JP4170082B2 - Microarray and manufacturing method thereof - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性物質を固相基板に固定化してなるマイクロアレイおよびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロアレイのシグナル検出において、マイクロアレイ基板への試料の非特異的な結合・吸着は信号対雑音比を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（たとえば非特許文献１参照）。生理活性物質の固定化工程前の基板表面には、生理活性物質を効率良く固定化するための化学的修飾が施されることが通常であり、たとえば生理活性物質が核酸の場合、アルデヒド基を導入したものが多用されている。官能基が活性な状態のままであると、試料の非特異的な結合・吸着が起こるため、固定化工程後に未反応の官能基の不活性化処理（ブロッキング処理）を行う必要がある（非特許文献２、および、非特許文献３を参照）。
【０００３】
従来のブロッキング処理は、アルブミン、トリス、スキムミルクに代表されるような物質を基板上に吸着させて官能基を遮蔽する方法が主流であった。しかしながら、この方法では、官能基の遮蔽により試料の基板への化学結合、化学吸着を抑制することは可能であるものの、基板への物理的吸着を抑制することはできず、シグナル検出精度を低下させる原因となっていた。
【０００４】
【非特許文献１】
「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57
【非特許文献２】
「細胞工学別冊 ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」、P.22、秀潤社、2000年
【非特許文献３】
「ＤＮＡチップ技術とその応用」、「蛋白質 核酸 酵素 43(13)」、君塚房夫、加藤郁之進著、共立出版、1998年、pp.2004〜2011
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、検出対象物質の非特異的な吸着・結合量が少なく検出精度の高いマイクロアレイを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の通りである。
（１）表面に生理活性物質が固定されており、該生理活性物質との相互作用により目標物質を捕捉し、その捕捉量の情報を検出するマイクロアレイであって、生理活性物質が固定されていない部分に負電荷を有する物質が導入されていることを特徴とするマイクロアレイであって、生理活性物質の固定および負電荷を有する物質の導入が、同種の官能基であるアルデヒド基を介してなされ、負電荷を有する物質が亜硫酸イオンであるマイクロアレイ。
（２）捕捉される目標物質が核酸である（１）記載のマイクロアレイ。
（３）表面に固定されている生理活性物質が核酸である（１）又は（２）記載のマイクロアレイ。
（４）アルデヒド基が、アミノアルキルシランのアミノ基を介して結合した多官能性アルデヒドに由来する（１）〜（３）いずれか記載のマイクロアレイ。
（５）生理活性物質がアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドである（１）〜（４）記載いずれかのマイクロアレイ。
（６）基板がプラスチック製である（１）〜（５）いずれか記載のマイクロアレイ。
（７）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（６）記載のマイクロアレイ。
（８）基板表面へのアルデヒド基導入工程、基板上への生理活性物質の固定化工程、負電荷を有する物質の導入工程を含むマイクロアレイの製造方法であって、負電荷を有する物質の導入工程が亜硫酸水素ナトリウム溶液への接触工程を含むマイクロアレイの製造方法。
（９）アミノアルキルシラン溶液への基板の接触工程、および、グルタルアルデヒド溶液への基板の接触工程を含む（８）記載のマイクロアレイの製造方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
（基板の表面処理）
アルデヒド基は多くの生理活性物質に含まれているアミノ基との反応性が高いため、本発明のマイクロアレイに使用するマイクロアレイ基板表面にはアルデヒド基を導入することが好ましい。
基板表面へのアルデヒド基の導入方法として好適に用いられるのは、アミノ基導入の後に多官能性アルデヒドを反応させる方法である。基板表面へのアミノ基の導入には、アミノアルキルシラン処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティングなどの方法を用いることができるが、処理の簡便性、均一性の観点から、アミノアルキルシラン処理が好ましい。アミノアルキルシラン処理は、アミノアルキルシラン溶液への基板の浸漬および熱処理によることが好ましい。アミノアルキルシラン溶液の濃度は、アミノ基の導入効率の観点から、０．１〜１０％が好ましく、０．１〜５％がより好ましく、さらに好ましくは１〜５％である。アミノ基の導入後に反応させる多官能性アルデヒドとしては、グルタルアルデヒド、オキサルアルデヒド、テレフタルアルデヒド、イソフタルアルデヒド、マロン酸ジアルデヒド、酒石酸ジアルデヒド、コハク酸ジアルデヒド、マレイン酸ジアルデヒド、フマル酸ジアルデヒド、デキストランジアルデヒド、過ヨウ素酸により酸化された糖類などを好ましく用いることができ、最も好ましくはグルタルアルデヒドである。基板表面のアミノ基とグルタルアルデヒドとの反応は、基板をグルタルアルデヒド溶液に浸漬する方法を好ましく用いることができる。グルタルアルデヒド溶液の濃度は、アミノ基とアルデヒド基の反応効率の観点から、好ましくは０．１〜２０％であり、０．５〜１０％がより好ましく、１〜５％がさらに好ましい。
【０００８】
（核酸の固定化）
以下、生理活性物質として核酸を用いる場合について記述する。核酸を固定化する際、基板上のアルデヒド基との反応性を高めるため、核酸に予めアミノ基を導入することが好ましい。アミノ基の導入位置は核酸の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが好ましい。核酸の基板上への固定化は、核酸溶液を基板上に点着して行うことが好ましい。点着後には必要に応じて熱処理、紫外線照射、所定時間の静置などの後処理を施すことができる。
【０００９】
（ブロッキング）
核酸の固定化後、基板上には未反応のアルデヒド基が残存しており、このままの状態で核酸溶液を接触させると基板表面への非特異的吸着が起こり易く、検出精度が低下する。そのため、核酸の固定化後にアルデヒド基のブロッキング処理を行う必要がある。従来の一般的なブロッキング処理では、基板上のアルデヒド基にアルブミンやトリスなど、核酸のハイブリダイゼーション反応に無関係な物質を結合させることによりアルデヒド基を不活性化する。しかしながらこの方法では、核酸の物理的吸着を抑える効果は期待できないため、検出精度の向上には限界がある。
【００１０】
核酸は主鎖のリン酸基に由来する負電荷を帯びているため、基板上に負電荷が存在すると静電的反発により基板への吸着は抑制される。すなわち、基板上に負電荷を付与することにより検出精度の高いマイクロアレイの作製が可能となる。基板上に負電荷を付与する方法として好適に用いられるのは、基板上のアルデヒド基への亜硫酸イオンの付加反応である。亜硫酸イオンの硫黄原子には非共有電子対が存在し、これがアルデヒド基のカルボニル炭素に求核付加する（「有機合成化学」飯田弘忠著、培風館、p.70、1995年）。アルデヒドの亜硫酸水素ナトリウム付加物は電離状態で負電荷を有することから、核酸との静電的反発により非特異的吸着が抑制される。亜硫酸イオンの付加の方法としては、亜硫酸水素ナトリウム溶液への基板の浸漬が好ましい。亜硫酸水素ナトリウムの濃度は、ブロッキング効率の観点から、好ましくは０．０１〜２０％、より好ましくは０．５〜１０％であり、さらに好ましくは１〜１０％である。
【００１１】
基板上に負電荷を付与する他の方法として、アルデヒド基との結合性を有する官能基と負電荷を併せ持つ物質によるブロッキングが挙げられる。たとえば、アルデヒド基との結合性の高いアミノ基、ヒドラジド基などと負電荷を併せ持つ物質を用いてブロッキングを行うことにより、静電的反発による核酸の吸着抑制効果が現れる。
【００１２】
また、負電荷を有する高分子化合物の核酸固定化後の基板へのコーティングによっても負電荷を付与することが可能であるが、バックグラウンド蛍光量の上昇を回避するため、低蛍光性の高分子化合物を用いることが好ましい。負電荷を有する高分子化合物としては、たとえば、ポリアクリル酸に代表されるカルボキシル基を含有する合成高分子、その他の解離基を有する合成高分子、カルボキシメチルセルロース、デキストラン誘導体などの天然由来高分子などを用いることができる。このとき、高分子化合物にアルデヒド基との結合性の高い官能基を導入することにより、ブロッキング効率はさらに向上する。
【００１３】
（基板の素材）
マイクロアレイ用基板の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、熱可塑性樹脂が好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
【００１４】
【実施例】
（実施例１）
飽和環状ポリオレフィンを材料として、射出成形法により７６×２４×１ｍｍの板状基板を作製した。基板を酸素雰囲気下のプラズマ処理により親水化処理した後、γ−アミノプロピルトリメトキシシランの２％水溶液に室温で浸漬後、純水でリンスしたのち、乾燥オーブン中、４５℃で２時間処理することにより、基板表面にアミノ基を導入した。引き続き、基板をグルタルアルデヒドの１％水溶液（ｐＨ７．４に調整）に３７℃で２時間浸漬することで基板表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させた。基板を純水で洗浄、風乾し、評価に供した。
【００１５】
評価１： ５'末端にアミノ基を導入したオリゴＤＮＡ（オリゴ１と略称、倉敷紡績（株）製、塩基配列は、５'−TAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG−３'）を０．１μｇ／μｌの濃度でスポッティング溶液（TeleChem International, Inc. 製「Micro Spotting Solution」）に溶解し、マイクロアレイスポッター（ニチリョー製スポッター「ＣＨＯＴ」）を用いて上記の基板上に点着した。点着後、基板を８０℃にて１時間ベーキングすることでオリゴ１を基板上に固定化した。亜硫酸水素ナトリウム（和光純薬工業（株）製、試薬特級）を２％の濃度で純水に溶解した
溶液に、ベーキング後の基板を１時間浸漬することでブロッキング処理を施した。ブロッキング処理後、基板を純水で洗浄し、風乾した。
５'末端にローダミン標識を施したオリゴＤＮＡ（オリゴ２と略称、倉敷紡績（株）製、塩基配列は、５'−CATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA−３'）を２０ｎｇ／μｌの濃度でハイブリ用緩衝液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸３ナトリウム、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液）に溶解した。この溶液をブロッキング処理後の基板上に展開し、カバーグラスを被せたのち、６５℃で３時間静置することでハイブリダイゼーション反応を進行させた。基板からカバーグラスを除去し、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液および純水で洗浄、風乾後、ハイブリダイズしたオリゴ２の蛍光量を測定した。
【００１６】
評価２： アルデヒド導入後の基板に、ＤＮＡを点着しないまま、評価１の方法で亜硫酸イオンによるブロッキング処理を施した。オリゴ２を評価１の方法で２０ｎｇ／μｌの濃度に調製した溶液を基板上に点着し、洗浄した。洗浄後に基板上に残存したオリゴ２の蛍光量を測定した。
【００１７】
（比較例１）
実施例１と同様にプラスチック基板にアルデヒド基を導入した。
評価１： 実施例１と同様にオリゴ１を固定化した。ブロッキング処理を施さないまま、基板を純水で洗浄した。実施例１と同様にオリゴ２をハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイズしたオリゴ２の蛍光量を測定した。
評価２： アルデヒド導入後の基板に、ブロッキング処理を施さないままオリゴ２を２０ｎｇ／μｌの濃度に調製した溶液を基板上に点着し、洗浄した。洗浄後に基板上に残存したオリゴ２の蛍光量を測定した。
【００１８】
（比較例２）
実施例１と同様にプラスチック基板にアルデヒド基を導入した。
評価１： 実施例１と同様にオリゴ１を固定化した。スキムミルク（和光純薬工業（株）製）を１％の濃度で純水に溶解した溶液に基板を１時間浸漬することでブロッキング処理を施した。ブロッキング処理後、基板を純水で洗浄した。実施例１と同様にオリゴ２をハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイズしたオリゴ２の蛍光量を測定した。
評価２： アルデヒド導入後の基板に、ＤＮＡを点着しないまま、評価１の方法でスキムミルクによるブロッキング処理を施した。オリゴ２を２０ｎｇ／μｌの濃度に調製した溶液を基板上に点着し、洗浄した。洗浄後に基板上に残存したオリゴ２の蛍光量を測定した。
【００１９】
（比較例３）
実施例１と同様にプラスチック基板にアルデヒド基を導入した。
評価１： 実施例１と同様にオリゴ１を固定化した。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（和光純薬工業（株）製、試薬特級）を０．１Ｍの濃度で純水に溶解し、塩酸でｐＨを８に調整した。この溶液に基板を１時間浸漬することでブロッキング処理を施した。ブロッキング処理後、基板を純水で洗浄した。実施例１と同様にオリゴ２をハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイズしたオリゴ２の蛍光量を測定した。
評価２： アルデヒド導入後の基板に、ＤＮＡを点着しないまま、評価１の方法でトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンによるブロッキング処理を施した。オリゴ２を２０ｎｇ／μｌの濃度に調製した溶液を基板上に点着し、洗浄した。洗浄後に基板上に残存したオリゴ２の蛍光量を測定した。
【００２０】
実施例および比較例における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、評価１においては、励起波長５５５ｎｍ、測定波長５７０ｎｍ、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度４５％、解像度３０ｎｍであり、評価２においては、励起波長５５５ｎｍ、測定波長５７０ｎｍ、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度７０％、解像度３０ｎｍであった。
【００２１】
評価１の結果を表１に示す。実施例１と比較例１〜３で同等の蛍光量となり、本発明のマイクロアレイを用いてハイブリダイゼーション反応が検出可能であることが示された。
評価２の結果を表２に示す。実施例１においてオリゴＤＮＡの吸着量が有意に低く、本発明のマイクロアレイは非特異的な吸着が抑制されていることが示された。
【００２２】
【表１】
【表２】
【発明の効果】
本発明によれば、検出対象物質の非特異的な吸着・結合量が少なく検出精度の高いマイクロアレイを得ることができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a microarray in which a physiologically active substance is immobilized on a solid phase substrate and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
In microarray signal detection, non-specific binding / adsorption of a sample to a microarray substrate causes a reduction in the signal-to-noise ratio, thereby reducing detection accuracy (see Non-Patent Document 1, for example). The surface of the substrate before the step of immobilizing the physiologically active substance is usually chemically modified to efficiently immobilize the physiologically active substance. For example, when the physiologically active substance is a nucleic acid, an aldehyde group is added. What was introduced is used a lot. If the functional group remains in an active state, non-specific binding / adsorption of the sample occurs. Therefore, it is necessary to inactivate the unreacted functional group (blocking treatment) after the immobilization step (non-blocking). (See Patent Literature 2 and Non-Patent Literature 3).
[0003]
In the conventional blocking treatment, a method in which a functional group is shielded by adsorbing a substance typified by albumin, Tris, or skim milk on a substrate has been the mainstream. However, this method can suppress chemical bonding and chemical adsorption of the sample to the substrate by blocking the functional group, but cannot suppress physical adsorption to the substrate, thus reducing the signal detection accuracy. It was a cause.
[0004]
[Non-Patent Document 1]
“DNA Microarray Practice Manual”, Yoshihide Hayashizaki, Koji Okazaki, Yodosha, 2000, p.57
[Non-Patent Document 2]
"Cell engineering separate volume DNA microarray and latest PCR method", P.22, Shujunsha, 2000 [Non-patent document 3]
"DNA chip technology and its application", "Protein Nucleic Acid Enzyme 43 (13)", Fumio Kimizuka, Yasuyuki Kato, Kyoritsu Publishing, 1998, pp. 2004-2011
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a microarray with a small amount of nonspecific adsorption / binding of a substance to be detected and high detection accuracy.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present invention is as follows.
(1) A microarray in which a physiologically active substance is immobilized on the surface, captures a target substance by interaction with the physiologically active substance, and detects information on the amount captured, and the physiologically active substance is not immobilized A microarray characterized in that a substance having a negative charge is introduced into a part thereof, wherein a physiologically active substance is immobilized and a substance having a negative charge is introduced through an aldehyde group which is a functional group of the same kind, A microarray in which a substance having a negative charge is a sulfite ion .
(2) The microarray according to (1), wherein the target substance to be captured is a nucleic acid.
(3) The microarray according to (1) or (2), wherein the physiologically active substance immobilized on the surface is a nucleic acid.
( 4 ) The microarray according to any one of (1) to ( 3 ), wherein the aldehyde group is derived from a polyfunctional aldehyde bonded via an amino group of an aminoalkylsilane.
( 5 ) The microarray according to any one of (1) to ( 4 ), wherein the physiologically active substance is an oligonucleotide into which an amino group is introduced.
( 6 ) The microarray according to any one of (1) to ( 5 ), wherein the substrate is made of plastic.
( 7 ) The microarray according to ( 6 ), wherein the plastic is a saturated cyclic polyolefin.
( 8 ) A microarray manufacturing method including an aldehyde group introduction step on the substrate surface, a physiologically active substance immobilization step on the substrate, and a negative charge substance introduction step , the negative charge introduction substance introduction step A method for producing a microarray, comprising a step of contacting with a sodium bisulfite solution .
( 9 ) The method for producing a microarray according to ( 8 ), comprising a step of contacting the substrate with the aminoalkylsilane solution and a step of contacting the substrate with the glutaraldehyde solution.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(Surface treatment of substrate)
Since the aldehyde group has a high reactivity with the amino group contained in many physiologically active substances, it is preferable to introduce the aldehyde group on the surface of the microarray substrate used in the microarray of the present invention.
As a method for introducing an aldehyde group onto the substrate surface, a method in which a polyfunctional aldehyde is reacted after the introduction of an amino group is used. For introduction of amino groups onto the substrate surface, methods such as aminoalkylsilane treatment, plasma treatment in a nitrogen atmosphere, and coating of amino group-containing polymer materials can be used. From the viewpoint, aminoalkylsilane treatment is preferred. The aminoalkylsilane treatment is preferably performed by immersing the substrate in an aminoalkylsilane solution and heat treatment. The concentration of the aminoalkylsilane solution is preferably 0.1 to 10%, more preferably 0.1 to 5%, and further preferably 1 to 5% from the viewpoint of amino group introduction efficiency. Multifunctional aldehydes to be reacted after the introduction of amino groups include glutaraldehyde, oxalaldehyde, terephthalaldehyde, isophthalaldehyde, malonic acid dialdehyde, tartaric acid dialdehyde, succinic acid dialdehyde, maleic acid dialdehyde, and fumaric acid dialdehyde. , Dextran dialdehyde, saccharides oxidized by periodic acid, and the like can be preferably used, and most preferably glutaraldehyde. For the reaction between the amino group on the substrate surface and glutaraldehyde, a method of immersing the substrate in a glutaraldehyde solution can be preferably used. The concentration of the glutaraldehyde solution is preferably 0.1 to 20%, more preferably 0.5 to 10%, and even more preferably 1 to 5%, from the viewpoint of the reaction efficiency of the amino group and the aldehyde group.
[0008]
(Immobilization of nucleic acid)
Hereinafter, the case where a nucleic acid is used as a physiologically active substance will be described. When immobilizing the nucleic acid, it is preferable to introduce an amino group into the nucleic acid in advance in order to increase the reactivity with the aldehyde group on the substrate. The amino group may be introduced at the molecular chain end or side chain of the nucleic acid, but is preferably introduced at the molecular chain end. The nucleic acid is preferably immobilized on the substrate by spotting the nucleic acid solution on the substrate. After spotting, post-treatment such as heat treatment, ultraviolet irradiation, and standing for a predetermined time can be performed as necessary.
[0009]
(blocking)
After immobilization of the nucleic acid, an unreacted aldehyde group remains on the substrate. When the nucleic acid solution is brought into contact with the nucleic acid solution in this state, nonspecific adsorption to the substrate surface easily occurs, and the detection accuracy decreases. Therefore, it is necessary to perform an aldehyde group blocking treatment after the nucleic acid is immobilized. In a conventional general blocking treatment, an aldehyde group is inactivated by binding a substance unrelated to the hybridization reaction of nucleic acid such as albumin or Tris to the aldehyde group on the substrate. However, this method cannot be expected to suppress the physical adsorption of nucleic acids, so there is a limit to improving detection accuracy.
[0010]
Since the nucleic acid has a negative charge derived from the phosphate group of the main chain, if a negative charge exists on the substrate, adsorption to the substrate is suppressed by electrostatic repulsion. That is, it is possible to produce a microarray with high detection accuracy by applying a negative charge on the substrate. A preferred method for imparting a negative charge on the substrate is an addition reaction of sulfite ions to aldehyde groups on the substrate. The sulfur atom of the sulfite ion has an unshared electron pair, which nucleophilically adds to the carbonyl carbon of the aldehyde group (“Synthetic Organic Chemistry” by Hirotada Iida, Bafukan, p.70, 1995). Since the sodium bisulfite adduct of aldehyde has a negative charge in an ionized state, nonspecific adsorption is suppressed by electrostatic repulsion with nucleic acid. As a method for adding sulfite ions, it is preferable to immerse the substrate in a sodium hydrogen sulfite solution. The concentration of sodium bisulfite is preferably 0.01 to 20%, more preferably 0.5 to 10%, and further preferably 1 to 10%, from the viewpoint of blocking efficiency.
[0011]
As another method for imparting a negative charge on the substrate, blocking by a substance having both a negative charge and a functional group capable of binding to an aldehyde group can be mentioned. For example, blocking using a substance having a negative charge with an amino group, hydrazide group, or the like that has a high binding property to an aldehyde group exhibits an effect of suppressing nucleic acid adsorption due to electrostatic repulsion.
[0012]
In addition, a negative charge can be imparted by coating a negatively charged polymer compound on a substrate after nucleic acid immobilization, but in order to avoid an increase in background fluorescence, a low fluorescence polymer It is preferable to use a compound. Examples of the negatively charged polymer compound include synthetic polymers containing a carboxyl group typified by polyacrylic acid, synthetic polymers having other dissociating groups, naturally-derived polymers such as carboxymethyl cellulose and dextran derivatives, etc. Can be used. At this time, blocking efficiency is further improved by introducing a functional group having a high binding property with an aldehyde group into the polymer compound.
[0013]
(Substrate material)
The material for the microarray substrate can be glass, plastic, metal, or the like, but a thermoplastic resin is preferable from the viewpoint of ease of surface treatment and mass productivity. As the thermoplastic resin, those having a small amount of fluorescence generation are preferable, for example, linear polyolefins such as polyethylene and polypropylene, cyclic polyolefins, fluorine-containing resins, etc. are preferably used, heat resistance, chemical resistance, low fluorescence, It is more preferable to use a saturated cyclic polyolefin that is particularly excellent in moldability. Here, the saturated cyclic polyolefin refers to a saturated polymer obtained by hydrogenating a polymer having a cyclic olefin structure or a copolymer of a cyclic olefin and an α-olefin.
[0014]
【Example】
(Example 1)
Using a saturated cyclic polyolefin as a material, a plate-like substrate of 76 × 24 × 1 mm was produced by an injection molding method. The substrate is hydrophilized by plasma treatment in an oxygen atmosphere, immersed in a 2% aqueous solution of γ-aminopropyltrimethoxysilane at room temperature, rinsed with pure water, and then treated at 45 ° C. for 2 hours in a drying oven. As a result, amino groups were introduced onto the substrate surface. Subsequently, the amino group on the substrate surface was reacted with glutaraldehyde by immersing the substrate in a 1% aqueous solution of glutaraldehyde (adjusted to pH 7.4) at 37 ° C. for 2 hours. The substrate was washed with pure water and air-dried for evaluation.
[0015]
Evaluation 1: A spotting solution of an oligo DNA introduced with an amino group at the 5 ′ end (abbreviated as oligo 1; manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd., base sequence: 5′-TAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG-3 ′) at a concentration of 0.1 μg / μl. (TeleChem International, Inc. “Micro Spotting Solution”) was dissolved and spotted on the substrate using a microarray spotter (Nichiyo Spotter “CHOT”). After the spotting, the substrate was baked at 80 ° C. for 1 hour to immobilize Oligo 1 on the substrate. Blocking treatment was performed by immersing the baked substrate for 1 hour in a solution obtained by dissolving sodium bisulfite (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., reagent grade) in pure water at a concentration of 2%. After the blocking treatment, the substrate was washed with pure water and air-dried.
An oligo DNA labeled with rhodamine at the 5 ′ end (abbreviated as oligo 2; manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd., base sequence: 5′-CATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA-3 ′) at a concentration of 20 ng / μl in a hybridization buffer (0. 3M sodium chloride, 0.03M trisodium citrate, 0.2% sodium dodecyl sulfate aqueous solution). This solution was spread on the substrate after the blocking treatment, covered with a cover glass, and allowed to stand at 65 ° C. for 3 hours to advance the hybridization reaction. The cover glass was removed from the substrate, washed with a 0.5% aqueous sodium dodecyl sulfate solution and pure water, air-dried, and the fluorescence amount of the hybridized oligo 2 was measured.
[0016]
Evaluation 2: The substrate after aldehyde introduction was subjected to blocking treatment with sulfite ions by the method of Evaluation 1 without spotting the DNA. A solution prepared by preparing the oligo 2 to a concentration of 20 ng / μl by the method of Evaluation 1 was spotted on a substrate and washed. The fluorescence amount of oligo 2 remaining on the substrate after washing was measured.
[0017]
(Comparative Example 1)
In the same manner as in Example 1, aldehyde groups were introduced into the plastic substrate.
Evaluation 1: Oligo 1 was immobilized in the same manner as in Example 1. The substrate was washed with pure water without performing blocking treatment. In the same manner as in Example 1, the oligo 2 was hybridized, and the fluorescence amount of the hybridized oligo 2 was measured.
Evaluation 2: A solution in which Oligo 2 was prepared to a concentration of 20 ng / μl was spotted on the substrate and washed without blocking treatment on the substrate after aldehyde introduction. The fluorescence amount of oligo 2 remaining on the substrate after washing was measured.
[0018]
(Comparative Example 2)
In the same manner as in Example 1, aldehyde groups were introduced into the plastic substrate.
Evaluation 1: Oligo 1 was immobilized in the same manner as in Example 1. The substrate was immersed in a solution of skim milk (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a concentration of 1% in pure water for 1 hour to perform blocking treatment. After the blocking treatment, the substrate was washed with pure water. In the same manner as in Example 1, the oligo 2 was hybridized, and the fluorescence amount of the hybridized oligo 2 was measured.
Evaluation 2: The substrate after aldehyde introduction was subjected to blocking treatment with skim milk by the method of Evaluation 1 without spotting the DNA. A solution prepared by preparing oligo 2 at a concentration of 20 ng / μl was spotted on a substrate and washed. The fluorescence amount of oligo 2 remaining on the substrate after washing was measured.
[0019]
(Comparative Example 3)
In the same manner as in Example 1, aldehyde groups were introduced into the plastic substrate.
Evaluation 1: Oligo 1 was immobilized in the same manner as in Example 1. Tris (hydroxymethyl) aminomethane (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., reagent grade) was dissolved in pure water at a concentration of 0.1 M, and the pH was adjusted to 8 with hydrochloric acid. The substrate was immersed in this solution for 1 hour to perform a blocking treatment. After the blocking treatment, the substrate was washed with pure water. In the same manner as in Example 1, the oligo 2 was hybridized, and the fluorescence amount of the hybridized oligo 2 was measured.
Evaluation 2: The substrate after aldehyde introduction was subjected to blocking treatment with tris (hydroxymethyl) aminomethane by the method of Evaluation 1 without spotting the DNA. A solution prepared by preparing oligo 2 at a concentration of 20 ng / μl was spotted on a substrate and washed. The fluorescence amount of oligo 2 remaining on the substrate after washing was measured.
[0020]
A microarray scanner “ScanArray” manufactured by Packard BioChip Technologies was used to measure the amount of fluorescence in Examples and Comparative Examples. The measurement conditions are as follows: in evaluation 1, excitation wavelength 555 nm, measurement wavelength 570 nm, laser output 90%, PMT sensitivity 45%, resolution 30 nm. In evaluation 2, excitation wavelength 555 nm, measurement wavelength 570 nm, laser output 90%, The PMT sensitivity was 70% and the resolution was 30 nm.
[0021]
The results of Evaluation 1 are shown in Table 1. The fluorescence amount was the same in Example 1 and Comparative Examples 1 to 3, indicating that the hybridization reaction can be detected using the microarray of the present invention.
The results of Evaluation 2 are shown in Table 2. In Example 1, the amount of oligo DNA adsorbed was significantly low, indicating that nonspecific adsorption was suppressed in the microarray of the present invention.
[0022]
[Table 1]
[Table 2]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to obtain a microarray with a small amount of nonspecific adsorption / binding of a substance to be detected and high detection accuracy.
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