JP2010183842A - New thermostable dna polymerase - Google Patents

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Yoshihide Hayashizaki
良英 林崎
Masayoshi Ito
昌可 伊藤
Alexander Lezhava
アレキサンダー レジャバ
Yoshimi Benno
義巳 辨野
Yasumasa Mitani
康正 三谷
Motoki Kanamori
基 金森
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a DNA polymerase which has complementary strand replacement/amplification activity and also has high thermal stability. <P>SOLUTION: There are disclosed a protein which has a specific amino acid sequence derived from the genus Bacillus or Geobacillus, a protein in which 1 to 51 arbitrary numerical and contiguous amino acid residues from the N-terminal of the protein is deleted, and a protein which comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids in the protein are deleted, substituted, inserted or added and which has DNA polymerase activity. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、新規なＤＮＡポリメラーゼ、それをコードするＤＮＡおよび前記ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法等に関する。   The present invention relates to a novel DNA polymerase, a DNA encoding the same, a nucleic acid amplification method using the DNA polymerase, and the like.

ＤＮＡポリメラーゼは、ライフサイエンスの分野で最も汎用的な酵素の一つであり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法をはじめとして、種々の技術に必須の酵素である。このようなＤＮＡポリメラーゼは、数多くの種類が販売されており、それぞれのポリメラーゼは、例えば、反応条件、酵素活性について特徴を持っている。最もよく知られている大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩは、鋳型ＤＮＡとプライマーとから鋳型と相補的な配列を合成する５’→３’ポリメラーゼ活性と共に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。これら３つの酵素活性は、各々異なる構造ドメインと関連することが知られている。すなわち、Ｎ末端側の５’→３’エキソヌクレアーゼドメイン、中央部の３’→５’エキソヌクレアーゼドメインおよびＣ末端側のポリメラーゼドメインである（例えば、非特許文献１参照）。前記ＤＮＡポリメラーゼＩをズブチリシンで処理して得られる７５ｋＤの大きな断片（ラージフラグメント）は、クレノウフラグメントとも呼ばれ、前記３つの活性のうち５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。このため、クレノウフラグメントは、ジデオキシ法シークエンス反応や、５’突出末端の平滑化反応等に有用である。現在では、ＤＮＡポリメラーゼＩのＮ末端側小断片を含まない組換えタンパク質として発現、精製されて、市販されている。   DNA polymerase is one of the most general-purpose enzymes in the field of life science. For example, it is an enzyme essential for various techniques including polymerase chain reaction (PCR). Many types of such DNA polymerases are sold, and each polymerase is characterized, for example, in terms of reaction conditions and enzyme activity. The most well-known DNA polymerase I of E. coli is a 5 ′ → 3 ′ polymerase activity that synthesizes a sequence complementary to a template from a template DNA and a primer, together with a 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity and a 3 ′ → 5. 'Has exonuclease activity. These three enzyme activities are known to be associated with different structural domains. That is, the 5 ′ → 3 ′ exonuclease domain on the N-terminal side, the 3 ′ → 5 ′ exonuclease domain on the center, and the polymerase domain on the C-terminal side (see, for example, Non-Patent Document 1). A large 75 kD fragment (large fragment) obtained by treating DNA polymerase I with subtilisin is also called a Klenow fragment, and lacks 5 '→ 3' exonuclease activity among the three activities. For this reason, Klenow fragment is useful for dideoxy method sequencing reaction, 5 'overhanging end blunting reaction and the like. Currently, it is expressed and purified as a recombinant protein that does not contain the N-terminal small fragment of DNA polymerase I, and is commercially available.

ＤＮＡの増幅技術としては、一般的にＰＣＲ法が利用されているが、複雑な温度制御が必要であること、これらの複雑な温度制御を行うためのサーマルサイクラーが必要であること、反応時間が数時間かかること等の問題点がある。そこで、ＰＣＲ法に代わる新たなＤＮＡの増幅技術として、近年、ＬＡＭＰ(Loop-mediated Isothermal Amplification)法（例えば、非特許文献２参照）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法（例えば、特許文献１参照）、三谷らの方法（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献３参照）等が開発されている。これらの方法は、等温での増幅反応が可能であるため、ＰＣＲのような複雑な温度制御や、それを実行するサーマルサイクラーが不要である。他方、等温での増幅反応のためには、相補鎖置換複製活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、特許文献２、特許文献３参照）が必須となっている。この相補鎖置換複製活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、現在、市場で入手できる種類が少なく、至適温度等の反応条件が限られており、あるいは、反応時間が長いという点等が指摘されている。このため、これらのＤＮＡ増幅方法を用いる検査・診断薬等の開発を制限している。   As a DNA amplification technique, a PCR method is generally used. However, complicated temperature control is required, a thermal cycler for performing these complex temperature controls is required, and reaction time is increased. There are problems such as taking several hours. Therefore, as a new DNA amplification technique replacing the PCR method, in recent years, a LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) method (for example, see Non-Patent Document 2) and an SDA (Strand Displacement Amplification) method (for example, see Patent Document 1). Mitani et al. (See, for example, Patent Document 4, Patent Document 5, Patent Document 6, and Non-Patent Document 3) have been developed. Since these methods can perform an isothermal amplification reaction, complicated temperature control such as PCR and a thermal cycler for executing the temperature control are unnecessary. On the other hand, for an isothermal amplification reaction, a DNA polymerase having complementary strand displacement replication activity (see, for example, Patent Document 2 and Patent Document 3) is essential. It has been pointed out that DNA polymerases having complementary strand displacement replication activity are currently available on the market in a limited number, the reaction conditions such as optimum temperature are limited, or the reaction time is long. For this reason, the development of testing / diagnostic drugs using these DNA amplification methods is limited.

特開平１０−３１３９００号公報JP-A-10-313900 特許第２９７８００１号公報Japanese Patent No. 2978001 特開平０９−２２４６８１号公報JP 09-224681 A 国際公開ＷＯ２００４／０４００１９号パンフレットInternational Publication WO2004 / 040019 Pamphlet 国際公開ＷＯ２００５／０６３９７７号パンフレットInternational Publication WO2005 / 063977 Pamphlet 国際公開ＷＯ２００１／０３０９９３号パンフレットInternational Publication WO2001 / 030993 Pamphlet Kornberg, A., Baker TA. DNA Replication, W.H. Freeman and Company, New York, 1992.Kornberg, A., Baker TA.DNA Replication, W.H.Freeman and Company, New York, 1992. Notomi, T. et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 12, e63Notomi, T. et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 12, e63 Mitani et al., Nature Methods, 2007, Vol. 4, No. 3, 257-262Mitani et al., Nature Methods, 2007, Vol. 4, No. 3, 257-262

現在、ＳＤＡ法に用いられているＤＮＡポリメラーゼは、比較的低温で作用するため、前記増幅反応において、鋳型ＤＮＡとプライマーとのアニーリングの厳密性が低い。このため、副反応物が生じて増幅反応の特異性が低下することや、長い目的配列の増幅が難しい等の問題点が指摘されている。従って、本発明は、これらの問題点を解決するために、相補鎖置換複製活性を有し、且つ熱安定性の高い新たなＤＮＡポリメラーゼを提供することを目的とする。   Since DNA polymerase currently used in the SDA method operates at a relatively low temperature, the stringent annealing of the template DNA and the primer is low in the amplification reaction. For this reason, it has been pointed out that problems such as the occurrence of a side reaction product and a decrease in the specificity of the amplification reaction and the difficulty of amplifying a long target sequence. Accordingly, an object of the present invention is to provide a new DNA polymerase having complementary strand displacement replication activity and high thermal stability in order to solve these problems.

本発明者らは、ジェオバシラス・カルドキシロシリティカス(Geobacillus caldoxylosilyticus)より、通常の鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性および相補鎖置換複製活性を有し、且つ、熱安定性の高い、新規なＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを単離し、これを用いて新規耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得ることにより本発明を完成した。 The present inventors, from Geobacillus caldoxylosilyticus , have a novel template-dependent DNA replication enzyme activity and complementary strand displacement replication activity, and a novel DNA having high thermostability. The present invention was completed by isolating the DNA encoding the polymerase and using it to obtain a novel thermostable DNA polymerase.

すなわち、第一の視点において、本発明は、少なくとも以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなるＤＮＡポリメラーゼを含む。
（ａ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、Ｎ末端から１〜５１個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）いずれか記載のタンパク質の有するアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
なお、「１または数個のアミノ酸」とは、例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは１〜５個程度である。 That is, in the first aspect, the present invention includes a DNA polymerase comprising at least one of the following proteins (a) to (d).
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (b) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (c) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 from the N-terminus Protein in which any number of consecutive amino acid residues of 1 to 51 are deleted (d) In the amino acid sequence of the protein according to any one of (a) to (c), one or several amino acids are deleted , A protein consisting of a substituted, inserted or added amino acid sequence and having DNA polymerase activity. Here, “1 or several amino acids” is, for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 20, More preferably, it is about 1-10, and most preferably about 1-5.

本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、６３℃〜７１．２℃の範囲における少なくともいずれかの温度において活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。   The DNA polymerase of the present invention is a thermostable DNA polymerase having activity at at least any temperature within a range of 63 ° C. to 71.2 ° C., for example.

つぎに、第二の視点において、本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかであることを特徴とするＤＮＡを含む。
（ａ）配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）前記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列との相同性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡであり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）前記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡであり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ Next, in a second aspect, the present invention includes a DNA that is any of the following (a) to (e).
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13
(B) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 15
(C) DNA that hybridizes with the DNA of (a) or (b) under stringent conditions and encodes a protein having DNA polymerase activity
(D) DNA consisting of a base sequence having a homology of 80% or more with the base sequence described in (a) or (b) above, and encoding a protein having DNA polymerase activity
(E) a protein having a DNA polymerase activity, which is DNA consisting of a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence described in (a) or (b) above; DNA encoding

上記（ｄ）において、ストリンジェントな条件とは、以下に詳細に説明するが、例えば、６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄条件があげられる。このような条件下、例えば、前記塩基配列の一部または全部からなるプローブを用いて、目的生物の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって、このようなＤＮＡを取得することができる。   In the above (d), stringent conditions are described in detail below, and examples include washing conditions with 65 ° C., 1 × SSC, and 0.1% SDS. Under such conditions, for example, such a DNA can be obtained by screening a gene library of a target organism using a probe comprising a part or all of the base sequence.

また、本発明は、別の視点において、本発明のＤＮＡを含む組み換えベクターを提供する。前記ベクターは、例えば、宿主細胞に導入した際、前記宿主細胞内で、本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）を産生し得る組換えベクターであって、前記組換えベクターは、前記宿主細胞内における発現制御配列に機能的に結合されていることが好ましい。本発明において、機能的に結合、機能的に配置とは、それが意図する機能を発揮しうる状態で結合（連結）または配置されていることを意味する。さらに、本発明は、本発明の組換えベクターを含む形質転換体、および、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼの製造方法も提供する。   Moreover, this invention provides the recombinant vector containing the DNA of this invention in another viewpoint. The vector is, for example, a recombinant vector capable of producing the protein (DNA polymerase) of the present invention in the host cell when introduced into the host cell, and the recombinant vector is expressed in the host cell. It is preferably operably linked to a control sequence. In the present invention, functionally connected and functionally arranged means connected (connected) or arranged in a state where the intended function can be exhibited. Furthermore, the present invention also provides a transformant comprising the recombinant vector of the present invention, and a method for producing a DNA polymerase characterized by culturing the transformant and collecting the DNA polymerase from the resulting culture. To do.

本発明は、さらに異なる視点において、前記本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅法を提供する。前記核酸増幅法は、鋳型核酸と、プライマーと、本発明のＤＮＡポリメラーゼとを、一定温度で反応させることを特徴とする。本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅キットも提供する。この本発明の核酸増幅キットにより、本発明の核酸増幅方法を、簡便且つ容易に実施できる。   In a further different aspect, the present invention provides a nucleic acid amplification method using the DNA polymerase of the present invention. The nucleic acid amplification method is characterized by reacting a template nucleic acid, a primer, and the DNA polymerase of the present invention at a constant temperature. The present invention also provides a nucleic acid amplification kit comprising the DNA polymerase of the present invention. With the nucleic acid amplification kit of the present invention, the nucleic acid amplification method of the present invention can be carried out simply and easily.

本発明は、別の視点において、バシラス属（Bacillus）またはジェオバシラス属（Geobacillus）由来の細菌からＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローン化する方法を提供する。前記方法は、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２〜４のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子断片とｍｕｔＭ遺伝子断片とを含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｂ）前記工程（ａ）で増幅した前記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で決定した前記ＤＮＡ断片のセンス鎖の部分配列からなるプライマーと、前記ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｄ）前記工程（ｃ）で増幅されたＤＮＡ断片をクローン化する工程 In another aspect, the present invention provides a method for cloning a DNA polymerase gene from a bacterium from the genus Bacillus or Geobacillus . The method includes the following steps (a) to (d).
(A) using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 4, and using the genomic DNA extracted from the bacteria as a template, (b) amplifying a DNA fragment containing a mutM gene fragment (b) determining the base sequence of the DNA fragment amplified in the step (a) (c) sense strand of the DNA fragment determined in the step (b) A step of amplifying a DNA fragment containing the polA gene using a primer consisting of a partial sequence of the above and a primer consisting of a partial sequence of the antisense strand of the DNA fragment using the genomic DNA extracted from the bacterium as a template (d) The step of cloning the DNA fragment amplified in (c)

本発明のＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細菌であるジェオバシラス属（Geobacillus）より単離されたものであるため、例えば、相補鎖置換複製酵素活性を持つ従来のＤＮＡポリメラーゼよりも高温度の反応条件で活性を有する。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼによれば、相補鎖置換複製酵素活性を持つ従来のＤＮＡポリメラーゼよりも、速い速度で核酸の増幅を行うことができる。このような性質から、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＰＣＲ等のように複数回にわたる温度変化の工程や温度変化のための特有の機器を必要としない等温増幅法に用いることができる。そして、本発明のＤＮＡポリメラーゼによれば、例えば、従来の酵素と比較して、より高温での反応が可能となるため、より正確に効率良く増幅反応を行うことができる。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、逆転写活性を有してもよく、この場合、例えば、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成でき、従来の逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の代替法に利用することもできる。 Since the DNA polymerase of the present invention is isolated from the thermophilic bacterium, Geobacillus , for example, it is active under higher temperature reaction conditions than conventional DNA polymerase having complementary strand displacement replication enzyme activity. Have In addition, according to the DNA polymerase of the present invention, nucleic acid can be amplified at a higher rate than conventional DNA polymerase having complementary strand displacement replication enzyme activity. Because of these properties, the DNA polymerase of the present invention can be used in isothermal amplification methods that do not require a temperature change step or a specific device for temperature change, such as PCR. According to the DNA polymerase of the present invention, for example, a reaction at a higher temperature is possible as compared with a conventional enzyme, so that an amplification reaction can be performed more accurately and efficiently. In addition, the DNA polymerase of the present invention may have reverse transcription activity. In this case, for example, DNA can be synthesized using RNA as a template and used as an alternative to conventional reverse transcription PCR (RT-PCR). You can also.

本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ジェオバシラス属（Geobacillus）の微生物から単離することができ、好ましくは、ジェオバシラス・カルドキシロシリティカス(Geobacillus caldoxylosilyticus)から、さらに好ましくは、Geobacillus caldoxylosilyticus DSM12041株から単離できる。本菌株は、ＤＳＭＺ社（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)）より購入可能である（http://www.dsmz.de/index.htm）。なお、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下、「本発明のＤＮＡポリメラーゼ（またはＤＮＡポリメラーゼＩ）」、「本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ」または「本発明のタンパク質」という場合もある。 The DNA polymerase of the present invention can be isolated from, for example, a microorganism of the genus Geobacillus , preferably from Geobacillus caldoxylosilyticus , more preferably from Geobacillus caldoxylosilyticus DSM12041 strain. Can be separated. This strain can be purchased from DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)) (http://www.dsmz.de/index.htm). The DNA polymerase of the present invention may hereinafter be referred to as “the DNA polymerase of the present invention (or DNA polymerase I)”, “the heat-resistant DNA polymerase of the present invention” or “the protein of the present invention”.

本発明において、例えば、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術等の一般的方法は、当該技術分野の標準的な参考書籍を参照して実施できる。これらには、例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第３版（Sambrook & Russell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001）；Current Protocols in Molecular biology（Ausubelら編、John Wiley & Sons、1987）；Methods in Enzymologyシリーズ（Academic Press）；PCR Protocols: Methods in Molecular Biology（Bartlett & Striling編、Humana Press、2003）；Antiboides：A Laboratory Manual（Harlowら & Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1987）等が含まれる。また、本明細書において参照される試薬およびキット類等は、例えば、Sigma社、Aldrich社、Invitrogen/GIBCO社、Clontech社、Stratagene社、Qiagen社、Promega社、Roche Diagnostics社、Becton-Dickinson社、TaKaRa（タカラバイオ株式会社）等の市販業者から入手可能である。   In the present invention, for example, general methods such as molecular biology, microbiology, and recombinant DNA technology can be performed with reference to standard reference books in the art. These include, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition (Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); Current Protocols in Molecular biology (Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1987); Methods in Enzymology Series (Academic Press); PCR Protocols: Methods in Molecular Biology (Bartlett & Striling, Humana Press, 2003); Antiboides: A Laboratory Manual (Harlow et al & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987). The reagents and kits referred to in the present specification include, for example, Sigma, Aldrich, Invitrogen / GIBCO, Clontech, Stratagene, Qiagen, Promega, Roche Diagnostics, Becton-Dickinson, It is available from commercial vendors such as TaKaRa (Takara Bio Inc.).

＜本発明のＤＮＡポリメラーゼおよびこれをコードするＤＮＡ＞
近縁のバシラス属微生物では、一般に、ＤＮＡポリメラーゼＩをコードする遺伝子（ｐｏｌＡ）の上流にｐｈｏＲ遺伝子が、下流にｍｕｔＭ遺伝子が保存されている。そこで、例えば、保存されている遺伝子の塩基配列を決定し、これに基づいてｐｏｌＡクローニング用プライマーを設計し、遺伝子増幅を行うことによって、例えば、バシラス属またはジェオバシラス属のＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子（ｐｏｌＡ）を単離することができる。以下に具体例を示すが、本発明はこれには制限されない。 <DNA polymerase of the present invention and DNA encoding the same>
In related Bacillus microorganisms, the phoR gene is generally conserved upstream of the gene encoding DNA polymerase I (polA), and the mutM gene is conserved downstream. Therefore, for example, by determining the nucleotide sequence of a conserved gene, designing a primer for polA cloning based on this, and performing gene amplification, for example, a DNA polymerase I gene (polA) belonging to the genus Bacillus or Geobacillus Can be isolated. Specific examples are shown below, but the present invention is not limited thereto.

第一の具体例としては、まず、バシラス属微生物のＤＮＡポリメラーゼＩにおいて保存されているアミノ酸配列から、逆翻訳によりプライマー（例えば、フォワードプライマー）を設計する。他方、ｍｕｔＭの保存領域から、プライマー（例えば、リバースプライマー）を設計する。そして、これらのプライマーセットを用いて、目的の細菌（例えば、ジェオバシラス属微生物）のゲノムＤＮＡを鋳型として、遺伝子増幅を行う。次いで、増幅産物の塩基配列を決定し、その情報からｐｏｌＡを増幅するためのプライマーを設計し、ゲノムＤＮＡについて遺伝子増幅を行う。これによって、ｐｏｌＡを含むＤＮＡを得ることができる。   As a first specific example, first, a primer (eg, forward primer) is designed by reverse translation from an amino acid sequence conserved in DNA polymerase I of a Bacillus microorganism. On the other hand, a primer (for example, reverse primer) is designed from the conserved region of mutM. Then, using these primer sets, gene amplification is performed using the genomic DNA of the target bacterium (for example, Geobacillus microorganism) as a template. Next, the base sequence of the amplification product is determined, a primer for amplifying polA is designed from the information, and gene amplification is performed on the genomic DNA. Thereby, DNA containing polA can be obtained.

本発明は、このようなプライマーを用いて、バシラス属やその近縁微生物（例えば、ジェオバシラス属細菌）からＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を単離する方法を含む。本発明の方法は、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２〜４のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子断片とｍｕｔＭ遺伝子断片とを含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｂ）前記工程（ａ）で増幅した前記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で決定した前記ＤＮＡ断片のセンス鎖の部分配列からなるプライマーと、前記ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｄ）前記工程（ｃ）で増幅されたＤＮＡ断片をクローン化する工程 The present invention includes a method for isolating a DNA polymerase gene from Bacillus and related microorganisms (for example, Geobacillus bacteria) using such primers. The method of the present invention includes the following steps (a) to (d).
(A) using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 4, and using the genomic DNA extracted from the bacteria as a template, (b) amplifying a DNA fragment containing a mutM gene fragment (b) determining the base sequence of the DNA fragment amplified in the step (a) (c) sense strand of the DNA fragment determined in the step (b) A step of amplifying a DNA fragment containing the polA gene using a primer consisting of a partial sequence of the above and a primer consisting of a partial sequence of the antisense strand of the DNA fragment using the genomic DNA extracted from the bacterium as a template (d) The step of cloning the DNA fragment amplified in (c)

プライマーの長さは、制限されず、種々の実験条件によって適宜調節可能であるが、例えば、１５〜５０塩基長、好ましくは１８〜４０塩基長、最も好ましくは２５〜３５塩基長である。また、前記（ｃ）工程において、前記ＤＮＡ断片のセンス鎖の部分配列からなるプライマーとしては、例えば、配列番号８〜１０のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーがあげられる。また、前記ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとしては、配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーがあげられる。これらのプライマーは、例えば、アミノ酸のコドン使用を考慮して、特定の塩基について縮重した混合プライマーであってもよい。   The length of the primer is not limited and can be appropriately adjusted according to various experimental conditions. For example, the length is 15 to 50 bases, preferably 18 to 40 bases, and most preferably 25 to 35 bases. In the step (c), examples of the primer comprising the partial sequence of the sense strand of the DNA fragment include a primer comprising the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 8 to 10. Moreover, as a primer which consists of a partial arrangement | sequence of the antisense strand of the said DNA fragment, the primer which consists of a base sequence in any one of sequence number 5-7 is mention | raise | lifted. These primers may be, for example, mixed primers degenerate with respect to a specific base in consideration of the codon usage of amino acids.

また、第二の具体例としては、例えば、保存されているｐｈｏＲおよびｍｕｔＭの塩基配列からプライマーを設計する方法があげられる。例えば、まず、保存されているｐｈｏＲおよびｍｕｔＭの塩基配列を決定し、これに基づいて、各遺伝子（ｐｈｏＲおよびｍｕｔＭ）を増幅するための、一対または複数対のプライマーを設計する。次いで、得られた増幅産物をクローン化し、塩基配列を決定する。前述のように、種々のバシラス属微生物のゲノム構造から、ｐｈｏＲ、ｐｏｌＡおよびｍｕｔＭの３つの遺伝子は、いずれも同一方向に転写されることが知られている。そこで、例えば、ｐｈｏＲ遺伝子配列のセンス鎖の部分配列からなるプライマーと、ｍｕｔＭ遺伝子配列のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとを用い、目的の細菌（例えば、ジェオバシラス属微生物）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅を行う。そして、増幅されたＤＮＡ断片をクローン化することにより、ｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡを取得することができる。   As a second specific example, for example, a method of designing a primer from conserved phoR and mutM base sequences can be mentioned. For example, first, a conserved phoR and mutM nucleotide sequence is determined, and based on this, a pair or a plurality of pairs of primers for amplifying each gene (phoR and mutM) is designed. Next, the obtained amplification product is cloned and the nucleotide sequence is determined. As described above, it is known from the genome structures of various Bacillus microorganisms that all three genes, phoR, polA, and mutM, are transcribed in the same direction. Therefore, for example, genomic DNA extracted from a target bacterium (for example, Geobacillus microorganism) using a primer consisting of a partial sequence of the sense strand of the phoR gene sequence and a primer consisting of a partial sequence of the antisense strand of the mutM gene sequence Gene amplification is performed using as a template. Then, the DNA containing the polA gene can be obtained by cloning the amplified DNA fragment.

プライマーの長さは、制限されず、種々の実験条件によって適宜調節可能であるが、例えば、１５〜５０塩基長、好ましくは１８〜４０塩基長、最も好ましくは２５〜３５塩基長である。   The length of the primer is not limited and can be appropriately adjusted according to various experimental conditions. For example, the length is 15 to 50 bases, preferably 18 to 40 bases, and most preferably 25 to 35 bases.

本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性として、通常の鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性および相補鎖置換複製酵素活性を有し、例えば、さらに、逆転写酵素活性を有する。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、さらに３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。本発明のＤＮＡポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有すれば、例えば、基質を取り込む際のエラーをより減少することが可能である。本発明のＤＮＡポリメラーゼの至適温度は、例えば、公知の相補鎖置換複製酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの至適温度（例えば、２０〜３７℃）より高温度である。具体的には、例えば、３７〜８０℃の反応温度でも活性を有し、好ましくは６３〜７１．２℃の反応温度でも活性を有する。従って、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、相補鎖置換複製酵素活性を有する従来のＤＮＡポリメラーゼよりも高温度の反応条件で用いることができる。このため、例えば、前述のようなＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、三谷らの方法等の等温増幅法等において、鋳型ＤＮＡとプライマーとのより厳密なアニーリング条件下で使用することが可能である。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素活性を有する場合、例えば、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成でき、従来のＲＴ−ＰＣＲの代替法にも利用できる。   The DNA polymerase of the present invention has normal template-dependent DNA replication enzyme activity and complementary strand displacement replication enzyme activity as polymerase activity, for example, further, reverse transcriptase activity. The DNA polymerase of the present invention may further have 3 '→ 5' exonuclease activity. If the DNA polymerase of the present invention has 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity, for example, it is possible to further reduce errors during substrate incorporation. The optimum temperature of the DNA polymerase of the present invention is, for example, higher than the optimum temperature (for example, 20 to 37 ° C.) of a known DNA polymerase having complementary strand displacement replication enzyme activity. Specifically, for example, it has activity even at a reaction temperature of 37 to 80 ° C., and preferably has activity even at a reaction temperature of 63 to 71.2 ° C. Therefore, the DNA polymerase of the present invention can be used under reaction conditions at a higher temperature than, for example, conventional DNA polymerases having complementary strand displacement replication enzyme activity. Therefore, for example, in the isothermal amplification method such as the LAMP method, the SDA method, the method of Mitani et al. As described above, it can be used under more strict annealing conditions between the template DNA and the primer. In addition, when the DNA polymerase of the present invention has reverse transcriptase activity, for example, DNA can be synthesized using RNA as a template and can be used as an alternative to conventional RT-PCR.

本発明は、前述のようにして得られるＤＮＡポリメラーゼであるタンパク質および前記ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを包含する。   The present invention includes a protein which is a DNA polymerase obtained as described above and a DNA encoding the DNA polymerase.

配列番号１３に、本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列の一例を、配列番号１４に、本発明のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の一例を示す。なお、本発明は、これらの配列に限定されない。   SEQ ID NO: 13 shows an example of the base sequence of the DNA encoding the DNA polymerase of the present invention, and SEQ ID NO: 14 shows an example of the amino acid sequence of the DNA polymerase of the present invention. The present invention is not limited to these arrangements.

さらに、本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端側アミノ酸残基を欠失させたＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼ、および、それをコードするＤＮＡも包含する。欠失させるＮ末端側のアミノ酸残基数は、例えば、得られるＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼが相補鎖置換複製酵素活性を有する限りにおいて、特に限定されない。具体例としては、前記Ｎ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、例えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントに対応する活性を有するものが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、Ｎ末端から１〜５１個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したタンパク質があげられる。Ｎ末端から欠失するアミノ酸の残基数が相対的に多い場合に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失する可能性が相対的に高いと考えられる。本発明の一例として、大腸菌のクレノウフラグメントに対応するＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１５に、前記Ｎ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列番号１６に、それぞれ示す。このように、本発明のＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失する場合、例えば、遺伝子増幅を行う際に、得られた増幅産物の分解を防止できるという利点を有する。   Furthermore, the present invention also includes an N-terminal deletion DNA polymerase from which the N-terminal amino acid residue of the DNA polymerase has been deleted, and a DNA encoding the same. The number of amino acid residues on the N-terminal side to be deleted is not particularly limited as long as, for example, the obtained N-terminal deleted DNA polymerase has complementary strand displacement replication enzyme activity. As a specific example, the N-terminal deletion DNA polymerase preferably lacks the 5 '→ 3' exonuclease activity and has, for example, an activity corresponding to the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I. An example of such a DNA polymerase is a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 with any number of consecutive amino acid residues 1 to 51 deleted from the N-terminus. When the number of amino acid residues deleted from the N-terminus is relatively large, it is considered that the possibility of losing the 5 'to 3' exonuclease activity is relatively high. As an example of the present invention, the base sequence of DNA encoding the N-terminal deletion DNA polymerase corresponding to the Klenow fragment of E. coli is SEQ ID NO: 15, the amino acid sequence of the N-terminal deletion DNA polymerase is SEQ ID NO: 16, respectively. Show. Thus, when the DNA polymerase of the present invention lacks 5 '→ 3' exonuclease activity, for example, when performing gene amplification, there is an advantage that degradation of the obtained amplification product can be prevented.

さらに、本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質、および、前記タンパク質をコードするＤＮＡを包含する。種々のＤＮＡポリメラーゼＩについて、各アミノ酸配列を比較すると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素には、酵素タンパク質の中央部に３つの共通配列モチーフが存在することが知られている。これらのモチーフを除去した酵素を作製することができる、例えば、市販の好熱性細菌由来のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している（Aliotta, J.M. et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, Vol. 12, pp. 185-195, 1996）。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼは、例えば、核酸増幅反応に用いた際、プライマーの３’末端を分解することがない。このため、プライマー濃度の低下が十分に防止されることによって、核酸増殖速度がより速くなるという利点がある。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼは、例えば、点突然変異の検出への使用に適している。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼによれば、例えば、プライマーが３’側から分解されることを十分に防止できることから、プライマーは、鋳型ＤＮＡの変異箇所を十分に識別することができる。   Furthermore, the present invention includes the DNA polymerase, wherein the protein lacks 3 '→ 5' exonuclease activity, and DNA encoding the protein. When various amino acid sequences of various DNA polymerases I are compared, it is known that an enzyme having 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity has three common sequence motifs in the center of the enzyme protein. Enzymes with these motifs removed can be made, for example, commercially available Bst DNA polymerase from thermophilic bacteria lacks 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity (Aliotta, JM et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, Vol. 12, pp. 185-195, 1996). A DNA polymerase lacking 3 '→ 5' exonuclease activity does not degrade the 3 'end of the primer when used in a nucleic acid amplification reaction, for example. For this reason, there is an advantage that the nucleic acid growth rate becomes faster by sufficiently preventing the decrease in the primer concentration. Also, DNA polymerases lacking 3 '→ 5' exonuclease activity are suitable for use in detecting point mutations, for example. According to the DNA polymerase lacking the 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity, for example, since the primer can be sufficiently prevented from being degraded from the 3 ′ side, the primer can sufficiently prevent the mutation site of the template DNA. Can be identified.

一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の発現には、例えば、活性中心のカルボキシル基に配位する２つの金属イオンが重要であることが示唆されている。そこで、例えば、このようなアミノ酸を活性中心に導入することによって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の低いＤＮＡポリメラーゼについて、前記酵素活性を増強することも可能である(Park, Y. et al., Mol Cells. Vol. 7, No.3, pp.419-24, 1997)。   On the other hand, it is suggested that, for example, two metal ions coordinated to the carboxyl group of the active center are important for the expression of the 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity. Thus, for example, by introducing such an amino acid into the active center, it is possible to enhance the enzyme activity of a DNA polymerase having a low 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity (Park, Y. et al. , Mol Cells. Vol. 7, No. 3, pp.419-24, 1997).

また、本発明のＤＮＡには、例えば、前述のいずれかのＤＮＡに対して相補的な配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ＭのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１×ＳＳＣとは、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる。ストリンジェンシーの選択のため、例えば、洗浄工程における塩濃度や温度を適宜最適化することができる。また、当業者であれば、ストリンジェンシーを上げるために、例えば、ホルムアミドやＳＤＳ等を添加することも技術常識である。   The DNA of the present invention encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a sequence complementary to any of the aforementioned DNAs and has a DNA polymerase activity, for example. DNA is also included. Here, “hybridizes under stringent conditions” is, for example, well-known experimental conditions for hybridization in those skilled in the art. Specifically, “stringent conditions” refers to, for example, hybridization at 60 to 68 ° C. in the presence of 0.7 to 1 M NaCl, and then using a 0.1 to 2 times SSC solution. The conditions which can be identified by washing | cleaning at 65-68 degreeC. 1 × SSC consists of 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate. For selection of stringency, for example, the salt concentration and temperature in the washing step can be optimized as appropriate. In addition, it is also common technical knowledge for those skilled in the art to add, for example, formamide or SDS in order to increase stringency.

また、本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡと、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、例えば、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しており、且つ、ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む。また、本発明のＤＮＡは、この他に、例えば、配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡと、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、例えば、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しており、且つ、ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡも含む。さらに、本発明は、前記ＤＮＡに対するＲＮＡ、例えば、前記ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、若しくは、アンチセンスＲＮＡ等も含む。   The DNA of the present invention is, for example, at least 80% or more, preferably 90% or more when calculated under the default conditions using, for example, DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and BLAST. More preferably, it comprises DNA having a base sequence encoding a protein having a homology of 95% or more and having a DNA polymerase activity. In addition, the DNA of the present invention is, for example, at least 80% or more when calculated under the default conditions using, for example, DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 and BLAST. Is a nucleotide sequence encoding a protein having a homology of 90% or more, more preferably 95% or more and having DNA polymerase activity but lacking 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity The DNA consisting of Furthermore, the present invention also includes RNA for the DNA, such as mRNA transcribed from the DNA or antisense RNA.

さらに、本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１３または１５に表される塩基配列の縮重変異体も含む。また、本発明は、前述のＤＮＡの相補的な配列からなるＤＮＡも含む。   Furthermore, the DNA of the present invention also includes a degenerate variant of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15, for example. The present invention also includes DNA comprising a complementary sequence of the aforementioned DNA.

遺伝子に変異を導入する方法は、制限されないが、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法またはギャップ二重鎖(Gapped duplex)法等の公知手法またはこれに準ずる方法によって行うことができる。また、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えば、Mutant-K(TAKARA社製）、Mutant-G(TAKARA社製）等)、LA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキット（TAKARA社）等を利用することもできる。   The method for introducing a mutation into a gene is not limited, but can be performed by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a method analogous thereto. In addition, for example, mutation introduction kits using site-directed mutagenesis (for example, Mutant-K (manufactured by TAKARA), Mutant-G (manufactured by TAKARA), etc.), LA PCR in vitro Mutagenesis series kit (TAKARA) Etc.) can also be used.

さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、前述のいずれかのタンパク質の有するアミノ酸配列において、例えば、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を含む。「１または数個のアミノ酸」とは、例えば、全長アミノ酸残基数の多くとも５〜１０％程度をいい、例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは１〜５個程度である。   Furthermore, the DNA polymerase of the present invention is a protein consisting of an amino acid sequence in which any one of the aforementioned proteins has, for example, one or several amino acids deleted, substituted, inserted or added, and A protein having DNA polymerase activity. “One or several amino acids” means, for example, at most about 5 to 10% of the total number of amino acid residues, for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 20, more preferably 1 to About 10, most preferably about 1 to 5.

ＤＮＡポリメラーゼの活性測定方法は、制限されず、当業者に周知の種々の方法により測定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ活性のうち鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性は、例えば、文献（Seville M. et al. Biotechniques Vol.21, pp.664-668 (1996)）等に記載されている蛍光定量的な測定方法を用いることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性のうち相補鎖置換複製酵素活性は、例えば、前述の非特許文献１（Kornberg, A., Baker TA. DNA Replication, W.H. Freeman and Company, New York, 1992.）等に記載されている測定方法を用いることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性のうち逆転写酵素活性は、例えば、市販キット（例えば、EnzChek（商標） Reverse Transcriptase Assay Kit (E-22064) Molecular Probes (Invitrogen社製)）を使用し、そのプロトコールに従って測定できる。   The method for measuring the activity of the DNA polymerase is not limited and can be measured by various methods well known to those skilled in the art. Among DNA polymerase activities, template-dependent DNA replication enzyme activity is measured by a quantitative quantitative method described in, for example, the literature (Seville M. et al. Biotechniques Vol. 21, pp. 664-668 (1996)). The method can be used. Further, the complementary strand displacement replication enzyme activity among the DNA polymerase activities is described in, for example, the aforementioned Non-Patent Document 1 (Kornberg, A., Baker TA. DNA Replication, WH Freeman and Company, New York, 1992.). The measuring method can be used. Moreover, reverse transcriptase activity among DNA polymerase activities can be measured according to the protocol using, for example, a commercially available kit (for example, EnzChek (trademark) Reverse Transcriptase Assay Kit (E-22064) Molecular Probes (manufactured by Invitrogen)). .

さらに、本発明の他の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、配列番号１４もしくは１６に示したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、前記アミノ酸配列と、例えば、少なくとも５０％、好ましくは７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％以上の相同性を有するタンパク質からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質が提供される。タンパク質の相同性（ホモロジー）の程度は、通常、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、前記両アミノ酸配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は、種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定できる（Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3):403-10）。   Furthermore, in another embodiment of the present invention, as the DNA polymerase of the present invention, for example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or 16, or the amino acid sequence, for example, at least 50%, preferably 70 %, 80%, 85%, 90%, 97%, 98% or more of a protein having homology and having a DNA polymerase activity is provided. The degree of homology between proteins can usually be expressed as a percentage of identity when the amino acid sequences of two proteins are properly aligned, and an exact match between the two amino acid sequences. Means the appearance rate of Appropriate alignment between sequences for identity comparison can be determined using various algorithms, such as the BLAST algorithm (Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215 (3): 403-10).

＜本発明のプライマーおよびプローブ＞
つぎに、本発明は、生物からＤＮＡポリメラーゼを単離するために用いるプライマーおよびプローブを包含する。本発明のプライマーおよび本発明のプローブは、前述の本発明のＤＮＡの断片であり、塩基の数は、例えば、５〜５０である。塩基数の下限は、例えば、５以上であり、好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上であり、塩基数の上限は、例えば、５０以下であり、好ましくは３０以下であり、より好ましくは２５以下である。また、好ましい範囲の具体例としては、例えば、１０〜５０であり、より好ましくは１０〜３０、より好ましくは１５〜２５である。増幅させる塩基配列の長さは、特に制限されない。本発明のプライマーの具体例としては、例えば、配列番号１〜１０のいずれかに表されるプライマーがあげられ、いずれか１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。中でも、配列番号８〜１０で表される少なくとも１つのプライマーをフォワードプライマーとして、配列番号５〜７で表される少なくとも１つのプライマーをリバースプライマーとして、それぞれ組み合わせて使用することが好ましい。 <Primer and probe of the present invention>
Next, the present invention includes primers and probes used to isolate DNA polymerase from an organism. The primer of the present invention and the probe of the present invention are the aforementioned fragments of the DNA of the present invention, and the number of bases is, for example, 5-50. The lower limit of the number of bases is, for example, 5 or more, preferably 10 or more, more preferably 15 or more, and the upper limit of the number of bases is, for example, 50 or less, preferably 30 or less, more preferably 25. It is as follows. Moreover, as a specific example of a preferable range, it is 10-50, for example, More preferably, it is 10-30, More preferably, it is 15-25. The length of the base sequence to be amplified is not particularly limited. Specific examples of the primer of the present invention include, for example, a primer represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 10, and any one kind may be used, or two or more kinds may be used in combination. Among these, it is preferable to use a combination of at least one primer represented by SEQ ID NOs: 8 to 10 as a forward primer and at least one primer represented by SEQ ID NOs: 5 to 7 as a reverse primer.

＜本発明の組換えベクター＞
本発明の組換えベクターは、前述のように、本発明のＤＮＡを含む。本発明の組換えベクターは、例えば、適当なベクターに本発明のＤＮＡを連結(挿入)することにより得られる。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、例えば、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）等が挙げられる。ファージＤＮＡとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）等が挙げられる。さらに、レトロウイルスまたはワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等を用いることもできる。 <Recombinant vector of the present invention>
As described above, the recombinant vector of the present invention contains the DNA of the present invention. The recombinant vector of the present invention can be obtained, for example, by ligating (inserting) the DNA of the present invention into an appropriate vector. The vector for inserting the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA. Examples of plasmid DNA include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), and plasmids derived from yeast (eg, YEp13, YEp24, YCp50). Etc.). Examples of the phage DNA include λ phage (for example, Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, etc.). Furthermore, animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, insect virus vectors such as baculovirus, and the like can also be used.

ベクターに本発明のＤＮＡを挿入する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等があげられる。本発明のＤＮＡは、例えば、それがコードするタンパク質が発現されるように、前記ベクターに組み込まれることが好ましい。そこで、本発明におけるベクターには、例えば、プロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等）の他に、所望により、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することもできる。前記選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。   The method for inserting the DNA of the present invention into a vector is not particularly limited, and conventionally known methods can be employed. Specific examples include, for example, a method in which purified DNA is first cleaved with a suitable restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of a suitable vector DNA, and ligated to a vector. The DNA of the present invention is preferably incorporated into the vector so that, for example, the protein encoded by it is expressed. Therefore, the vector in the present invention includes, for example, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection in addition to a promoter (for example, trp promoter, lac promoter, PL promoter, tac promoter, etc.). Markers, ribosome binding sequences (SD sequences), etc. can also be linked. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, and a neomycin resistance gene.

＜本発明の形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述のように、本発明の組換えベクターを含む。本発明の形質転換体は、例えば、本発明のタンパク質を発現し得るように、本発明のＤＮＡを宿主に導入することにより得られる。形質転換は、例えば、簡便で効率が良いことから、多くの場合、ベクターを用いて行われる。本発明においては、本発明の組換えベクターを宿主に導入することによって得られる。ここで、宿主としては、本発明のタンパク質を発現できるものであれば、特に限定されるものではない。前記宿主としては、例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバシラス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌等が挙げられる。また、この他に、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、さらに、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞等も挙げられる。あるいは、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。 <Transformant of the present invention>
As described above, the transformant of the present invention contains the recombinant vector of the present invention. The transformant of the present invention can be obtained, for example, by introducing the DNA of the present invention into a host so that the protein of the present invention can be expressed. For example, transformation is often performed using a vector because it is simple and efficient. In the present invention, it can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host. Here, the host is not particularly limited as long as it can express the protein of the present invention. As the host, such as E. coli (Escherichia coli) Escherichia genus such as Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) Bacillus such as, such as Pseudomonas putida (Pseudomonas putida) Pseudomonas, Rhizobium meliloti (Rhizobium meliloti), such as Examples include bacteria belonging to the genus Rhizobium. Other examples include yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe , and animal cells such as COS cells and CHO cells. Alternatively, for example, insect cells such as Sf9 and Sf21 can be used.

形質転換方法としては、制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法等があげられる。   The transformation method is not limited and a conventionally known method can be employed. Specific examples include a method using calcium ions (Cohen, SN et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114), DEAE dextran method, electroporation method and the like. It is done.

＜本発明のＤＮＡポリメラーゼの製造方法）
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物からタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）を採取することにより得ることができる。「培養物」とは、例えば、培養上清の他、培養細胞若しくは培養菌体、または、細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味する。また、「本発明の形質転換体を培養する方法」は、例えば、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われ、その条件等は、例えば、宿主の種類等に応じて適宜決定できる。 <Method for Producing DNA Polymerase of the Present Invention>
The DNA polymerase of the present invention can be obtained, for example, by culturing the transformant of the present invention and collecting a protein (DNA polymerase) from the obtained culture. “Culture” means, for example, any of cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells, in addition to the culture supernatant. Further, the “method for culturing the transformant of the present invention” is performed according to, for example, a normal method applied to host culture, and the conditions can be appropriately determined according to, for example, the type of the host.

培養後、本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）が、菌体内または細胞内に生産される場合には、例えば、菌体または細胞を破砕することにより前記タンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）が、菌体外または細胞外に生産される場合には、例えば、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により前記培養液から菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を、単独で、または、適宜組み合わせて用いることによって、前記培養物から本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）を精製することができる。前記単離精製の方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があげられる。また、例えば、精製のために、発現するタンパク質にタグ配列を付加している場合には、前記精製工程の間または後に、プロテアーゼ処理等により、前記タグ配列を除去することもできる。   After culturing, when the protein (DNA polymerase) of the present invention is produced in cells or cells, for example, the protein is extracted by disrupting the cells or cells. When the protein (DNA polymerase) of the present invention is produced outside the cells or cells, for example, the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed from the culture solution by centrifugation or the like. To do. Thereafter, the protein (DNA polymerase) of the present invention can be purified from the culture by using general biochemical methods used for protein isolation and purification alone or in appropriate combination. Examples of the isolation and purification method include ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. For example, when a tag sequence is added to the protein to be expressed for purification, the tag sequence can be removed by protease treatment or the like during or after the purification step.

＜抗体＞
本発明は、さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼに対する抗体をも含む。前記「抗体」には、例えば、好適な任意のフラグメントまたは誘導体も含まれる。このような広義の抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体（diabody）（融合した同一のＦｖフラグメントの２つのコピー）、単鎖抗体、および、２以上の抗体フラグメントから形成される多重特異性（multi-specific）抗体等が含まれる。前記抗体は、例えば、本発明のＤＮＡポリメラーゼの精製に用いることができる。前記抗体の製造方法は、制限されず、例えば、従来公知の方法により製造できる。 <Antibody>
The present invention further includes an antibody against the DNA polymerase of the present invention. The “antibody” also includes, for example, any suitable fragment or derivative. Such broadly defined antibodies include, for example, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, Fab fragments, Fab ′ fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fv fragments, bispecific antibodies (diabody) (fused identical Fv fragments 2), single chain antibodies, multi-specific antibodies formed from two or more antibody fragments, and the like. The antibody can be used, for example, for purification of the DNA polymerase of the present invention. The method for producing the antibody is not limited, and can be produced by, for example, a conventionally known method.

＜本発明の核酸増幅法およびキット＞
さらに、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸を増幅する方法を含む。本発明の核酸増幅方法においては、ＤＮＡポリメラーゼとして本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用することが特徴であり、その他の構成や工程は制限されない。前記核酸増幅方法としては、例えば、公知のＰＣＲ法（例えば、特許第２５０２０４１号、第２５４６５７６号および第２７０３１９４号公報等参照）、ＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、Trends in Biothechnology Vol.10, pp.146-153, 1992参照）、三谷らの方法（国際公開ＷＯ０１／０３０９９３号パンフレット、国際公開ＷＯ２００４／０４００１９号パンフレット、国際公開ＷＯ２００５／０６３９７７号パンフレット参照）、ＬＡＭＰ法（例えば、非特許文献１参照）、ＳＤＡ法（例えば、特許文献１）、ＩＣＡＮ（登録商標）(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acid)法（例えば、国際公開ＷＯ００／５６８７７号パンフレット参照）、ＮＡＳＢＡ(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)法（例えば、特許第２６５０１５９号公報参照）等が挙げられる。本発明は、制限されず、例えば、これらのいずれの増幅方法にも適用できるが、中でも、特に、三谷らの方法（ＳＭＡＰ法（Smart Amplification Process）法ともいう）、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ（登録商標）法等の等温増幅法に適している。これらの遺伝子増幅法において、前述のように、従来用いられているＤＮＡポリメラーゼに代えて、本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。すなわち、本発明の核酸増幅方法の一実施形態（等温増幅法）として、例えば、鋳型核酸と、プライマー（例えば、少なくとも２種類のプライマー）と、本発明のＤＮＡポリメラーゼとを一定温度で反応させる方法があげられる。 <Nucleic acid amplification method and kit of the present invention>
Furthermore, the present invention includes a method for amplifying a nucleic acid using the DNA polymerase of the present invention. The nucleic acid amplification method of the present invention is characterized by using the DNA polymerase of the present invention as a DNA polymerase, and other configurations and processes are not limited. Examples of the nucleic acid amplification method include known PCR methods (see, for example, Patent Nos. 2502041, 2546576 and 2703194), RT-PCR methods (see, for example, Trends in Biothechnology Vol. 10, pp.146). -153, 1992), Mitani et al. Method (see International Publication WO01 / 030993 pamphlet, International Publication WO2004 / 040019 pamphlet, International Publication WO2005 / 063977 pamphlet), LAMP method (for example, see Non-patent document 1), SDA method (for example, Patent Document 1), ICAN (registered trademark) (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acid) method (for example, see WO00 / 56877 pamphlet), NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) method (For example, refer to Japanese Patent No. 2650159) . The present invention is not limited and can be applied to, for example, any of these amplification methods. Among them, in particular, the method of Mitani et al. (Also referred to as SMAP method (Smart Amplification Process) method), LAMP method, SDA method, ICAN Suitable for isothermal amplification method such as (registered trademark) method. In these gene amplification methods, as described above, the DNA polymerase of the present invention can be used in place of the conventionally used DNA polymerase. That is, as one embodiment (isothermal amplification method) of the nucleic acid amplification method of the present invention, for example, a method of reacting a template nucleic acid, a primer (for example, at least two kinds of primers), and the DNA polymerase of the present invention at a constant temperature. Is given.

さらに、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを含有する核酸増幅キットを含む。本発明の核酸増幅キットは、前述のいずれかの核酸増幅方法に適応させたキットであり、本発明の核酸増幅キットによれば、例えば、容易且つ簡便に、前述の本発明の核酸増幅方法を行うことができる。本発明の核酸増幅キットは、本発明のＤＮＡポリメラーゼを含んでいればよく、その他の構成等は制限されない。その他の構成等は、前述の核酸増幅方法に応じて適宜決定できる。本発明の拡散増幅キットは、本発明のＤＮＡポリメラーゼの他に、例えば、プライマー、ｄＮＴＰｓ、トリス塩酸緩衝液等の各種緩衝液、硫酸マグネシウム、ベタイン等を含んでもよい。前記プライマーは、例えば、少なくとも２種類のプライマーが好ましく、例えば、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含むプライマーセットがあげられる。   Furthermore, the present invention includes a nucleic acid amplification kit containing the DNA polymerase of the present invention. The nucleic acid amplification kit of the present invention is a kit adapted to any of the above-described nucleic acid amplification methods. According to the nucleic acid amplification kit of the present invention, for example, the nucleic acid amplification method of the present invention described above can be easily and simply performed. It can be carried out. The nucleic acid amplification kit of the present invention is not limited as long as it contains the DNA polymerase of the present invention. Other configurations and the like can be appropriately determined according to the nucleic acid amplification method described above. In addition to the DNA polymerase of the present invention, the diffusion amplification kit of the present invention may contain, for example, various buffers such as primers, dNTPs, Tris-HCl buffer, magnesium sulfate, betaine, and the like. For example, the primer is preferably at least two kinds of primers, for example, a primer set including a forward primer and a reverse primer.

本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。   The present invention will be described in detail by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

［ジェオバシラス・カルドキシロシリティカス(Geobacillus caldoxylosilyticus)ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子（ｐｏｌＡ）のクローニング］
G. caldoxylosilyticus DSM12041の培養菌体より、定法によりゲノムＤＮＡを調製した。次いで、バシラス属の他種のｐｏｌＡの遺伝子構造より、下流にｍｕｔＭが保存されていることから、ｐｏｌＡおよびｍｕｔＭの保存領域から、以下に示すプライマーを合成した。 [Cloning of Geobacillus caldoxylosilyticus DNA polymerase I gene (polA)]
Genomic DNA was prepared from cultured cells of G. caldoxylosilyticus DSM12041 by a conventional method. Subsequently, since mutM was conserved downstream from the gene structure of other types of polA of the genus Bacillus, the primers shown below were synthesized from the conserved regions of polA and mutM.

ｐｏｌＡクローニング用ＰＣＲプライマー
BD3F（Fwd）：5'-GAKCCNAAYYTRCAAAAYATHCC-3'（配列番号１） PCR primer for polA cloning
BD3F (Fwd): 5'-GAKCCNAAYYTRCAAAAYATHCC-3 '(SEQ ID NO: 1)

ｍｕｔＭクローニング用ＰＣＲプライマー
mutMRev1(x288)：5'-AAAGAGGTGCATCGTTCCRAAYT-3'（配列番号２）
mutMRev2(x324)：5'-TCBACATADATRTTBCCVAGYCC-3'（配列番号３）
mutMRev3(x864)：5'-CCBCKYCCBCCAACRACHRTYTT-3'（配列番号４） PCR primers for mutM cloning
mutMRev1 (x288): 5'-AAAGAGGTGCATCGTTCCRAAYT-3 '(SEQ ID NO: 2)
mutMRev2 (x324): 5'-TCBACATADATRTTBCCVAGYCC-3 '(SEQ ID NO: 3)
mutMRev3 (x864): 5'-CCBCKYCCBCCAACRACHRTYTT-3 '(SEQ ID NO: 4)

なお、前記配列中において、Ｒは、グアニンまたはアデニンのプリン塩基を、Ｙは、チミンまたはシトシンのピリミジン塩基を、Ｍは、アデニンまたはシトシンを、Ｋは、グアニンまたはチミンを、Ｓは、グアニンまたはシトシンを、Ｗは、アデニンまたはチミンを、Ｄは、アデニンまたはグアニンまたはチミンを、Ｈは、アデニンまたはシトシンまたはチミンを、Ｖは、アデニンまたはグアニンまたはシトシンを、Ｎは、４種類（グアニン、アデニン、シトシン、チミン）のいずれかの塩基をそれぞれ表す。また、括弧内の数字は組み合わせによる種類数を表す。また、Fwdは、正方向（フォワード）プライマー、Revは、逆方向（リバース）プライマーを示す。なお、以下の配列についても同様である。   In the above sequence, R is a purine base of guanine or adenine, Y is a pyrimidine base of thymine or cytosine, M is adenine or cytosine, K is guanine or thymine, and S is guanine or Cytosine, W is adenine or thymine, D is adenine or guanine or thymine, H is adenine or cytosine or thymine, V is adenine or guanine or cytosine, N is four types (guanine, adenine , Cytosine, and thymine). The number in parentheses represents the number of types by combination. Fwd represents a forward primer, and Rev represents a reverse primer. The same applies to the following arrangements.

前記調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、正方向（Ｆｗｄ）プライマーおよび逆方向（Ｒｅｖ）プライマーの各組み合わせによりＰＣＲを行って、ＤＮＡを増幅させた。増幅したＤＮＡ断片を、クローニングキット（インビトロジェン社製、TOPO TA PCRクローニングキット）を用いて、プラスミドベクターにクローニングした。具体的には、正方向プライマーとしてBD3Fを、逆方向プライマーとして、mutMRev1、mutMRev2およびmutMRev3のいずれかを、それぞれ用いて、ｐｏｌＡの部分配列およびｍｕｔＭの部分配列を含むＤＮＡ断片（約１〜２ｋｂ）を増幅した。そして、ベクターにクローニングした前記増幅ＤＮＡ断片について、塩基配列を決定した。ｐｏｌＡおよびｍｕｔＭを含むと推測される前記ＤＮＡ断片の塩基配列より、ｐｏｌＡ遺伝子をクローン化するための下記プライマーを合成した。   Using the prepared genomic DNA as a template, PCR was performed with each combination of forward (Fwd) primer and reverse (Rev) primer to amplify the DNA. The amplified DNA fragment was cloned into a plasmid vector using a cloning kit (manufactured by Invitrogen, TOPO TA PCR cloning kit). Specifically, using BD3F as a forward primer and any of mutMRev1, mutMRev2, and mutMRev3 as a reverse primer, respectively, a DNA fragment (about 1-2 kb) containing a partial sequence of polA and a partial sequence of mutM Was amplified. Then, the nucleotide sequence of the amplified DNA fragment cloned in the vector was determined. From the nucleotide sequence of the DNA fragment presumed to contain polA and mutM, the following primers for cloning the polA gene were synthesized.

GcaR2（Rev）：5'-AGAGTGCGGCGAATCGTTTCTACT-3' （配列番号５）
GcaR3（Rev）：5'-TTGCTGCAGCCGCTTTACTTCTTC-3' （配列番号６）
GcaR4（Rev）：5'-GCTGCAGCCGCTTTACTTCTTCTT-3' （配列番号７）
FPR1（Fwd）：5'-TCGAGCTCTCATTGGAGGAT-3' （配列番号８）
FPR2（Fwd）：5'-TGCTGAAGCAATTTGGTACG-3' （配列番号９）
FPR3（Fwd）：5'-TCGAGCAAATCAATGGGAAC-3' （配列番号１０） GcaR2 (Rev): 5'-AGAGTGCGGCGAATCGTTTCTACT-3 '(SEQ ID NO: 5)
GcaR3 (Rev): 5'-TTGCTGCAGCCGCTTTACTTCTTC-3 '(SEQ ID NO: 6)
GcaR4 (Rev): 5'-GCTGCAGCCGCTTTACTTCTTCTT-3 '(SEQ ID NO: 7)
FPR1 (Fwd): 5'-TCGAGCTCTCATTGGAGGAT-3 '(SEQ ID NO: 8)
FPR2 (Fwd): 5'-TGCTGAAGCAATTTGGTACG-3 '(SEQ ID NO: 9)
FPR3 (Fwd): 5'-TCGAGCAAATCAATGGGAAC-3 '(SEQ ID NO: 10)

調製した前記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、FPR1〜FPR3のいずれかの正方向プライマーとGcaR2、GcaR3およびGcaR4のいずれかの逆方向プライマーとを組み合わせ、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅させた。増幅したＤＮＡ断片を、クローニングキット（インビトロジェン社製、TOPO TA PCRクローニングキット）を用いて、プラスミドベクターにクローニングした。そして、ベクターにクローニングした前記増幅ＤＮＡ断片について、塩基配列を決定した。ここで決定された塩基配列ならびに前記塩基配列がコードするアミノ酸配列を、配列番号１３および配列番号１４にそれぞれ示す。   Using the prepared genomic DNA as a template, the forward primer of any one of FPR1 to FPR3 and the reverse primer of any of GcaR2, GcaR3 and GcaR4 were combined, and the DNA was amplified by PCR. The amplified DNA fragment was cloned into a plasmid vector using a cloning kit (manufactured by Invitrogen, TOPO TA PCR cloning kit). Then, the nucleotide sequence of the amplified DNA fragment cloned in the vector was determined. The base sequence determined here and the amino acid sequence encoded by the base sequence are shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, respectively.

決定した塩基配列に基づいて、下記プライマーを合成し、大腸菌（E. coli）のクレノウフラグメントのＮ末端と同等位置に相当するＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより増幅した。なお、下記プライマーの設計により、増幅するＤＮＡ断片の５’末端側にＮｄｅＩ認識配列を、３’末端側にＢａｍＨＩ認識配列を、それぞれ導入した。 Based on the determined nucleotide sequence, the following primers were synthesized, and a DNA fragment corresponding to the N-terminus of the Klenow fragment of E. coli was amplified by PCR. In addition, by designing the following primers, an NdeI recognition sequence was introduced into the 5 ′ end side of the DNA fragment to be amplified, and a BamHI recognition sequence was introduced into the 3 ′ end side, respectively.

GcaLF1 NdeI（Fwd）:
5'-GAGACATATGGTCGAGGAAGTAAGCGAGTCGG-3' （配列番号１１）
R1BamS2 BamHI（Rev）:
5'-GAGAGGATCCAGAGTGCGGCGAATCGTTTCTACT-3' （配列番号１２） GcaLF1 NdeI (Fwd):
5'-GAGACATATGGTCGAGGAAGTAAGCGAGTCGG-3 '(SEQ ID NO: 11)
R1BamS2 BamHI (Rev):
5'-GAGAGGATCCAGAGTGCGGCGAATCGTTTCTACT-3 '(SEQ ID NO: 12)

増幅したＤＮＡ断片を、クローニングキット（インビトロジェン社製、TOPO TA PCRクローニングキット）を用いて、プラスミドベクターにクローニングした。そして、前記ＤＮＡ断片をクローニングしたプラスミドベクターとプラスミドベクターｐＹＳＮとを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、両者を混合して、連結した。これによって、Ｎ末端欠失型ＧｃａＤＮＡポリメラーゼ（以下、「ΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼ」、「ＧｃａＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント」ともいう）の発現プラスミドｐｄＮＧｃａを構築した。ΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列、ならびに、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を、配列番１６および配列番号１５にそれぞれ示す。   The amplified DNA fragment was cloned into a plasmid vector using a cloning kit (manufactured by Invitrogen, TOPO TA PCR cloning kit). Then, the plasmid vector in which the DNA fragment was cloned and the plasmid vector pYSN were digested with restriction enzymes NdeI and BamHI, and both were mixed and ligated. Thus, an expression plasmid pdNGca for N-terminal deletion type Gca DNA polymerase (hereinafter also referred to as “ΔN Gca DNA polymerase” or “Gca DNA polymerase large fragment”) was constructed. The amino acid sequence of ΔN Gca DNA polymerase and the base sequence encoding the amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 15, respectively.

［Ｎ末端欠失型ＡａｃＤＮＡポリメラーゼの発現および精製］
（１）培養、発現および粗抽出液の調製
ｐｄＮＧｃａを有する大腸菌ＤＨ５αを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌにて、３７℃で一晩培養し、これを前培養液とした。この前培養液５ｍｌを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養（Orbital Shaking Incubator, FIRSTEK OSI-502LD）を行った。培養液のＯＤ６００ｎｍ値が０．５付近となった時点で、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。さらに、３７℃、２００ｒｐｍで１〜２時間振盪培養した。続いて、培養液を遠沈管に移し、４，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、沈殿を得た。この沈殿を１×ＰＢＳ ３０ｍｌに懸濁し、再度、４，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、菌体を洗浄した。沈殿を１×ＰＢＳ ２５ｍｌに懸濁し、１回あたり１０秒間として合計６回、超音波による細胞の破砕を行った（MISONIX Astrason Ultrasonic processor XL）。超音波破砕後の試料を、１５，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、上清を得た。この上清に、３０％ポリエチレンイミン溶液を終濃度０．１％となるように添加して混合し、氷中で３０分間放置した後、１５，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、上清を得た。得られた上清を粗抽出液とした。 [Expression and purification of N-terminal deletion type AacDNA polymerase]
(1) Cultivation, expression and preparation of crude extract E. coli DH5α having pdNGca was cultured overnight at 37 ° C. in 5 ml of LB medium containing 100 μg / ml ampicillin, and this was used as a preculture solution. 5 ml of this preculture was inoculated into 500 ml of LB medium containing 100 μg / ml ampicillin, and subjected to shaking culture at 37 ° C. and 200 rpm (Orbital Shaking Incubator, FIRSTEK OSI-502LD). 1 mM IPTG was added when the OD600 nm value of the culture solution reached around 0.5. Furthermore, the shaking culture was performed at 37 ° C. and 200 rpm for 1 to 2 hours. Subsequently, the culture solution was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 4,000 × g for 10 minutes to obtain a precipitate. This precipitate was suspended in 30 ml of 1 × PBS, and centrifuged again at 4,000 × g for 10 minutes to wash the cells. The precipitate was suspended in 25 ml of 1 × PBS, and the cells were disrupted by ultrasonic waves for a total of 6 times for 10 seconds (MISONIX Astrason Ultrasonic processor XL). The sample after ultrasonication was centrifuged at 15,000 × g for 30 minutes to obtain a supernatant. To this supernatant, a 30% polyethyleneimine solution was added and mixed to a final concentration of 0.1%, left in ice for 30 minutes, then centrifuged at 15,000 × g for 30 minutes, A supernatant was obtained. The obtained supernatant was used as a crude extract.

（２）陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐＱとを用いて、イオン交換クロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）と１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールとの混合液を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述の粗抽出液をアプライした後、非吸着画分を前記ランニングバッファーで洗浄した。約１５カラム容量の０〜１Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は、１ｍｌごとに分画し、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した。そして、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮・脱塩し、これを陰イオン交換画分とした。 (2) Anion exchange column chromatography Ion exchange chromatography was performed using an AKTA Prime high performance liquid chromatography system manufactured by GE Healthcare and a strong anion exchange column HiTrapQ manufactured by GE Healthcare. As a running buffer, a mixed solution of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) and 10 mM 2-mercaptoethanol was used. After equilibrating the column at a flow rate of 1 ml / min and applying the aforementioned crude extract, the non-adsorbed fraction was washed with the running buffer. The adsorbed fraction was eluted with about 15 column volumes of a 0-1 M sodium chloride concentration gradient. The eluted fraction was fractionated every 1 ml, and each was subjected to SDS-PAGE to confirm the protein band. And the fraction which has a protein band of the applicable molecular weight was collect | recovered. The collected fraction was concentrated and desalted using an ultrafiltration membrane to obtain an anion exchange fraction.

（３）ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ヘパリンアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎとを用いて、ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして、前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに同じ溶液を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述の陰イオン交換画分をアプライした後、非吸着画分を前記ランニングバッファーで洗浄した。約２２カラム容量の０〜１Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は、１ｍｌごとに分画し、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した。そして、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。前記回収画分を限外濾過膜を用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ塩化ナトリウムとの混合液にバッファー置換を行い、さらに濃縮して、これをヘパリン画分とした。 (3) Heparin affinity column chromatography Heparin affinity column chromatography was performed using an AKTA Prime high performance liquid chromatography system manufactured by GE Healthcare and a heparin affinity column HiTrap Heparin manufactured by GE Healthcare. As the running buffer, the same solution was used for the anion exchange column chromatography. After equilibrating the column at a flow rate of 1 ml / min and applying the anion exchange fraction described above, the non-adsorbed fraction was washed with the running buffer. The adsorbed fraction was eluted with a gradient of 0 to 1 M sodium chloride in about 22 column volumes. The eluted fraction was fractionated every 1 ml and subjected to SDS-PAGE to confirm the protein band. And the fraction which has a protein band of the applicable molecular weight was collect | recovered. The recovered fraction was subjected to buffer replacement with a mixed solution of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 0.2 M sodium chloride using an ultrafiltration membrane, and further concentrated to obtain a heparin fraction. .

（４）ゲルろ過カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ １０ＸＴ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅとを用いて、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー行った。ランニングバッファーとして、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ塩化ナトリウムとの混合液を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述のヘパリン画分をアプライした後、前記ランニングバッファーで溶出した。溶出画分は、１ｍｌごとに分画し、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した。そして、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。前記回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮し、保存バッファーにバッファー交換を行った。これを精製酵素標品とした。なお、前記保存バッファーの組成は、５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０％グリセロールとした。 (4) Gel filtration column chromatography Gel filtration column chromatography was performed using GE Healthcare's AKTA 10XT high-performance liquid chromatography system and GE Healthcare's gel filtration column HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade. As a running buffer, a mixed solution of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 0.2 M sodium chloride was used. The column was equilibrated at a flow rate of 1 ml / min, and the above heparin fraction was applied, followed by elution with the running buffer. The eluted fraction was fractionated every 1 ml and subjected to SDS-PAGE to confirm the protein band. And the fraction which has a protein band of the applicable molecular weight was collect | recovered. The recovered fraction was concentrated using an ultrafiltration membrane, and the buffer was exchanged with a storage buffer. This was used as a purified enzyme preparation. The composition of the storage buffer was 50 mM potassium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, and 50% glycerol.

［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定］
インビトロジェン社製Picogreen dsDNA定量試薬を用いて、Seville M. et al. Biotechniques Vol.21, pp.664-668 (1996)を参考に、前記精製酵素標品のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。具体的には、前記Picogreen dsDNA定量試薬とＴＥ緩衝液とを、体積比１：３４５となるように混合した。そして、この混合液１７３μｌを、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰおよび前記精製酵素標品の混合物２７μｌに添加した。この反応液を所定の温度（６０℃、６５℃、７０℃）で５分間放置した後、励起波長４８０ｎｍ、測定波長５２０ｎｍにて蛍光を測定した。この際、単位が既知である市販のクレノウフラグメント（市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ；ＮＥＢ社製）についても同様に蛍光測定を行い、その測定値より、相対値としての酵素単位を算出した。以下に測定の一例を示す。なお、標準曲線は、測定ごとに作成し、反応温度は６５℃とした。市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製、以下同様）を標準として、Picogreen dsDNA定量試薬により、各希釈倍での蛍光強度を測定した。この結果を表１に示す。 [DNA polymerase activity measurement]
The DNA polymerase activity of the purified enzyme preparation was measured using Picogreen dsDNA quantitative reagent manufactured by Invitrogen Corporation with reference to Seville M. et al. Biotechniques Vol.21, pp.664-668 (1996). Specifically, the Picogreen dsDNA quantitative reagent and the TE buffer were mixed so that the volume ratio was 1: 345. Then, 173 μl of this mixed solution was added to 27 μl of a mixture of M13mp18 single-stranded DNA, primer, dNTP and the purified enzyme preparation. The reaction solution was allowed to stand at a predetermined temperature (60 ° C., 65 ° C., 70 ° C.) for 5 minutes, and then fluorescence was measured at an excitation wavelength of 480 nm and a measurement wavelength of 520 nm. Under the present circumstances, the fluorescence measurement was similarly performed about the commercially available Klenow fragment (commercially available BstDNA polymerase; NEB company) whose unit is known, and the enzyme unit as a relative value was computed from the measured value. An example of measurement is shown below. A standard curve was prepared for each measurement, and the reaction temperature was 65 ° C. Using commercially available BstDNA polymerase (manufactured by NEB, the same applies hereinafter) as a standard, the fluorescence intensity at each dilution was measured with a Picogreen dsDNA quantitative reagent. The results are shown in Table 1.

Figure 2010183842
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これらの結果をプロットし、１次直線に回帰したところ、次の式を得た。回帰曲線を図１に示す。下記式において、ｘは、ポリメラーゼ活性のユニット、ｙは、蛍光強度を示す。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性は、６５℃において３０分間に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを酸不溶性画分に取り込む酵素量を１ｕｎｉｔとする。
ｙ＝３３．７２５ｘ＋９６．５６８ (Ｒ２＝０．９９５２) When these results were plotted and returned to a linear line, the following equation was obtained. The regression curve is shown in FIG. In the following formula, x represents a unit of polymerase activity, and y represents fluorescence intensity. In addition, for the DNA polymerase activity, the amount of enzyme that incorporates 10 nmol of dNTP into the acid-insoluble fraction in 30 minutes at 65 ° C. is defined as 1 unit.
y = 33.725x + 96.568 (R 2 = 0.99952)

また、測定した精製酵素標品（ΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼ）は、反応温度６０℃における蛍光強度が、平均２７３．５５２(１回目２６８．０１２、２回目２７９．０９１)、６５℃における蛍光強度が、平均３０４．８３７(１回目３１６．１７８、２回目２９３．４９５)、７０℃における蛍光強度が、平均２５４．２９８(１回目２７０．３９０、２回目２３８．２０５)を示した。このため、前記回帰直線式より、６０℃では約５．２５ｕｎｉｔ、６５℃では約６．１８ｕｎｉｔ、７０℃では約４．６８ｕｎｉｔと算出された。この結果から、実施例２で得られた精製酵素標品は、ＤＮＡポリメラーゼであることが確認できた。以下、精製酵素標品を、ΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼともいう。   The measured purified enzyme preparation (ΔNGca DNA polymerase) has an average fluorescence intensity at a reaction temperature of 60 ° C. of 273.552 (first time 268.012, second time 279.091) and an average fluorescence intensity at 65 ° C. 304.837 (first time 316.178, second time 293.495), the fluorescence intensity at 70 ° C. showed an average of 254.298 (first time 270.390, second time 238.205). Therefore, from the regression line equation, it was calculated to be about 5.25 units at 60 ° C, about 6.18 units at 65 ° C, and about 4.68 units at 70 ° C. From this result, it was confirmed that the purified enzyme preparation obtained in Example 2 was a DNA polymerase. Hereinafter, the purified enzyme preparation is also referred to as ΔNGa DNA polymerase.

［相補鎖置換型複製活性測定］
前述の非特許文献２（Notomi, T. et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 12, e63）に記載された方法に従って、活性測定を行った。まず、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、０．８μＭ ＦＩＰ、０．８μＭ ＢＩＰ、０．２μＭ Ｆ３、０．２μＭ Ｂ３の各合成ＤＮＡ、１Ｍベタイン、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％トリトンＸ−１００、２−４ｍＭ硫酸マグネシウムの混合物２０μｌを調製した。これを９５℃で５分間放置し、次いで、氷上で５分間放置した。これに前述の精製酵素標品５μｌを加えて所定の反応温度（６３℃〜７４℃）で１時間放置した後、アガロースゲル電気泳動に供した。この際、単位が既知であるＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を同様にして電気泳動に供した。そして、精製酵素標品の電気泳動後の精製物のバンドの濃さと、単位が既知のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの電気泳動後の精製物のバンドの濃さとを比較することにより、相対値としての酵素単位を算出した。なお、ブランクとして、前記精製酵素標品に代えて、前記トリス塩酸緩衝液を添加したものについても電気泳動を行った。また、ネガティブコントロールとして、鋳型ＤＮＡを添加しないものについても電気泳動を行った。これらの結果を、図２に示す。 [Measurement of complementary strand displacement replication activity]
The activity was measured according to the method described in Non-Patent Document 2 (Notomi, T. et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 12, e63). First, each synthetic DNA of M13mp18 single-stranded DNA, 0.8 μM FIP, 0.8 μM BIP, 0.2 μM F3, 0.2 μM B3, 1 M betaine, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.8), 10 mM potassium chloride, A 20 μl mixture of 10 mM ammonium sulfate, 0.1% Triton X-100, 2-4 mM magnesium sulfate was prepared. This was left at 95 ° C. for 5 minutes and then on ice for 5 minutes. To this was added 5 μl of the above-mentioned purified enzyme preparation and left at a predetermined reaction temperature (63 ° C. to 74 ° C.) for 1 hour, and then subjected to agarose gel electrophoresis. At this time, Bst DNA polymerase (large fragment) having a known unit was subjected to electrophoresis in the same manner. Then, by comparing the band density of the purified product after electrophoresis of the purified enzyme preparation with the band density of the purified product after electrophoresis of Bst DNA polymerase having a known unit, the enzyme unit as a relative value is obtained. Calculated. In addition, it electrophoresed also about what added the said tris hydrochloric acid buffer instead of the said purified enzyme sample as a blank. Further, as a negative control, electrophoresis was also performed for those not added with template DNA. These results are shown in FIG.

図２は、所定の温度で増幅させた遺伝子増幅産物の電気泳動写真である。同図において、レーン１および１９は、分子量マーカー（λ−ＳｔｙＩ）の結果であり、レーン２、５および１８は、ブランクの結果であり、レーン４は、ネガティブコントロールの結果（w／ｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ）である。レーン３は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を用いた結果であり、レーン６〜１７は、前記精製酵素標品（ΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼ）を用いた結果である。なお、図中に、各レーンにおける反応温度（℃）を記載する。   FIG. 2 is an electrophoresis photograph of a gene amplification product amplified at a predetermined temperature. In the figure, lanes 1 and 19 are the results of the molecular weight marker (λ-StyI), lanes 2, 5 and 18 are the results of the blank, and lane 4 is the result of the negative control (w / o template). It is. Lane 3 is the result using Bst DNA polymerase (large fragment), and lanes 6 to 17 are the results using the purified enzyme preparation (ΔNGaca DNA polymerase). In the figure, the reaction temperature (° C.) in each lane is described.

図２に示すように、精製酵素標品、すなわち、実施例２で得られたΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼは、相補鎖置換型複製活性を有することが確認された。また、さらに、高温領域（約７１．２℃までの高温領域）で、前記活性が確認された。このように、高温領域での活性が認められることから、ΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼは、高温で安定な酵素であることがわかる。   As shown in FIG. 2, it was confirmed that the purified enzyme preparation, that is, ΔNGca DNA polymerase obtained in Example 2, has complementary strand displacement replication activity. Furthermore, the activity was confirmed in a high temperature region (a high temperature region up to about 71.2 ° C.). Thus, since activity in a high temperature region is recognized, it can be seen that ΔNGca DNA polymerase is a stable enzyme at high temperatures.

［等温増幅］
三谷らの方法（例えば、特許文献４（特許第３８６７９２６）、特許文献５参照）に従い、核酸の等温増幅を行った。下記組成を有する反応液１０μｌを調製し、これを６５℃で６０分間反応させた。この反応を、Ｍｘ３０００Ｐ（商品名、Stratagene社製）を用いて、リアルタイムでモニタリングした。比較例としては、ΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼに代えて、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を、下記反応液において終濃度０．６４ユニット／μｌとなるように添加し、同様にしてリアルタイムでモニタリングを行った。これらの結果を図３に示す。 [Isothermal amplification]
Nucleic acid was isothermally amplified according to the method of Mitani et al. (For example, see Patent Document 4 (Patent No. 3867926) and Patent Document 5). 10 μl of a reaction solution having the following composition was prepared and reacted at 65 ° C. for 60 minutes. This reaction was monitored in real time using Mx3000P (trade name, manufactured by Stratagene). As a comparative example, instead of ΔN GcaDNA polymerase, commercially available BstDNA polymerase (large fragment) was added to a final concentration of 0.64 units / μl in the following reaction solution, and real-time monitoring was performed in the same manner. . These results are shown in FIG.

Figure 2010183842
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プライマー配列
ＥＮＺＯ：5’-CGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3’ （配列番号１７）
ＳＭＡＰ：5’-TTTATATATATATAAACCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3’（配列番号１８）
Ｌｏｏｐ：5’-ATCCGGATGTAGGATC-3’ （配列番号１９）
Outer forward：5’-GATGGTGACCACCTCGAC-3’ （配列番号２０）
Outer reverse：5’-TGTACCCTTCCTCCCTCG-3’ （配列番号２１） Primer sequence ENZO: 5'-CGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3 '(SEQ ID NO: 17)
SMAP: 5'-TTTATATATATATAAACCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3 '(SEQ ID NO: 18)
Loop: 5'-ATCCGGATGTAGGATC-3 '(SEQ ID NO: 19)
Outer forward: 5'-GATGGTGACCACCTCGAC-3 '(SEQ ID NO: 20)
Outer reverse: 5'-TGTACCCTTCCTCCCTCG-3 '(SEQ ID NO: 21)

図３は、等温増幅をリアルタイムでモニタリングした、サイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフである。同図において、■が、ΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼを用いた実施例５−１の結果、▲が、■の２倍濃度のΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼを用いた実施例５−２の結果、●が、市販ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いた比較例の結果である。同図に示すように、ΔＮ ＧｃａＤＮＡポリメラーゼを用いた実施例５−１（■）によれば、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いた比較例（●）よりも速く目的配列が増幅された。さらに、実施例５−２（▲）に示すように、酵素濃度を増加させることによって、目的配列の増幅がより一層促進された。なお、増幅物の塩基配列を決定したところ、目的配列が増幅されていることが確認できた。核酸増幅の分野においては、分刻みで増幅時間を短縮することが望まれている。したがって、本発明のＧｃａＤＮＡポリメラーゼによれば、従来のＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅法よりも、十分な短縮化を図ることができるといえる。   FIG. 3 is a graph showing the relationship between the number of cycles and the fluorescence intensity, in which isothermal amplification is monitored in real time. In the figure, ■ indicates the result of Example 5-1 using ΔNGca DNA polymerase, ▲ indicates the result of Example 5-2 using ΔN GcaDNA polymerase twice the concentration of ■, and ● indicates the commercially available Bst DNA polymerase. It is a result of the comparative example using this. As shown in the figure, according to Example 5-1 (■) using ΔNGca DNA polymerase, the target sequence was amplified faster than the comparative example (●) using commercially available Bst DNA polymerase. Furthermore, as shown in Example 5-2 (▲), amplification of the target sequence was further promoted by increasing the enzyme concentration. When the base sequence of the amplified product was determined, it was confirmed that the target sequence was amplified. In the field of nucleic acid amplification, it is desired to shorten the amplification time in increments of minutes. Therefore, according to the Gca DNA polymerase of the present invention, it can be said that a sufficient shortening can be achieved as compared with the isothermal amplification method using the conventional DNA polymerase.

図１は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定に使用した標準曲線を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing a standard curve used for measurement of DNA polymerase activity. 図２は、本発明の一実施例において、ＧｃａＤＮＡポリメラーゼおよび市販ＤＮＡポリメラーゼを用いて、６３℃〜７４℃における相補鎖置換複製酵素活性を測定した結果を示す電気泳動写真である。FIG. 2 is an electrophoresis photograph showing the results of measuring the complementary strand displacement replication enzyme activity at 63 ° C. to 74 ° C. using Gca DNA polymerase and a commercially available DNA polymerase in one example of the present invention. 図３は、本発明のその他の実施例において、ＧｃａＤＮＡポリメラーゼおよび市販ＤＮＡポリメラーゼを用いて、等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing an amplification profile when an isothermal amplification reaction is carried out using Gca DNA polymerase and a commercially available DNA polymerase in another example of the present invention.

Claims (17)

以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
（ａ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、Ｎ末端から１〜５１個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）いずれか記載のタンパク質の有するアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質 A DNA polymerase comprising any of the following proteins (a) to (d):
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (b) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (c) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 from the N-terminus Protein in which any number of consecutive amino acid residues of 1 to 51 are deleted (d) In the amino acid sequence of the protein according to any one of (a) to (c), one or several amino acids are deleted A protein comprising an amino acid sequence substituted, inserted or added and having DNA polymerase activity ６３℃〜７１．２℃の範囲における少なくともいずれかの温度において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。   The DNA polymerase according to claim 1, which has a DNA polymerase activity at at least any temperature within a range of 63 ° C to 71.2 ° C. 前記ＤＮＡポリメラーゼ活性が、相補鎖置換複製酵素活性を含む請求項１または２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。   The DNA polymerase according to claim 1 or 2, wherein the DNA polymerase activity comprises complementary strand displacement replication enzyme activity. 前記ＤＮＡポリメラーゼ活性が、逆転写酵素活性を含む請求項１から３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。   The DNA polymerase according to any one of claims 1 to 3, wherein the DNA polymerase activity includes reverse transcriptase activity. ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。   The DNA polymerase according to any one of claims 1 to 4, which lacks 5 'to 3' exonuclease activity. ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。   The DNA polymerase according to any one of claims 1 to 5, which has 3 'to 5' exonuclease activity. ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。   The DNA polymerase according to any one of claims 1 to 5, which lacks 3 '→ 5' exonuclease activity. 以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）前記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列との相同性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡであり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）前記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡであり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ DNA which is any of the following (a) to (e):
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13
(B) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 15
(C) DNA that hybridizes with the DNA of (a) or (b) under stringent conditions and encodes a protein having DNA polymerase activity
(D) DNA consisting of a base sequence having a homology of 80% or more with the base sequence described in (a) or (b) above, and encoding a protein having DNA polymerase activity
(E) a protein having a DNA polymerase activity, which is DNA consisting of a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence described in (a) or (b) above; DNA encoding 請求項８に記載のＤＮＡを含む組み換えベクター。   A recombinant vector comprising the DNA according to claim 8. 請求項９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。   A transformant comprising the recombinant vector according to claim 9. 請求項１０に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼの製造方法。   A method for producing a DNA polymerase, comprising culturing the transformant according to claim 10 and collecting the DNA polymerase from the resulting culture. 鋳型核酸と、プライマーと、請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼとを、一定温度で反応させることを特徴とする核酸増幅方法。   A nucleic acid amplification method comprising reacting a template nucleic acid, a primer, and the DNA polymerase according to any one of claims 1 to 7 at a constant temperature. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅キット。   A nucleic acid amplification kit comprising the DNA polymerase according to any one of claims 1 to 7. バシラス属またはジェオバシラス属由来の細菌からＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローン化する方法であって、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を含むことを特徴とする方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２〜４のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子断片とｍｕｔＭ遺伝子断片とを含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｂ）前記工程（ａ）で増幅した前記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で決定した前記ＤＮＡ断片のセンス鎖の部分配列からなるプライマーと、前記ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｄ）前記工程（ｃ）で増幅されたＤＮＡ断片をクローン化する工程 A method for cloning a DNA polymerase gene from a bacterium belonging to the genus Bacillus or Geobacillus, comprising the following steps (a) to (d):
(A) using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 4, and using the genomic DNA extracted from the bacteria as a template, (b) amplifying a DNA fragment containing a mutM gene fragment (b) determining the base sequence of the DNA fragment amplified in the step (a) (c) sense strand of the DNA fragment determined in the step (b) A step of amplifying a DNA fragment containing the polA gene using a primer consisting of a partial sequence of the above and a primer consisting of a partial sequence of the antisense strand of the DNA fragment using the genomic DNA extracted from the bacterium as a template (d) The step of cloning the DNA fragment amplified in (c) 前記（ｃ）工程において、前記ＤＮＡ断片のセンス鎖の部分配列からなるプライマーが、配列番号８〜１０のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーであり、前記ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーが、配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーである請求項１４記載のクローン化する方法。   In the step (c), the primer consisting of the partial sequence of the sense strand of the DNA fragment is a primer consisting of the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 8 to 10, and the partial sequence of the antisense strand of the DNA fragment The method for cloning according to claim 14, wherein the primer consisting of is a primer consisting of the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 5 to 7. 請求項８に記載のＤＮＡの塩基配列またはその相補的な塩基配列において、連続する５〜５０塩基のＤＮＡからなり、且つ、ジェオバシラス属由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と特異的にハイブリダイズすることを特徴とするプライマー。   The base sequence of the DNA according to claim 8 or a complementary base sequence thereof, comprising a continuous 5 to 50 base DNA and specifically hybridizing with a DNA polymerase gene derived from the genus Geobacillus, Primer to do. 請求項８に記載のＤＮＡの塩基配列またはその相補的な塩基配列が、配列番号１５で表される塩基配列またはその相補的な塩基配列である請求項１６記載のプライマー。   The primer according to claim 16, wherein the base sequence of the DNA according to claim 8 or a complementary base sequence thereof is the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or a complementary base sequence thereof.
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