JP4193997B1

JP4193997B1 - New DNA polymerase

Info

Publication number: JP4193997B1
Application number: JP2007314385A
Authority: JP
Inventors: 良純石野; 健山上; 秀二田島; 正明高橋; 雪子宮下
Original assignee: Kyushu University NUC; Precision System Science Co Ltd
Current assignee: Kyushu University NUC; Precision System Science Co Ltd
Priority date: 2007-12-05
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2027-12-05
Also published as: JP2009136188A

Abstract

【課題】新規なＤＮＡポリメラーゼを提供すること。
【解決手段】野生型Ｔａｑポリメラーゼのアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加する変異が導入された改変Ｔａｑポリメラーゼ。それをコードするＤＮＡ、組換えベクター及び形質転換体も提供される。
【選択図】図１１PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a novel DNA polymerase.
[MEANS FOR SOLVING PROBLEMS] A modified Taq polymerase in which a mutation that increases the total charge of glutamic acid at position 742 and alanine at position 743 in the amino acid sequence of wild-type Taq polymerase is introduced. DNAs encoding them, recombinant vectors and transformants are also provided.
[Selection] FIG.

Description

本発明は、新規ＤＮＡポリメラーゼに関する。 The present invention relates to a novel DNA polymerase.

鋳型ＤＮＡの塩基配列に従って、それと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ鎖を合成することができるＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）、ＤＮＡの塩基配列決定、部位特異的変異導入法等をはじめとする遺伝子操作実験に必要不可欠の試薬として、日常的に利用されている。分子医学、分子生物学及び生化学の発展のために果たしてきたこの酵素の貢献度は、計り知れないものがある。 A DNA polymerase capable of synthesizing a DNA strand consisting of a complementary base sequence according to the base sequence of the template DNA includes PCR (polymerase chain reaction), DNA base sequence determination, site-specific mutagenesis, etc. It is routinely used as an indispensable reagent for genetic manipulation experiments such as the first. The contribution of this enzyme that has been made for the development of molecular medicine, molecular biology and biochemistry is immeasurable.

現在までに多くの種類のＤＮＡポリメラーゼが商品として市場に出回っているが、各酵素の理化学的性質、例えば、熱安定性、合成鎖伸長能、ミス合成の校正能、鋳型ＤＮＡの好み等は異なり、実験目的によって使い分けられている。 To date, many types of DNA polymerases are on the market, but the physicochemical properties of each enzyme, such as thermal stability, ability to extend synthetic strands, ability to calibrate missynthesis, and preference for template DNA are different. , Depending on the purpose of the experiment.

例えば、ＰＣＲには、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼの利用が必要不可欠である。熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼは二本鎖ＤＮＡの変性の際に失活することがないので、酵素の追加等の手間を省くことができる。また、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを利用して高温でＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことにより、プライマーの非特異的なアニーリング、一本鎖ＤＮＡの分子内高次構造（例えばヘアピンループ等）の形成等を防止することができ、目的の伸長反応を効率よく進行させることができる。 For example, the use of thermostable or thermoactive DNA polymerase is essential for PCR. Since the thermostable or thermoactive DNA polymerase is not inactivated when the double-stranded DNA is denatured, it is possible to save the trouble of adding an enzyme. In addition, by performing a DNA strand elongation reaction at high temperature using thermostable or thermoactive DNA polymerase, non-specific annealing of primers, intramolecular higher-order structure of single-stranded DNA (eg hairpin loop, etc.) And the like, and the intended extension reaction can be efficiently advanced.

熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）（特許文献１、２及び３参照）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＴｍａＤＮＡポリメラーゼ）（特許文献４及び５参照）等が知られている。 Examples of the thermostable or thermoactive DNA polymerase include DNA polymerase (Taq DNA polymerase) derived from Thermus aquaticus (see Patent Documents 1, 2, and 3), Thermotoga maritima (Thermotoga maritima). A DNA polymerase (Tma DNA polymerase) (see Patent Documents 4 and 5) is known.

ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（以下、「Ｔａｑポリメラーゼ」ということもある。）を含むファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼに高度に保存されているアミノ酸配列のうち、活性部位を含むアミノ酸配列をもとにプライマーを設計し、温泉土壌サンプルを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られたＤＮＡポリメラーゼ遺伝子断片を野生型Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子の相当する部分とプラスミド上で入れ換え、それを大腸菌に形質転換後、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導したところ、Ｔａｑポリメラーゼより伸長活性の高いキメラＤＮＡポリメラーゼが得られた（特許文献６及び７）。 Among the amino acid sequences highly conserved in family A type DNA polymerases including Taq DNA polymerase (hereinafter also referred to as “Taq polymerase”), primers are designed based on the amino acid sequence including the active site, A PCR reaction was performed using a hot spring soil sample as a template, and the obtained DNA polymerase gene fragment was replaced with a corresponding portion of the wild-type Taq polymerase gene on a plasmid, and transformed into Escherichia coli to induce expression of the DNA polymerase gene. However, chimeric DNA polymerase having a higher elongation activity than Taq polymerase was obtained (Patent Documents 6 and 7).

米国特許第４，８８９，８１８号明細書U.S. Pat. No. 4,889,818 米国特許第５，３５２，６００号明細書US Pat. No. 5,352,600 米国特許第５，０７９，３５２号明細書US Pat. No. 5,079,352 米国特許第５，３７４，５５３号明細書US Pat. No. 5,374,553 米国特許第５，４２０，０２９号US Pat. No. 5,420,029 特開2006-101791号公報JP 2006-101791 A 特開2006-204267号公報JP 2006-204267 A

本発明は、新規ＤＮＡポリメラーゼを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a novel DNA polymerase.

本発明者らは、Ｔａｑポリメラーゼのメタゲノム及び立体構造の情報をもとに、Ｔａｑポリメラーゼのアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加するような変異を導入したところ、これらの部位特異的変異体のプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つがＴａｑポリメラーゼよりも高いことを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have introduced a mutation that increases the sum of the charges of glutamic acid at position 742 and alanine at position 743 in the amino acid sequence of Taq polymerase based on the metagenome and three-dimensional structure information of Taq polymerase. The inventors have found that at least one of the primer extension activity of these site-specific mutants, the binding activity to the primer annealed to the template DNA, and the PCR performance is higher than that of Taq polymerase, and the present invention has been completed.

本発明の要旨は以下の通りである。 The gist of the present invention is as follows.

（１）配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加する変異が導入された改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（２）プライマー伸長活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い（１）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（３）鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い（１）又は（２）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（４）ＰＣＲ性能が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い（１）〜（３）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。 (1) A modified Taq polymerase into which a mutation that increases the total charge of glutamic acid at position 742 and alanine at position 743 of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is introduced.
(2) The modified Taq polymerase according to (1), wherein the primer extension activity is higher than that of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(3) The modified Taq polymerase according to (1) or (2), which has a higher binding activity to a primer annealed to a template DNA than Taq polymerase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(4) The modified Taq polymerase according to any one of (1) to (3), which has higher PCR performance than Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

（５）配列番号２のアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸と743位のアラニンの少なくとも１つを電荷のないアミノ酸又は正電荷を持つアミノ酸に置換する変異が導入された（１）〜（４）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（６）電荷のないアミノ酸がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンからなる群より選択され、正電荷を持つアミノ酸がアルギニン、リシン及びヒスチジンからなる群より選択される（５）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。 (5) Mutations that replace at least one of glutamic acid at position 742 and alanine at position 743 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with an uncharged amino acid or a positively charged amino acid were introduced (1) to (4) The modified Taq polymerase according to any one of the above.
(6) The amino acid having no charge is selected from the group consisting of alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, tryptophan, phenylalanine, proline, glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. The modified Taq polymerase according to (5), selected from the group consisting of arginine, lysine and histidine.

（７）以下の(i)及び/又は(ii)の変異が導入された（６）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
(i)742位のグルタミン酸がアラニン、グルタミン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
(ii) 743位のアラニンがチロシン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
（８）以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である（１）〜（７）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。 (7) The modified Taq polymerase according to (6), wherein the following mutation (i) and / or (ii) is introduced.
(i) Glutamic acid at position 742 is replaced with alanine, glutamine, arginine or lysine
(ii) Alanine at position 743 is substituted with either tyrosine, arginine or lysine. (8) The protein according to any one of (1) to (7), which is any one of the following proteins (a) to (c): Modified Taq polymerase.

(a)配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２0のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかのアミノ酸配列において、742位と743位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
(c)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されており、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質 (a) a protein comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 or 20
(b) In the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 or 20, one or several amino acids other than the amino acids at positions 742 and 743 are deleted or substituted Alternatively, a protein consisting of an added amino acid sequence and having at least one of primer extension activity, binding activity to a primer annealed to template DNA, and PCR performance higher than Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(c) It is encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to DNA consisting of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19. Wherein the amino acid encoded by the codon consisting of nucleotides 2224 to 2226 and the amino acid encoded by the codon consisting of nucleotides 2227 to 2229 in the nucleotide sequence are conserved, and primer extension activity, template A protein having at least one of binding activity to a primer annealed to DNA and PCR performance higher than Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

（９）さらに、配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの667位のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異が導入された（１）〜（８）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変ＴａｑポリメラーゼのN末端から280位までのアミノ酸を除くアミノ酸配列からなる改変Ｔａｑポリメラーゼの断片。
（１１）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は（１０）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片をコードするＤＮＡ。
（１２）（１１）記載のＤＮＡを含む組換えベクター。 (9) The modified Taq polymerase according to any one of (1) to (8), further introduced with a mutation in which phenylalanine at position 667 of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with tyrosine.
(10) A modified Taq polymerase fragment comprising an amino acid sequence excluding amino acids from the N-terminal to the 280th position of the modified Taq polymerase according to any one of (1) to (9).
(11) A DNA encoding the modified Taq polymerase according to any one of (1) to (9) or the fragment of the modified Taq polymerase according to (10).
(12) A recombinant vector comprising the DNA according to (11).

（１３）（１２）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１４）（１３）記載の形質転換体を培養することを含む（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は請求項１０記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片を製造する方法。
（１５）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は（１０）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片を用いて、ＤＮＡを増幅する方法。 (13) A transformant comprising the recombinant vector according to (12).
(14) A method for producing the modified Taq polymerase according to any one of (1) to (9) or the fragment of the modified Taq polymerase according to claim 10, comprising culturing the transformant according to (13).
(15) A method for amplifying DNA using the modified Taq polymerase according to any one of (1) to (9) or the fragment of the modified Taq polymerase according to (10).

（１６）さらに、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼを用いる（１５）記載の方法。
（１７）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は（１０）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片を含むＤＮＡ増幅用キット。
（１８）さらに、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼを含む（１７）記載のキット。 (16) The method according to (15), further using a family B type DNA polymerase.
(17) A DNA amplification kit comprising the modified Taq polymerase according to any one of (1) to (9) or the fragment of the modified Taq polymerase according to (10).
(18) The kit according to (17), further comprising a family B type DNA polymerase.

本発明により、プライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つがＴａｑポリメラーゼよりも高いＤＮＡポリメラーゼが提供される。 The present invention provides a DNA polymerase having at least one of primer extension activity, binding activity to a primer annealed to a template DNA, and PCR performance higher than Taq polymerase.

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加する変異が導入された改変Ｔａｑポリメラーゼを提供する。
本明細書において、「Ｔａｑポリメラーゼ」とは、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼを意味する。「ＤＮＡポリメラーゼ」とは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として、鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡを合成する触媒作用を有するタンパク質を意味する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention provides a modified Taq polymerase in which a mutation that increases the total charge of glutamic acid at position 742 and alanine at position 743 of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is introduced.
In the present specification, “Taq polymerase” means a DNA polymerase derived from Thermus aquaticus. “DNA polymerase” means a protein having a catalytic action of synthesizing DNA complementary to template DNA using deoxyribonucleoside triphosphate as a substrate.

Ｔａｑポリメラーゼのアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。これらの配列情報は、ジーンバンクに登録されている（登録番号P19821）。Ｔａｑポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の742位がグルタミン酸で、743位がアラニンである（Taq(742E743A)）。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、以下の(1)〜(3)の少なくとも１つの特性を有するものであるとよい。 The amino acid sequence of Taq polymerase is shown in SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence of DNA encoding Taq polymerase is shown in SEQ ID NO: 1. Such sequence information is registered in Genebank (registration number P19821). Taq polymerase has glutamic acid at position 742 and alanine at position 743 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (Taq (742E743A)).
The modified Taq polymerase of the present invention may have at least one of the following properties (1) to (3).

(1)プライマー伸長活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い。
(2)鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い。
(3)ＰＣＲ性能が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い。 (1) The primer extension activity is higher than that of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(2) The binding activity to the primer annealed to the template DNA is higher than that of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(3) PCR performance is higher than Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

プライマー伸長活性は、後述の実施例３に記載の方法により測定することができる。
鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性は、後述の実施例４に記載の方法により測定することができる。 Primer extension activity can be measured by the method described in Example 3 below.
The binding activity to the primer annealed to the template DNA can be measured by the method described in Example 4 described later.

ＰＣＲ性能は、既知のDNAに対して、適当な位置にプライマーを設定することによって、増幅すべきDNA鎖長を決め、PCR反応条件を設定して評価することができる。例えば、伸長性に優れた酵素であれば、各サイクル中での伸長反応時間設定を短くして行き、より短い時間でも目的の増幅バンドが検出できることで差別化できる。また同じ時間でより長鎖のDNAを増幅できること、また同じ条件で反応させても、増幅されるバンドの強度で増幅効率を比較することもできる。このようにPCRに要する時間、増幅されるDNAの長さ、増幅効率などの要素を含む概念であり、後述の実施例５〜１１に記載の方法により測定することができる。 PCR performance can be evaluated by setting a primer at an appropriate position for a known DNA, determining the length of the DNA chain to be amplified, and setting PCR reaction conditions. For example, an enzyme having excellent extensibility can be differentiated by shortening the extension reaction time setting in each cycle and detecting the target amplification band even in a shorter time. Moreover, longer-chain DNA can be amplified in the same time, and even if the reaction is performed under the same conditions, amplification efficiency can be compared based on the intensity of the amplified band. Thus, it is a concept including factors such as the time required for PCR, the length of DNA to be amplified, and amplification efficiency, and can be measured by the methods described in Examples 5 to 11 described later.

本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸と743位のアラニンの少なくとも１つを電荷のないアミノ酸又は正電荷を持つアミノ酸に置換する変異を導入されたものである。電荷のないアミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどを例示することができる。正電荷を持つアミノ酸としては、アルギニン、リシン、ヒスチジンなどを例示することができる。本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼの例として、以下の(i)及び/又は(ii)の変異が導入されたものを挙げることができる。 In the modified Taq polymerase of the present invention, for example, a mutation that substitutes at least one of glutamic acid at position 742 and alanine at position 743 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with an uncharged amino acid or a positively charged amino acid has been introduced. Is. Examples of the amino acid having no charge include alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, tryptophan, phenylalanine, proline, glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine and the like. Examples of positively charged amino acids include arginine, lysine, histidine and the like. Examples of the modified Taq polymerase of the present invention include those in which the following mutations (i) and / or (ii) are introduced.

(i) 配列番号２のアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸がアラニン、グルタミン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
(ii) 配列番号２のアミノ酸配列中の743位のアラニンがチロシン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
より具体的な例として、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質が本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼに含まれる。 (i) The glutamic acid at position 742 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with any of alanine, glutamine, arginine or lysine
(ii) Alanine at position 743 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with any one of tyrosine, arginine, or lysine. As a more specific example, any one of the following proteins (a) to (c) is provided in the present invention: Of the modified Taq polymerase.

(a)配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２0のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかのアミノ酸配列において、742位と743位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
(c)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されており、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質 (a) a protein comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 or 20
(b) In the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20, one or several amino acids other than the amino acids at positions 742 and 743 are deleted or substituted Alternatively, a protein consisting of an added amino acid sequence and having at least one of primer extension activity, binding activity to a primer annealed to template DNA, and PCR performance higher than Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(c) It is encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to DNA consisting of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19. Wherein the amino acid encoded by the codon consisting of nucleotides 2224 to 2226 and the amino acid encoded by the codon consisting of nucleotides 2227 to 2229 in the nucleotide sequence are conserved, and primer extension activity, template A protein having at least one of binding activity to a primer annealed to DNA and PCR performance higher than Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

(a)の配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がアルギニンに、743位のアラニンがアルギニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742R743R又はTaqRR)である。配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の743位のアラニンがアルギニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742E743R又はTaqER)である。配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がアラニンに、743位のアラニンがアルギニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742A743R又はTaqAR)である。配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がアラニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742A743A又はTaqAA)である。配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がアルギニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742R743A又はTaqRA)である。配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がアルギニンに、743位のアラニンがリシンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742R743K又はTaqRK)である。配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がリシンに、743位のアラニンがアルギニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742K743R又はTaqKR)である。配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がリシンに、743位のアラニンがリシンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742K743K又はTaqKK)である。配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がグルタミンに、743位のアラニンがチロシンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742Q743Y又はTaqQY)である。 The protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in (a) is a modified Taq polymerase (742R743R or TaqRR) in which the glutamic acid at position 742 of the amino acid of SEQ ID NO: 2 is replaced with arginine and the alanine at position 743 is replaced with arginine. The protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is a modified Taq polymerase (742E743R or TaqER) in which the alanine at position 743 of the amino acid of SEQ ID NO: 2 is substituted with arginine. The protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 is a modified Taq polymerase (742A743R or TaqAR) in which the glutamic acid at position 742 of the amino acid of SEQ ID NO: 2 is replaced with alanine and the alanine at position 743 is replaced with arginine. The protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 is a modified Taq polymerase (742A743A or TaqAA) in which the glutamic acid at position 742 of the amino acid of SEQ ID NO: 2 is substituted with alanine. The protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is a modified Taq polymerase (742R743A or TaqRA) in which the glutamic acid at position 742 of the amino acid of SEQ ID NO: 2 is replaced with arginine. The protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 is a modified Taq polymerase (742R743K or TaqRK) in which the glutamic acid at position 742 of the amino acid of SEQ ID NO: 2 is replaced with arginine and the alanine at position 743 is replaced with lysine. The protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 is a modified Taq polymerase (742K743R or TaqKR) in which the glutamic acid at position 742 of the amino acid of SEQ ID NO: 2 is replaced with lysine and the alanine at position 743 is replaced with arginine. The protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 is a modified Taq polymerase (742K743K or TaqKK) in which the glutamic acid at position 742 of the amino acid of SEQ ID NO: 2 is replaced with lysine and the alanine at position 743 is replaced with lysine. The protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 is a modified Taq polymerase (742Q743Y or TaqQY) in which the glutamic acid at position 742 of the amino acid of SEQ ID NO: 2 is replaced with glutamine and the alanine at position 743 is replaced with tyrosine.

(b)のタンパク質は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかのアミノ酸配列において、742位と743位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数及び位置は特に限定されるものではない。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は、欠失に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個であり、置換に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個であり、付加に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
プライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能については前述の通りである。 The protein of (b) has one or several amino acids other than the amino acids at positions 742 and 743 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 or 20. It consists of an amino acid sequence that is deleted, substituted, or added. The total number and position of amino acids to be deleted, substituted or added are not particularly limited. The total number of amino acids to be deleted, substituted or added is 1 or more, preferably 1 or several, and the specific range thereof is usually 1 to 10, preferably 1 to 5 for deletion, More preferably, the number is 1 to 2, the substitution is usually 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2, and the addition is usually 1 to 10, preferably 1 to 5. The number is more preferably 1-2.
The primer extension activity, the binding activity to the primer annealed to the template DNA, and the PCR performance are as described above.

(c)のタンパク質は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されており、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い。「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。 The protein of (c) hybridizes under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA consisting of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19. A protein encoded by DNA, wherein the amino acid encoded by the codon consisting of nucleotides 2224 to 2226 and the amino acid encoded by the codon consisting of nucleotides 2227 to 2229 in the nucleotide sequence are conserved, and a primer At least one of the extension activity, the binding activity to the primer annealed to the template DNA, and the PCR performance is higher than that of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Examples of “stringent conditions” include conditions of 42 ° C., 2 × SSC and 0.1% SDS, preferably 65 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS.

配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、それぞれ、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡと少なくとも８８％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
プライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能については前述の通りである。 DNAs that hybridize under stringent conditions with DNA complementary to the DNA comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19 No. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19 DNA having a nucleotide sequence of at least 88%, preferably 90% or more, more preferably 95% or more DNA is mentioned.
The primer extension activity, the binding activity to the primer annealed to the template DNA, and the PCR performance are as described above.

本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、さらに、配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの667位のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異が導入されたものであってもよい。配列番号２のアミノ酸配列中の667位のフェニルアラニンをチロシンに置換することにより、ジデオキシヌクレオチドを取り込む能力を高めることができる。 The modified Taq polymerase of the present invention may further have a mutation in which phenylalanine at position 667 of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with tyrosine. By replacing phenylalanine at position 667 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with tyrosine, the ability to incorporate dideoxynucleotides can be enhanced.

また、本発明は、上記の改変ＴａｑポリメラーゼのN末端から280位までのアミノ酸を除くアミノ酸配列からなる改変Ｔａｑポリメラーゼの断片も提供する。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０のアミノ酸配列において、N末端から280位のアミノ酸までのアミノ酸配列は、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有する領域である。しかし、Ｔａｑポリメラーゼにおける5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有する領域は、N末端から280位のアミノ酸までのアミノ酸配列に限定されるわけではなく、ＴａｑポリメラーゼのN末端から280位の前後10個までのアミノ酸を除くアミノ酸配列からなる改変Ｔａｑポリメラーゼの断片も本発明に包含される。この断片をファミリーＢ型ポリメラーゼと組合わせて用いることにより、より高い正確性と生産性でＤＮＡを増幅することができる。5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させるとプライマーの5’末端が削られた増幅産物が得られることを防ぐ事ができ、PCRによって、きっちりプライマーの末端から末端までのDNA断片をえることができる。 The present invention also provides a fragment of the modified Taq polymerase comprising the amino acid sequence excluding the amino acid from the N-terminal to the 280th position of the modified Taq polymerase. In the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20, the amino acid sequence from the N-terminal to the 280th amino acid is a region having 5'-3 'exonuclease activity It is. However, the region having 5′-3 ′ exonuclease activity in Taq polymerase is not limited to the amino acid sequence from the N-terminal to the 280th amino acid, but up to about 10 before and after the 280th position from the N-terminal of Taq polymerase. Fragments of modified Taq polymerase consisting of an amino acid sequence excluding these amino acids are also encompassed by the present invention. By using this fragment in combination with Family B type polymerase, DNA can be amplified with higher accuracy and productivity. Deletion of 5'-3 'exonuclease activity can prevent the amplification product with the 5' end of the primer from being cut off, and PCR provides a DNA fragment from the end to the end of the primer. Can do.

本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、糖鎖が付加されたタンパク質又は糖鎖が付加されていないタンパク質のいずれであってもよい。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、それらの塩であってもよい。
本発明は、上記の改変Ｔａｑポリメラーゼ又はその断片をコードするＤＮＡも提供する。 The modified Taq polymerase of the present invention may be either a protein with a sugar chain added or a protein without a sugar chain added. The type, position, etc. of the sugar chain added to the protein vary depending on the type of host cell used in the production of the protein, but any host cell can be used for the protein with the added sugar chain. Protein is also included. In addition, the modified Taq polymerase of the present invention may be a salt thereof.
The present invention also provides DNA encoding the modified Taq polymerase or a fragment thereof.

本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡは、ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡ（配列番号２）に、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得ることができる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Mutant-K（TAKARA社製）、Mutant-G（TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。 The DNA encoding the modified Taq polymerase of the present invention can be obtained by artificially introducing a mutation into the DNA encoding the Taq polymerase (SEQ ID NO: 2) using a known method such as site-directed mutagenesis. Can do. Mutation can be introduced, for example, using a mutation introduction kit such as Mutant-K (TAKARA), Mutant-G (TAKARA), or TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis series kit.

ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号１のヌクレオチド配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得ることができる。
本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡは、オープンリーディングフレームとその３'末端に位置する終止コドンとを含む。また、本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡは、オープンリーディングフレームの５'末端及び／又は３'末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。 For example, DNA encoding Taq polymerase can be obtained by preparing a cDNA library using mRNA extracted from Thermus aquaticus, and using a probe synthesized based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, It can be obtained by screening a clone containing the target DNA from the rally.
The DNA encoding the modified Taq polymerase of the present invention comprises an open reading frame and a stop codon located at the 3 ′ end thereof. In addition, the DNA encoding the modified Taq polymerase of the present invention can contain an untranslated region (UTR) at the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the open reading frame.

本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡが挙げられる。ここで、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９記載のヌクレオチド配列のうち、オープンリーディングフレームは１〜２４９６番目、翻訳開始コドンは１〜３番目、終止コドンは２４９７〜２４９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に位置する。本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は、本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼをコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のヌクレオチド配列のうち、１〜２４９６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に限定されるものではない。 Examples of the DNA encoding the modified Taq polymerase of the present invention include DNA containing DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19. Here, among the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19, the open reading frame is 1 to 2496, the translation initiation codon is 1 to 3, and the stop codon is It is located in the nucleotide sequence consisting of nucleotides 2497 to 2499. The nucleotide sequence of the DNA encoding the modified Taq polymerase of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the modified Taq polymerase of the present invention, and the nucleotide sequence of the open reading frame is SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 , 11, 13, 15, 17 or 19 is not limited to the nucleotide sequence consisting of the 1st to 2496th nucleotides.

本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されているＤＮＡが挙げられる。「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。 The DNA encoding the modified Taq polymerase of the present invention includes a DNA complementary to a DNA comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19 and a stringent DNA. DNA that hybridizes under conditions, wherein the amino acid encoded by the codon consisting of nucleotides 2224 to 2226 and the amino acid encoded by the codon consisting of nucleotides 2227 to 2229 in the nucleotide sequence are conserved DNAs Can be mentioned. Examples of “stringent conditions” include conditions of 42 ° C., 2 × SSC and 0.1% SDS, preferably 65 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS.

配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、それぞれ、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡと少なくとも８８％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ及びその断片は、例えば、以下の組換えベクター及び形質転換体を作製する工程、形質転換体を培養する工程、並びにタンパク質を精製する工程に従って、それぞれをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより製造することができる。 DNAs that hybridize under stringent conditions with DNA complementary to the DNA comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19 No. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 19 DNA having a nucleotide sequence of at least 88%, preferably 90% or more, more preferably 95% or more DNA is mentioned.
The modified Taq polymerase and fragments thereof of the present invention can be prepared by, for example, using the following recombinant vectors and transformants, culturing the transformants, and purifying the proteins according to the DNA encoding the respective hosts. It can be produced by expressing in cells.

〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、まず、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。目的とするタンパク質のコード領域のヌクレオチド配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、ヌクレオチドを置換してもよい。 [Production of recombinant vector and transformant]
When preparing a recombinant vector, first, a DNA fragment of an appropriate length containing the coding region of the target protein is prepared. Nucleotides may be substituted in the nucleotide sequence of the coding region of the protein of interest so as to be the optimal codon for expression in the host cell.

次いで、上記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換えベクターを作製する。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有することができる。 Next, the above DNA fragment is inserted downstream of the promoter of an appropriate expression vector to prepare a recombinant vector. The DNA fragment needs to be incorporated into a vector so that its function is exhibited. The vector is not only a promoter but also a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker (for example, dihydro A folate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene), a ribosome binding sequence (SD sequence), and the like.

目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体は、組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。 A transformant capable of producing the target protein can be obtained by introducing a recombinant vector into an appropriate host cell.

発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）を使用することができ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）等を使用することができ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを使用することができる。 The expression vector is not particularly limited as long as it can replicate autonomously in a host cell, and for example, a plasmid vector, a phage vector, a virus vector and the like can be used. Examples of plasmid vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pRSET, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5), and plasmids derived from yeast (eg, YEp13 YEp24, YCp50) can be used, and as phage vectors, for example, λ phages (for example, Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP) and the like can be used. For example, animal viruses such as retroviruses and vaccinia viruses, and insect viruses such as baculoviruses can be used.

宿主細胞としては、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。 As a host cell, any of prokaryotic cells, yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like may be used as long as the DNA encoding the target protein can be expressed. Moreover, you may use an animal individual, a plant individual, a silkworm body, etc.

細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用することができる。具体的には、Escherichia coli BL21、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli K12、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101等の大腸菌、Bacillus subtilis MI 114、Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、Ｐ_Lプロモーター、Ｐ_Rプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用することができる。また、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用することができる。 When a bacterium is used as a host cell, for example, Escherichia genus such as Escherichia coli, Bacillus genus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas genus such as Pseudomonas putida, Rhizobium meriroti ( Rhizobium meliloti) and other bacteria belonging to the genus Rhizobium can be used as host cells. Specifically, Escherichia coli BL21, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli K12, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, etc., Bacillus subtilis MI 114, Bacillus subtilis 207-21 Bacillus subtilis such as can be used as a host cell. The promoter of the case is not particularly limited as long as it can be expressed in bacteria such as Escherichia coli, for example, using a promoter derived from the trp promoter, lac promoter, P _L promoter, P _R promoter of Escherichia coli or phage, etc. can do. In addition, artificially designed and modified promoters such as tac promoter, lacT7 promoter, and let I promoter can also be used.

細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。 The method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions, an electroporation method, or the like can be used.

酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を使用することができる。 When yeast is used as a host cell, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, etc. can be used as host cells. The promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast. For example, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter Etc. can be used.

酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用することができる。
動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTR(Long Terminal Repeat)プロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用することができる。 The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing DNA into yeast. For example, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, or the like can be used.
When animal cells are used as host cells, monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), mouse L cells, rat GH3, human FL cells, and the like can be used as host cells. The promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in animal cells. For example, SRα promoter, SV40 promoter, LTR (Long Terminal Repeat) promoter, CMV promoter, human cytomegalovirus early gene promoter, etc. Can be used.

動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用することができる。
昆虫細胞を宿主とする場合には、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用することができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等を使用することができる。 The method for introducing the recombinant vector into the animal cell is not particularly limited as long as it can introduce DNA into the animal cell. For example, an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method, or the like can be used.
When insect cells are used as hosts, Spodoptera frugiperda ovary cells, Trichoplusia ni ovary cells, cultured cells derived from silkworm ovary, etc. can be used as host cells. Spodoptera frugiperda ovarian cells such as Sf9 and Sf21, Trichoplusia ni ovarian cells such as High 5, BTI-TN-5B1-4 (manufactured by Invitrogen), and silkworm ovary-derived cultured cells such as Bombyx mori N4 can do.

昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。 The method for introducing a recombinant vector into insect cells is not particularly limited as long as DNA can be introduced into insect cells, and for example, calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like can be used.

〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌、酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地及び合成培地のいずれを使用してもよい。 [Culture of transformants]
A transformant into which a recombinant vector incorporating a DNA encoding the target protein has been introduced is cultured. The transformant can be cultured according to a usual method used for culturing host cells.
As a medium for cultivating transformants obtained by using microorganisms such as E. coli and yeast as host cells, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms, so that transformants can be cultured efficiently. As long as it is a medium that can be used, any of natural and synthetic media may be used.

炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用することができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用することができる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用することができる。 As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used. As the nitrogen source, use ammonium salt of inorganic acid or organic acid such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, etc. Can do. As the inorganic salt, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.

大腸菌、酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体の培養は、例えば、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は通常２５〜３７℃、培養時間は通常１２〜４８時間であり、培養期間中はｐＨを通常６〜８に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 Culture of transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as host cells can be performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture. The culture temperature is usually 25 to 37 ° C., the culture time is usually 12 to 48 hours, and the pH is usually maintained at 6 to 8 during the culture period. The pH can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like. When culturing, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、Ham F12培地、Ham F12K培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で３〜１０日間行う。培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter, and indole acrylic is used when a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter is cultured. An acid or the like may be added to the medium.
As a medium for culturing a transformant obtained by using animal cells as host cells, generally used RPMI1640 medium, Eagle's MEM medium, DMEM medium, Ham F12 medium, Ham F12K medium, fetal bovine serum, etc. Can be used. The transformant is usually cultured at 37 ° C. for 3 to 10 days in the presence of 5% CO ₂ . When culturing, antibiotics such as kanamycin, penicillin, streptomycin and the like may be added to the medium as necessary.

昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、Sf-900 II SFM培地（Gibco BRL社製）、ExCell400、ExCell405（JRHバイオサイエンシーズ社製）等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常、２７℃で３〜１０日間行う。培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 As a medium for culturing a transformant obtained by using insect cells as host cells, commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Gibco BRL), ExCell400 ExCell405 (manufactured by JRH Biosciences) or the like can be used. The transformant is usually cultured at 27 ° C. for 3 to 10 days. When culturing, an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium as necessary.

目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させてもよい。融合させるタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン等を使用することができる。 The protein of interest may be expressed as a secreted protein or a fusion protein. Examples of proteins to be fused include β-galactosidase, protein A, IgG binding region of protein A, chloramphenicol acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose binding protein, glutathione S- A transferase, a polyhistidine chain (His-tag), an S peptide, a DNA-binding protein domain, a Tac antigen, thioredoxin, green fluorescent protein, and the like can be used.

〔タンパク質の単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。 [Isolation and purification of protein]
The target protein is obtained by collecting the target protein from the culture of the transformant. Here, the “culture” includes any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, cells or disrupted cells.
If the target protein accumulates in the cells of the transformant, the culture is centrifuged to collect the cells in the culture, wash the cells, disrupt the cells, Extract the protein to be used. When the target protein is secreted outside the transformant, the culture supernatant is used as it is, or cells or cells are removed from the culture supernatant by centrifugation or the like.

得られたタンパク質は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製することができる。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ及びその断片は、そのアミノ酸配列に基づいて、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。この際、市販のペプチド合成機を使用することができる。 The obtained protein was extracted using a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylaminoethyl (DEAE) -sepharose, an ion exchange chromatography method, a hydrophobic chromatography method, a gel filtration method, It can be purified by affinity chromatography or the like.
The modified Taq polymerase and fragment thereof of the present invention can be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) based on the amino acid sequence. it can. At this time, a commercially available peptide synthesizer can be used.

本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ及びその断片は、ＤＮＡ増幅（特に、ＰＣＲ）を行う際に有用であり、ＤＮＡ増幅（特に、ＰＣＲ）用キットの構成要素として使用することができる。ＤＮＡ増幅（特に、ＰＣＲ）用キットは、本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ又はその断片以外に、ＤＮＡ増幅（特に、ＰＣＲ）を行うために必要な試薬（例えば、４種類のdNTPs、Mg²⁺、バッファー、添加剤など）、容器、装置等を含むことができる。本発明のＤＮＡ増幅方法及びキットは、ＤＮＡ配列決定、遺伝子診断、親子鑑定や犯罪捜査における個体識別、品種判定、体質調査のためのSNP(一塩基多型)解析、遺跡調査など幅広い用途に適している。 The modified Taq polymerase and fragments thereof of the present invention are useful when performing DNA amplification (especially PCR), and can be used as components of kits for DNA amplification (particularly PCR). In addition to the modified Taq polymerase of the present invention or a fragment thereof, a kit for DNA amplification (especially PCR) includes reagents necessary for DNA amplification (especially PCR) (for example, four types of dNTPs, Mg ²⁺ , buffer) , Additives, etc.), containers, devices, and the like. The DNA amplification method and kit of the present invention are suitable for a wide range of uses such as DNA sequencing, genetic diagnosis, individual identification in criminal investigation and criminal investigation, variety determination, SNP (single nucleotide polymorphism) analysis for constitution survey, ruins investigation, etc. ing.

一般に、Ｔａｑポリメラーゼは、ＤＮＡ増幅反応中に誤ったヌクレオチドの取り込みを検出・修復する能力に欠けるため、誤って取り込まれたヌクレオチドを取り除くことができず、ＤＮＡ増幅のエラーの確率が高くなる。さらに、増幅中に誤って取り込まれたヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を妨げ、短い増幅産物しか得られない場合もある。ＤＮＡ増幅の高い正確性が要求される増幅産物のクローニングやシークエンスなどには、プルーフリーディング活性を持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用するとよい。プルーフリーディング活性を持つＤＮＡポリメラーゼは3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有するので、誤って取り込まれたヌクレオチドを取り除くことができる。ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼは、プルーフリーディング（3’-5’エキソヌクレアーゼ）活性を有するので、本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ又はその断片と組合わせてＤＮＡ増幅に用いることにより、ＤＮＡ増幅の正確性を高めることができる。ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼとしては、Pfu DNAポリメラーゼ（Pyrococcus furiosus由来）、KOD DNAポリメラーゼ（Thermococcus kodakaraensis 由来）、Vent DNAポリメラーゼ（Thermococcus litoralis由来）などを例示することができるが、これらに限定されることはない。本発明のＤＮＡ増幅方法及びキットには、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼを含めてもよい。 In general, Taq polymerase lacks the ability to detect and repair erroneous nucleotide incorporation during a DNA amplification reaction, and thus cannot remove erroneously incorporated nucleotides, increasing the probability of DNA amplification errors. Furthermore, nucleotides mistakenly incorporated during amplification interfere with the extension reaction by DNA polymerase, and only a short amplification product may be obtained. A thermostable DNA polymerase having a proofreading activity may be used for cloning or sequencing of amplification products that require high accuracy of DNA amplification. Since a DNA polymerase having proofreading activity has 3'-5 'exonuclease activity, nucleotides incorporated by mistake can be removed. Family B type DNA polymerases have proofreading (3'-5 'exonuclease) activity, and therefore, when used in combination with the modified Taq polymerase of the present invention or a fragment thereof, DNA amplification accuracy is improved. be able to. Examples of the family B type DNA polymerase include Pfu DNA polymerase (derived from Pyrococcus furiosus), KOD DNA polymerase (derived from Thermococcus kodakaraensis), Vent DNA polymerase (derived from Thermococcus litoralis) and the like, but are not limited to these. Absent. Family B type DNA polymerase may be included in the DNA amplification method and kit of the present invention.

以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに何ら影響されることはない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the scope of the present invention is not affected by these.

〔実施例１〕変異Ｔａｑポリメラーゼの作製
Taqポリメラーゼ変異体（TaqRR, TaqER, TaqAR, TaqAA, TaqRA, TaqRK, TaqKR, TaqKK, TaqQY）の作成は、pTV118N(タカラバイオ社製)のLacプロモーターの下流のNco I制限酵素サイトにTaqポリメラーゼの遺伝子が挿入されたpTV-Taqプラスミドおよび下記のプライマーを用いて、ストラタジーン社のQuick Change site-directed mutagenesis kitのプロトコールにしたがって部位特異的変異を行った。変異プラスミドを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、生じたコロニーから変異プラスミドを調製し、塩基配列を調べることにより変異が導入されていることを確認した。 [Example 1] Production of mutant Taq polymerase
Taq polymerase mutants (TaqRR, TaqER, TaqAR, TaqAA, TaqRA, TaqRK, TaqKR, TaqKK, TaqQY) were created by the Taq polymerase gene at the Nco I restriction enzyme site downstream of the Lac promoter of pTV118N (Takara Bio). Using the pTV-Taq plasmid into which was inserted and the following primers, site-specific mutagenesis was performed according to the protocol of the Stratagene Quick Change site-directed mutagenesis kit. Escherichia coli JM109 was transformed with the mutant plasmid, a mutant plasmid was prepared from the resulting colonies, and the nucleotide sequence was examined to confirm that the mutation was introduced.

それぞれの変異プラスミドを用いて大腸菌JM109株を形質転換した。生じたコロニーをLB-アンピシリン液体培地で600 nmにおける吸光度が0.2から0.4になるまで培養し、IPGTを1 mMになるように添加し、25℃で16時間ポリメラーゼを産生させた。菌体を50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1 mM EDTAに懸濁し、超音波処理を行った。遠心分離後、上清を75℃で1時間熱処理を行った。遠心分離後、上清に1 MになるようにNaClを加え、さらに、0.15％になるように5%ポリエチレンイミン溶液pH8.0を加え、0℃で1時間処理し、DNAを沈殿させた。遠心分離後、上清に100%飽和となるように固形硫安を加え、生じた沈殿を粗Taqポリメラーゼとした。 Each mutant plasmid was used to transform Escherichia coli JM109 strain. The resulting colonies were cultured in LB-ampicillin liquid medium until the absorbance at 600 nm was 0.2 to 0.4, IPGT was added to 1 mM, and polymerase was produced at 25 ° C. for 16 hours. The cells were suspended in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, and sonicated. After centrifugation, the supernatant was heat treated at 75 ° C. for 1 hour. After centrifugation, NaCl was added to the supernatant to 1 M, and 5% polyethyleneimine solution pH 8.0 was added to 0.15%, followed by treatment at 0 ° C. for 1 hour to precipitate DNA. After centrifugation, solid ammonium sulfate was added to the supernatant to 100% saturation, and the resulting precipitate was used as crude Taq polymerase.

粗Taqポリメラーゼを50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 0.5 M NaCl溶液に透析した。沈殿を遠心分離により除去した後、上清を0.1 M K-phosphate, pH 7.8, 1 M硫安で平衡化したHiTrap Phenylカラムにアプライした。0.1 M K-phosphate, pH 7.8でカラムを洗浄した後、変異Taq ポリメラーゼをミリQ水で溶出した。この溶液を、50 mM Tris-HCl, pH 7.8で平衡化したHiTrap Heparinカラムにアプライした。変位Taqポリメラーゼの溶出はNaCl濃度を0から2 M NaClの直線的溶出で行った。変位Taqポリメラーゼの同定は、SDS-PAGEおよびヌクレオチド取り込みによるDNAポリメラーゼ活性測定により行った。 Crude Taq polymerase was dialyzed against 50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 0.5 M NaCl solution. After removing the precipitate by centrifugation, the supernatant was applied to a HiTrap Phenyl column equilibrated with 0.1 M K-phosphate, pH 7.8, 1 M ammonium sulfate. After washing the column with 0.1 M K-phosphate, pH 7.8, the mutant Taq polymerase was eluted with milliQ water. This solution was applied to a HiTrap Heparin column equilibrated with 50 mM Tris-HCl, pH 7.8. Displacement Taq polymerase was eluted by linear elution with a NaCl concentration of 0 to 2 M NaCl. The displacement Taq polymerase was identified by SDS-PAGE and measurement of DNA polymerase activity by nucleotide incorporation.

〔実施例２〕デオキシヌクレオチドの取り込み活性測定による変異Ｔａｑポリメラーゼの評価
デオキシヌクレオチド取り込みによるポリメラーゼの活性測定は20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl₂, 14 mM 2-メルカプトエタノール, 0.2 mg/ml 活性化DNA, [³H]TTPを含む0.2 mM dNTPの反応系に変異Taqポリメラーゼを加え、74℃で反応をおこなった。反応液をDE81濾紙にスポットし、乾燥後、未反応の[³H]TTPを5%リン酸二ナトリウム溶液で洗浄した。DE81濾紙を乾燥した後、取り込まれた[³H]TTPを液体シンチレーションカウンターで測定した。ユニットの定義は、74℃で30分間に10 nmolのdNTPを取り込む量を1ユニットとした。 [Example 2] Evaluation of mutant Taq polymerase by measuring deoxynucleotide uptake activity Measurement of polymerase activity by deoxynucleotide uptake was 20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl ₂ , 14 mM 2-mercaptoethanol, 0.2 mg / Mutant Taq polymerase was added to a reaction system of 0.2 mM dNTP containing ml activated DNA and [ ³ H] TTP, and the reaction was carried out at 74 ° C. The reaction solution was spotted on DE81 filter paper, and after drying, unreacted [ ³ H] TTP was washed with 5% disodium phosphate solution. After drying the DE81 filter paper, the incorporated [ ³ H] TTP was measured with a liquid scintillation counter. The unit was defined as one unit, which was taken up at 10 ° C. for 30 minutes at 74 ° C. for 30 minutes.

その結果、表に示したように、Taqポリメラーゼが5.1 x 10⁵U/mg、TaqRRが1.3 x 10⁵U/mg、TaqERが1.4 x 10⁵U/mg、TaqARが1.1 x 10⁵U/mg、TaqAAが2.8 x 10⁵U/mg、TaqRAが2.3 x 10⁵U/mg、TaqRKが1.5 x 10⁵ U/mg、TaqKRが1.1 x 10⁵U/mg、TaqKKが1.4 x 10⁵U/mg、TaqQYが4.7 x 10⁵U/mgであった。 As a result, as shown in the table, Taq polymerase was 5.1 x 10 ⁵ U / mg, TaqRR was 1.3 x 10 ⁵ U / mg, TaqER was 1.4 x 10 ⁵ U / mg, TaqAR was 1.1 x 10 ⁵ U / mg , TaqAA 2.8 x 10 ⁵ U / mg, TaqRA 2.3 x 10 ⁵ U / mg, TaqRK 1.5 x 10 ⁵ U / mg, TaqKR 1.1 x 10 ⁵ U / mg, TaqKK 1.4 x 10 ⁵ U / mg TaqQY was 4.7 × 10 ⁵ U / mg.

また、精製した変異TaqポリメラーゼをSDS-PAGEに供した後、CBB（クマシーブリリアントブルー）染色した結果を図1に示す。 Further, FIG. 1 shows the result of subjecting the purified mutant Taq polymerase to SDS-PAGE and then staining with CBB (Coomassie Brilliant Blue).

〔実施例３〕プライマー伸長活性測定による変異Ｔａｑポリメラーゼの評価
配列番号３９の環状鋳型DNA(aacatccaataaatcatacaggcaaggcaaagaattagcaaaattaagcaataaagcctcagagcataaagctaaatcggttgtaccaaaaacattatgaccctgtaatacttttgcgggagaagcctttatttcaacgcaaggataaaaatttttagaaccctcatatattttaaatgcaatgcctgagtaatgtgtaggtaaagattcaaaagggtgagaaaggccggagacagtcaaatcaccatcaatatgatattcaaccgttctagctgataaattaatgccggagagggtagctatttttgagagatctacaaaggctatcaggtcattgcctgagagtctggagcaaacaagagaatcgatgaacggtaatcgtaaaactagcatgtcaatcatatgtaccccggttgataatcagaaaagccccaaaaacaggaagattgtataagcaaatatttaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggaacgccatcaaaaataattcgcgtctggccttcctgtagccagctttcatcaacattaaatgtgagcgagtaacaacccgtcggattctccgtgggaacaaacggcggattgaccgtaatgggataggttacgttggtgtagatgggcgcatcgtaaccgtgcatctgccagtttgaggggacgacgaccgtatcggcctcaggaagatcgcactccagccagctttccggcaccgcttctggtgccggaaaccaggcaaagcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagcgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacccaaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtactatggttgctttgacgagcacgtataacgtgctttcctcgttggaatcagagcgggagctaaacaggaggccgattaaagggattttagacaggaacggtacgccagaatcttgagaagtgtttttataatcagtgaggccaccgagtaaaagagtctgtccatcacgcaaattaaccgttgtagcaatacttctttgattagtaataacatcacttgcctgagtagaagaactcaaactatcggccttgctggtaatatccagaacaatattaccgccagccattgcaacaggaaaaacgctcatggaaatacctacattttgacgctcaatcgtctgaaatggattatttacattggcagattcaccagtcacacgaccagtaataaaagggacattctggccaacagagatagaacccttctgacctgaaagcgtaagaatacgtggcacagacaatatttttgaatggctattagtctttaatgcgcgaactgatagccctaaaacatcgccattaaaaataccgaacgaaccaccagcagaagataaaacagaggtgaggcggtcagtattaacaccgcctgcaacagtgccacgctgagagccagcagcaaatgaaaaatctaaagcatcaccttgctgaacctcaaatatcaaaccctcaatcaatatctggtcagttggcaaatcaacagtagaaaggaattgaggaaggttatctaaaatatctttaggtgcactaacaactaatagattagagccgtcaatagataatacatttgaggatttagaagtattagactttacaaacaattcgacaactcgtattaaatcctttgcccgaacgttattaattttaaaagtttgagtaacattatcattttgcggaacaaagaaaccaccagaaggagcggaattatcatcatattcctgattatcagatgatggcaattcatcaatataatcctgattgtttggattatacttctgaattatggaaggaattgaaccaaccatatcaaaattattagcacgtaaaacagaaataaagaaattgcgtagattttcaggtttaacgtcagatgaatatacagtaacagtaccttttacatcgggagaaacaataacggattcgcctgattgctttgaataccaagttacaaaatcgcgcagaggcgaattattcatttcaattacctgagcaaaagaagatgatgaaacaaacatcaagaaaacaaaattaattacatttaacaatttcatttgaattaccttttttaatggaaacagtacataaatcaatatatgtgagtgaataaccttgcttctgtaaatcgtcgctattaattaattttcccttagaatccttgaaaacatagcgatagcttagattaagacgctgagaagagtcaatagtgaatttatcaaaatcataggtctgagagactacctttttaacctccggcttaggttgggttatataactatatgtaaatgctgatgcaaatccaatcgcaagacaaagaacgcgagaaaactttttcaaatatattttagttaatttcatcttctgacctaaatttaatggtttgaaataccgaccgtgtgataaataaggcgttaaataagaataaacaccggaatcataattactagaaaaagcctgtttagtatcatatgcgttatacaaattcttaccagtataaagccaacgctcaacagtagggcttaattgagaatcgccatatttaacaacgccaacatgtaatttaggcagaggcattttcgagccagtaataagagaatataaagtaccgacaaaaggtaaagtaattctgtccagacgacgacaataaacaacatgttcagctaatgcagaacgcgcctgtttatcaacaatagataagtcctgaacaagaaaaataatatcccatcctaatttacgagcatgtagaaaccaatcaataatcggctgtctttccttatcattccaagaacgggtattaaaccaagtaccgcactcatcgagaacaagcaagccgtttttattttcatcgtaggaatcattaccgcgcccaatagcaagcaaatcagatatagaaggcttatccggtattctaagaacgcgaggcgttttagcgaacctcccgacttgcgggaggttttgaagccttaaatcaagattagttgctattttgcacccagctacaattttatcctgaatcttaccaacgctaacgagcgtctttccagagcctaatttgccagttacaaaataaacagccatattatttatcccaatccaaataagaaacgattttttgtttaacgtcaaaaatgaaaatagcagcctttacagagagaataacataaaaacagggaagcgcattagacgggagaattaactgaacaccctgaacaaagtcagagggtaattgagcgctaatatcagagagataacccacaagaattgagttaagcccaataataagagcaagaaacaatgaaatagcaatagctatcttaccgaagccctttttaagaaaagtaagcagatagccgaacaaagttaccagaaggaaaccgaggaaacgcaataataacggaatacccaaaagaactggcatgattaagactccttattacgcagtatgttagcaaacgtagaaaatacatacataaaggtggcaacatataaaagaaacgcaaagacaccacggaataagtttattttgtcacaatcaatagaaaattcatatggtttaccagcgctaaagacaaaagggcgacattcaaccgattgagggagggaaggtaaatattgacggaaattattcattaaaggtgaattatcaccgtcaccgacttgagccatttgggaattagagccagcaaaatcaccagtagcaccattaccattagcaaggccggaaacgtcaccaatgaaaccatcgatagcagcaccgtaatcagtagcgacagaatcaagtttgcctttagcgtcagactgtagcgcgttttcatcggcattttcggtcatagcccccttattagcgtttgccatcttttcataatcaaaatcaccggaaccagagccaccaccggaaccgcctccctcagagccgccaccctcagaaccgccaccctcagagccaccaccctcagagccgccaccagaaccaccaccagagccgccgccagcattgacaggaggttgaggcaggtcagacgattggccttgatattcacaaacgaatggatcttcattaaagccagaatggaaagcgcagtctctgaatttaccgttccagtaagcgtcatacatggcttttgatgatacaggagtgtactggtaataagttttaacggggtcagtgccttgagtaacagtgcccgtataaacagttaatgccccctgcctatttcggaacctattattctgaaacatgaaagtattaagaggctgagactcctcaagagaaggattaggattagcggggttttgctcagtaccaggcggataagtgccgtcgagagggttgatataagtatagcccggaataggtgtatcaccgtactcaggaggtttagtaccgccaccctcagaaccgccaccctcagaaccgccaccctcagagccaccaccctcattttcagggatagcaagcccaataggaacccatgtaccgtaacactgagtttcgtcaccagtacaaactacaacgcctgtagcattccacagacaaccctcatagttagcgtaacgatctaaagttttgtcgtctttccagacgttagtaaatgaattttctgtatggggttttgctaaacaactttcaacagtttcagcggagtgagaatagaaaggaacaactaaaggaattgcgaataataattttttcacgttgaaaatctccaaaaaaaaaggctccaaaaggagcctttaattgtatcggtttatcagcttgctttcgaggtgaatttcttaaacagcttgataccgatagttgcgccgacaatgacaacaaccatcgcccacgcataaccgatatattcggtcgctgaggcttgcagggagttaaaggccgcttttgcgggatcgtcaccctcagcagcgaaagacagcatcggaacgagggtagcaacggctacagaggctttgaggactaaagactttttcatgaggaagtttccattaaacgggtaaaatacgtaatgccactacgaaggcaccaacctaaaacgaaagaggcgaaagaatacactaaaacactcatctttgacccccagcgattataccaagcgcgaaacaaagtacaacggagatttgtatcatcgcctgataaattgtgtcgaaatccgcgacctgctccatgttacttagccggaacgaggcgcagacggtcaatcataagggaaccgaactgaccaactttgaaagaggacagatgaacggtgtacagaccaggcgcataggctggctgaccttcatcaagagtaatcttgacaagaaccggatattcattacccaaatcaacgtaacaaagctgctcattcagtgaataaggcttgccctgacgagaacaccagaacgagtagtaaattgggcttgagatggtttaatttcaactttaatcattgtgaattaccttatgcgattttaagaactggctcattataccagtcaggacgttgggaagaaaaatctacgttaataaaacgaactaacggaacaacattattacaggtagaaagattcatcagttgagatttaggaataccacattcaactaatgcagatacataacgccaaaaggaattacgaggcatagtaagagcaacactatcataaccctcgtttaccagacgacgataaaaaccaaaatagcgagaggcttttgcaaaagaagttttgccagagggggtaatagtaaaatgtttagactggatagcgtccaatactgcggaatcgtcataaatattcattgaatccccctcaaatgctttaaacagttcagaaaacgagaatgaccataaatcaaaaatcaggtctttaccctgactattatagtcagaagcaaagcggattgcatcaaaaagattaagaggaagcccgaaagacttcaaatatcgcgttttaattcgagcttcaaagcgaaccagaccggaagcaaactccaacaggtcaggattagagagtacctttaattgctccttttgataagaggtcatttttgcggatggcttagagcttaattgctgaatctggtgctgtagctcaacatgttttaaatatgcaactaaagtacggtgtctggaagtttcattccatgtaacagttgattcccaattctgcgaacgagtagatttagtttgaccattagatacatttcgcaaatggtcaataacctgtttagctatattttcatttggggcgcgagctgaaaaggtggcatcaattctactaatagtagtagcatt)に配列番号４０(tcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattc)の5'末端を放射標識化したプライマーをアニールさせたプライムドDNA(0.05 pmol)を含む20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl₂, 14 mM 2-メルカプトエタノール反応溶液に変異Taqポリメラーゼを加え、74℃で5分間反応した。合成されたDNAを50 mM NaOH, 1 mM EDTAを含む1％アガロースゲルで泳動させ、ゲルを乾燥した後、オートラジオグラフィーにより検出した。 [Example 3] Evaluation of mutant Taq polymerase by measuring primer extension activity Primed DNA (0.05 pmol) obtained by annealing a primer obtained by radiolabeling the 5 'end of SEQ ID NO: 40 (tcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattc) to circular template DNA (SEQ ID NO: 39) The mutant Taq polymerase was added to a reaction solution containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl ₂ , 14 mM 2-mercaptoethanol, and the mixture was reacted at 74 ° C. for 5 minutes. The synthesized DNA was run on a 1% agarose gel containing 50 mM NaOH and 1 mM EDTA, dried, and then detected by autoradiography.

その結果、図2および表に示したように、742番目と743番目のアミノ酸の荷電が-1のTaqは、ユニット当たり５分間で0.7 kb伸長するのに対し、荷電が0であるTaqER(742E743R), TaqAA(742A743A), TaqQY(742Q743Y)は2〜3.5 kb伸長した。荷電が+1のTaqAR(742A743R), TaqRA(742R743A)は、3.7〜4.3 kb伸長した。荷電が+2であるTaqRR(742R743R), TaqRK(742R743K), TaqKR(742K743R), TaqKK(742K743K)は20 kb以上伸長した。この結果から、プラスの荷電が多いほど伸長性は増加することがわかった。 As a result, as shown in FIG. 2 and the table, Taq whose 742 and 743th amino acids have a charge of -1 extends 0.7 kb in 5 minutes per unit, whereas TaqER (742E743R with zero charge). ), TaqAA (742A743A), TaqQY (742Q743Y) were extended by 2 to 3.5 kb. TaqAR (742A743R) and TaqRA (742R743A) having a charge of +1 extended by 3.7 to 4.3 kb. TaqRR (742R743R), TaqRK (742R743K), TaqKR (742K743R), TaqKK (742K743K) with a charge of +2 extended more than 20 kb. From this result, it was found that the extensibility increases as the positive charge increases.

〔実施例４〕ゲルシフト法による変異ＴａｑポリメラーゼとＤＮＡとの結合の評価
配列番号４１の鋳型DNA(TCGATGGTACGGACGTGCTTAATTCGTTAAGCATTAGTACCAGTATCGA)に配列番号４２(AGCTATGACCATGATTACGAATTGCTT)の5'末端を放射標識化したプライマーをアニールさせたプライムドDNA(0.02 pmol)を含む20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 14 mM 2-メルカプトエタノール, 100 μg/ml BSA, 5% glycerolを含む反応溶液に変異Taqポリメラーゼを加え、37℃で5分間反応させた。これを0.1xTAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)を含む1％アガロースゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。 [Example 4] Evaluation of binding between mutant Taq polymerase and DNA by gel shift method Primed DNA obtained by annealing primer labeled with radiolabeled 5 'end of SEQ ID NO: 42 (AGCTATGACCATGATTACGAATTGCTT) to template DNA (TCGATGGTACGGACGTGCTTAATTCGTTAAGCATTAGTACCAGTATCGA) of SEQ ID NO: 41 Add mutant Taq polymerase to a reaction solution containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl ₂ , 14 mM 2-mercaptoethanol, 100 μg / ml BSA, 5% glycerol containing (0.02 pmol) And allowed to react at 37 ° C. for 5 minutes. This was separated on a 1% agarose gel containing 0.1 × TAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0) and detected by autoradiography.

結果を図3及び4に示す。全ての変異Taqポリメラーゼで鋳型DNAとの結合が見られた。この図からDNAとの解離定数(Kd)値を求めた結果、野生型Taqが400 nMであったのに対し、変異型TaqのKd値は10 nMであった。また、742番目と743番目の荷電の総和が2である変異型Taq(TaqRR(742R743R), TaqRK(742R743K), TaqKR(742K743R), TaqKK(742K743K))は、さらに移動度の遅い位置にバンドが得られた。 The results are shown in FIGS. All mutant Taq polymerases showed binding to template DNA. As a result of obtaining the dissociation constant (Kd) value from DNA from this figure, the wild type Taq was 400 nM, whereas the Kd value of the mutant Taq was 10 nM. In addition, the mutant Taq (TaqRR (742R743R), TaqRK (742R743K), TaqKR (742K743R), TaqKK (742K743K)), which has a sum of charges of 742 and 743, has a band at a slower mobility. Obtained.

変異Ｔａｑポリメラーゼの性質を下記の表にまとめる。
The properties of the mutant Taq polymerase are summarized in the table below.

〔実施例５〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（１）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４３のプライマーF02(gtcgtttctgcaagcttggc)と配列番号４４のプライマーR03(ccgagataaaaacaaacccgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、98℃5秒、55℃10秒、72℃10秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図5に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかったが、TaqRK(742R743K), TaqKR(742K743R), TaqKK(742K743K), TaqRR(742R743R)では、2 kbの位置に増幅バンドが検出された。 [Example 5] PCR reaction using mutant Taq polymerase (1)
The template lambda DNA was manufactured by Takara Bio. As the primers, primer F02 (gtcgtttctgcaagcttggc) of SEQ ID NO: 43 and primer R03 (ccgagataaaaacaaacccgc) of SEQ ID NO: 44 were used. The composition of the reaction solution was 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM dNTP, 0.5 μM primer, 100 ng / 100 μl reaction solution, 5 Units / 100 μl polymerase, reaction cycle Were subjected to 30 cycles of reaction at 98 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds.
The results are shown in FIG. Wild type Taq polymerase showed no amplified DNA band, but TaqRK (742R743K), TaqKR (742K743R), TaqKK (742K743K), TaqRR (742R743R) detected an amplified band at the 2 kb position. .

〔実施例６〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（２）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４３のプライマーF02(gtcgtttctgcaagcttggc)と配列番号４４のプライマーR03(ccgagataaaaacaaacccgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、99℃5秒、66℃40秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図6に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかったが、TaqRR(742R743R), TaqQY(742Q743Y)では、2 kbの位置に増幅バンドが検出された。 [Example 6] PCR reaction using mutant Taq polymerase (2)
The template lambda DNA was manufactured by Takara Bio. As the primers, primer F02 (gtcgtttctgcaagcttggc) of SEQ ID NO: 43 and primer R03 (ccgagataaaaacaaacccgc) of SEQ ID NO: 44 were used. The composition of the reaction solution was 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM dNTP, 0.5 μM primer, 100 ng / 100 μl reaction solution, 5 Units / 100 μl polymerase, reaction cycle Reacted at 99 ° C for 5 seconds and 66 ° C for 40 seconds for 30 cycles.
The results are shown in FIG. Wild-type Taq polymerase did not show an amplified DNA band, but TaqRR (742R743R) and TaqQY (742Q743Y) detected an amplified band at the 2 kb position.

〔実施例７〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（３）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４５のプライマーF24(cgtcggggacattgtaaaggcg)と配列番号４６のプライマーR14(ggcattcctacgagcagatgg)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、98℃5秒、55℃10秒、72℃10秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図7に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかった。TaqRR(742R743R)では、500から10 kbの位置に増幅シグナルが現れた。TaqQY(742Q743Y)では、8 kbの位置に増幅バンドが検出された。 [Example 7] PCR reaction using mutant Taq polymerase (3)
The template lambda DNA was manufactured by Takara Bio. As the primers, primer F24 (cgtcggggacattgtaaaggcg) of SEQ ID NO: 45 and primer R14 (ggcattcctacgagcagatgg) of SEQ ID NO: 46 were used. The composition of the reaction solution was 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM dNTP, 0.5 μM primer, 100 ng / 100 μl reaction solution, 5 Units / 100 μl polymerase, reaction cycle Were subjected to 30 cycles of reaction at 98 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds.
The results are shown in FIG. Wild type Taq polymerase showed no amplified DNA band. In TaqRR (742R743R), an amplified signal appeared at a position of 500 to 10 kb. In TaqQY (742Q743Y), an amplified band was detected at the 8 kb position.

〔実施例８〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（４）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４５のプライマーF24(cgtcggggacattgtaaaggcg)と配列番号４６のプライマーR14(ggcattcctacgagcagatgg)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、99℃5秒、66℃160秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図8に示す。野生型Taqポリメラーゼでは8 kbの位置に薄いバンドが検出された。TaqRR(742R743R)では、2から10 kbの位置に増幅シグナルが現れた。TaqQY(742Q743Y)では、8 kbの位置に濃い増幅バンドが検出された。 [Example 8] PCR reaction using mutant Taq polymerase (4)
The template lambda DNA was manufactured by Takara Bio. As the primers, primer F24 (cgtcggggacattgtaaaggcg) of SEQ ID NO: 45 and primer R14 (ggcattcctacgagcagatgg) of SEQ ID NO: 46 were used. The composition of the reaction solution was 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM dNTP, 0.5 μM primer, 100 ng / 100 μl reaction solution, 5 Units / 100 μl polymerase, reaction cycle Reacted at 99 ° C. for 5 seconds and 66 ° C. for 160 seconds for 30 cycles.
The results are shown in FIG. Wild-type Taq polymerase detected a thin band at 8 kb. In TaqRR (742R743R), an amplified signal appeared at a position of 2 to 10 kb. In TaqQY (742Q743Y), a deep amplification band was detected at the 8 kb position.

〔実施例９〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。8 kbのDNA増幅に用いたプライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４８のプライマーR6(gagaaaacaggatgccggtcataccaccggcccc)を用いた。15 kbのDNA増幅に用いたプライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４９のプライマーR9(gaatatctggcggtgcaatatcggtactgtttgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼである。反応サイクルは、99℃5秒、66℃5分で30サイクルの反応を行った。 [Example 9] PCR reaction using mutant Taq polymerase (5)
The template lambda DNA was manufactured by Takara Bio. As the primers used for the 8 kb DNA amplification, primer F1 (gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc) of SEQ ID NO: 47 and primer R6 (gagaaaacaggatgccggtcataccaccggcccc) of SEQ ID NO: 48 were used. As the primers used for the 15 kb DNA amplification, primer F1 (gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc) of SEQ ID NO: 47 and primer R9 (gaatatctggcggtgcaatatcggtactgtttgc) of SEQ ID NO: 49 were used. The composition of the reaction solution is 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM dNTP, 0.5 μM primer, 100 ng / 100 μl reaction solution, 5 Units / 100 μl polymerase. The reaction cycle was 30 cycles at 99 ° C for 5 seconds and 66 ° C for 5 minutes.

結果を図9に示す。8 kbの増幅では、野生型Taqポリメラーゼ、TaqRR、TaqQYで増幅バンドが検出された。
15 kbの増幅では、野生型Taqポリメラーゼでは増幅バンドは見られなかった。TaqRR(742R743R)では、増幅バンドは見られたが、15 kbではなかった。TaqQY(742Q743Y)では、15 kbの位置に増幅バンドが検出された。 The results are shown in FIG. In the 8 kb amplification, amplification bands were detected with wild type Taq polymerase, TaqRR and TaqQY.
In the 15 kb amplification, no amplification band was seen with wild type Taq polymerase. In TaqRR (742R743R), an amplified band was seen but not 15 kb. In TaqQY (742Q743Y), an amplified band was detected at a position of 15 kb.

〔実施例１０〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（６）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４８のプライマーR6(gagaaaacaggatgccggtcataccaccggcccc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼである。反応サイクルは、99℃5秒、66℃5分で30サイクルの反応を行った。
結果を図10に示す。野生型Taqポリメラーゼ、TaqRR(742R743R)、TaqQY(742Q743Y), TaqER(742E743R), TaqAA(742A743A)で8 kbの位置に増幅バンドが検出された。 [Example 10] PCR reaction using mutant Taq polymerase (6)
The template lambda DNA was manufactured by Takara Bio. As the primer, primer F1 (gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc) of SEQ ID NO: 47 and primer R6 (gagaaaacaggatgccggtcataccaccggcccc) of SEQ ID NO: 48 were used. The composition of the reaction solution is 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM dNTP, 0.5 μM primer, 100 ng / 100 μl reaction solution, 5 Units / 100 μl polymerase. The reaction cycle was 30 cycles at 99 ° C for 5 seconds and 66 ° C for 5 minutes.
The results are shown in FIG. An amplified band was detected at the 8 kb position with wild-type Taq polymerase, TaqRR (742R743R), TaqQY (742Q743Y), TaqER (742E743R), TaqAA (742A743A).

〔実施例１１〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（７）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４９のプライマーR9(gaatatctggcggtgcaatatcggtactgtttgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼである。反応サイクルは、99℃5秒、66℃5分で30サイクルの反応を行った。
結果を図11に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかった。TaqAA(742A743A)は、15 kbの位置に濃い増幅バンドが検出された。 [Example 11] PCR reaction using mutant Taq polymerase (7)
The template lambda DNA was manufactured by Takara Bio. As the primers, primer F1 (gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc) of SEQ ID NO: 47 and primer R9 (gaatatctggcggtgcaatatcggtactgtttgc) of SEQ ID NO: 49 were used. The composition of the reaction solution is 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM dNTP, 0.5 μM primer, 100 ng / 100 μl reaction solution, 5 Units / 100 μl polymerase. The reaction cycle was 30 cycles at 99 ° C for 5 seconds and 66 ° C for 5 minutes.
The results are shown in FIG. Wild type Taq polymerase showed no amplified DNA band. In TaqAA (742A743A), a deep amplification band was detected at a position of 15 kb.

[実施例12]変異TaqポリメラーゼのF667Y変異体を用いた塩基配列解析の可能性
変異TaqポリメラーゼのF667Y変異体の作成は、[実施例1]に示したように、変異Taqポリメラーゼを産生するプラスミドを鋳型に下記のプライマーを用いてF667Y変異プラスミドを作成した。変異Taqポリメラーゼの作成は[実施例1]にしたがって行った。 [Example 12] Possibility of base sequence analysis using F667Y mutant of mutant Taq polymerase As shown in [Example 1], a plasmid that produces mutant Taq polymerase is used to create F667Y mutant of mutant Taq polymerase. F667Y mutant plasmid was prepared using the following primers as a template. Mutant Taq polymerase was prepared according to [Example 1].

F667Y-5 ggccaagaccatcaactAcggggtcctctacggc（配列番号５０）
F667Y-3 gccgtagaggaccccgTagttgatggtcttggcc（配列番号５１）
反応溶液(10 μl )の組成は、20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0.1 mM dNTP, 0.01 mM ddNTP, 0.1 pmol プライムドDNA(5'末端を放射標識化した配列番号４０と配列番号３９をアニールさせたもの)である。この溶液に変異TaqポリメラーゼのF667Y変異体(TaqRR(F667Y)およびTaqQY(F667Y))を1.4 ng加え、70℃で5分反応させた。これを7 M尿素を含む12％アクリルアミドゲルで分離し、ゲルを乾燥させた後、オートラジオグラフィーによりDNAを検出した。 F667Y-5 ggccaagaccatcaactAcggggtcctctacggc (SEQ ID NO: 50)
F667Y-3 gccgtagaggaccccgTagttgatggtcttggcc (SEQ ID NO: 51)
The composition of the reaction solution (10 μl) consisted of 20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl ₂ , 5 mM DTT, 0.1 mM dNTP, 0.01 mM ddNTP, 0.1 pmol primed DNA (sequence with radiolabeled 5 ′ end) No. 40 and SEQ ID NO: 39 are annealed). To this solution, 1.4 ng of F667Y mutant of mutant Taq polymerase (TaqRR (F667Y) and TaqQY (F667Y)) was added and reacted at 70 ° C. for 5 minutes. This was separated on a 12% acrylamide gel containing 7 M urea, the gel was dried, and then DNA was detected by autoradiography.

結果を図12に示す。TaqRR(F667Y)およびTaqQY(F667Y)はシークエンスラダーが検出され、塩基配列解析に使用できることが明らかになった。 The results are shown in FIG. For TaqRR (F667Y) and TaqQY (F667Y), a sequence ladder was detected and it was revealed that it could be used for nucleotide sequence analysis.

本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、ＤＮＡ増幅に利用することができる。 The modified Taq polymerase of the present invention can be used for DNA amplification.

本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having dye | stained CBB (Coomassie brilliant blue) after using the modified Taq polymerase of this invention for SDS-PAGE. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743R, 742R743A, 742A743A, 742E743R, 742A743R, 742R743K, 742K743R, 742K743K, 742Q743Y）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))のプライマー伸長活性の測定結果を示す図である。It is a figure which shows the measurement result of the primer extension activity of modified Taq polymerase (742R743R, 742R743A, 742A743A, 742E743R, 742A743R, 742R743K, 742K743R, 742K743K, 742Q743Y) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of the present invention. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743R, 742E743R, 742A743R, 742A743A, 742R743A）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))の二本鎖ＤＮＡに対する結合能の測定結果を示す図である。It is a figure which shows the measurement result of the binding ability with respect to double stranded DNA of the modified Taq polymerase (742R743R, 742E743R, 742A743R, 742A743A, 742R743A) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of the present invention. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743R, 742E743K, 742K743R, 742K743K, 742Q743Y）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))の二本鎖ＤＮＡに対する結合能の測定結果を示す図である。It is a figure which shows the measurement result of the binding ability with respect to double stranded DNA of the modified Taq polymerase (742R743R, 742E743K, 742K743R, 742K743K, 742Q743Y) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of this invention. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743K, 742K743R, 742K743K, 742R743R）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))を用いたＰＣＲ反応の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of PCR reaction using the modified Taq polymerase (742R743K, 742K743R, 742K743K, 742R743R) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of the present invention. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743R, 742Q743Y）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))を用いたＰＣＲ反応の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of PCR reaction using the modified Taq polymerase (742R743R, 742Q743Y) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of the present invention. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743R, 742Q743Y）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))を用いたＰＣＲ反応の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of PCR reaction using the modified Taq polymerase (742R743R, 742Q743Y) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of the present invention. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743R, 742Q743Y）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))を用いたＰＣＲ反応の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of PCR reaction using the modified Taq polymerase (742R743R, 742Q743Y) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of the present invention. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743R, 742Q743Y）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))を用いたＰＣＲ反応の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of PCR reaction using the modified Taq polymerase (742R743R, 742Q743Y) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of the present invention. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743R, 742Q743Y, 742E743R, 742A743R, 742A743A, 742R743A）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))を用いたＰＣＲ反応の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of PCR reaction using the modified Taq polymerase (742R743R, 742Q743Y, 742E743R, 742A743R, 742A743A, 742R743A) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of the present invention. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743R, 742Q743Y, 742E743R, 742A743R, 742A743A, 742R743A）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))を用いたＰＣＲ反応の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of PCR reaction using the modified Taq polymerase (742R743R, 742Q743Y, 742E743R, 742A743R, 742A743A, 742R743A) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of the present invention. 本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ（742R743R667Y, 742Q743Y667Y）及び野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))を用いた塩基配列解析の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the base sequence analysis using the modified Taq polymerase (742R743R667Y, 742Q743Y667Y) and wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)) of the present invention.

＜配列番号１＞
配列番号１は、野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742E743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742E743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743A)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743A)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743A)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743A)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743K)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743K)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743K)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743K)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742Q743Y)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742Q743Y)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２１＞
配列番号２１は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRR5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２２＞
配列番号２２は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRR3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２３＞
配列番号２３は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーER5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２４＞
配列番号２４は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーER3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２５＞
配列番号２５は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAR5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２６＞
配列番号２６は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAR3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２７＞
配列番号２７は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAA5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２８＞
配列番号２８は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAA3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２９＞
配列番号２９は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRA5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３０＞
配列番号３０は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRA3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３１＞
配列番号３１は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRK5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３２＞
配列番号３２は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRK3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３３＞
配列番号３３は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKR5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３４＞
配列番号３４は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKR3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３５＞
配列番号３５は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKK5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３６＞
配列番号３６は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKK3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３７＞
配列番号３７は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーQY5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３８＞
配列番号３８は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーQY3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３９＞
配列番号３９は、実施例３の変異Ｔａｑポリメラーゼのプライマー伸長活性測定に用いた鋳型のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４０＞
配列番号４０は、実施例３のプライマー伸長活性測定に用いたプライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４１＞
配列番号４１は、実施例４のゲルシフト法による変異ＴａｑポリメラーゼとＤＮＡとの結合の測定に用いた鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４２＞
配列番号４２は、実施例４のゲルシフト法による変異ＴａｑポリメラーゼとＤＮＡとの結合の測定に用いた標識プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４３＞
配列番号４３は、実施例５および６の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（１）および（２）に用いたプライマーＦ02のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４４＞
配列番号４４は、実施例５および６の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（１）および（２）に用いたプライマーＲ03のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４５＞
配列番号４５は、実施例７および８の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（３）および（４）に用いたプライマーＦ２４のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４６＞
配列番号４６は、実施例７および８の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（３）および（４）に用いたプライマーＲ１４のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４７＞
配列番号４７は、実施例９の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）、（６）および（７）に用いたプライマーＦ１のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４８＞
配列番号４８は、実施例９および１０の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）および（６）に用いたプライマーＲ６のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４９＞
配列番号４９は、実施例１１の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）および（７）に用いたプライマーR9のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号５０＞
配列番号５０は、実施例１２の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーF667Y-5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号５１＞
配列番号５１は、実施例１２の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーF667Y-3のヌクレオチド配列を示す。 <SEQ ID NO: 1>
SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of wild type Taq polymerase (Taq (742E743A)).
<SEQ ID NO: 2>
SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of wild-type Taq polymerase (Taq (742E743A)).
<SEQ ID NO: 3>
SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of DNA encoding mutant Taq polymerase (742R743R).
<SEQ ID NO: 4>
SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of mutant Taq polymerase (742R743R).
<SEQ ID NO: 5>
SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of DNA encoding mutant Taq polymerase (742E743R).
<SEQ ID NO: 6>
SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of mutant Taq polymerase (742E743R).
<SEQ ID NO: 7>
SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of DNA encoding mutant Taq polymerase (742A743R).
<SEQ ID NO: 8>
SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of mutant Taq polymerase (742A743R).
<SEQ ID NO: 9>
SEQ ID NO: 9 shows the nucleotide sequence of DNA encoding mutant Taq polymerase (742A743A).
<SEQ ID NO: 10>
SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of mutant Taq polymerase (742A743A).
<SEQ ID NO: 11>
SEQ ID NO: 11 shows the nucleotide sequence of DNA encoding mutant Taq polymerase (742R743A).
<SEQ ID NO: 12>
SEQ ID NO: 12 shows the amino acid sequence of mutant Taq polymerase (742R743A).
<SEQ ID NO: 13>
SEQ ID NO: 13 shows the nucleotide sequence of DNA encoding mutant Taq polymerase (742R743K).
<SEQ ID NO: 14>
SEQ ID NO: 14 shows the amino acid sequence of mutant Taq polymerase (742R743K).
<SEQ ID NO: 15>
SEQ ID NO: 15 shows the nucleotide sequence of DNA encoding mutant Taq polymerase (742K743R).
<SEQ ID NO: 16>
SEQ ID NO: 16 shows the amino acid sequence of mutant Taq polymerase (742K743R).
<SEQ ID NO: 17>
SEQ ID NO: 17 shows the nucleotide sequence of DNA encoding mutant Taq polymerase (742K743K).
<SEQ ID NO: 18>
SEQ ID NO: 18 shows the amino acid sequence of mutant Taq polymerase (742K743K).
<SEQ ID NO: 19>
SEQ ID NO: 19 shows the nucleotide sequence of DNA encoding mutant Taq polymerase (742Q743Y).
<SEQ ID NO: 20>
SEQ ID NO: 20 shows the amino acid sequence of mutant Taq polymerase (742Q743Y).
<SEQ ID NO: 21>
SEQ ID NO: 21 shows the nucleotide sequence of primer RR5 used for preparation of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 22>
SEQ ID NO: 22 shows the nucleotide sequence of primer RR3 used for the production of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 23>
SEQ ID NO: 23 shows the nucleotide sequence of primer ER5 used to produce mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 24>
SEQ ID NO: 24 shows the nucleotide sequence of primer ER3 used to produce the mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 25>
SEQ ID NO: 25 shows the nucleotide sequence of primer AR5 used for preparation of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 26>
SEQ ID NO: 26 shows the nucleotide sequence of primer AR3 used for preparation of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 27>
SEQ ID NO: 27 shows the nucleotide sequence of primer AA5 used for preparation of the mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 28>
SEQ ID NO: 28 shows the nucleotide sequence of primer AA3 used for preparation of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 29>
SEQ ID NO: 29 shows the nucleotide sequence of primer RA5 used for preparation of the mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 30>
SEQ ID NO: 30 shows the nucleotide sequence of primer RA3 used for preparation of the mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 31>
SEQ ID NO: 31 shows the nucleotide sequence of primer RK5 used for the production of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 32>
SEQ ID NO: 32 shows the nucleotide sequence of primer RK3 used to prepare mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 33>
SEQ ID NO: 33 shows the nucleotide sequence of primer KR5 used for the production of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 34>
SEQ ID NO: 34 shows the nucleotide sequence of primer KR3 used to produce mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 35>
SEQ ID NO: 35 shows the nucleotide sequence of primer KK5 used for the production of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 36>
SEQ ID NO: 36 shows the nucleotide sequence of primer KK3 used for the production of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 37>
SEQ ID NO: 37 shows the nucleotide sequence of primer QY5 used for preparation of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 38>
SEQ ID NO: 38 shows the nucleotide sequence of primer QY3 used for preparation of mutant Taq polymerase of Example 1.
<SEQ ID NO: 39>
SEQ ID NO: 39 is the nucleotide sequence of the template used for measuring the primer extension activity of the mutant Taq polymerase of Example 3.
<SEQ ID NO: 40>
SEQ ID NO: 40 is the nucleotide sequence of the primer used for the primer extension activity measurement of Example 3.
<SEQ ID NO: 41>
SEQ ID NO: 41 shows the nucleotide sequence of the template DNA used for measurement of binding between mutant Taq polymerase and DNA by the gel shift method of Example 4.
<SEQ ID NO: 42>
SEQ ID NO: 42 shows the nucleotide sequence of a labeled primer used for measurement of binding between mutant Taq polymerase and DNA by the gel shift method of Example 4.
<SEQ ID NO: 43>
SEQ ID NO: 43 shows the nucleotide sequence of primer F02 used in PCR reactions (1) and (2) using the mutant Taq polymerase of Examples 5 and 6.
<SEQ ID NO: 44>
SEQ ID NO: 44 shows the nucleotide sequence of primer R03 used in PCR reactions (1) and (2) using the mutant Taq polymerase of Examples 5 and 6.
<SEQ ID NO: 45>
SEQ ID NO: 45 shows the nucleotide sequence of primer F24 used for PCR reactions (3) and (4) using the mutant Taq polymerase of Examples 7 and 8.
<SEQ ID NO: 46>
SEQ ID NO: 46 shows the nucleotide sequence of primer R14 used in PCR reactions (3) and (4) using the mutant Taq polymerase of Examples 7 and 8.
<SEQ ID NO: 47>
SEQ ID NO: 47 shows the nucleotide sequence of primer F1 used in PCR reactions (5), (6) and (7) using the mutant Taq polymerase of Example 9.
<SEQ ID NO: 48>
SEQ ID NO: 48 shows the nucleotide sequence of primer R6 used in PCR reactions (5) and (6) using the mutant Taq polymerase of Examples 9 and 10.
<SEQ ID NO: 49>
SEQ ID NO: 49 shows the nucleotide sequence of primer R9 used in PCR reactions (5) and (7) using the mutant Taq polymerase of Example 11.
<SEQ ID NO: 50>
SEQ ID NO: 50 shows the nucleotide sequence of primer F667Y-5 used for preparing the mutant Taq polymerase of Example 12.
<SEQ ID NO: 51>
SEQ ID NO: 51 shows the nucleotide sequence of primer F667Y-3 used to prepare mutant Taq polymerase of Example 12.

Claims

A modified Taq polymerase in which a mutation that increases the total charge of glutamic acid at position 742 and alanine at position 743 of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is introduced , comprising the following (i) and / or (ii) Modified Taq polymerase introduced with the mutation of
(i) The glutamic acid at position 742 of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with any of alanine, glutamine, arginine, lysine or histidine
(ii) Alanine at position 743 of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with tyrosine, arginine, lysine or histidine

The modified Taq polymerase according to claim 1, which is a protein of any one of the following (a) to (c).
(a) a protein comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20
(b) In the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, one or several amino acids other than the amino acids at positions 742 and 743 are deleted or substituted Alternatively, a protein consisting of an added amino acid sequence and having at least one of primer extension activity, binding activity to a primer annealed to template DNA, and PCR performance higher than Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(c) Coded by DNA that hybridizes under highly stringent conditions with DNA complementary to DNA consisting of any nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 The amino acid encoded by the codon consisting of nucleotides 2224 to 2226 and the amino acid encoded by the codon consisting of nucleotides 2227 to 2229 in the nucleotide sequence are conserved, and primer extension activity, A protein having at least one of the binding activity to the primer annealed to the template DNA and the PCR performance higher than Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

The modified Taq polymerase according to claim 1 or 2 , wherein a mutation in which phenylalanine at position 667 of Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with tyrosine is introduced.

A modified Taq polymerase fragment comprising an amino acid sequence excluding amino acids from the N-terminal to the 280th position of the modified Taq polymerase according to any one of claims 1 to 3 .

DNA encoding the modified Taq polymerase according to any one of claims 1 to 3 or the modified Taq polymerase fragment according to claim 4 .

A recombinant vector comprising the DNA according to claim 5 .

A transformant comprising the recombinant vector according to claim 6 .

A method for producing the modified Taq polymerase according to any one of claims 1 to 3 , or the modified Taq polymerase fragment according to claim 4 , comprising culturing the transformant according to claim 7 .

A method for amplifying DNA using the modified Taq polymerase according to any one of claims 1 to 3 or the modified Taq polymerase fragment according to claim 4 .

Furthermore, the method of Claim 9 using a family B type DNA polymerase.

A DNA amplification kit comprising the modified Taq polymerase according to any one of claims 1 to 3 or the modified Taq polymerase fragment according to claim 4 .

The kit according to claim 11 , further comprising a family B type DNA polymerase.