが可能だからである。キャピラリは、粘着テープにより母材に貼り付けて固定しても良いし接着剤による接着して固定しても良い。
【００３６】
図３（ａ）、（ｂ）は、標準試料を導入したキャピラリを生化学反応チップに固定した例を示す図である。図３（ａ）、（ｂ）に示すように、生化学反応チップ１１４が母材１１３に固定されている。尚、生化学反応チップ１１４が母材としての機能（読取装置との固定・位置出し、フローセルなどの流路構成、など）を兼用していても良い。図３（ａ）は、母材１１３に溝１１５を形成し、溝１１５内に標準試料を導入したキャピラリ１１６を固定した例である。溝１１５内にキャピラリ１１６を固定する方法は、母材１１３と生化学反応チップ１１４を組み合わせて信号読取装置にセットし測定する際に信号読取装置側の何らかの部品とキャピラリ１１６とが機械的に干渉してしまう場合に有効な方法である。また、信号読取装置の光学系の焦点において、母材の表面が焦点を合わせるストロークの範囲外にあるような場合、キャピラリを焦点合わせ可能な位置に設置したい場合にも有効である。
【００３７】
特に、干渉する部品が周囲に存在せず、また、焦点合わせの範囲が広い信号読取装置に関して評価を行う場合は、単にキャピラリ１１６を母材１１３またはその同等品に乗せて固定しただけの図３（ｂ）に示す構造でも良い。この構成は、きわめてシンプルな構成である。尚、図３においては、生化学反応チップ１１４が母材１１３と組み合わされている構成について例示したが、母材１１３が存在しない構造の生化学反応チップに応用することも可能である。すなわち、スライドガラス自身に生化学試料をスポッティングして使用し、このスライドガラスそのものを読取装置に搭載して、信号を読み取るような場合である。この場合は、母材が存在しないことになるが、チップであるスライドガラス上にキャピラリを貼り付けるかまたはスライドガラスにキャピラリを設置する溝を掘ってキャピラリを固定することができる。上記キャピラリ方式には、簡便かつ簡素である利点の他に被写界深度の影響を考慮できるという利点がある。すなわち、キャピラリ内に標準試料を導入し標準試料をキャピラリ内に閉じこめることにより、標準試料を光学系の「被写界深度程度」の厚さ方向領域に「局在」させることができる。キャピラリの内径とフローセルの厚みとの関係を図１（ａ）を参照して説明する。図１（ａ）の下の図は、仮想線で示された光学系の光軸方向における確認容器の厚み（この場合は、キャピラリ１１６の内径１１０）が、測定容器（この場合は、フローセル１１７）の厚み１１７ａよりも小さくなる状態を作り出すことができる。
【００３８】
キャピラリ１１６内部の標準試料の濃度と信号読み取り装置の測定値との関係を求めることにより、濃縮された試料の評価を行うことができる。例えば、標準試料の濃度系列を作成し信号読取装置で測定することにより、局在させた分子数を変数とした従来の方法よりも正確な感度評価が可能となる。
【００３９】
次に、実際にキャピラリ１１６内に標準物質を導入する方法について図５を参照して説明する。標準物質は、実際に使用する蛍光色素のみでもよく、これを実際にレポータとして使用するオリゴヌクレオチドを実際に使用する蛍光色素で修飾したものでもよい。これを信号読取時に使用する溶液、例えば燐酸バッファなどで希釈したものを用意し、適当な長さに切断し、かつ、信号読取部のサイズにあわせた部分の被覆１１２を除去したものを準備する。被覆１１２の除去はオゾンによる灰化などでも行うことができるが、炎で簡単に灰化することもできる。この状態のキャピラリ１１６の一端を準備した標準溶液１２０に浸すと、毛細管現象によってキャピラリ１１６の内部は標準溶液１２０により満たされる。この状態を保持し、図３に示すように母材１１３にキャピラリ１１６を固定すればよい。上記の方法を用いると、キャピラリ１１６への標準溶液１２０の導入が非常に簡単なので、標準試料の測定の度に標準試料を導入することも可能である。すなわち、１回だけ使用する感度評価治具を構成することができる。
【００４０】
尚、室温よりも高い温度環境にさらされている生化学反応チップにおける信号を読み取る場合、又は、励起光の照射によって試料の温度が上昇してしまうような場合には、キャピラリの両端からキャピラリ内部の液体の蒸発が問題となる。このような場合には、キャピラリの両端のうち試料が蒸発しやすい一端または両端を、接着剤などで封入しておいても良い。このような構造にすることで、持ち運びが可能となり、複数回の使用が可能な感度評価治具として用いることも可能である。
【００４１】
使用する蛍光色素に関して、励起光照射による退色の影響が問題となる場合には、キャピラリの一端を標準溶液に浸し他端を減圧して、標準試料をキャピラリ内部で流動させながら感度評価を行うことも可能である。
【００４２】
減圧によって標準試料をキャピラリの内部で流動させる構成例について再び図５を参照して説明する。キャピラリ１１６の一端を標準試料１２０が入っているバイアルに浸す。キャピラリ１１６の他端をシリンジ１２２に接続しておく。シリンジ１２２のピストンを引くことにより、シリンジ１２２の内部は負圧になる。そのため、標準試料１２０はキャピラリ１１６内をシリンジ１２２の方向に向かって移動する。キャピラリ１１６は、励起光を照射する部分１２１の被覆を除去して母材１１３または生化学反応チップ１１４（図３）にセットする。このようにした後、読取装置を用いた標準試料の測定を行う。
【００４３】
もちろん、キャピラリ１１６の一端側に蓄えた標準試料（たとえばシリンジ１２２に蓄えた標準試料）を加圧することによってキャピラリ内部を流動させても良い。上記のように標準試料を流動させる方法を用いると、光に敏感に反応して壊れやすい蛍光色素も標準試料として取り扱うことが可能となる。
【００４４】
本実施の形態による信号読取部に局在した蛍光分子数の決定の手順について図６を参照して説明する。まず、ステップ１３０において、信号読取装置の設計情報から、その検出光学系の被写界深度に近い被写界深度と同等から２倍程度の範囲のキャピラリを調達する。例えば、光学系の開口数（Ｎ．Ａ．）が０．２であり、検出する蛍光波長が６００ｎｍであったとすると、その被写界深度は、以下の式を用いて計算できる。
【００４５】
６００×１０^−９／０．２２＝１．５×１０^−５＝１５μｍ
ここで、焦点から１５μｍから外れた部分の光は検出されないわけではない。これ以上離れた部分からの光も、結像しているわけではないが検知器に届く。ここでは、被写界深度の約２倍程度の位置からの光も検知器に十分届くとものと仮定する。すなわち、内径約１５μｍから３０μｍ程度のキャピラリを準備すればよい。
【００４６】
次に、ステップ１３１において、使用する蛍光色素が劣化しやすいものであれば、例えば、キャピラリ内を流動させることにより標準試料を移動させるか否かを判断する。例えば、サービスマンが持ち歩いてユーザの装置の評価を行うなどの使用目的や使用環境（状況）に応じて、標準試料を移動させるか否かを決定する。移動させると決定した場合には、ステップ１３２に進み、例えば図５に示すような移動方法を組み込んだキャピラリに加工する。標準試料を移動させない場合には、ステップ１３３に進み、移動手段を組み込まないキャピラリを加工する。
【００４７】
次に、ステップ１３４において、キャピラリ内に濃度が既知の試料を導いたものを測定する。測定により信号とノイズとが十分に区別できれば、さらに濃度の小さい試料を測定し、区別できなければ濃度の大きい試料で再測定を行う。信号とノイズとを区別する方法は、バックグラウンド信号（キャピラリのない領域からの信号）と標準試料からの信号との比、又は、その他、判定者が独自の基準に基づいて区別できるか否かを判定する。
【００４８】
例えば、ステップ１３４の処理を繰り返し、キャピラリ内に導いて検出できる最も小さい濃度を検出限界として導く（ステップ１３５）。この例では、光学系の被写界深度が１５μｍであり、これに合わせて内径１５μｍのキャピラリを使用した。生化学反応チップの１スポットの直径が１００μｍであり、５００μＭの蛍光色素を含んだ溶液が検出限界であったと仮定すると、光学系が観察している空間の体積は、以下の式により求められる。
（７．５×１０^−６）２×π×１００×１０^−６
＝１．７×１０^−１４ｍ^３
＝１．７×１０^−１４リットル
従って、その中に含まれている蛍光分子数は、
６．０２×１０^２３×５００×１０^−６×１．７×１０^−１４
＝５．１１７×１０^６（個）と計算できる（ステップ１３６）。
【００４９】
以上に説明したように、本発明の実施の形態による感度（検出限界）測定方法によれば、微細なキャピラリ内に蛍光色素を封入し、既存の読取装置を用いてキャピラリ中の蛍光色素の信号強度を得ることができる。光学軸の延在する方向に沿って計った標準試料の厚さ（キャピラリの内径）が光学系の被写界深度の２倍程度以下であるため、信号読み取り装置により読み取られた信号は標準試料の全厚みによって発せられた信号となり、標準試料の体積（厚み）と信号量とが対応関係にあり、信号読み取り装置の評価が正確になるという利点がある。この方法において使用される石英のキャピラリは、通常、生化学反応チップの信号読取に用いられる励起波長において蛍光を発しないので、ノイズ源となりにくい。また樹脂中に蛍光色素を封じ込める方法とは異なり、液体試料を極めて簡単にキャピラリ内部に導くことができる。これにより、装置間での信号強度の比較が正確に行えるようになり、また読取原理の異なる読取装置間でも比較が可能になる。また、多くの液中の蛍光色素に対応可能であり、極めて汎用性が高い。サービスマンなどがこれを所持し、移動して測定することも比較的簡単である。
【００５０】
次に、本実施の形態の変形例による感度測定方法について図４を参照して説明する。図４に示すように、本変形例による感度測定方法に用いる装置は、生化学反応チップ１５５と、これと対面して配置されたガラス板１５１と、生化学反応チップ１５５とガラス板１５１との間に、例えば接着剤により接着されたキャピラリ管であって、略平行に配置され略等しい外径ｔを有する２本のキャピラリ１５３ａ、１５３ｂと、を有している。キャピラリ１５３ａ、１５３ｂの外径ｔにより生化学反応チップ１５５とガラス板１５１との向かい合う面間の距離を略ｔに保持するとともに、生化学反応チップ１５５とガラス板１５１及び２本のキャピラリ１５３ａと１５３ｂにより画定される空間内に標準試料を保持することができる。この装置においても、厚さｔは、図１に示すフローセルの厚さ１１７ａよりも薄く、かつ、光学系の被写界深度の２倍程度以下であるのが好ましい。本変形例による感度測定方法においても、光学軸の延在する方向に沿って計った厚さｔが光学系の被写界深度の２倍程度以下であるため、信号読み取り装置により読み取られた信号は標準試料の全厚みｔによって発せられた信号とすることができ、標準試料の体積（厚みｔ）と信号量とが対応関係にある。従って、信号読み取り装置の評価が正確になるという利点がある。
【００５１】
以上に説明したように、図７に示すような生化学反応チップでは、母材１１３または母材１１３と一体化した生化学反応チップ１１４に、厚さ１１８のフローセル１１７を設けた構造において、信号読取時にこのフローセル１１７の内部に液体が満たされている。読み取るべきオリゴヌクレオチドと結合した蛍光色素は、生化学反応チップ１１４表面に固定化されている。すなわち、生化学反応チップ１１４の表面に蛍光色素が局在している。局在している蛍光色素分子の分子数を推定するには、温度、ｐＨ、電界による引き付けの効率などきわめて多くの媒介変数が介在し分子数を推定するのが困難である。
【００５２】
また、図８に示すように、生化学反応チップ１１４に、厚さ１１８のフローセルを設け、濃度が既知の蛍光色素溶液をフローセルに満たして信号読取装置が読み取ったとしても、蛍光信号はその光学系の被写界深度程度の厚さ領域１１９から発せられたものであって、フローセルの厚さ１１８内の全ての蛍光色素からの信号を検出しているわけではない。従って、フローセル内に満たされた溶液中の信号を読取装置により読み取った蛍光分子数は、フローセルの厚さ１１８に基づく体積計算では評価できない。
【００５３】
しかし、上述した感度評価方法によれば、光学軸方向の厚みが光学系の被写界深度の２倍に近い領域に標準試料を閉じ込めることができる。信号読み取り装置により読み取られた信号は標準試料の全厚みによって発せられた信号となり、標準試料の体積（厚み）と信号量とを対応させることができるため、信号読み取り装置の評価が正確になるという利点がある。これにより、装置間の強度の比較が正確に行えるようになり、また原理の異なる読取装置でも比較が可能になる。
【００５４】
（付記）
本発明は以下の付記に記載されている発明の開示を含む。
（付記１）
生化学反応チップ用信号読取装置の検出限界を測定する方法であって、前記生化学反応チップ用信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリを準備する第１ステップと、前記生化学反応チップ用信号読取装置と同じ測定原理を用いて検出する検出対象に関する濃度が既知の標準物質を前記キャピラリ内中に導入し、前記生化学反応チップ用信号読取装置を用いて前記標準物質からの信号を検出する第２ステップと、該第２ステップにより検出された信号と前記標準物質の濃度との関係に基づいて前記検出対象に関する検出限界濃度を求める第３ステップとを含む方法。
【００５５】
（付記２）
前記第２ステップを繰り返し、検量線を作成するステップを含むことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００５６】
（付記３）
さらに、前記第２のステップで求められた検出された信号と前記標準物質の濃度との関係に基づいて、前記生化学反応チップ用信号読取装置を用いて濃度が未知のサンプルに関する信号を検出し該サンプルの濃度を求めるステップを有することを特徴とする付記１又は２に記載の方法。
【００５７】
（付記４）
前記第２ステップは、前記キャピラリ内で前記標準物質を移動させながら信号を検出するステップを含むことを特徴とする付記１から３までのいずれか１に記載の方法。
【００５８】
（付記５）
生化学反応チップ用信号読取装置を調整する方法であって、前記生化学反応チップ用信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリを準備するステップと、前記生化学反応チップ用信号読取装置と同じ測定原理を用いて検出する検出対象に関する濃度が既知の標準物質を前記キャピラリ内中に導入し前記生化学反応チップ用信号読取装置を用いて前記標準物質からの信号を検出するステップを繰り返すことにより得られた結果と、前記生化学反応チップ用信号読取装置を用いて予め求めておいた前記標準物質から検出された信号と前記標準物質の濃度との関係とを比較することにより、前記生化学反応チップ用信号読取装置の調整を行うステップとを含む方法。
【００５９】
（付記６）
生化学反応チップ用信号読取装置を評価するための装置であって、生化学反応チップと、該生化学チップの一面に取り付けられ、前記生化学反応チップ用信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリとを備えた装置。
【００６０】
（付記７）
前記生化学チップの他面に取り付けられた透明な面状の母材を有する付記６に記載の装置。
【００６１】
（付記８）
付記６又は７に記載の装置と、さらに、生化学反応チップ用信号読取装置と同じ測定原理を用いて検出する複数の検出対象を含む標準物質であって、濃度の異なる標準物質を複数の容器にそれぞれ収容した試薬セットとを有する検査セット。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、信号読取装置の信号検出感度を正確に評価できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（ａ）は、本発明の実施の形態に用いる一般的な明視野蛍光測定光学系を用いた生化学反応チップの信号読取装置の構成例を示す図であり、図１ｂ）は、試料（生化学反応チップ）の構成例を示す図であり、上面図と正面図とを示す図である。
【図２】本実施の形態によるキャピラリの構成を示す図である。
【図３】図３（ａ）、（ｂ）は、標準試料を導入したキャピラリを生化学反応チップに固定した例を示す図である。
【図４】本発明の実施の形態の変形例による感度測定装置の構成例について示す図である。
【図５】本実施の形態による方法に用いる構成であって、キャピラリ内に標準物質を導入する様子を示す図である。
【図６】本実施の形態による信号読取部に局在した蛍光分子数の決定の手順を示すフローチャート図である。
【図７】母材または母材と一体化した生化学反応チップに、フローセルを設けた構造例を示す図である。
【図８】生化学反応チップに、ある厚さのフローセルを設け、濃度が既知の蛍光色素溶液をフローセルに満たした構成を示す図である。
【符号の説明】
１０１蛍光励起光源、１０２ダイクロイックミラー、１０３対物レンズ、１０４試料、１０５結像レンズ、１０６検知器、１０７ピンホール、１０８試料走査、１０９試料スポット、１１０キャピラリの内径、１１１キャピラリの外形、１１２キャピラリの被覆、１１３生化学反応チップの母材、１１４生化学反応チップ、１１５溝、１１６キャピラリ、１１７生化学反応チップ上のフローセル、１１８フローセルの厚さ、１１９光学系の被写界深度。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a technique for evaluating the signal detection sensitivity of a signal reading device. For example, the present invention relates to a technique for evaluating the signal detection sensitivity of a signal reader that reads a signal of a chemical reaction chip using fluorescence analysis.
[0002]
[Prior art]
As a biochemical reaction chip, for example, in order to measure the base sequence of a nucleic acid, a polynucleotide detection chip in which a single-stranded oligonucleotide probe of a pre-designed base sequence is divided into regions for each type of base sequence and immobilized on a substrate It has been known. Using this polynucleotide detection chip, the presence or absence of complementary strand binding (hybridization) between a single-stranded polynucleotide to be measured and a single-stranded oligonucleotide probe can be detected. Mainly, these functional elements (hereinafter, referred to as "spots") are arranged in an array in a matrix, and are called a biochemical reaction chip array, particularly a DNA microarray in the case of nucleic acid. Such biochemical reaction chips have been commercialized by a plurality of companies such as Affymetrix, Nanogen and Agilent.
[0003]
As a substrate for the biochemical reaction chip, a glass substrate, a Si substrate, a plastic substrate, or the like is used. In one entire biochemical reaction array, spots are arranged in a matrix at intervals of 50 μm to 500 μm.
[0004]
As a method of immobilizing an oligonucleotide on a substrate, generally, a method of immobilizing an oligonucleotide while synthesizing one layer at a time on a substrate, and a method of immobilizing an oligonucleotide synthesized separately in advance on a substrate are used. There is a way. A typical example of the former method is a method using a photolithography technique (for example, a method of Affymetrix, see Non-Patent Document 1).
[0005]
The latter method includes a mechanical micro spotting technique. Nanogen's technology is that a solution containing the target oligonucleotide sequence is brought into contact with the chip substrate surface, a positive voltage is applied to the spot where the oligonucleotide is to be immobilized, and a negatively charged oligonucleotide is placed on the spot. (See, for example, Patent Document 1).
[0006]
[Non-patent document 1]
Science, No. 251, p. 767 (1991).
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 9-504910
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
To read signals from these biochemical reaction chips, a method using a fluorescent dye, a method using an intercalator to read the fluorescence or potential difference of complementary strand bonds, or a method of directly reading the electrical resistance value of complementary strand bonds and so on. Among these, the method using a fluorescent dye is most frequently used because a sample can be directly labeled with the fluorescent dye, and various types of dyes can be simultaneously and independently measured by using fluorescent dyes having different fluorescence wavelengths. It is a method.
[0008]
Readers corresponding to various types of fluorescent dyes are also commercially available from Affymetrix and Agilent. These readers are basically composed of a laser as an excitation light source, a PMT (photomultiplier tube) as a detector for reading fluorescence, and the like, similarly to the conventional fluorescence analysis.
[0009]
In the conventional fluorescence analysis, the SN ratio has been used as one of the performance indexes of the apparatus. In this method, Raman scattered light when pure water is irradiated with excitation light is used as a signal intensity, and fluctuations in the signal intensity are used as noise to obtain a ratio.
[0010]
In the analysis technique of a normal biochemical reaction chip, the fluorescent dye to be used is fixed, that is, the excitation / detection wavelength is fixed, so that spectroscopy using an optical filter is adopted rather than spectroscopy using a diffraction grating. Often. In this case, the optical filter for detection is designed according to the wavelength of the fluorescent dye, and in most cases, the Raman signal from the wavelength of the excitation light of the reader cannot be detected. Therefore, a method based on the SN ratio by Raman scattered light cannot be used for performance evaluation of the device. There is also a method in which the dye is held on a chip in a liquid state without fixing, and measurement is performed. In this case, however, it is necessary to control the thickness of the liquid containing the dye on the chip. This is because if the thickness is indefinite, the concentration of the dye on the chip cannot be determined accurately. Even if the thickness of the liquid containing the dye can be controlled, if the resulting liquid layer is thicker than the depth of field of the optical system, the amount of the dye existing on the chip and the optical system The concentration cannot be determined accurately because the amount of dye being viewed is different.
[0011]
In addition, if the evaluation is performed using the same method as the actual measurement, since the dye is actually fixed, a concentration series containing a different dye is created, a calibration curve is created, and the detection limit is obtained to determine the detection limit. It can also be used as a performance indicator. In the mechanical microspotting technique, the number of oligonucleotide molecules to be immobilized on a spot can be estimated from the volume of a liquid containing an oligonucleotide or the like to be immobilized and the concentration of the oligonucleotide in the liquid. However, fluorescent dyes are easily degraded in response to light. Particularly, at the time of fluorescence measurement, since strong excitation light is irradiated, deterioration of the fluorescent dye is remarkable. For this reason, the fluorescent dye on the substrate obtained by mechanical microspotting cannot be used repeatedly as a standard for sensitivity evaluation. Further, since the area of the spot area is not constant, data processing may be complicated.
[0012]
Furthermore, if photolithography technology, electric field control technology, or the like is used, the number of molecules cannot be accurately estimated by this method. The amount of the substance immobilized on the biochemical reaction chip created using these technologies depends on the liquid temperature, pH, electric field strength, etc., hybridization efficiency, and immobilization of the oligonucleotide in the biochemical reaction chip. And the surface condition of the member. And it is extremely difficult to quantitatively understand the efficiency of these factors on immobilization.
[0013]
As described above, it is difficult to estimate the amount of the oligonucleotide immobilized on the biochemical reaction chip in the conventional biochemical reaction chip analysis technique using fluorescence analysis. This makes it difficult to control and control the required sample amount and to compare the detection sensitivities on a signal reading device.
[0014]
Therefore, in order to more stably define and compare the performance of such a signal reading device that reads signals from the biochemical reaction chip, the analysis result is not affected by multiple factors of the system including the biochemical reaction process. Therefore, a technique for considering not only the comparison with other apparatuses but also the ability and stability of the apparatus itself has been required. Evaluation of detection sensitivity is important for comparing biochemical reaction chips. This is because it is directly related to how much the fluorescent molecule to be measured is prepared under the optical system, which affects the consumption of the reagent for the pretreatment of the measurement. The consumption of the reagent is also an index of the running cost of the apparatus, and cannot be ignored when measuring a large amount of sample.
An object of the present invention is to provide an accurate evaluation method for a signal reading device.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
According to one aspect of the present invention, there is provided a method for confirming the detection sensitivity of a signal reader for a biochemical reaction chip, comprising the steps of: placing a standard substance having a predetermined concentration in a capillary having an inner diameter close to the depth of field of an optical system of the signal reader; There is provided a method of introducing, arranging the capillary in a state where the standard substance can be measured by the optical system, and measuring the standard substance by the optical system.
[0016]
Since a standard substance of a predetermined concentration is introduced into a capillary having an inner diameter close to the depth of field of the optical system of the signal reader and the standard substance is measured by the optical system, the signal read by the signal reader is the optical axis of the standard sample. The signal is emitted from almost the entire thickness in the direction, and the evaluation of the signal reading device becomes accurate.
[0017]
According to another aspect of the present invention, there is provided a method for confirming the detection sensitivity of an apparatus for concentrating a sample in a measurement container at a predetermined location and measuring the concentrated sample by an optical system, comprising the steps of: A standard substance of a predetermined concentration is introduced into a confirmation container having a thickness smaller than the thickness, the thickness of the confirmation container in the optical axis direction of the optical system is smaller than the thickness of the measurement container in the optical axis direction of the optical system, and There is provided a method of arranging the confirmation container in a state where the standard substance can be measured by the optical system and measuring the standard substance by the optical system.
[0018]
According to the above method, the standard substance in the confirmation container is measured by an apparatus having the same optical system as the optical system for measuring the concentrated sample in the measurement container to be actually measured. The detection sensitivity can be accurately confirmed.
[0019]
According to another aspect of the present invention, there is provided a system capable of evaluating a signal reader for a biochemical reaction chip, comprising: a holding mechanism of the signal reader capable of holding the biochemical reaction chip; and a biochemical reaction chip held by the holding mechanism. And the depth of field of the optical system of the signal reader placed on the biochemical reaction chip held by the holding device or on the holding device not holding the biochemical reaction chip. And a capillary having a standard substance at a predetermined concentration introduced therein.
[0020]
According to the above system, the standard substance can be measured under conditions close to that of the concentrated sample to be measured. Therefore, the evaluation accuracy of the signal reader for a biochemical reaction chip is improved.
[0021]
According to yet another aspect of the present invention, there is provided a test set of a signal reader for a biochemical reaction chip, which can be disposed on a biochemical reaction chip held by a holding device of the signal reader, or a biochemical reaction chip. A test set including a capillary having an inner diameter close to the depth of field of the optical system of the signal reading device, and a standard substance measurable by the signal reading device, which can be arranged on a holding device not held by the signal reading device. When this test set is used, the signal reader for a biochemical reaction chip can be tested with a set including a tool that can be miniaturized (convenient to carry) such as a standard sample and a capillary, so that the test does not become large.
[0022]
Hereinafter, the above and other novel features and effects of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0023]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the method according to the present invention, for example, a fluorescent dye is introduced into a fine capillary tube, and the sensitivity of the device is evaluated using an existing reading device with reference to the signal intensity of the fluorescence emitted from the fluorescent dye in the capillary tube. Including methods.
[0024]
A method for evaluating the sensitivity of a signal reader for a biochemical reaction chip according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings. FIG. 1A is a diagram showing a configuration example of a signal reader of a biochemical reaction chip using a general bright-field fluorescence measurement optical system.
[0025]
As shown in FIG. 1A, a signal reader for a biochemical reaction chip includes an excitation light source 101, a dichroic mirror 102, an objective lens (optical system) 103, a sample 104, an imaging lens 105, And a vessel 106. The light beam L for excitation of fluorescence emitted from the excitation light source 101 enters the dichroic mirror 102. The reflectance of the dichroic mirror 102 at the wavelength of the incident excitation light source is high, and almost all the incident light is reflected toward the biochemical reaction chip 104. On the way, it passes through the objective lens 103, passes through the concentrated sample concentrated at a predetermined location 119 in the flow cell 117 (measurement container), and reaches the biochemical reaction chip 104. By the action of the excitation light, the fluorescent light emitted from the concentrated sample is captured by the objective lens 103 and travels toward the dichroic mirror 102. The excitation light incident in the direction of the biochemical reaction chip 104 and the wavelength of the fluorescence emitted from the concentrated sample are different (the fluorescence wavelength is longer than the wavelength of the excitation light).
[0026]
The dichroic mirror 102 is set so that the reflectance with respect to the fluorescence wavelength is low and the transmittance is high, so that most of the fluorescence from the sample passes through the dichroic mirror 102. Here, since the reflectance of the excitation light is kept low, the excitation light hardly passes. The fluorescence that has passed through the dichroic mirror 102 forms an image on a detector 106 by an imaging lens 105.
[0027]
FIG. 1B is a diagram showing a configuration example of the biochemical reaction chip 104, and shows a top view and a front view. In the entire biochemical reaction array, the spots 109 shown in FIG. 1B are arranged in a matrix at intervals of 50 μm to 500 μm. It is necessary for the signal reader to read and discriminate the signal from each spot 109 on the biochemical reaction chip. When a negative electric field is applied to the spot 109, the sample in the flow cell 117 is concentrated and collected at a predetermined location (near the spot 109).
[0028]
Although FIGS. 1A and 1B show an example of a bright-field optical system in which the excitation light source 101 is incident from the vertical direction of the sample 104, the optical system for fluorescence detection is an excitation light source. A dark field optical system in which the light 101 is obliquely incident on the sample 104 and the degree of the excitation light reaching the detector may be reduced.
[0029]
In FIG. 1A, when the excitation light source 101 reaches the sample 104, an image may be formed on an extremely small spot. If an image is formed in a minute space area, a confocal optical system can be formed by providing the pinhole 107 on the sample side of the detector 106, and the spatial resolution and the focus direction of the fluorescence analysis on the sample can be formed. Can be increased in position resolution. In this case, it is desirable that the light beam can relatively scan on the sample. As a scanning method, the sample or the stage on which the sample is mounted may be scanned 108, or the objective lens 103 may be scanned to move the position where the light beam reaches the sample. The traveling direction of the light beam may be changed using a polygon mirror or the like.
[0030]
As the excitation light, excitation light that illuminates the entire sample without using a minute spot may be used. In this case, an image sensor such as a CCD camera can be used as the detector. There is an advantage that the entire image of the sample can be obtained without scanning the light beam. Further, when the pinhole 107 is provided on the sample side of the detector and the position of the pinhole is scanned, the excitation light can illuminate the entire sample and also form a confocal optical system.
[0031]
In FIG. 1A, the lens system is composed of the objective lens 103 and the imaging lens 105, but each of them may be composed of a combination of a plurality of lenses. Further, the objective lens and the imaging lens may be housed inside one lens barrel to constitute one lens system.
[0032]
However, it is extremely difficult to estimate the amount of the oligonucleotide immobilized on the biochemical reaction chip by the above-described technique for analyzing a biochemical reaction chip by fluorescence analysis. This means that it is difficult to control and control the required sample amount and to compare the detection sensitivities on the signal reading device. Because the amount of the substance immobilized on the biochemical reaction chip depends on the liquid temperature, pH, electric field strength, etc., the efficiency of hybridization, the member for immobilizing the oligonucleotide in the biochemical reaction chip and its surface state, This is because it is determined by various parameters such as.
[0033]
Also, in general fluorescence analysis, even if the oligonucleotide is not fixed to the biochemical reaction chip, a method of creating a plurality of concentration series in a solution state and defining the detection sensitivity by a calibration curve method may be considered, Also in this case, the influence of the depth of field of the optical system must be considered. For example, even if a signal of a fluorescent dye in a solution having a thickness of 500 μm is measured by an optical system having a depth of field of 5 μm, only a signal from a fluorescent dye having a thickness of about 5 μm is detected. Even when an excellent optical system capable of detecting extremely small fluorescent molecules with a thickness of 5 μm is actually used, it may be underestimated as if a fluorescent dye contained in a thickness of 500 μm is detected. is there.
[0034]
FIG. 2 is a diagram showing a configuration of the capillary according to the present embodiment. As shown in FIG. 2, the inner diameter of the capillary is denoted by reference numeral 110, and the outer diameter is denoted by reference numeral 111. The inside of the capillary is hollow. The outermost layer of the capillary is covered with a protective film 112 such as polyimide. The outer diameter 110 is usually about 90 μm to about 850 μm, and the inner diameter is about 2 μm to about 700 μm.
[0035]
As described above, since the outer diameter of the capillary is 1 mm or less, it is possible to fix the capillary at almost all the chip positions of the biochemical reaction chip. It may be fixed on the base material as it is, or when it interferes with other parts inside the reader, a groove may be dug in the biochemical reaction chip and a capillary into which a standard sample has been introduced may be embedded. This is because a groove of about 1 mm can be formed on the base material of the biochemical reaction chip regardless of whether the base material is metal, glass, or plastic. The capillary may be fixed to the base material by sticking it with an adhesive tape, or may be fixed by bonding with an adhesive.
[0036]
FIGS. 3A and 3B are diagrams showing an example in which a capillary into which a standard sample is introduced is fixed to a biochemical reaction chip. As shown in FIGS. 3A and 3B, a biochemical reaction chip 114 is fixed to a base material 113. Note that the biochemical reaction chip 114 may also have a function as a base material (fixing / positioning with a reader, configuration of a flow path such as a flow cell, etc.). FIG. 3A shows an example in which a groove 115 is formed in a base material 113 and a capillary 116 into which a standard sample is introduced is fixed in the groove 115. The method of fixing the capillary 116 in the groove 115 is such that when the base material 113 and the biochemical reaction chip 114 are combined and set in a signal reader and measurement is performed, some parts on the signal reader side and the capillary 116 mechanically interfere with each other. This is an effective method when it is done. It is also effective when the focus of the optical system of the signal reading device is such that the surface of the base material is out of the range of the stroke for focusing, or when it is desired to place the capillary at a position where focusing can be performed.
[0037]
In particular, when an evaluation is performed on a signal reading device in which no interfering components are present in the surroundings and the focusing range is wide, FIG. 3 in which the capillary 116 is simply mounted on the base material 113 or its equivalent and fixed. The structure shown in FIG. This configuration is a very simple configuration. Although FIG. 3 illustrates the configuration in which the biochemical reaction chip 114 is combined with the base material 113, the present invention can be applied to a biochemical reaction chip having a structure in which the base material 113 does not exist. That is, this is a case where a biochemical sample is spotted on a slide glass itself and used, and the slide glass itself is mounted on a reading device to read a signal. In this case, the base material does not exist, but the capillary can be fixed on the slide glass, which is a chip, by attaching a capillary or by digging a groove for installing the capillary in the slide glass. The above-mentioned capillary method has an advantage that the influence of the depth of field can be considered in addition to the advantage of being simple and simple. That is, by introducing the standard sample into the capillary and closing the standard sample in the capillary, the standard sample can be "localized" in the thickness direction region of the optical system "about the depth of field". The relationship between the inner diameter of the capillary and the thickness of the flow cell will be described with reference to FIG. 1A, the thickness of the confirmation container (in this case, the inner diameter 110 of the capillary 116) in the optical axis direction of the optical system indicated by the imaginary line is different from the measurement container (in this case, the flow cell 117). ) Can be made smaller than the thickness 117a of FIG.
[0038]
By determining the relationship between the concentration of the standard sample inside the capillary 116 and the measured value of the signal reading device, the concentrated sample can be evaluated. For example, by preparing a concentration series of a standard sample and measuring it with a signal reader, it is possible to perform a more accurate sensitivity evaluation than the conventional method using the number of localized molecules as a variable.
[0039]
Next, a method of actually introducing a standard substance into the capillary 116 will be described with reference to FIG. The standard substance may be only a fluorescent dye actually used, or may be an oligonucleotide actually used as a reporter modified with a fluorescent dye actually used. A solution to be used at the time of signal reading, for example, a solution diluted with a phosphate buffer or the like is prepared, cut into an appropriate length, and a portion corresponding to the size of the signal reading portion and the coating 112 removed is prepared. . The removal of the coating 112 can be performed by incineration with ozone or the like, but can also be easily incinerated by flame. When one end of the capillary 116 in this state is immersed in the prepared standard solution 120, the inside of the capillary 116 is filled with the standard solution 120 by capillary action. In this state, the capillary 116 may be fixed to the base material 113 as shown in FIG. When the above method is used, the introduction of the standard solution 120 into the capillary 116 is very simple, so that the standard sample can be introduced every time the standard sample is measured. That is, a sensitivity evaluation jig that is used only once can be configured.
[0040]
When reading a signal from a biochemical reaction chip exposed to a temperature environment higher than room temperature, or when the temperature of a sample rises due to irradiation of excitation light, the inside of the capillary is drawn from both ends of the capillary. The problem is the evaporation of the liquid. In such a case, one or both ends of the capillary at which the sample is likely to evaporate may be sealed with an adhesive or the like. By adopting such a structure, the device can be carried and can be used as a sensitivity evaluation jig that can be used a plurality of times.
[0041]
If the effect of fading due to excitation light irradiation becomes a problem for the fluorescent dye to be used, immerse one end of the capillary in the standard solution, decompress the other end, and perform sensitivity evaluation while flowing the standard sample inside the capillary. Is also possible.
[0042]
An example of a configuration in which the standard sample is caused to flow inside the capillary by reducing the pressure will be described again with reference to FIG. One end of the capillary 116 is immersed in a vial containing the standard sample 120. The other end of the capillary 116 is connected to the syringe 122. By pulling the piston of the syringe 122, the inside of the syringe 122 becomes a negative pressure. Therefore, the standard sample 120 moves in the capillary 116 toward the syringe 122. The capillary 116 is set on the base material 113 or the biochemical reaction chip 114 (FIG. 3) after removing the coating on the portion 121 to which the excitation light is irradiated. After doing so, the standard sample is measured using the reading device.
[0043]
Of course, the inside of the capillary may be made to flow by pressurizing the standard sample (for example, the standard sample stored in the syringe 122) stored on one end side of the capillary. When the method of flowing a standard sample is used as described above, a fluorescent dye which reacts sensitively to light and is easily broken can be handled as a standard sample.
[0044]
A procedure for determining the number of fluorescent molecules localized in the signal reading unit according to the present embodiment will be described with reference to FIG. First, in step 130, from the design information of the signal reading device, a capillary having a depth equal to or approximately twice the depth of field close to the depth of field of the detection optical system is procured. For example, assuming that the numerical aperture (NA) of the optical system is 0.2 and the fluorescence wavelength to be detected is 600 nm, the depth of field can be calculated using the following equation.
[0045]
600 × 10^-9/0.22=1.5×10^-5= 15 μm
Here, the light in the portion deviated from the focal point by 15 μm is not necessarily not detected. Light from more distant parts also reaches the detector, although not imaged. Here, it is assumed that light from a position about twice the depth of field also reaches the detector sufficiently. That is, a capillary having an inner diameter of about 15 μm to about 30 μm may be prepared.
[0046]
Next, in step 131, if the fluorescent dye to be used is easily deteriorated, for example, it is determined whether or not the standard sample is moved by flowing through the capillary. For example, it is determined whether or not to move the standard sample according to a use purpose and a use environment (situation) such as a service person carrying the user to evaluate the device. If it is determined that the moving is to be performed, the process proceeds to step 132, where the capillary is processed into a capillary incorporating a moving method as shown in FIG. 5, for example. If the standard sample is not to be moved, the process proceeds to step 133, where the capillary without the moving means is processed.
[0047]
Next, in Step 134, a sample having a known concentration in the capillary is measured. If the signal and noise can be sufficiently distinguished by the measurement, a sample with a lower concentration is measured. If the signal and noise cannot be distinguished, a measurement with a higher concentration is performed again. The method of distinguishing between signal and noise can be based on the ratio of the background signal (the signal from the non-capillary region) to the signal from the standard sample, or whether the discriminator can discriminate based on their own criteria. Is determined.
[0048]
For example, the process of step 134 is repeated, and the smallest concentration that can be detected by being guided into the capillary is derived as the detection limit (step 135). In this example, the depth of field of the optical system was 15 μm, and a capillary having an inner diameter of 15 μm was used in accordance with this. Assuming that the diameter of one spot on the biochemical reaction chip is 100 μm and the solution containing a 500 μM fluorescent dye is at the detection limit, the volume of the space observed by the optical system can be obtained by the following equation.
(7.5 × 10^-6) 2 × π × 100 × 10^-6
= 1.7 × 10^-14m³
= 1.7 × 10^-14liter
Therefore, the number of fluorescent molecules contained therein is
6.02 × 10²³× 500 × 10^-6× 1.7 × 10^-14
= 5.117 × 10⁶Can be calculated (step 136).
[0049]
As described above, according to the sensitivity (detection limit) measuring method according to the embodiment of the present invention, a fluorescent dye is sealed in a fine capillary, and the signal of the fluorescent dye in the capillary is read using an existing reader. Strength can be obtained. Since the thickness of the standard sample (the inner diameter of the capillary) measured along the direction in which the optical axis extends is about twice or less the depth of field of the optical system, the signal read by the signal reading device is the standard sample. The signal is generated by the total thickness of the reference sample, and the volume (thickness) of the standard sample and the signal amount are in a correspondence relationship, and there is an advantage that the evaluation of the signal reading device becomes accurate. Quartz capillaries used in this method usually do not emit fluorescence at the excitation wavelength used for signal reading of the biochemical reaction chip, and thus are unlikely to be noise sources. Also, unlike the method of enclosing the fluorescent dye in the resin, the liquid sample can be guided into the capillary very easily. This makes it possible to accurately compare the signal intensities between the apparatuses, and also enables comparison between the reading apparatuses having different reading principles. In addition, it is applicable to many kinds of fluorescent dyes in liquids, and is extremely versatile. It is relatively easy for a service person or the like to carry this and move and measure.
[0050]
Next, a sensitivity measurement method according to a modification of the present embodiment will be described with reference to FIG. As shown in FIG. 4, an apparatus used in the sensitivity measurement method according to the present modification includes a biochemical reaction chip 155, a glass plate 151 disposed facing the biochemical reaction chip 155, and a biochemical reaction chip 155 and a glass plate 151. Between them, for example, two capillary tubes 153a and 153b which are substantially parallel and have substantially the same outer diameter t, which are capillary tubes bonded by an adhesive, for example. The outer diameter t of the capillaries 153a and 153b keeps the distance between the opposing surfaces of the biochemical reaction chip 155 and the glass plate 151 substantially at t, and also the biochemical reaction chip 155 and the glass plate 151 and the two capillaries 153a and 153b. The standard sample can be held in the space defined by. Also in this apparatus, it is preferable that the thickness t is smaller than the thickness 117a of the flow cell shown in FIG. 1 and is not more than about twice the depth of field of the optical system. Also in the sensitivity measuring method according to the present modification, the thickness t measured along the direction in which the optical axis extends is about twice or less the depth of field of the optical system. Can be a signal generated by the total thickness t of the standard sample, and the volume (thickness t) of the standard sample and the signal amount have a corresponding relationship. Therefore, there is an advantage that the evaluation of the signal reading device becomes accurate.
[0051]
As described above, in the biochemical reaction chip as shown in FIG. 7, in the structure in which the flow cell 117 having a thickness 118 is provided on the base material 113 or the biochemical reaction chip 114 integrated with the base material 113, At the time of reading, the inside of the flow cell 117 is filled with liquid. The fluorescent dye bound to the oligonucleotide to be read is immobilized on the surface of the biochemical reaction chip 114. That is, the fluorescent dye is localized on the surface of the biochemical reaction chip 114. In order to estimate the number of localized fluorescent dye molecules, it is difficult to estimate the number of molecules due to an extremely large number of parameters such as temperature, pH, and the efficiency of attraction by an electric field.
[0052]
Also, as shown in FIG. 8, a flow cell having a thickness 118 is provided on the biochemical reaction chip 114, and even if the flow cell is filled with a fluorescent dye solution of a known concentration and the signal is read by a signal reader, the fluorescent signal is not reflected by the optical signal. The signal is emitted from the thickness region 119 which is about the same as the depth of field of the system, and signals from all the fluorescent dyes in the flow cell thickness 118 are not detected. Therefore, the number of fluorescent molecules obtained by reading the signal in the solution filled in the flow cell by the reader cannot be evaluated by the volume calculation based on the thickness 118 of the flow cell.
[0053]
However, according to the sensitivity evaluation method described above, the standard sample can be confined in a region whose thickness in the optical axis direction is nearly twice the depth of field of the optical system. The signal read by the signal reading device is a signal generated by the total thickness of the standard sample, and the volume (thickness) of the standard sample can be associated with the signal amount, so that the evaluation of the signal reading device is accurate. There are advantages. As a result, the intensity comparison between the devices can be accurately performed, and the comparison can be performed even with a reader having a different principle.
[0054]
(Note)
The present invention includes the disclosure of the invention described in the following supplementary notes.
(Appendix 1)
A method for measuring a detection limit of a signal reader for a biochemical reaction chip, wherein a first step of preparing a capillary having an inner diameter close to a depth of field of an optical system of the signal reader for a biochemical reaction chip, A standard substance having a known concentration relating to a detection target to be detected using the same measurement principle as that of the biochemical reaction chip signal reader is introduced into the capillary, and the standard is introduced using the biochemical reaction chip signal reader. A method comprising: a second step of detecting a signal from a substance; and a third step of determining a detection limit concentration for the detection target based on a relationship between the signal detected in the second step and the concentration of the standard substance.
[0055]
(Appendix 2)
2. The method according to claim 1, further comprising the step of repeating the second step to generate a calibration curve.
[0056]
(Appendix 3)
Further, based on the relationship between the detected signal obtained in the second step and the concentration of the standard substance, a signal relating to a sample whose concentration is unknown is detected using the signal reader for a biochemical reaction chip. 3. The method according to claim 1 or 2, further comprising the step of determining the concentration of the sample.
[0057]
(Appendix 4)
The method according to any one of appendices 1 to 3, wherein the second step includes detecting a signal while moving the standard substance in the capillary.
[0058]
(Appendix 5)
A method for adjusting a signal reader for a biochemical reaction chip, the method comprising: preparing a capillary having an inner diameter close to a depth of field of an optical system of the signal reader for a biochemical reaction chip; A standard substance having a known concentration related to a detection target to be detected using the same measurement principle as that of the signal reader for blood is introduced into the capillary, and a signal from the standard substance is detected using the signal reader for the biochemical reaction chip. And the relationship between the concentration of the standard substance and the signal detected from the standard substance, which has been determined in advance using the signal reader for the biochemical reaction chip, is compared with the result obtained by repeating the step of Adjusting the signal reader for the biochemical reaction chip.
[0059]
(Appendix 6)
An apparatus for evaluating a signal reader for a biochemical reaction chip, comprising: a biochemical reaction chip; an object field mounted on one surface of the biochemical chip; and an optical system of the signal reader for the biochemical reaction chip. A capillary having an inner diameter close to the depth.
[0060]
(Appendix 7)
7. The apparatus according to claim 6, further comprising a transparent planar base material attached to the other surface of the biochemical chip.
[0061]
(Appendix 8)
Apparatus according to Supplementary Note 6 or 7, and a standard substance containing a plurality of detection targets to be detected using the same measurement principle as the signal reader for a biochemical reaction chip, wherein the standard substance having a different concentration is contained in a plurality of containers And a reagent set respectively contained in the test set.
[0062]
【The invention's effect】
According to the present invention, the signal detection sensitivity of the signal reading device can be accurately evaluated.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1A is a diagram showing a configuration example of a signal reader of a biochemical reaction chip using a general bright-field fluorescence measuring optical system used in an embodiment of the present invention, and FIG. 4) is a diagram illustrating a configuration example of a sample (biochemical reaction chip), and is a diagram illustrating a top view and a front view.
FIG. 2 is a diagram showing a configuration of a capillary according to the present embodiment.
FIGS. 3A and 3B are diagrams showing an example in which a capillary into which a standard sample has been introduced is fixed to a biochemical reaction chip.
FIG. 4 is a diagram showing a configuration example of a sensitivity measuring device according to a modification of the embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a diagram showing a configuration used in the method according to the present embodiment and showing a state in which a standard substance is introduced into a capillary.
FIG. 6 is a flowchart illustrating a procedure for determining the number of fluorescent molecules localized in the signal reading unit according to the present embodiment.
FIG. 7 is a diagram showing an example of a structure in which a flow cell is provided on a base material or a biochemical reaction chip integrated with the base material.
FIG. 8 is a diagram showing a configuration in which a flow cell of a certain thickness is provided on a biochemical reaction chip, and the flow cell is filled with a fluorescent dye solution having a known concentration.
[Explanation of symbols]
101 fluorescence excitation light source, 102 dichroic mirror, 103 objective lens, 104 sample, 105 imaging lens, 106 detector, 107 pinhole, 108 sample scanning, 109 sample spot, 110 capillary inner diameter, 111 capillary outer diameter, 112 capillary Coating, 113 base material of biochemical reaction chip, 114 biochemical reaction chip, 115 groove, 116 capillary, 117 flow cell on biochemical reaction chip, 118 thickness of flow cell, 119 depth of field of optical system.

Claims

A detection sensitivity confirmation method for a signal reader for a biochemical reaction chip,
A standard substance of a predetermined concentration is introduced into a capillary having an inner diameter close to the depth of field of the optical system of the signal reader, and the capillary is arranged in a state where the standard substance can be measured by the optical system. How to measure.

The method according to claim 1, wherein an inner diameter of the capillary is equal to or less than twice a depth of field of the optical system.

The detection sensitivity confirmation method according to claim 1,
A method in which the inside diameter of the capillary is equal to or less than the depth of field of the optical system (excluding 0).

Using the detection sensitivity confirmation method according to claim 1, the measured measurement result is compared with a measurement result of a standard substance having a predetermined concentration determined in advance, and a signal reading device for a biochemical reaction chip is determined based on the comparison result. How to make adjustments.

A method for confirming the detection sensitivity of an apparatus for concentrating a sample in a measurement container to a predetermined location and measuring the concentrated sample by an optical system,
Introducing a standard substance of a predetermined concentration into a confirmation container having a thickness smaller than the thickness of the measurement container in the optical axis direction of the optical system,
The thickness of the confirmation container in the optical axis direction of the optical system is smaller than the thickness of the measurement container in the optical axis direction of the optical system, and the confirmation container is arranged in a state where a standard substance can be measured by the optical system. ,
A method of measuring a standard substance using an optical system.

The detection sensitivity confirmation method according to claim 5, wherein
A method in which the thickness of the confirmation container in the optical axis direction of the optical system is equal to or less than twice the depth of field of the optical system.

The detection sensitivity confirmation method according to claim 5, wherein
A method in which the thickness of the confirmation container in the optical axis direction of the optical system is equal to or less than the depth of field of the optical system (excluding 0).

The detection sensitivity confirmation method according to claim 5, wherein
A method of comparing the measured measurement result with a measurement result of a standard substance having a predetermined concentration obtained in advance, and adjusting the apparatus based on the comparison result.

A system that can evaluate a signal reader for a biochemical reaction chip,
A holding mechanism of a signal reader capable of holding a biochemical reaction chip,
An optical system that can measure the biochemical reaction chip held by the holding mechanism,
A capillary having an inner diameter close to the depth of field of the optical system of the signal reading device, which is arranged on the biochemical reaction chip held by the holding mechanism or arranged on the holding mechanism not holding the biochemical reaction chip. A capillary into which a standard substance of a predetermined concentration is introduced.

An inspection set of a signal reader for a biochemical reaction chip,
The inner diameter close to the depth of field of the optical system of the signal reader, which can be placed on the biochemical reaction chip held by the holding device of the signal reader or can be placed on the holding device where the biochemical reaction chip is not held. A capillary having
An inspection set including a standard substance that can be measured by a signal reader.