JP4217046B2

JP4217046B2 - Immobilization of bacterial cells on hydrophobic carrier

Info

Publication number: JP4217046B2
Application number: JP2002297492A
Authority: JP
Inventors: 秀樹福田; 秀樹山地
Original assignee: Ｂｉｏ−ｅｎｅｒｇｙ株式会社
Priority date: 2002-10-10
Filing date: 2002-10-10
Publication date: 2009-01-28
Anticipated expiration: 2022-10-10
Also published as: JP2004129572A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、菌体の固定化に関する。より詳細には、疎水性担体に菌体を固定化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素を多量に含む細胞を工業的に効率よく利用するために、細胞を固定化することが試みられている。細胞を固定化する方法としては、次の３つに大別される：１）不溶性の担体に菌体を結合させる担体結合法、２）架橋剤を用いる架橋法、３）高分子ゲルマトリクス格子中に包み込む、または半透膜マイクロカプセルに封じ込める包括法。確実に固定化するためには、包括法が好ましいが、固定化された細胞周辺の物質移動などを考慮して、多孔性担体を用いる担体結合法が種々検討されている。特に、凝集性または接着性を有する細胞の場合は、一般的に、入手しやすい多孔性の担体と細胞とを混ぜるという簡単な操作による担体結合法によって、非常に簡便に固定化が行われている。例えば、凝集性酵母は、ポリウレタンフォーム片と混合するだけで、容易に固定化できる（非特許文献１および２参照）。しかし、凝集性または付着性があまり強くない細胞の場合は、担体への固定化は困難であった。
【０００３】
例えば、付着性動物細胞については、多孔性セルロース担体を用いてインキュベートするだけで固定化できたこと（非特許文献３参照）、および陽荷電基を有するポリエチレンイミンあるいは細胞付着因子を導入した多孔性セルロース担体（特許文献１参照）において、高濃度の浮遊性細胞を固定化できたこと（非特許文献４および非特許文献５参照）が報告されている。これらの方法によって固定化は可能となったが、固定化され得る細胞数は十分とはいえなかった。また、動物細胞に比べてサイズが小さく、凝集性または付着性があまり強くない細菌などの他の菌体については、未だ簡便かつ有効な固定化方法は見出されていない。
【０００４】
【特許文献１】
特開平５−２５２９４１号公報
【非特許文献１】
フルタ（H. Furuta）、外，「ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering）」，１９９７年，第８４巻，第２号，ｐ．１６９−１７１
【非特許文献２】
リュウ（Y. Liu）、外，「バイオケミカル・エンジニアリング・ジャーナル（Biochemical Engineering Journal）」，１９９８年，第２巻，第３号，ｐ．２２９−２３５
【非特許文献３】
タツヤ・オガワ（Tatsuya Ogawa）、外５名，「ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering）」，１９９２年，第７４巻，第１号，ｐ．２７−３１
【非特許文献４】
寺嶋修司、外５名，「生物工学会誌」，１９９３年，第７１巻，第３号，ｐ．１６５−１７０
【非特許文献５】
シュージ・テラシマ（Shuji Terashima）、外５名，「ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering）」，１９９４年，第７７巻，第１号，ｐ．５２−５６
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、凝集性を有する菌体の場合と同様に、凝集性または付着性があまり強くない菌体を、簡便にかつ高密度で担体に固定化する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、種々検討を重ねた結果、固定化に通常用いられている疎水性担体を、複数のペンダントアミンを有するポリマーで前処理することにより、菌体を容易に高密度で固定化できることを見出した。
【０００７】
本発明は、疎水性担体を複数のペンダントアミンを有するポリマーで処理する工程、および該処理した担体と菌体とを接触させる工程、を含む、菌体の固定化方法を提供する。
【０００８】
好適な実施態様では、上記複数のペンダントアミンを有するポリマーは、ポリ−Ｌ−リシンである。
【０００９】
他の好適な実施態様では、上記疎水性担体は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリカーボネート、ポリエーテル、ポリエステル、ナイロン、ポリビニルホルマール、アセタール樹脂、フェノール樹脂、シリコン樹脂、フッ素樹脂、ガラス、セラミックス、および金属からなる群より選択される。
【００１０】
より好適な実施態様では、上記疎水性担体は、多孔性である。
【００１１】
別の好適な実施態様では、上記菌体は、凝集性または付着性が弱い菌体である。
【００１２】
さらに好適な実施態様では、上記菌体は、細菌である。
【００１３】
本発明はまた、複数のペンダントアミンを有するポリマーで前処理した疎水性担体に固定化された、固定化菌体を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
（担体）
本発明において用いられる担体は、疎水性の固体であれば、特に限定されない。疎水性担体は、菌体を多数保持し得る点で、多孔性であることが好ましい。その場合、孔径は、特に限定されず、菌体のサイズに応じて、適宜決定され得る。その孔径は、好ましくは０．１〜１，０００μｍ、より好ましくは１〜１００μｍである。
【００１５】
疎水性担体の材料としては、多孔性担体として凝集性菌体の固定化に通常用いられている材料が好ましい。具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリカーボネート、ポリエーテル、ポリエステル、ナイロン、ポリビニルホルマール、アセタール樹脂、フェノール樹脂、シリコン樹脂、フッ素樹脂、ガラス、セラミックス、および金属が挙げられる。なお、ポリビニルホルマールは、親水性であるポリビニルアルコールにホルマール化処理を施して疎水性にしたものであり、好ましくは疎水性が高い高ホルマール化度のものが用いられる。入手容易性および取り扱いやすさの点から、ポリエステル、ポリウレタン、ナイロン、ポリプロピレン、およびポリビニルホルマールが好ましい。特に好ましい疎水性担体としては、ポリビニルホルマールスポンジ、ポリエステルフォーム、ポリウレタンフォーム、およびポリプロピレンフォームが挙げられる。
【００１６】
このような担体の形状および大きさは、特に限定されない。例えば、ブロック状、シート状などの形状であり得る。また、取り扱いの容易さの点で、数ｍｍ角の細片が最もよく用いられ得る。
【００１７】
（複数のペンダントアミンを有するポリマー）
本発明で用いられる複数のペンダントアミンを有するポリマーは、培養液中で菌体の活性に悪影響を及ぼすことなく、疎水性相互作用によって他の疎水性物質と結合する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的には、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−ＤＬ−リシン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｄ−オルニチン、ポリ−ＤＬ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｄ−アルギニン、ポリ−ＤＬ−アルギニンなどが挙げられる。複数のペンダントアミンを有するポリマーは、疎水性相互作用の能力を考慮すると大きい分子であることが好ましく、その粘度平均分子量は、好ましくは１０，０００以上、より好ましくは７０，０００以上かつ１５０，０００以下である。
【００１８】
（菌体）
本発明において、固定化され得る菌体は、微小な単細胞生物をいい、細菌、酵母、単細胞の藻類、シアノバクテリアなどが挙げられる。本発明の固定化方法は、凝集性の菌体やカビ類などの多細胞生物に対しても用いられ得るが、凝集性または付着性が弱い菌体に、特に好適に用いられ得る。ここで、凝集性または付着性が弱いとは、培養中に凝集塊の形成や容器への付着が少なく、培養液中に浮遊する傾向があることをいう。
【００１９】
（固定化方法）
本発明の菌体の固定化方法は、疎水性担体を、複数のペンダントアミンを有するポリマーで処理する工程、および該処理した担体と菌体とを接触させる工程を含む。
【００２０】
まず、疎水性担体の処理は、担体を複数のペンダントアミンを有するポリマーの水溶液中に浸漬することによって行われる。この複数のペンダントアミンを有するポリマーの水溶液の濃度は、特に限定されない。０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度が好適である。担体の浸漬時間は、複数のペンダントアミンを有するポリマーの水溶液の濃度、担体の種類などに応じて適宜決定され得る。通常、５分〜２４時間、振盪または攪拌しながら浸漬される。
【００２１】
なお、得られた担体は、菌体と接触させる直前に滅菌処理を行うことが好ましい。滅菌処理は、どのような方法で行ってもよく、容易である点で、通常のオートクレーブ処理が好ましい。
【００２２】
次に、処理した担体と菌体とを接触させる。この工程は、菌体を含む培地に処理した担体を加え、振盪培養したり、あるいは培養槽中で撹拌することによって行われる。培地は、通常の組成であり、特別な組成を必要としない。菌体の量、培地の量、担体の量などは、菌体の種類、担体の種類などに応じて適宜決定され得る。接触させる時間は、通常、数時間〜数日間である。菌体を含む培地と接触させて菌体を担体に播種した後、担体を取り出して新鮮培地に加え、さらに培養を数日間行うことによって、菌体を担体に高密度で固定化することができる。必要に応じて、適時、培地を新鮮培地に交換し得る。
【００２３】
担体に固定化された菌体数または菌体濃度は、種々の方法によって測定され得る。
【００２４】
例えば、ＭＴＴアッセイ（ティム・モスマン（Tim Mosmann）、「ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Journal of Immunological Methods）」，１９８３年，第６５巻，ｐ．５５−６３）によって、固定化菌体の濃度を精度よく測定することができる。ＭＴＴアッセイは、詳細には、黄色のＭＴＴ（3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド）が生細胞内のミトコンドリア内に存在する脱水素酵素により還元され、その結果生じる紫色のＭＴＴホルマザンの量が生細胞数に対応することに基づく。生成したＭＴＴホルマザンは、水に不溶であるため、通常２−プロパノールで溶解した後、吸光度を測定する。
【００２５】
あるいは、所定の溶液中で菌体を担体から物理的に剥がし、その前後の担体の乾燥重量または湿重量の差から、担体に固定された菌体の量を測定することもできる。また、菌体を剥がした後、得られた懸濁液の濁度を測定したり、血球計算盤を用いて懸濁液中の細胞数を計数してもよい。
【００２６】
（固定化菌体）
上記の方法によって、固定化菌体が得られる。固定化菌体は、培地中であるいは乾燥して保存され得る。
【００２７】
得られた固定化菌体は、各菌体に応じた酵素反応に用いられ、適切な反応系で使用され得る。担体に高密度で固定化され得るので、反応効率がよい。また、繰り返し使用も可能である。
【００２８】
【実施例】
（実施例１：ポリ−Ｌ−リシン処理疎水性担体への細菌の固定化）
菌体として、通性嫌気性の光合成細菌である紅色非硫黄性細菌Rhodovulum sulfidophilum strain Ｗ−１Ｓ（以下Ｗ−１Ｓ株と略す；マエダ，外、「バイオテクノロジー・レターズ（Biotechnology Letters）」，１９９７年，第１９巻，第１２号，ｐ．１２０９−１２１２を参照のこと）を使用した。なお、本細菌の平均粒径をレーザー回折／散乱式粒子径分布測定装置（ＬＡ−３００、（株）堀場製作所）を用いて測定すると、０．８４μｍ（球相当直径が０．８４μｍ）であった。
【００２９】
固定化担体粒子（ＢＳＰ）として、高ホルマール化度のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）スポンジシートＤＡ（Ａ）（孔径６０μｍ）（厚さ２ｍｍ、アイオン（株））を、２×２×２ｍｍの粒子状に細切して使用した。
【００３０】
まず、容量５０ｍｌのねじ口振盪三角フラスコに、担体粒子１２５個および純水約２０ｍｌを入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブして滅菌を行った。純水を除去した後、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のポリ−Ｌ−リシン（ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（平均分子量＞７０，０００、和光純薬工業（株））を純水に溶解したもの）１０ｍｌを加えて、室温にて９０回／分の振盪速度で４時間往復振盪した。ポリ−Ｌ−リシン溶液を除去した後、Ｗ−１Ｓを懸濁した培地（波長６６０ｎｍにおける培養液の濁度が１．５になるように調製した培地）を１０ｍｌ加え、３０℃の水浴中光照射条件下、振盪速度９０回／分で往復振盪培養を２日間行った。なお、用いた培地は、NaCl(30g/l)、MgSO₄・7H₂O(0.25g/l)、CaCl₂・2H₂O(0.2g/l)、FeSO₄・7H₂O(0.02g/l)、H₃BO₄(2.86mg/l)、MnCl₂・4H₂O(1.81mg/l)、ZnSO₄・7H₂O(0.22mg/l)、CuSO₄・5H₂O(0.08mg/l)、Na₂MoO₄(0.021mg/l)、CoCl₂・6H₂O(0.01mg/l)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(0.05g/l)、ピルビン酸ナトリウム(1g/l)、コハク酸ナトリウム(1g/l)、DL-リンゴ酸ナトリウム(1g/l)、酢酸ナトリウム(1g/l)、およびNH₄Cl(5mM)を含む水溶液に、リン酸緩衝液（チアミン塩酸塩(100mg/l)、ニコチン酸(100mg/l)、p-アミノ安息香酸(60mg/l)、ビオチン(10mg/l)、KH₂PO₄(8.16g/l)、K₂HPO₄(99g/l)、pH＝8.0）を５ｍｌ／ｌの割合で添加することにより調製した。この播種操作の後、菌体懸濁培地を除去し、新鮮培地を１０ｍｌ加えて、往復振盪培養を再開した。培地を全量新鮮培地と適時交換し、振盪培養を継続した。担体粒子を、培養２日目および５日目に５個ずつサンプリングし、担体粒子に固定化された菌体濃度を、ＭＴＴアッセイにより評価した。また、７日目にもサンプリングし、実体顕微鏡で目視観察した。
【００３１】
ＭＴＴアッセイは、以下のように行った。まず、ＭＴＴ（（株）同仁化学研究所）を１ｇ／ｌの濃度となるように培地に溶解し、孔径０．２２μｍのフィルターを用いてろ過滅菌することにより、ＭＴＴ溶液を調製した。このＭＴＴ溶液に、サンプリングした担体粒子を加えて、２０℃のインキュベーター内で４時間静置した。４時間後ＭＴＴ溶液を除去し、２−プロパノールを加え、担体粒子内で生成したＭＴＴホルマザンを抽出した。分光光度計を用いて抽出液の５６０ｎｍおよび７００ｎｍにおける吸光度を測定し、ＭＴＴホルマザンのモル吸光係数を用いて、吸光度差から固定化細胞によるＭＴＴホルマザンの生成量を算出した。一方、予めＷ−１Ｓ懸濁培地を用いて同様にＭＴＴの変換反応を行い、菌体濃度とＭＴＴホルマザンの生成量との間に比例関係があることを確認した。両者の比例関係に基づいて、固定化細胞によるＭＴＴホルマザンの生成量から固定化菌体濃度を求めた。培養２日目および５日目のＭＴＴアッセイの結果を表１に示す。また、培養７日目の観察については、担体粒子をサンプリングし、ＭＴＴ溶液中で４時間インキュベートし、純水で洗浄した後行った。結果を図１に示す。
【００３２】
（比較例１：無処理疎水性担体への細菌の固定化）
固定化担体粒子をポリ−Ｌ−リシンで処理しなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１および図１に示す。
【００３３】
（比較例２：ポリエチレンイミン添加による疎水性担体への細菌の固定化）
固定化担体粒子をポリ−Ｌ−リシンで処理しなかったこと、ならびに菌体を２日間振盪培養する際にポリエチレンイミン（平均分子量７０，０００、和光純薬工業（株））を０．０２％（ｗ／ｗ）の濃度で培地に添加したこと以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００３４】
（比較例３：ポリ−Ｌ−リシン処理親水性担体への細菌の固定化）
固定化担体粒子として、ホルマール化度が低いため親水性であるポリビニルアルコール（ＰＶＡ）スポンジシートＤ（Ｄ）（孔径８０μｍ）（厚さ２ｍｍ、アイオン（株））をこと以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００３５】
（比較例４：無処理親水性担体への細菌の固定化）
比較例３と同様の固定化担体粒子を用いたこと、ならびに固定化担体粒子をポリ−Ｌ−リシンで処理しなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００３６】
（比較例５：ポリエチレンイミン添加による親水性担体への細菌の固定化）
比較例３と同様の固定化担体粒子を用いたこと、固定化担体粒子をポリ−Ｌ−リシンで処理しなかったこと、ならびに菌体を２日間振盪培養する際にポリエチレンイミン（平均分子量７０，０００、和光純薬工業（株））を０．０２％（ｗ／ｗ）の濃度で培地に添加したこと以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】

【００３８】
ポリ−Ｌ−リシン処理した疎水性の固定化担体粒子を用いた場合（実施例１）は、無処理の場合（比較例１）と比べて、非常に高い濃度の固定化菌体が得られた。また、図１に示すように、ポリ−Ｌ−リシン処理した場合の方が、明らかにＭＴＴホルマザンによる染色が濃く、担体の表面だけでなく、内部まで十分に菌体が保持されていた。
【００３９】
一方、Ｗ−１Ｓを懸濁した培地に、ポリエチレンイミンを最終濃度が０．０２％（ｗ／ｗ）となるように添加して静置すると、Ｗ−１Ｓが凝集し沈降することが観察された。ポリエチレンイミンはカチオン性残基を有しているため、菌体表面の負電荷との静電的な相互作用により細菌の凝集が促進されたものと考えられる。そこで、菌体の播種時にポリエチレンイミンを添加して、ポリ−Ｌ−リシン処理の場合と比較した（比較例２）。表１からわかるように、ポリエチレンイミンを添加しても、無処理の場合とあまり変わらなかった。
【００４０】
次いで、ホルマール化度が低いため親水性である同種の担体を用いて、同様にポリ−Ｌ−リシン処理、無処理、およびポリエチレンイミン添加について検討を行った（比較例３〜５）。表１からわかるように、いずれの場合も、固定された菌体量は少なかった。ポリ−Ｌ−リシン処理した場合（比較例３）でも、無処理の疎水性担体の場合（比較例１）と同等またはそれ以下であった。
【００４１】
ポリ−Ｌ−リシン処理した疎水性担体においては、ポリ−Ｌ−リシンが疎水的相互作用によりポリビニルホルマール多孔性担体の表面に吸着し、さらにポリ−Ｌ−リシンのカチオン性残基とＷ−１Ｓ菌体表面の負電荷との静電的な相互作用によって、Ｗ−１Ｓ菌体が効率よく担体に固定化されたと考えられる。
【００４２】
（実施例２：ポリ−Ｌ−リシン処理疎水性担体に固定化した細菌による水素生産）
容量３００ｍｌの三角フラスコを用いたこと、担体粒子を２５００個用いたこと、ならびに培地量を２００ｍｌとしたこと以外は、実施例１と同様に、光合成細菌Ｗ−１Ｓをポリ−Ｌ−リシン処理した疎水性担体粒子に固定化し、適時培地交換しながら５日間往復振盪培養を行った。培養液を除去し、次いでピルビン酸ナトリウム、DL-リンゴ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびNH₄Clを含まずかつコハク酸ナトリウムの濃度を５０ｍＭとした培地を用いて、固定化菌体を２度洗浄した後、同じ培地１２０ｍｌを加えた。三角フラスコに回転子を入れＷキャップで密栓し、注射針を通じて３０分間アルゴンガスを培地中でバブリングさせ、三角フラスコ内の空気および培地中に溶解している空気をアルゴン置換した後、密封して嫌気条件を維持した。３０℃のインキュベーター内で光照射条件下、固定化担体粒子をマグネチックスターラーで攪拌しながら、２日間放置した。その後、三角フラスコ内の気体をサンプリングし、ガスクロマトグラフ（ＧＣ−８Ａ、（株）島津製作所）を用いて熱伝導度検出器（ＴＣＤ）により気体中の水素含量を測定した。結果を表２に示す。
【００４３】
（比較例６：無処理疎水性担体に固定化した細菌による水素生産）
疎水性の固定化担体粒子をポリ−Ｌ−リシン処理しなかったこと以外は、実施例２と同様に行った。結果を表２に示す。
【００４４】
（比較例７：固定化していない細菌による水素生産）
Ｗ−１Ｓを懸濁した培養液（波長６６０ｎｍにおける培養液の濁度が１．５となるように調製した培養液）１２０ｍｌを遠心分離して上清を除去し、得られた菌体のペレットを、ピルビン酸ナトリウム、DL-リンゴ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびNH₄Clを含まずかつコハク酸ナトリウムの濃度を５０ｍＭとした培地に再懸濁させた。この操作をもう一度繰り返し、菌体を洗浄した。菌体を同じ培地１２０ｍｌに懸濁させた後は、実施例２と同様に水素の生産および定量を行った。結果を表２に示す。
【００４５】
【表２】

【００４６】
ポリ−Ｌ−リシン処理した疎水性の固定化担体粒子を用いた場合（実施例２）は、無処理の場合（比較例６）および固定化していない菌体を用いた場合（比較例７）と比べて、２倍以上の水素が生産されていた。これは、ポリ−Ｌ−リシン処理した疎水性の固定化担体粒子を用いた場合、菌体が高密度で担体粒子内に固定化されているため、反応系全体としてより効率的に水素生産を行うことができたためと考えられる。
【００４７】
【発明の効果】
本発明の菌体の固定化方法によれば、簡便にかつ高密度で菌体を担体に固定化することが可能である。さらに、これまで固定化が困難であった凝集性または付着性の弱い菌体についても、簡便にかつ高密度で菌体を担体に固定化することができる。本発明の固定化菌体は、高密度で固定されているため、反応系全体として反応効率の上昇が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】光合成細菌Ｗ−１Ｓの固定化を行ったポリ−Ｌ−リシン処理または無処理の疎水性担体を、ＭＴＴアッセイにより染色した場合の、担体表面および断面の実体顕微鏡写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to immobilization of bacterial cells. More specifically, the present invention relates to a method for immobilizing bacterial cells on a hydrophobic carrier.
[0002]
[Prior art]
Attempts have been made to immobilize cells in order to efficiently use cells containing a large amount of enzyme in an industrially efficient manner. Methods for immobilizing cells are broadly classified into the following three methods: 1) a carrier binding method for binding cells to an insoluble carrier, 2) a crosslinking method using a crosslinking agent, and 3) a polymer gel matrix lattice. Comprehensive method of enclosing or encapsulating in semipermeable membrane microcapsules. In order to ensure immobilization, the entrapment method is preferable, but various carrier binding methods using a porous carrier have been studied in consideration of the mass transfer around the immobilized cells. In particular, in the case of cells having aggregating properties or adhesiveness, immobilization is generally carried out very easily by a carrier binding method by a simple operation of mixing easily available porous carriers and cells. Yes. For example, the flocculating yeast can be easily fixed simply by mixing with a polyurethane foam piece (see Non-Patent Documents 1 and 2). However, immobilization on a carrier has been difficult in the case of cells that are not so strongly aggregated or adherent.
[0003]
For example, adherent animal cells could be immobilized by simply incubating with a porous cellulose carrier (see Non-Patent Document 3), and were introduced with a polyethyleneimine having a positively charged group or a cell adhesion factor introduced therein. It has been reported that a high concentration of suspended cells could be immobilized on a cellulose carrier (see Patent Document 1) (see Non-Patent Document 4 and Non-Patent Document 5). Although these methods enabled immobilization, the number of cells that could be immobilized was not sufficient. In addition, a simple and effective immobilization method has not yet been found for other microbial cells such as bacteria that are smaller in size than animal cells and do not aggregate or adhere strongly.
[0004]
[Patent Document 1]
JP-A-5-252941 [Non-Patent Document 1]
H. Furuta, et al., “Journal of Fermentation and Bioengineering”, 1997, Vol. 84, No. 2, p. 169-171
[Non-Patent Document 2]
Y. Liu, et al., “Biochemical Engineering Journal”, 1998, Vol. 2, No. 3, p. 229-235
[Non-Patent Document 3]
Tatsuya Ogawa, 5 others, “Journal of Fermentation and Bioengineering”, 1992, Vol. 74, No. 1, p. 27-31
[Non-Patent Document 4]
Shuji Terashima, 5 others, “Biotechnology Journal”, 1993, Vol. 71, No. 3, p. 165-170
[Non-Patent Document 5]
Shuji Terashima, 5 others, “Journal of Fermentation and Bioengineering”, 1994, Vol. 77, No. 1, p. 52-56
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to provide a method for immobilizing bacterial cells, which are not highly agglutinable or adherent, on a carrier simply and at a high density, as in the case of bacterial cells having aggregability.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various studies, the present inventors easily fixed the cells at high density by pretreating a hydrophobic carrier usually used for immobilization with a polymer having a plurality of pendant amines. I found out that I can do it.
[0007]
The present invention provides a method for immobilizing bacterial cells, comprising a step of treating a hydrophobic carrier with a polymer having a plurality of pendant amines, and a step of bringing the treated carrier into contact with bacterial cells.
[0008]
In a preferred embodiment, the polymer having a plurality of pendant amines is poly-L-lysine.
[0009]
In another preferred embodiment, the hydrophobic carrier is polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyurethane, polyvinyl chloride, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylidene difluoride, polycarbonate, polyether, polyester, nylon, polyvinyl formal, acetal. It is selected from the group consisting of resin, phenol resin, silicon resin, fluororesin, glass, ceramics, and metal.
[0010]
In a more preferred embodiment, the hydrophobic carrier is porous.
[0011]
In another preferred embodiment, the microbial cell is a microbial cell that is less flocculating or adherent.
[0012]
In a more preferred embodiment, the microbial cell is a bacterium.
[0013]
The present invention also provides an immobilized microbial cell immobilized on a hydrophobic carrier pretreated with a polymer having a plurality of pendant amines.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(Carrier)
The carrier used in the present invention is not particularly limited as long as it is a hydrophobic solid. The hydrophobic carrier is preferably porous in that it can hold many cells. In that case, the pore diameter is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the size of the bacterial cells. The pore diameter is preferably 0.1 to 1,000 μm, more preferably 1 to 100 μm.
[0015]
As a material for the hydrophobic carrier, a material usually used as a porous carrier for immobilizing aggregating bacterial cells is preferable. Specifically, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyurethane, polyvinyl chloride, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylidene difluoride, polycarbonate, polyether, polyester, nylon, polyvinyl formal, acetal resin, phenol resin, silicone resin, fluorine Resins, glass, ceramics, and metals are included. Polyvinyl formal is a product obtained by subjecting hydrophilic polyvinyl alcohol to a formalization treatment to make it hydrophobic, preferably having a high degree of formalization having a high hydrophobicity. Polyester, polyurethane, nylon, polypropylene, and polyvinyl formal are preferable from the viewpoints of availability and ease of handling. Particularly preferred hydrophobic carriers include polyvinyl formal sponge, polyester foam, polyurethane foam, and polypropylene foam.
[0016]
The shape and size of such a carrier are not particularly limited. For example, the shape may be a block shape, a sheet shape, or the like. Also, in terms of ease of handling, a few mm square strips are most often used.
[0017]
(Polymer with multiple pendant amines)
As long as the polymer having a plurality of pendant amines used in the present invention has the ability to bind to other hydrophobic substances by hydrophobic interaction without adversely affecting the activity of the cells in the culture solution, There is no particular limitation. Specifically, poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-DL-lysine, poly-L-ornithine, poly-D-ornithine, poly-DL-ornithine, poly-L-arginine, poly-D -Arginine, poly-DL-arginine, etc. are mentioned. The polymer having a plurality of pendant amines is preferably a large molecule in consideration of the ability of hydrophobic interaction, and the viscosity average molecular weight is preferably 10,000 or more, more preferably 70,000 or more and 150,000. It is as follows.
[0018]
(Bacteria)
In the present invention, the cells that can be immobilized refer to minute single-cell organisms, and include bacteria, yeast, single-cell algae, cyanobacteria, and the like. The immobilization method of the present invention can be used for multicellular organisms such as aggregating fungi and fungi, but can be particularly suitably used for fungi that have poor aggregability or adhesion. Here, the weak cohesiveness or adherence means that there is little formation of aggregates and adhesion to the container during the culture, and there is a tendency to float in the culture solution.
[0019]
(Immobilization method)
The method for immobilizing bacterial cells of the present invention includes a step of treating a hydrophobic carrier with a polymer having a plurality of pendant amines, and a step of bringing the treated carrier into contact with bacterial cells.
[0020]
First, the treatment of the hydrophobic carrier is performed by immersing the carrier in an aqueous solution of a polymer having a plurality of pendant amines. The concentration of the aqueous solution of the polymer having a plurality of pendant amines is not particularly limited. A concentration of 0.01 to 10 mg / ml is preferred. The immersion time of the carrier can be appropriately determined according to the concentration of the aqueous solution of the polymer having a plurality of pendant amines, the kind of the carrier, and the like. Usually, it is immersed for 5 minutes to 24 hours with shaking or stirring.
[0021]
The obtained carrier is preferably sterilized immediately before contacting the cells. The sterilization treatment may be performed by any method, and a normal autoclave treatment is preferable because it is easy.
[0022]
Next, the treated carrier is brought into contact with the bacterial cells. This step is performed by adding the treated carrier to a medium containing bacterial cells and culturing with shaking or stirring in a culture tank. The medium has a normal composition and does not require a special composition. The amount of the bacterial cells, the amount of the medium, the amount of the carrier and the like can be appropriately determined according to the type of the bacterial cell, the type of the carrier, and the like. The contact time is usually several hours to several days. After contacting cells with a medium containing cells and seeding the cells on a carrier, the carriers can be taken out and added to a fresh medium, and further cultured for several days, so that the cells can be immobilized on the carrier at a high density. . If necessary, the medium can be replaced with fresh medium at the appropriate time.
[0023]
The number of cells or the concentration of cells immobilized on the carrier can be measured by various methods.
[0024]
For example, by the MTT assay (Tim Mosmann, “Journal of Immunological Methods”, 1983, 65, p. 55-63) The concentration can be accurately measured. Specifically, the MTT assay is a dehydrogenase in which yellow MTT (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) is present in mitochondria in living cells. And the resulting amount of purple MTT formazan is based on the number of viable cells. Since the produced MTT formazan is insoluble in water, the absorbance is usually measured after dissolving in 2-propanol.
[0025]
Alternatively, the cells can be physically peeled from the carrier in a predetermined solution, and the amount of the cells immobilized on the carrier can be measured from the difference in the dry weight or wet weight of the carrier before and after that. Further, after removing the cells, the turbidity of the obtained suspension may be measured, or the number of cells in the suspension may be counted using a hemocytometer.
[0026]
(Immobilized cells)
Immobilized cells can be obtained by the above method. The immobilized cells can be stored in a medium or dried.
[0027]
The obtained immobilized microbial cells are used for an enzyme reaction according to each microbial cell, and can be used in an appropriate reaction system. Since it can be immobilized on the carrier at a high density, the reaction efficiency is good. It can also be used repeatedly.
[0028]
【Example】
(Example 1: Immobilization of bacteria on a hydrophobic carrier treated with poly-L-lysine)
As a bacterial body, a red non-sulfur bacterium, Rhodovulum sulfidophilum strain W-1S (hereinafter abbreviated as W-1S strain; Maeda, et al., “Biotechnology Letters”, 1997). 19, Vol. 12, No. 12, pp. 1209-1212). When the average particle size of the bacterium was measured using a laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer (LA-300, Horiba, Ltd.), it was 0.84 μm (sphere equivalent diameter was 0.84 μm). It was.
[0029]
Polyvinyl alcohol (PVA) sponge sheet DA (A) (pore size 60 μm) (thickness 2 mm, Aion Co., Ltd.) having a high degree of formalization as 2 × 2 × 2 mm particles as immobilized carrier particles (BSP) I used it after chopping it.
[0030]
First, 125 carrier particles and about 20 ml of pure water were placed in a 50-ml screw-mouthed conical flask, and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. After removing pure water, poly-L-lysine (poly-L-lysine hydrobromide (average molecular weight> 70,000, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a concentration of 0.1 mg / ml was purified. 10 ml) was added, and the mixture was reciprocally shaken at a shaking speed of 90 times / minute at room temperature for 4 hours. After removing the poly-L-lysine solution, 10 ml of a medium in which W-1S is suspended (medium prepared so that the turbidity of the culture solution at a wavelength of 660 nm is 1.5) is added, and light in a water bath at 30 ° C. Under irradiation conditions, reciprocal shaking culture was performed for 2 days at a shaking speed of 90 times / minute. The medium to be used is, NaCl (30g / l), MgSO 4 · 7H 2 O (0.25g / l), CaCl 2 · 2H 2 O (0.2g / l), FeSO 4 · 7H 2 O (0.02g / _{_{l), H 3 BO 4 (}} 2.86mg / l), MnCl 2 · 4H 2 O (1.81mg / l), ZnSO 4 · 7H 2 O (0.22mg / l), CuSO 4 · 5H 2 O (0.08mg / _{_{l), Na 2 MoO 4 (}} 0.021mg / l), CoCl 2 · 6H 2 O (0.01mg / l), disodium ethylenediaminetetraacetate (0.05g / l), sodium pyruvate (1g / l), succinic acid To an aqueous solution containing sodium (1 g / l), DL-sodium malate (1 g / l), sodium acetate (1 g / l), and NH ₄ Cl (5 mM), phosphate buffer (thiamine hydrochloride (100 mg / l ), Nicotinic acid (100 mg / l), p-aminobenzoic acid (60 mg / l), biotin (10 mg / l), KH ₂ PO ₄ (8.16 g / l), K ₂ HPO ₄ (99 g / l), pH = 8.0) at a rate of 5 ml / l. After this seeding operation, the cell suspension medium was removed, 10 ml of fresh medium was added, and reciprocal shaking culture was resumed. The medium was replaced with fresh medium in a timely manner, and shaking culture was continued. Five carrier particles were sampled on the 2nd and 5th day of culture, and the concentration of the cells immobilized on the carrier particles was evaluated by MTT assay. Moreover, it sampled also on the 7th day and visually observed with the stereomicroscope.
[0031]
The MTT assay was performed as follows. First, MTT solution was prepared by dissolving MTT (Dojindo Laboratories Co., Ltd.) in a medium so as to have a concentration of 1 g / l and sterilizing by filtration using a filter having a pore size of 0.22 μm. The sampled carrier particles were added to this MTT solution and allowed to stand for 4 hours in a 20 ° C. incubator. After 4 hours, the MTT solution was removed, 2-propanol was added, and MTT formazan formed in the carrier particles was extracted. The absorbance at 560 nm and 700 nm of the extract was measured using a spectrophotometer, and the amount of MTT formazan produced by immobilized cells was calculated from the difference in absorbance using the molar extinction coefficient of MTT formazan. On the other hand, the conversion reaction of MTT was similarly performed in advance using a W-1S suspension medium, and it was confirmed that there was a proportional relationship between the bacterial cell concentration and the amount of MTT formazan produced. Based on the proportional relationship between the two, the concentration of immobilized cells was determined from the amount of MTT formazan produced by the immobilized cells. The results of MTT assay on the 2nd and 5th days of culture are shown in Table 1. The observation on the seventh day of the culture was performed after sampling the carrier particles, incubating in the MTT solution for 4 hours, and washing with pure water. The results are shown in FIG.
[0032]
(Comparative Example 1: Immobilization of bacteria on untreated hydrophobic carrier)
The same procedure as in Example 1 was performed except that the immobilized carrier particles were not treated with poly-L-lysine. The results are shown in Table 1 and FIG.
[0033]
(Comparative Example 2: Immobilization of bacteria on a hydrophobic carrier by addition of polyethyleneimine)
The immobilization carrier particles were not treated with poly-L-lysine, and polyethyleneimine (average molecular weight 70,000, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was 0.02% when the cells were cultured with shaking for 2 days. It was carried out in the same manner as in Example 1 except that it was added to the medium at a concentration of (w / w). The results are shown in Table 1.
[0034]
(Comparative Example 3: Immobilization of bacteria on poly-L-lysine-treated hydrophilic carrier)
Example 1 except that polyvinyl alcohol (PVA) sponge sheet D (D) (pore size 80 μm) (thickness 2 mm, Aion Co., Ltd.), which is hydrophilic because of its low degree of formalization, is used as the immobilized carrier particles. The same was done. The results are shown in Table 1.
[0035]
(Comparative Example 4: Immobilization of bacteria on untreated hydrophilic carrier)
The same procedure as in Example 1 was performed except that the same immobilized carrier particles as in Comparative Example 3 were used and that the immobilized carrier particles were not treated with poly-L-lysine. The results are shown in Table 1.
[0036]
(Comparative Example 5: Immobilization of bacteria on hydrophilic carrier by addition of polyethyleneimine)
The same immobilized carrier particles as in Comparative Example 3 were used, the immobilized carrier particles were not treated with poly-L-lysine, and polyethyleneimine (average molecular weight 70, 000, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the culture medium at a concentration of 0.02% (w / w). The results are shown in Table 1.
[0037]
[Table 1]

[0038]
When the hydrophobic immobilized carrier particles treated with poly-L-lysine are used (Example 1), compared to the case without treatment (Comparative Example 1), an extremely high concentration of immobilized cells can be obtained. It was. In addition, as shown in FIG. 1, in the case of treatment with poly-L-lysine, staining with MTT formazan was clearly darker, and the cells were sufficiently retained not only on the surface of the carrier but also inside.
[0039]
On the other hand, when polyethyleneimine is added to a medium in which W-1S is suspended so that the final concentration is 0.02% (w / w) and left to stand, it is observed that W-1S aggregates and settles. It was. Since polyethyleneimine has a cationic residue, it is considered that bacterial aggregation was promoted by electrostatic interaction with the negative charge on the surface of the cell. Therefore, polyethyleneimine was added at the time of sowing the cells, and compared with the case of poly-L-lysine treatment (Comparative Example 2). As can be seen from Table 1, the addition of polyethyleneimine was not much different from the case of no treatment.
[0040]
Next, using the same kind of carrier that is hydrophilic because the degree of formalization is low, poly-L-lysine treatment, no treatment, and addition of polyethyleneimine were similarly examined (Comparative Examples 3 to 5). As can be seen from Table 1, in each case, the amount of immobilized cells was small. Even when poly-L-lysine was treated (Comparative Example 3), it was equal to or less than that of the untreated hydrophobic carrier (Comparative Example 1).
[0041]
In the hydrophobic carrier treated with poly-L-lysine, the poly-L-lysine is adsorbed on the surface of the polyvinyl formal porous carrier by hydrophobic interaction, and the cationic residues of poly-L-lysine and W-1S It is considered that the W-1S cells were efficiently immobilized on the carrier by electrostatic interaction with the negative charge on the surface of the cells.
[0042]
(Example 2: Hydrogen production by bacteria immobilized on a hydrophobic carrier treated with poly-L-lysine)
The photosynthetic bacterium W-1S was treated with poly-L-lysine in the same manner as in Example 1 except that a 300 ml Erlenmeyer flask was used, 2500 carrier particles were used, and the medium amount was 200 ml. The mixture was immobilized on hydrophobic carrier particles and subjected to reciprocal shaking culture for 5 days while changing the medium appropriately. The culture solution was removed, and then the immobilized cells were washed twice using a medium containing no sodium pyruvate, DL-sodium malate, sodium acetate, and NH ₄ Cl and a sodium succinate concentration of 50 mM. After that, 120 ml of the same medium was added. Put a rotor in the Erlenmeyer flask and seal it with a W cap, and bubble argon gas through the syringe for 30 minutes in the medium. After replacing the air in the Erlenmeyer flask and the air dissolved in the medium with argon, seal it. Maintained anaerobic conditions. The immobilized carrier particles were allowed to stand for 2 days in a 30 ° C. incubator under light irradiation conditions while stirring with a magnetic stirrer. Thereafter, the gas in the Erlenmeyer flask was sampled, and the hydrogen content in the gas was measured with a thermal conductivity detector (TCD) using a gas chromatograph (GC-8A, Shimadzu Corporation). The results are shown in Table 2.
[0043]
(Comparative Example 6: Hydrogen production by bacteria immobilized on an untreated hydrophobic carrier)
The same procedure as in Example 2 was performed except that the hydrophobic immobilized carrier particles were not treated with poly-L-lysine. The results are shown in Table 2.
[0044]
(Comparative Example 7: Hydrogen production by non-immobilized bacteria)
120 ml of the culture solution in which W-1S is suspended (culture solution prepared so that the turbidity of the culture solution at a wavelength of 660 nm is 1.5) is centrifuged to remove the supernatant, and the resulting cell pellet Was resuspended in medium containing no sodium pyruvate, DL-sodium malate, sodium acetate, and NH ₄ Cl and a sodium succinate concentration of 50 mM. This operation was repeated once to wash the cells. After the cells were suspended in 120 ml of the same medium, hydrogen production and quantification were performed in the same manner as in Example 2. The results are shown in Table 2.
[0045]
[Table 2]

[0046]
When the hydrophobic immobilized carrier particles treated with poly-L-lysine are used (Example 2), the case of no treatment (Comparative Example 6) and the case of using non-immobilized cells (Comparative Example 7) Compared to the above, more than twice as much hydrogen was produced. This is because when the hydrophobic immobilized carrier particles treated with poly-L-lysine are used, the bacterial cells are immobilized at high density in the carrier particles, so that the reaction system as a whole can produce hydrogen more efficiently. It is thought that it was possible to do it.
[0047]
【The invention's effect】
According to the method for immobilizing bacterial cells of the present invention, it is possible to immobilize bacterial cells on a carrier simply and at a high density. Furthermore, bacterial cells that have been difficult to immobilize until now can be immobilized on a carrier simply and at a high density. Since the immobilized bacterial cell of the present invention is fixed at a high density, an increase in reaction efficiency can be expected as the entire reaction system.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a stereomicrograph of a carrier surface and a cross section when a poly-L-lysine-treated or untreated hydrophobic carrier on which photosynthetic bacteria W-1S have been immobilized is stained by MTT assay.

Claims

Comprising the step of immersing a hydrophobic carrier in an aqueous solution of poly amino acids, and contacting the the bacteria support obtained by the dipping, the method of immobilizing the cells.

Wherein the poly amino acid is poly -L- lysine The method of claim 1.

The hydrophobic carrier is polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyurethane, polyvinyl chloride, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylidene difluoride, polycarbonate, polyether, polyester, nylon, polyvinyl formal, acetal resin, phenol resin, silicone resin, The method according to claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of a fluororesin, glass, ceramics, and metal.

The method according to claim 1, wherein the hydrophobic carrier is porous.

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the microbial cell is a microbial cell having poor aggregation or adhesion.

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the cell is a bacterium.

Immobilized on a hydrophobic support obtained was immersed in an aqueous solution of poly amino acids, immobilized microorganism.