JP4211463B2 - 画像からの濃度定量法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
臨床検査や薬品・医薬品の研究および品質検査において、電気泳動像などの支持体の濃度を光学的に求める測定法や酵素免疫測定法などの液体試料の濃度測定に関する分野。
【０００２】
【従来の技術】
吸光度測定法は一般的に被測定試料の液体をガラス等のセルに入れ分光光度計等で測定するように定められている。ところが、電気泳動支持体は液体でなくフイルム状のもの筒状のもの寒天状のもの等様々であり、その濃度は分光光度計などで直接測定できないので、吸光度が分かっている標準フイルムにより、検定した機器で測定した被試験試料の吸光度を使用することで測定していた。（参考文献１、２、３、４）
【０００３】
また酵素免疫測定法（ＥＩＡ）などで広く用いられている方法では、９６穴（または１２穴）のプレート上の各穴（ウエル、多数小容器群）の中で酵素免疫反応させ、それぞれのウエル中の液体の濃度を、専用の光度計で測定して検量線から濃度を求めていた。（参考文献５）
これら測定法は、昔から行われている比色定量の原理（ランバートベアーの法則）に基づいて濃度測定を行う必要があると言われている。（参考文献３、４）
【０００４】
ある特定の領域を抽出する方法としては、コンピュータのマウス操作により、抽出したい画像上の位置に中心線や幅・長さを設置して特定の画像を抽出していた。またコンピュータ上で、ある領域を特定する方法としては、パターンマッチング技法が知られている。（参考文献６）
【０００５】
参考文献
１． 電気泳動学会：デンシトメトリーおよびデンシトメータ（別冊）、１９７９．７．１０
２． 電気泳動学会：デンシトメータ検定用フイルムＢ型説明書（別冊）、１９７１．２．１５
３． 島尾一男：デンシトメトリー、電気泳動実験法、電気泳動学会編、（株）文光堂、１２５〜１３６、１９６４
４． 黒木洋一：デンシトメトリー、電気泳動法のすべて、医歯薬出版株式会社、ｐ１０−１５、１９８１
５． 石川栄治・河合忠・宮井潔 編：３０．抗体、酵素免疫測定法（第２版）、株式会社医学書院、ｐ４６０−４７１、１９８２．１２．１５
６． 田村秀行：コンピュータ画像処理入門「５．６マッチング」、総研出版、１９８５
【０００６】
【発明が解決しょうとする課題】
最近は、電子技術の進歩に従って高性能のＣＣＤカメラ素子が発売されスキャナーやデジタルカメラから直接画像をコンピュータに取込むことができる時代となり、その画像の濃淡もおおよそ解かるようになってきた。しかし現在この画像の濃度を測る場合、比色定量の原則であるランバートベアーの法則に則っての濃度（吸光度）変換させることについては確立されていなかった。
【０００７】
濃度分布波形を表示する場合、濃度分布波形と元の画像表記がなされていなかったり濃度分布波形の位置と画像の山の位置がずれており、分かり難かった点を解決する。
【０００８】
電気泳動画像のようにランダムに並んだ画像を、１列づつ取り出す場合、１列づつ場所や幅を操作者が指定していた。また酵素抗体測定法では測定したい各ウエルの位置を専用の機械で予め決められた部分を測定していた。または操作者が測定したい位置をそれぞれ指定して測定していた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願発明は、ＣＣＤカメラ素子で読み取った画像の濃淡を、濃度分布波形または濃度そのものを表す際、濃度既知の標準フイルムのデータを基にして濃度未知の試料の吸光度を得られるようにした。
【００１０】
また酵素免疫測定法においては、従来の技術で述べたような各ウエルに入れられた液体の濃度を比色定量の原理に基づいて測定していた。
この定量法においてもＣＣＤカメラやスキャナーの画像の濃度未知試料の濃度を、濃度既知の標準フイルムのデータを基にして真の吸光度を得る。
【００１１】
吸光度で表示した濃度分布波形は、撮影した泳動像そのものと１：１で表示したり印刷することおよびその幅や位置をも自由に選択できるようになった。
【００１２】
画像上の被試験試料個々の列やウエルの選択は、本願発明においてパターンマッチング技法を用い、特定の短冊状の枠やウエルに合致した丸穴の枠を、撮影時に設置する事で、自動的に画像の列や各ウエルの位置を決め、波形を書いたり吸光度などの濃度値を計算し表示できるようになった。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図１の白黒の標準フイルム（１）をＣＣＤカメラで読み込み、メモリーに記憶する。この標準フイルムは電気泳動用には２種類あって１つはＡフイルムといい階段状に濃度が上昇する光学楔となっており、もう１つはＢフイルム（１）と呼ばれ、５つのバンドがある一定の間隔で並んでおり徐々に濃度が濃くなるように作られている。このフイルムには電気泳動学会で決められた測定法で測定した各場所の吸光度（ＯＤ値）が表示されており（２）、その技術的裏付けは参考文献１、２に詳しく述べられている。
【００１４】
カラー標準フイルムも参考文献１から５の理論に基づき作成され、これを白黒の標準フイルムと同様ＣＣＤカメラで読み込みデータ化（画素値化）する。その後の吸光度化は白黒フイルムによる変換と同様に実施する。カラーの場合は、その色調の最大吸収波長の測定結果により吸光度が表記されておりこれに添う検量線を作成すれば良い。
【００１５】
標準フイルム（１）や図２に示すような被検試料（１８〜２２）をＣＣＤカメラやスキャナーで画像としてコンピュータに取り込みそれをデータとする。標準フイルムの吸光度は予め既知の値として入力しておく。
コンピュータは、入力されている標準フイルムの吸光度を検量線とし、被検試料の吸光度を２次方程式や近似方程式の解を求める方法で求めることは容易である。
【００１６】
この吸光度に換算した後のデータは、被検試料の一部に操作者が検量線用として別途既知濃度が設定しておく場合には、吸光度表示の他に、その設定してある既知濃度値を検量線として別の濃度値にさらに換算し表示または印字することも可能である。
【００１７】
本願発明はＣＣＤカメラ等の画像をコンピュータで処理を行ない表示させるので、図３に示すように電気泳動像３とその濃度分布波形６を、例えば電気泳動像３を左右に引き伸ばしたり縮めたりして１：１に図示したり印刷することができる。その上幅や位置、範囲はマウス操作により自由に選択できるようにできる。
【００１８】
被検試料をＣＣＤカメラやスキャナーで画像として取り込むとき、被検試料に図２に示す一定の短冊状の黒い枠を予め施してから撮影することで、この枠をパターンマッチング技法で自動抽出した。この自動抽出の方法（参考文献６）は、色成分画像の算出、画像の微分、微分画像の統一、直線当てはめ、マッチング度最大の位置検出、被検試料領域の決定、被検試料領域の濃度分布波形の算出などの処理を行って実施した。
【００１９】
【実施例１】
図３の３が電気泳動像を画像として取り込んだ図で、左端有意領域選択スライダー４と右端有意領域選択スライダー５で選んだ範囲についてその濃度分布波形６を表示させた。縦軸は吸光度（ＯＤ）とし、横軸は泳動の幅を示している。電気泳動像３の各バンド７〜１１と各濃度分布波形のピーク１２〜１６はそれぞれ一致して表示されている。各濃度分布波形のピークの値は、記憶されている標準フイルムの既知の吸光度（図１）を検量線として近似式（２次方程式等）から吸光度を計算して１７に表記した。また濃度分布波形全体の面積を求め各部分の面積比を百分率（％）で表示させた。
【００２０】
【実施例２】
図２に示す画像の１８〜２２は被試検体である。この画像から例えば被試検体１８を画像処理により自動抽出する実施例について説明する。図２の被試検体１８の画像を走査して、文献６のパターンマッチング技法を用いて図４に示す画像上の被試験試料輪郭である太い黒枠の細長い長方形で囲んだ検体領域２４を抽出した。具体的には、画像上に垂直線を設定し、その直線を左から右に動かしつつ、それぞれの位置で直線上の画素値の合計を求め、その合計値が極大となるような位置を探索する。図４の場合は、縦軸の太い２本の黒枠線いわゆる垂直線が得られる。次いで、この垂直線をもとに領域２４およびその中心線２３を求める。被試検体１８の濃度分布波形６（図３に示した）は中心線上の画素および近傍画素からそれぞれ平均化して吸光度を求めた上で表示した。
【００２１】
なお、検体領域の自動抽出が困難な画像については、従来法であるマウス操作により画像上の当該位置に中心線や位置や幅などを設定して、特定の画像を抽出することも併用した。
【００２２】
【実施例３】
図５は支持体上３２に固定した円型の被試験試料（検体）を画像に取り込んだ図である。この実施例の２５〜３０がそれぞれ検体で、３２はセルローズアセテート膜で、円形に塗られた被検検体の蛋白質を、銀染色で染めたものである。検体２５〜３０を図１の記憶されている標準フイルムの既知の吸光度を検量線として測定した吸光度（ＯＤ）は３１のようになった。
【００２３】
【実施例４】
図６は酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の画像を取り込んだものである。３３が一般的に用いられている９６穴のＥＩＡプレートである。３４〜４５は酵素反応し発色させた結果であり、これも実施例３と同様、図１に記憶されている標準フイルムの既知の吸光度を検量線として吸光度を測定したものを４６に示した。
【００２４】
例えば３４〜３９に段階的に濃度既知の検体を設置しておき、その３４〜３９の吸光度を測定し、その吸光度と設置した濃度既知の検体の濃度から検量線を作成して、その他の濃度未知の被検検体４０〜４５について４６のように吸光度と濃度値を併記して結果を出すことができた。
【００２５】
【発明の効果】
吸光度を測定する濃度測定法においてランバート・ベアーの法則は、参考文献１〜５に示すように重要な測定原理である。最近のＣＣＤカメラ素子を用いる画像技術で読み取った結果を吸光度濃度測定法に則ったものに対応させる新しい方法であり、結果として画像そのものと測定値である吸光度および吸光度に基づく検量線からの濃度算定結果を得ることができるので、測定結果の信頼性が大幅に向上する。
また画像と濃度分布波形を同一画面上に１：１にあわせることもでき、結果の解釈に良い情報を与えるばかりでなく、臨床的に使用した場合は、臨床的診断価値が増加する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 標準フイルム
【図２】 被検検体を画像で取り込んだ図
【図３】 被検検体の図と濃度分布波形を１：１で表記した図
【図４】 被検検体を抽出する図
【図５】 円形の被検検体の図
【図６】 酵素免疫測定法に適用した例
【符号の説明】
１． 標準フイルム
２． 標準フイルム上のパターンの吸光度値
３． 電気泳動像
４． 有意領域選択スライダー左
５． 有意領域選択スライダー右
６． 濃度分布波形
７． 像の分画１
８． 像の分画２
９． 像の分画３
１０．像の分画４
１１．像の分画５
１２．像７の濃度分布波形
１３．像８の濃度分布波形
１４．像９の濃度分布波形
１５．像１０の濃度分布波形
１６．像１１の濃度分布波形
１７．測定結果
１８〜２２． 画像として取り込んだ泳動像
２３． 被検検体１８の作成した中心線
２４． 被検検体１８の自動抽出のための枠
２５〜３０． 円型検体の例
３１． 円型検体の測定結果
３２． 支持体
３３． ９６穴ＥＩＡプレート
３４〜３９． 検量線用既知濃度検体の反応後の取り込んだ画像
４０〜４５． 一般被検検体の反応後の取り込んだ画像
４６． 被検検体の測定結果

Claims (3)

1. 一定の色調の階段状に濃淡を持つフイルムの吸光度を分光光度計で測定し、その吸光度を表記したフイルムを用いる測定法において、当該フイルムをＣＣＤカメラで読み取った画像データの画素値を基に、画素値と吸光度との検量線を作成し、一方、濃度未知の試料である被試験試料を同様ＣＣＤカメラで読み取った画像データの画素値について、前記画素値と吸光度との検量線を用いて被試験試料の濃度を吸光度で表現することを特徴とした濃度定量法。
2. 被試験試料の一部に濃度既知の部分を設定し、前記濃度既知の部分について請求項１の画素値と吸光度との検量線から吸光度を求め、その求めた吸光度と前記既知の濃度との関係から、吸光度と濃度との検量線を作成し、この吸光度と濃度との検量線を用いて、濃度未知の被試験試料の濃度を表示することを特徴とした請求項１の濃度定量法。
3. 電気泳動像とその濃度を表す濃度分布波形とを表記する方法において、ＣＣＤカメラで読み取った画像データの画素値について、請求項１の方法で吸光度に変換し濃度分布波形としたものを、前記電気泳動像の各バンドと前記濃度分布波形の各ピークが一致するように同一画面上に表示または同一印刷紙面上に表現することを特徴とした濃度定量法。

Images