JP4160201B2

JP4160201B2 - DNA vaccine against coronavirus infection

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Publication number: JP4160201B2
Application number: JP11411599A
Authority: JP
Inventors: 健前田; 雅美望月
Original assignee: Kyoritsu Seiyaku Corp
Current assignee: Kyoritsu Seiyaku Corp
Priority date: 1999-04-21
Filing date: 1999-04-21
Publication date: 2008-10-01
Anticipated expiration: 2019-04-21
Also published as: JP2000302692A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ネコ伝染性腹膜炎（Ｆｅｌｉｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ；ＦＩＰ）を引き起こすウイルス（ＦＩＰＶ）等のコロナウイルス感染症に対する予防／治療に有効なＤＮＡワクチンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
猫には、猫伝染性腹膜炎（Ｆｅｌｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ；以下、「ＦＩＰ」という）という病気がある。ＦＩＰは、コロナウイルス科コロナウイルス属に属するネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）によって引き起こされるネコの致死性疾患である。
ＦＩＰは６ケ月齢から５歳までのネコあるいは純血種のネコで起こりやすいことが知られている（Ｓｃｏｔｔ，１９９１，Ｐｅｄｅｒｓｅｎｅｔａｌ．，１９８３）。罹患ネコの口腔及び気道の分泌物、糞便並びに尿などからウイルスが排出され、経口感染すると考えらている。経口的に感染したウイルスは、咽頭や腸管上皮で増殖し、粘膜のバリヤーを通過後、血中のマクロファージに感染して全身に広がる（Ｈａｙａｓｈｉｅｔａｌ．１９８３：Ｓｃｏｔｔ，１９８９）。
ＦＩＰを発症したネコは、最初は発熱、食欲不振、不活発、体重減少、嘔吐、下痢、脱水、貧血のような非特異的かつ非限局性の症状を呈する。症状が進行するにつれて滲出型（ｗｅｔｔｙｐｅ）と非滲出型（ｄｒｙｔｙｐｅ）、あるいはそれらの混合型のＦＩＰに典型的な症状を呈するようになる。
【０００３】
滲出型は、腹腔、胸腔に浸出液が貯留し、通常無痛性の腹部の膨満が確認できる。浸出液が胸腔に著しく貯留した場合は呼吸困難を伴う。一方、非滲出型は、肝臓、腎臓、脾臓などの腹部臓器、眼、中枢神経系及び肺のような様々な器官に化膿性肉芽腫性炎と壊死性血管炎を呈することを特徴とする。一般に滲出型ＦＩＰの場合は臨床経過が急性であるのに対して、非滲出型ＦＩＰにおいては慢性あるいは潜行性の経過をとりはっきりしないことがある。しかし、いずれの場合も臨床症状が発現した場合、ほとんど進行性かつ致死性である。
【０００４】
ＦＩＰＶは大きさが約１００〜１５０ｎｍであり、エンペロープを有しその内側には螺旋状のヌクレオカプシド構造を持っている。その主要な構造蛋白としては、エンペロープから突出した糖蛋白（スパイク（Ｓ）蛋白）、膜蛋白であるＭ蛋白、ヌクレオカプシド蛋白であるＮ蛋白などが拳げられる。それ以外にもＦＩＰＶウイルスゲノム上にはＯＲＦ１ａ，１ｂ（ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＯＲＦ３ａ，３ｂ，３ｃ，３ｄ、ｓｍａｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ蛋白、ＯＲＦ７ａ，７ｂなどの遺伝子が存在する。しかし、ＦＩＰＶ感染細胞の抽出液をＦＩＰＶ感染ネコ血清を用いてｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ解析を行うと、Ｓ蛋白（分子量１８０〜２０５ｋＤａ）、Ｍ蛋白（分子量２５〜３０ｋＤａ）、Ｎ蛋白（分子量４３〜５０ｋＤａ）の３種類が検出される。そのため、これら３種類が免疫系による主要な標的となっていると考られている。
【０００５】
ＦＩＰＶ感染の特徴として、抗体依存性感染増強（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ；ＡＤＥ）が挙げられる（Ｃｏｒａｐｉｅｔａｌ，１９９２；Ｈｏｕｄａｔｓｕｅｔａｌ．，１９９１；Ｏｌｓｅｎｅｔａｌ．，１９９２）。ＡＤＥとは本来、異物を排除するための生体の防御機構である抗体が、逆にＦＩＰＶのマクロファージへの感染を促進させ、症状を悪化させることである。このため従来の抗体を誘導する不活化ワクチンや弱毒生ワクチンなどでは、逆に症状を悪化させることが知られている。このＡＤＥ作用のため、致死性であるにも関わらずＦＩＰに対する有効なワクチンは未だ開発されていない。
現在、ＦＩＰワクチンとして唯一存在するのは、弱毒化生ウイルスの温度感受性株を用いた鼻腔内ワクチン（ＰｒｉｍｕｃｅｌｌＦＩＰ；ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ）である。このワクチンは、温度感受性なので鼻咽頭では増殖するが、全身的な増殖がなく、鼻及び腸の局所粘膜免疫、唾液免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）及び細胞性免疫を促進する。さらに、ＦＩＰＶの多くの株を交差防御するという特徴を持つ。
【０００６】
鼻腔内ワクチンを用いた各種の治験においてワクチン接種後６ケ月若しくはそれ以前に感染攻撃した場合、生存率は接種群が７１〜８５％である。ワクチン非接種群の生存率は１７〜２０％である。
鼻腔内ワクチンの効果は、ウイルス株とウイルス感染量によって異なることが報告されている（Ｓｃｏｔｔ，ｅｔａｌ．，１９９２）。ウイルスの暴露量が少量であれば、５０％のネコをＦＩＰＶから防御できるが、大量（１０⁵ＴＣＩＤ₅₀以上）の暴露ではほとんど防御できず、却ってＦＩＰの感染増強すら見られた。また、他のデータでも野外のネコでワクチン接種群と非接種群のＦＩＰ発症と死亡率の有意差を示すことが出来なかったことが報告されている（Ｆａｎｔｏｎ，１９９１）。また、生ワクチンの欠点である病原性復帰の可能性なども考えられる。結局、未だ有効なワクチンはないと言える。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、致死性でありながら今まで実質的に有効なワクチンがなく、防御が困難であったＦＩＰＶ等のコロナウイルスに対する有効な予防手段を開発することであり、具体的には、防御が困難であったＦＩＰＶ等のコロナウイルス感染症の予防、発症の防御、及び発症後の治療ができるＤＮＡワクチンを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記諸特性に留意し鋭意検討した結果、本発明の目的が以下の構成によって達成されることを見出し、本発明に到達した。
即ち、本発明は、下記構成である。
(１) ネコ伝染性腹膜炎ウイルスにおけるヌクレオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡを含み、該タンパク質を適用動物内で発現させることができる発現ベクターと、生理食塩水とを含むことを特徴とするコロナウイルス感染症に対するＤＮＡワクチン。
(２) ネコ伝染性腹膜炎ウイルスにおけるヌクレオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡが、
配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列を有するか、あるいは
配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列との相同性が９５％以上であり、適用動物に対して免疫を付与できるヌクレオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する
ことを特徴とする前記（１）に記載のコロナウイルス感染症に対するＤＮＡワクチン。
（３）ネコ伝染性腹膜炎ウイルスにおけるヌクレオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡが、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列を有することを特徴とする前記（１）に記載のコロナウイルス感染症に対するＤＮＡワクチン。
【０００９】
特開平３−１６４１８２号公報には、ＦＩＰＶの７９−１１４６株のＭ−タンパク質又はＮ−タンパク質をコードするヌクレオチド配列が開示され、そのＭ−タンパク質又はＮ−タンパク質のいずれもワクチンとして使用できることが示唆されている。しかしながら、該公報には、実質的には上記株のＭ−タンパク質又はＮ−タンパク質をコードするヌクレオチド配列のみが開示され、該タンパク質のワクチンとしての実際の効果は示されていない。
H.Vennema, et al., Virology, 181, 327-335には、ＦＩＰＶの７９−１１４６株のＭ−タンパク質又はＮ−タンパク質をコードする遺伝子をワクシニアウイルスに組み込んだ組み換えワクシニアウイルスワクチンを作成し、ワクチンとしての効果を検討している。この文献によると、Ｍ−タンパク質の遺伝子を組み込んだ組み換えワクチンでは、強毒株の攻撃に対してある程度効果があり、Ｎ−タンパク質の遺伝子を組み込んだ組み換えワクチンではその効果がないと記載されている。
【００１０】
本発明においては、ＦＩＰＶにおいて免疫を付与できるタンパク質を種々検討した結果、そのタンパク質のうちＮ−タンパク質に着目し、それをＤＮＡワクチンという特有の構成とすることにより、従来感染予防が困難であったＦＩＰを防御できるワクチンの開発に成功した。後述するように、上記文献で効果があると記載されたＭ−タンパク質では、意外なことに、ＤＮＡワクチンとしては効果がなく、逆にＡＤＥ様活性を誘発した。
【００１１】
本発明のＤＮＡワクチンは、ＦＩＰＶ感染症の予防／治療に最も有効であるが、このコロナウイルス感染症以外にも、豚伝染性胃腸炎ウイルス感染症、豚流行性下痢ウイルス感染症、イヌコロナウイルス感染症、ネコ腸内コロナウイルス感染症等のコロナウイルス感染症にも、これらの原因ウイルスが抗原的に非常に近似しているので有効である。
本発明のＤＮＡワクチンは、ネコ、イヌ、ヒト、ブタ等のコロナウイルスが感染する哺乳動物に適用できるが、中でもネコに有効である。
本発明におけるＤＮＡワクチンは、感染症が発症している場合でも該ＤＮＡワクチンを投与することで下記の如く宿主免疫系、特に細胞性免疫を誘導することで病気の回復が期待できることから治療にも有効である。
【００１２】
尚、ＤＮＡワクチン、すなわちＤＮＡ接種によってＤＮＡは細胞内に取り込まれ、コードする蛋白（抗原）が細胞内で合成されるというワクチンは、１９９０年代になって報告がなされた（ＨａｓｓｅｔａｎｄＷｈｉｔｔｏｎ，１９９６；Ｕｌｍｅｒｅｔａｌ，１９９３，１９９６；Ｊｏｈｎｅｔａｌ．，１９９７）。プラスミドＤＮＡから発現される蛋白は抗原プロセッシングを受けた後、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ及びＭＨＣｃｌａｓｓＩＩ拘束性抗原提示により細胞性免疫、液性免疫両方を誘導できることが報告されている（Ｃｌｅｍｉｋｅｔａｌ．，１９９６；Ｔａｎｇｅｔａｌ．，１９９２）。また、ＤＮＡワクチンは、従来の生ワクチン、不活化ワクチンと比較して生物学的に安全であると考えられており、感染症に対する新たなワクチン法として期待されているものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれに限定されない。
本発明において、ＦＩＰＶにおけるヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ−タンパク質ともいう）をコードする遺伝子（ＤＮＡ）としては、従来のＦＩＰＶの各種の株から分離、クローニングでき、そのＮ−タンパク質によりネコにおいてはＦＩＰＶとネコ腸内コロナウイルス、豚においては豚伝染性胃腸炎ウイルスと豚流行性下痢ウイルス、イヌにおいてはイヌコロナウイルスに対する免疫を付与できるものが使用できる。
Ｎ−タンパク質をコードする遺伝子は例えば以下の方法でクローニングすることができる。従来の方法で増殖させたＦＩＰＶからＲＮＡを抽出し、そのＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作成し、そのｃＤＮＡを鋳型として所定のプライマー（例えば、ＦＩＰＶＮＦ、ＦＩＰＶＮＲ等）を用いてＰＣＲ法（詳しくはＲＴ−ＰＣＲ法）により該遺伝子を増幅し、これを所定のクローニングベクターに組み入れてクローニングすることができる。
【００１４】
本発明においては、Ｎ−タンパク質をコードする遺伝子は、
配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列を有するか、あるいは
配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列との相同性が９５％以上であり、ネコ、イヌ、豚に対して免疫を付与できるヌクレオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するものであることが好ましい。より好ましくは配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列である。
【００１５】
発現ベクターとしては、上記遺伝子が当該動物体内で発現できるように、上記Ｎ−タンパク質をコードするＤＮＡを挿入できる部位と、その上流にプロモーターやＳＤ配列を有するものが使用できる。また、宿主でその発現ベクターが増殖できないものがよく、例えば、複製開始点（ｏｒｉ）として原核細胞由来のものを使用することで達成される。
発現ベクターの具体例としては、プラスミドｐＭＥ１８Ｓ、ｐＣＡＧＧＳ等の真核細胞での発現プロモーターを有するプラスミドが挙げられる。
【００１６】
上記遺伝子を有する発現ベクターの作成法としては、上記クローニングしたＮ−タンパク質をコードする遺伝子と、発現ベクターを各々制限酵素で切断し、各々末端修飾したのち、ＤＮＡリガーゼで両者を結合させて、Ｎ−タンパク質をコードする遺伝子が導入された発現ベクターを得ることができる。
上記Ｎ−タンパク質をコードする遺伝子が導入された発現ベクターは、生理食塩水中に添加されてワクチンとして使用する。
そのベクターのワクチン中の添加量としては目安として１００μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌが挙げられる。
また、添加剤としては、アジュバント、サイトカイン、サイトカイン発現プラスミド等が挙げられるが、副作用を考えると、無添加が好ましい。
【００１７】
本発明のＤＮＡワクチンの投与方法としては、注射等の手段を用いて各種組織、例えば筋肉組織に接種できる。また、上記発現ベクターを表面に覆った金粒子を生理食塩水に溶解したものを接種することもできる。これにより、上記発現ベクターを取り込む細胞が非選択的となる。また、接種回数としては、目安として１回〜３回接種でき、その各接種間の間隔としては、１週間〜３週間を挙げることができる。１回の接種での投与量としては１００μｇ／１頭〜３００μｇ／１頭が挙げられる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の内容がこれにより限定されるものではない。
〈ワクチンの製造〉
ＦＩＰＶＭ９１−２６７株のＮ遺伝子とＭ遺伝子をクローニングし、プラスミドＤＮＡとインサートＤＮＡのライゲーション反応物を作成した。
１．遺伝子クローニング
実験には、ネコ由来培養細胞であるｆｅｌｉｎｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｌｉｋｅＦｅｌｉｎｅｃａｔｕｓｗｈｏｌｅｆｅｔｕｓ（ｆｃｗｆ−４）細胞を用いた。ｆｃｗｆ−４細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（シグマ、ケミカル）に、１０％（ｖ／ｖ）非働化牛胎児血清（ＦＣＳ）と抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン）を加えたものを増殖培地として、５％炭酸ガス培養器中で培養した。
【００１９】
ｆｃｗｆ−４細胞にウイルス液を接種し、３７℃で６０分間、１５分毎に優しく混和しながらインキユべートすることにより細胞へウィルスを吸着した。ウイルスは、強毒ＦＩＰＶであるＭ９１−２６７株を用いた〔Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，５９（４）；２５３〜２５８（１９９７）〕。
その後、ウイルス液を吸引し、ＤＭＥＭでｆｃｗｆ−４細胞を２回洗浄後、ＦＣＳ非添加のＤＭＥＭで維持した。
細胞変性効果（ＣＰＥ）が細胞全体に見られたときに上清を回収し、−８０℃でしばらく保存した。
【００２０】
（感染価の測定）
使用するウイルス液は、以下の方法で感染価の測定を行った。
プラークａｓｓａｙを行ってウイルス感染価を求めた。簡単に述べると、ｆｃｗｆ−４細胞を直径３５ｍｍシヤーレで９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで増殖させ、ＤＭＥＭで１０倍階段希釈したウイルス液を２００μｌずつ接種し、６０分間１５分毎にやさしく混和しながら３７℃でインキユベートした。ＤＭＥＭで２回細胞を洗浄し、２％ＦＣＳと１％アガロース添加のＤＭＥＭを１シャーレ当たり２ｍ１ずつ重層した。２日間３７℃のＣＯ₂インキユベーターで培養し、ホルマリン固定後、０．０５％クリスタルバイオレットで染色し、ブラーク数を数え、ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ（ＰＦＵ）値を算出した。
【００２１】
ＦＩＰＶＭ９１−２６７株のＮ遺伝子とＭ遺伝子をクローニングするため、該ウイルス株を３５ｍｍシャーレに感染後、ＣＰＥが全面に広がったところで細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＲＮＡを抽出した。得られた１μｇのＲＮＡをＡＭＶ由来Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅにより逆転写して、ｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型として
５’−ｇｇａｔｃｃａｔｇｇｃｃａｃａｃａｇｇｇａｃａａ−３’（ＦＩＰＶＮＦ）と
５’−ｇｇａｔｃｃｔｔａｇｔｔｃｇｔａａｃｃｔｃａｔｃ−３’（ＦＩＰＶＮＲ）
を用いて、ＬＡＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲ（９２℃ １’、４５℃ １’、７２℃ ２’、３５ｃｙｃｌｅｓ）を行ってＮ蛋白遺伝子を増幅した。
【００２２】
同様に、
５’−ｇｇａｔｃｃａｔｇｃａｔａｔｇａｔｇｃｃｔａｔａ−３’（ＦＩＰＶＭＦ）と
５’−ｇｇａｔｃｃｔｔａｃａｃｃａｔａｔｇｔａａｔａａ−３’（ＦＩＰＶＭＲ）
を用いて、ＬＡＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲ（９２℃ １’、４５℃ １’、７２℃ ２’；３５ｃｙｃｌｅｓ）を行ってＭ蛋白遺伝子を増幅した。
【００２３】
これらの反応産物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール中で沈殿させて精製し、その後、ＰＣＲ産物のｄｉｒｅｃｔクローニング用のベクターｐＵＣ１１８ＴＡ（制限酵素ＸｃｍＩ切断部位を２つ有する）に組み込んで、以下の実験に用いた。
【００２４】
２．ＤＮＡワクチン用発現プラスミドの作成
▲１▼インサートフラグメントの調製
ＦＩＰＶのＮ蛋白をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１１８ＴＡ−ＮをＢａｍＨＩで切断し、ＦＩＰＶＮ遺伝子を含む１．２ｋｂｐ断片をＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（ＢＩＯ−１０１社）により回収した。切断して得られた断片をＫｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端にし、フェノール／クロロホルムで抽出した。その後、その抽出物をエタノールで沈殿し、沈殿物を８０％エタノールで洗浄し、乾燥後、適当量の滅菌水で溶解した。
【００２５】
同様に、ＦＩＰＶのＭ蛋白をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１１８ＴＡ−ＭをＢａｍＨＩで切断し、ＦＩＰＶ−Ｍ遺伝子を含む０．９ｋｂｐをＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（ＢＩＯ−１０１社）により回収した。これをＫｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端にし、フェノール／クロロホルム抽出し、その後、その抽出物をエタノール沈殿し、沈殿物を８０％エタノールで洗浄、乾燥後、適当量の滅菌水で溶解した。
【００２６】
▲２▼ベクターの調製
ここではＦＩＰＶＮ遺伝子の予防・治療への有効性を実証するために、一つの例として、ＳｉｍｉａｎＶｉｒｕｓ４０のｏｒｉと、サイトメガロウイルスのエンハンサーと、鶏ベーターアクチンプロモーターと、ウサギベーターグロブリン３’フランキング配列とを、ｐＵＣ１３に組み込んだプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａｅｔ．ａｌ．，１９９１）を用いてみた。本プラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（ＢＩＯ−１０１社）を使用して回収した。
切断したプラスミドｐＣＡＧＧＳを、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端にし、フェノール／クロロホルム抽出した。その後、エタノール沈殿し、沈殿物を８０％エタノールで洗浄し、乾燥後、適当量の滅菌水で溶解した。これをＣＩＡＰ（Ｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理し、その後、フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿処理を行い、その後、８０％エタノールで洗浄し、次いで乾燥した後、適当量の滅菌水に溶解した。
【００２７】
▲３▼プラスミドＤＮＡのライゲーション反応
上記で調製したプラスミドＤＮＡとインサートＤＮＡを１：３−５のモル比で混ぜ、１０〜２０μｌとなるように等量のＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒｓｉｏｎ２ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ（宝酒造製）を加え、混和後１６℃で１２〜１５時間反応させることにより、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳとＭ／ｐＣＡＧＧＳとを構築した。
構築したＮ／ｐＣＡＧＧＳとＭ／ｐＣＡＧＧＳとは、制限酵素で切断されることで目的のプラスミドであることを確認した（図３、図９）。
【００２８】
強制感染実験〈動物実験〉
１３週齢のＳＰＦ猫（雄）を購入し、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種群、Ｍ／ｐＣＡＧＧＳ接種群、ｐＣＡＧＧＳ接種群（コントロール群）の３群に配分し、滅菌水と市販の餌で飼育した。
ＱＩＡＧＥＮメガキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、大量精製したＤＮＡを猫１頭あたり２００μｇ右後肢の大腿二頭筋に筋肉接種し、２週間隔で３回接種した。その最終接種から２週間後に、１頭あたり１×１０⁶ＰＦＵのＦＩＰＶＭ９１−２６７株を腹腔内接種した。
【００２９】
ウイルス接種前には週１回、接種後には週２回頚静脈から採血し、ＭＩＣＲＯＣＥＬＬＣＯＵＮＴＥＲＦ−８００（Ｓｙｓｍｅｘ）により赤血球数、白血球数、ヘモグロビン値、ヘマトクリット値を測定し、ＦＵＪＩＤＲＩ−ＣＨＥＭ５５００Ｓ（富士メディカルシステム株式会社）により血中の尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、アラニンアミノ転移酵素（ＧＰＴ）、アスパレートアミノ転移酵素（ＧＯＴ）を測定した。また、塗末標本より白血球百分比（分葉好中球、桿状好中球、リンパ球好酸球、単球）を測定した。別に分注した血液を、室温、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心して血漿を回収し、５６℃，３０分で非働化後、中和抗体価の測定とウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）解析を行った。
【００３０】
また、ウイルス攻撃前には、週１回、攻撃後は毎日、体温、体重、摂食量を測定し、便の状態、沈鬱、神経症状を観察した（下記表２〜９）。臨床症状は、表１に示した基準に従って、スコアリングを行った。実験ネコは瀕死の状態になったとき、致死量のケタミン投与と心採血により安楽死させ、剖検を行った。
上記結果を下記表−２〜９と、図４〜８、図１０〜１４に示す。
【００３１】
〈ウエスタンブロット解析〉
調製した抗原をサンプルバッファー（６．２５ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２．０％ＳＤＳ、５．０％メルカプトエタノール、２０％グリセロール、０．００１％プロモフェノールプルー）と混和し、１００℃で２分加熱し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｌａｅｍｍｌｉｅｔ．ａ１．，１９７０）で泳動した。ポリビニリデンジフルオライド（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）膜をあらかじめ１００％エタノールと転写バッファー（２５ｍＭＴｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）に浸しておき、陽極側から、３ＭＭペーパー、膜、アクリルアミドゲル、３ＭＭぺーパーの順に並ベ、１０Ｖで１時間転写した（Ｔｏｗｂｉｎｅｔ．ａｌ．，１９７９）。
【００３２】
その後、３％ゼラチン（ＥＩＡｇｒａｄｅ、ＢｉｏＲａｄ）添加ＴＢＳ（０．５ＭＮａＣｌ、０．０２ＭＴｒｉｓ［ｐＨ７．５］）でブロッキング後、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳ）で三回洗浄した。次に、１０倍希釈になるようにネコ血漿を加えた１％ゼラチンＴＴＢＳを加え、３７℃１時間反応させ、その後ＴＴＢＳで三回洗浄した。二次抗体としてぺルオキシダーゼ標識山羊抗ネコＩｇＧを５００倍希釈したものをもちいて、３７℃３０分反応させた。ＴＴＢＳ、ＴＢＳでそれぞれ三回洗浄した後、ジアミノベンジン四酸塩錠（和光）を１錠（１０ｍｇ）とＨ₂Ｏ₂を３３μｌのＴＢＳに加え、室温で反応させた。
【００３３】
〈ウイルス中和試験〉
被検血漿をＤＭＥＭで２倍階段希釈し、５０μｌずつ９６穴プレートに入れ、５０μｌのＦｌＰＶＭ９１−２６７株（１穴当たり１００ＰＦＵ）を加えた。３７℃で６０分反応させた後、２４穴プレートで９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅになるまで増殖させたｆｃｗｆ−４細胞に加え、１５分毎に穏やかに混和しながら、３７℃、１時間反応させた。その後は、感染価の測定と同様の操作を行い、プラーク数を算定した。７５％プラークが減少する血漿の最高希釈倍率の逆数を中和抗体価とした。
【００３４】
〈塩基配列の決定〉
▲１▼ シークエンス用クローンの作成
ＦＩＰＶのＮ−タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１１８ＴＡ−ＮをＢｇ１ＩＩで切断し、０．６ｋｂｐ、０．５ｋｂｐの二つの断片をＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（ＢＩＯ−１０１社）により回収した。ＦＩＰＶのＮ−タンパク質をコードする遺伝子は、Ｂｇ１ＩＩにより二カ所が切断されるため、０．６ｋｂｐと０．５ｋｂｐの中間部分の約２０ｂｐのシークエンスを行うために、別にｐＵＣ１１８ＴＡ−ＮをＰｓｔＩで切断し、３．９ｋｂｐを切り出して、セルフライゲーションした。同様にＦＩＰＶのＭ−タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１１８ＴＡ−ＭをＢｇ１ＩＩで切断し、０．５ｋｂｐ、０．４ｋｂｐの二つの断片をＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（ＢＩＯ−１０１社）により回収した。ベクターに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）を用い、これをＢａｍＨＩで切断し、フェノール／クロロホルムで抽出した後、エタノールで沈殿させ、得られた沈殿物を８０％エタノールで洗浄し、乾燥後、適当量の滅菌水に溶解し、アルカリフオスファターゼ（ＣＩＡＰ；ＣａｌｆＩｎｔｅｓｔｉｎｅＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理後、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（ＢｌＯ−１０１社）により回収した。調整したインサートＤＮＡとベクターは、ＤＮＡワクチン用プラスミド作成時と同様の手技によりライゲーション反応を行い、シークエンス用クローンを構築した。
【００３５】
▲２▼ サンプルの調整
サンプル調整は、ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔＤｙｅＰｒｉｍｅｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ，ＧｒｅａｔＢｒｉｔａｉｎ）を用いて行い、ＤＮＡ塩基配列の決定は、ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７ａｕｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ，ＦｏｓｔｅｒＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて行った。
【００３６】
〔実験例の結果〕
１．ＦＩＰＶＮ遺伝子とＭ遺伝子のクローニングと塩基配列の決定
日本で望月ら（１９９７）によりＦＩＰ症状を呈して死亡したネコより分離され、腹腔内接種によりネコにＦＩＰを引き起こすことが知られているＭ９１−２６７株よりＲＮＡを抽出後、ＲＴ−ＰＣＲによりＮ遺伝子とＭ遺伝子を増幅した結果、それぞれ１１４６ｂｐと８８２ｂｐが検出された。これをＴＡベクター（制限酵素ＸｃｍＩ切断ｐＵＣ１１８ＴＡ）にクローニングし、塩基配列を決定した。Ｎ遺伝子は３７６アミノ酸残基をコードする１１３１塩基よりなっていた（配列表の配列番号１）。Ｎ遺伝子の構造遺伝子は１〜１１２８番目である。
また、Ｍ遺伝子は２８９アミノ酸残基をコードする８７０塩基よりなっていた（配列表の配列番号３）。Ｍ遺伝子の構造遺伝子は１〜８６７番目である。
【００３７】
アミノ酸配列をすでに報告されているコロナウイルスのものと比較した結果、Ｎ蛋白においては７９−１１４６株のものと９３．４％の最も高い相同性を有しており、犬コロナウイルス（ＣＣＶ）とは７６．４％、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）とは７５．９％の相同性を有していた。Ｍ蛋白においては７９−１１４６株のものと９０．５％の最も高い相同性を有しており、犬コロナウイルス（ＣＣＶ）とは８４．７％、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）とは８８．６％、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）とは５２．３％、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）の２２９Ｅ株とは４５．７％、ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）とは４２．９％、七面鳥コロナウイルス（ＴＣｏＶ）とは４２．３％、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）のＯＣ４３株とは３９．８％、マウス肝炎ウイルスとは３９．３％、鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）とは２７．４％の相同性を有していた。加えて、系統樹を作成した結果、従来の報告通りネココロナウイルス間では他の動物種由来のコロナウイルスよりも近縁であることが示された（図１、図２）。
【００３８】
２．各検体の臨床症状と各測定結果
以下に、臨床症状のスコアリング基準、臨床症状と各測定結果を示した表−１〜９を示す。尚、表−２は、Ｍ群の検体番号１の結果、表−３はＭ群の検体番号２の結果、表−４はコントロール群の検体番号３の結果、表−５はコントロール群の検体番号４の結果、表−６はコントロール群の検体番号５の結果、表−７はＮ群の検体番号６の結果、表−８はＮ群の検体番号７の結果、表−９はＮ群の検体番号８の結果を示す。
【００３９】
【表１】

【００４０】
【表２】

【００４１】
【表３】

【００４２】
【表４】

【００４３】
【表５】

【００４４】
【表６】

【００４５】
【表７】

【００４６】
【表８】

【００４７】
【表９】

【００４８】
【表１０】

【００４９】
【表１１】

【００５０】
【表１２】

【００５１】
【表１３】

【００５２】
【表１４】

【００５３】
【表１５】

【００５４】
【表１６】

【００５５】
【表１７】

【００５６】
上記表において、ＢＷは体重、ＢＴは体温、Ｈｔはヘモトクリット値、Ｈｂはヘモグロビンを各々表す。
２ＦＩＰＶのＮ−タンパク質をコードする遺伝子を用いたＤＮＡワクチンの検討
ＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされたＮ遺伝子を、ｐＣＡＧＧＳに組み込んだ（Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ）。
生理食塩水に溶かしたプラスミドＤＮＡをＳＰＦネコの大腿二頭筋に一匹当たり２００μｇ接種した。さらに２週間間隔で計３回の免疫を行った。この間、臨床症状はみられなかった。最終免疫より２週間後に強毒ウイルス株であるＭ９１−２６７株を１×１０⁶ＰＦＵ／１ｍｌ／１匹に腹腔内接種した。
【００５７】
攻撃試験後の結果を項目別に以下に示す。
▲１▼ 臨床症状
〔コントロール群（検体番号３〜５）〕
コントロール群では接種後１日目から体重が減少し始め、検体番号３（表−４に示す）では８〜２２日目の間で、検体番号５（表−６に示す）では５〜１０日目の間で１０％以上の減少がみられた。２頭共その後いったん回復したが、検体番号３で２５日目、検体番号５で２４日目以降、ふたたび１０％以上の減少を示した（図５参照）。
体温は検体番号３で１５、１９〜２１、２２〜２６日目に、検体番号４（表−５に示す）で１９、２０、２２、２５日目に、検体番号５で１５〜１７、１９、２１日目に４０℃以上の発熱を示した。
【００５８】
ヘマトクリット値は、検体番号５、４、３でそれぞれ攻撃後３、７、１０日目から２５％以下に減少し、検体番号４と３はそれぞれ２４と２８日目に回復したが、検体番号５では以後２５％以上に回復することはなかった（図７）。
白血球数は、検体番号３で７、１０、１８、２４日目に、検体番号４で３，１４〜２４日目に、検体番号５で３、１８、２４日目に６０００／μｌ以下であった（図６）。
白血球百分比は、分葉好中球が８０％以上となったのは、検体番号３で１４，２４〜３１日目、検体番号４で３１〜４３日目、検体番号５で１０〜２６日目であった。単球は３頭共７日目に１０％以上に増加し、好酸球は検体番号３で１０，１４，２８，３１日目に、検体番号４で３１〜４３日目に、検体番号５で７，１８〜２６日目に１％以下に減少した（表−４〜６）。
【００５９】
下痢は、検体番号３で３，４日目に、検体番号４で９日目に見られた。食欲不振は、検体番号３で４日目以降ずっと続き、２８日目以降は摂食量がほぼ０ｇとなった。検体番号４でも４日目以降食欲不振となったが、１０〜２１日の間いったん食欲が回復していた。しかし、２８日目以降の摂食量はほぼ０ｇになった。検体番号５では接種後１日目からほぼ毎日食欲不振を示した。
沈鬱は、検体番号３で５〜１９日、検体番号４で４〜４３日、検体番号５で１９〜２６日の間でみられた。
神経症状は検体番号４ではみられなかったが、検体番号３では１５〜１８，２０日目に後肢のふらつき、旋回運動がみられ、検体番号５では２４〜２６日に後肢麻痺、発作がみられた。
【００６０】
〔Ｎ群（検体番号６〜８）〕
Ｎ群では、接種後１日目から３頭中２頭で、他の１頭は４日目から体重の減少がみられた。その後は回復と減少を繰り返したが、コントロール群で１０％以上の体重減少を示した日がのべ３１日間あったのに対して、Ｎ群では最も大きい減少を示した検体番号７でも最大９％の減少にとどまり、１０％以上は減少しなかった（図５、表−８）。
体温は検体番号７（表−８に示す）で１５〜２０，２２，２３日目に、検体番号８（表−９に示す）で１４，１６〜１８，２１，２２，２５〜２８日目に４０℃以上に発熱した。検体番号６（表−７に示す）では発熱はみられず、他の２頭では発熱に関してコントロール群との差はなかった。
【００６１】
白血球数は、検体番号６で３日目に、検体番号８で７日目に６０００／μｌ以下に減少したが、すぐに回復し、検体番号８では１８日目に再び減少したが、２１日目には回復した。検体番号７は７，１０，１８〜２４日目に６０００／μｌ以下の値を示した。Ｎ群ではコントロール群と比較して、白血球数が６０００／μｌ以下に減少し始める時期は同じであったが、一時的に回復するのが早かった（図６，表−７〜９）。
ヘマトクリット値では、２５％以下に減少したのは検体番号６で１０日目、検体番号７で７〜２４日目、検体番号８で７〜１８日目であった。Ｎ群とコントロール群でヘマトクリット値が２５％以下に減少する時期はほぼ等しく、差はみられなかったが、Ｎ群の１頭では明らかに回復が早かった（図７）。白血球百分比では、検体番号７，８ではコントロールとの差がみられなかったが、検体番号６ではほとんど異常値がみられなかった。
下痢は検体番号６もしくは検体番号７で５，６，１０，１９日目にみられた。検体番号６，７は２２日目まで同ケージに収容していたため下痢がどちらにおこっていたのかは不明である。１８，２０〜２２日目は検体番号６，７共に下痢をしていた。検体番号８では１０，２０〜２２日目に下痢を起こした。下痢はＮ接種群でコントロール群よりも頻繁にみられた（表−７〜９）。
【００６２】
食欲不振は検体番号６で２１日目、検体番号７で２１，２２〜２６日にみられたが、先に述べた理由により検体番号７で食欲不振が正確にはいつからおこっていたのか不明である。検体番号８では６，７日目にいったん摂食量が減少したが、すぐに回復した。検体番号８が再び食欲不振を起こすのは１８日目以降で特に２６日目以降は摂食量がほぼ０ｇとなった。
沈鬱は検体番号７で１６日目以降、検体番号８で２０日目以降、死亡するまで続いた。
神経症状は、検体番号７のみでみられ、１６〜１８日目、２２〜２５日目に後肢麻痺がみられ、２６日目には横臥して動けない状態であった。
上記の臨床症状を表−１に従ってスコア化した結果（図４）、接種後３，７，１０，１４日目でＮ群のポイントは、コントロール群の平均より低く、このうち１０日目では、有意差が見られた（ｐ＜０．０５）。コントロール群でスコアが上昇し始める３日目にはＮ群のスコアは０ポイントで臨床症状の発現が遅くなった。１４日目以降は、Ｎ群の検体番号７でコントロール群と同じか、若しくはそれ以上に高いポイントとなったが、他の２頭ではコントロール群の平均より低かった。Ｎ群の検体番号７は２６日目に、検体番号８は３２日目に瀕死となり、そのため２８日と３５日のＮ群のスコアが高くなっている。検体番号６は常に１ポイント以内の低い値を示しており、２５日以降は０ポイントとなった。以上より、Ｎ群ではコントロール群よりもスコアが上昇し始めるのが遅く、また臨床スコアが低いという結果になった。
【００６３】
▲２▼体重（図５）
コントロール群、Ｎ群共に接種後（ＰＩＤ）１日目に１〜２％の減少が見られた。コントロール群では、いったん回復したが、再び減少し始め、８日目までに接種前と比べて１０．７％減少した。その後、検体番号３（表−４）では接種後１７日目までにさらに５％減少したがその後、増加を始め、２１日目には接種前と比べて４％の減少となった。検体番号４，５は９日目以降増加したが、検体番号５は１８日目を境に減少し始め、その後回復は見られなかった。検体番号４は２１日目までに８％回復した。コントロール群全体では、接種前と比べて接種後２１日目に平均７％減少した。Ｎ群では２日目以降検体番号７が２％以内で増減を繰り返しながらも一定の値を保ち、さらに検体番号６，８では増加を示し、Ｎ群全体の平均では接種後２１日目に接種前と比べて８．７％の増加をしめした。６〜１９日の間コントロール群との間に有意差があった（ｐ＜０．０５）。結果として、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ群はコントロール群よりも体重の減少が有意に軽減されていることが示された。
【００６４】
▲３▼白血球数（図６）
コントロール群では検体番号４，５が接種後３日目に６０００／μｌ以下に減少し、検体番号３は７日目に３０００／μｌ以下に減少した。検体番号４，５は７日目には１００００／μｌ以上に回復したが、検体番号４は１４日目、検体番号５は１８日目にふたたび５０００／μｌ以下に減少した。Ｎ群では検体番号６で３日目に６０００／μｌ以下に減少し、検体番号７，８では７日目に減少した。しかし３頭共に１４日目には１００００／μｌ以上に回復し、検体番号６では以後６０００／μｌ以下に減少することはなかった。検体番号７，８はふたたび１８日目に５０００／μｌ以下に減少し、検体番号７では以後回復は見られなかった。検体番号８は２１日目に、１００００／μｌ以上に回復し、以後６０００／μ１以下に減少することはなかった。このようにコントロール群で１００００／μｌ以下であった１４日目にＮ接種群で平均して１７６００／μｌに増加しており、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種により白血球数の回復が早まる結果となった。
【００６５】
▲４▼ヘマトクリット値（図７）
コントロール群では接種後３日目には、接種前と比べて平均５％減少した。その後も減少を続け、検体番号５では３日目、検体番号３は１０日目に２５％以下となった。検体番号４は１４日目にさらに１８％に減少したが、１８日目以降は２０％以上に増加した。検体番号５と検体番号３は７日目と１４日目にそれぞれ２０％以下に減少し、２１日目までに２０％以上に回復することはなかった。これに対し、Ｎ群では３日目にはほとんど減少が見られず、２５％以下となったのは、検体番号７，８が７日目、検体番号６が１０日目であったが、検体番号６では１４日目には２７％に回復し、その後も増加して２１日目には３５％となった。検体番号７は１０日目に１９％に減少したが、１４日目には２２％に回復し、２１日目までに２０％以下に再び減少することはなかった。検体番号８は、２１日目に２５％に回復した。Ｎ群ではコントロール群と比ぺてヘマトクリット値の減少が遅く、その程度も低く、かつ回復が早い結果となった。
【００６６】
▲５▼赤血球数（図８）
コントロール群では接種後３日目に２頭が２００×１０⁴／μｌの減少を示した。このうち検体番号５は７日目９９０×１０⁴／μｌ、検体番号４は１０日目に１３４８×１０⁴／μｌに回復したが、１４日目には再び検体番号４で６５０×１０⁴／ｌ以下、検体番号５で５００×１０⁴／ｌ以下に減少した。検体番号３は７日目から減少を始め、２１日目には５５０×１０⁴／μｌ以下となった。Ｎ群では接種後３日目にはコントロール群ほどの著しい減少はみられなかったが、検体番号７が７日目に、検体番号６が１０日目に、検体番号８が１４日目に大きく減少し、５５０×１０⁴／μ１以下となった。しかし３頭共にその後回復を示した。このようにＮ群は３日目から減少したが、減少の程度はコントロール群よりも小さいものであり、１４日目以降著しく減少するコントロール群に対し、Ｎ群では増加がみられた。
【００６７】
▲６▼生存期間
コントロール群では検体番号３が接種後３１日目、検体番号４が４３日目、検体番号５が２６日目に死亡しており、生存期間の平均は３３．３日である。これに対し、Ｎ群では検体番号７が２６日、検体番号８が３１日目とコントロール群との差はみられないが、検体番号６は１５０日以上生存しており、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種により発症防御に成功した。
【００６８】
▲７▼ウイルス中和試験（図１５）及びウェスタンプロット解析
採取した血漿を用いてウイルス中和試験を行った。ｐＣＡＧＧＳ接種群（コントロール群）ではウイルス接種後１４日目から上昇し始めたが、Ｎ接種群では１８日目からウイルス中和抗体価が上昇し始めた。両群とも接種前には中和抗体は存在しなかった（図１５）。接種前の抗体価はウエスタンプロットでも検出できなかった。
【００６９】
３．ＦＩＰＶＭ遺伝子を用いたＤＮＡワクチン（比較例）
Ｎ遺伝子と同様にＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされたＭ遺伝子を、ｐＣＡＧＧＳに組み込んだ（Ｍ／ｐＣＡＧＧＳ）（図９）。生理食塩水に溶かしたプラスミドＤＮＡをＳＰＦネコの大腿二頭筋に一匹当たり２００μｇ接種した。さらに２週間間隔で計３回の免疫を行った。この間、臨床症状はみられなかった。最終免疫より２週間後に強毒ウイルス株であるＭ９１−２６７株を１×１０⁶ＰＦＵ／１ｍｌ／１匹に腹腔内接種した。攻撃試験後の結果を項目別に以下に示す。
【００７０】
▲１▼臨床症状（図１０〜１４，表−２、３）
Ｍ群では体重の減少が１０％以上になるのがコントロール群より遅かったが、コントロール群でみられた回復がＭ群ではみられず、またコントロール群での減少が最大１８％であったのに対し、Ｍ群では最大２２％の減少を示した（図１１，表−２、３）。体温は検体番号１で３，５，１０〜２０日目、検体番号２で１０〜１６日目に４０℃以上の発熱をおこし、コントロール群よりも早い時期に発熱がおこった（表−２、３参照）。
白血球数はコントロール群で６０００／μｌ以下に減少したのが３日目であったのに対し、Ｍ群では１０日目以降と遅かったが、コントロールでみられた回復がＭ群ではみられなかった（図１２、表−２、３）。
ヘマトクリット値では検体番号１，２共に７〜２１日目に２５％以下に減少し、コントロールとの差はみられず（図１３，表−２、３）、また白血球百分比でも、コントロールとの差はみられなかった。下痢はみられなかったが、食欲不振は５日目以降続き、回復することはなかった。沈鬱は検体番号１で１２日目以降、検体番号２で４日目以降続いた（表−２、３）。
【００７１】
神経症状が初めにおこったのはＭ群の検体番号２で、１４〜１６日目に後肢のふらつきが、１７，１９〜２１日目にはそれに加えて発作もみられた。２２日目には横臥、痙撃し全く動けない状態であった。検体番号１では１７日目に後肢麻痺、旋回、発作がおこった。以上の臨床症状を表−１に従ってスコア化した結果（図１０）、接種後３〜７日間はコントロール群よりもＭ群のポイントの方が低いが、１０日目ではＭ群の方が高くなった。その後、Ｍ群ではコントロール群の平均を常に上回り、２１日目では有意にコントロール群より高いポイントを示した（Ｐ＜０．０５）。
接種後、２２日目に検体番号２が、２３日目に検体番号１が死亡したため、２４日目のＭ群のポイントが著しく上昇している。このようにＭ接種群では７日目まで臨床症状の発症が抑制されているが、その後の上昇はコントロール群より早かった。
【００７２】
▲２▼ 白血球数（図１２）
コントロール群で３日目から減少が始まったのに対して、Ｍ群では、接種後７日目までは１００００／μｌ以上を示していた。Ｍ群で減少し始めたのは、１０日目以降であった。検体番号１では１０日目に４２００／μｌまで減少し、その後回復することはなかった。検体番号２では１０日目に７６００／μｌに減少し、４日目にいったん１２５００／μｌに回復したが１８日目には４２００／μｌに減少した。このようにごく初期の段階ではＭ／ｐＣＡＧＧＳ接種により白血球数の減少が抑えられている可能性が示されたが、減少し始めてからの減少の程度はＭ群の方が大きく、またコントロール群では２１日目に３頭中２頭で６０００／μｌ以上に回復しているのに対してＭ群では回復がみられなかった。
【００７３】
▲３▼ ヘマトクリット値（図１３）
コントロール群では接種後３日目に接種前と比べて５％の減少がみられたが、Ｍ群でも同様に４．５％の減少がみられた。Ｍ群では７日目に検体番号１，２ともに２５％以下に減少し、さらに検体番号１が１０日目に、検体番号２が１４日目に２０％以下となった。検体番号２は２１日目に２０％に回復したが、検体番号１はさらに減少が続き、２１日目には１５％まで減少した。Ｍ群ではヘマトクリット値の減少がコントロール群と同程度におこっている。
【００７４】
▲４▼ 赤血球数（図１４）
コントロール群では接種後３日目から大きく減少したが、Ｍ群でも同様に接種後３日目には接種前と比較して１５０×１０⁴／μｌ減少した。コントロール群ではその後一度回復がみられたが、Ｍ群ではその後も減少が続き、検体番号１では１０日目に４７４×１０⁴／μｌとなり、２１日目には２５７×１０⁴／μｌに減少した。検体番号２では１４日目に５５２×１０⁴／μｌに減少し、その後も６００×１０⁴／μｌ以上に回復することはなかった。このように、Ｍ群ではコントロール群でみられた一時的な回復がみられなかった。
【００７５】
▲５▼生存期間（表−２，３）
コントロール群での生存期間の平均が３３．３日であるのに対して、Ｍ群では検体番号１が２３日、検体番号２が２２日と１０日も短くなった。これは、Ｍ／ｐＣＡＧＧＳ接種による生存期間の延長はおこらず、かえって死期を早めたことを示している。
▲６▼ ウイルス中和試験（図１５）及びウエスタンプロット解析
Ｍ及びコントロール群においては攻撃試験後１４日目から中和抗体の上昇がみられ、コントロール群と比較してＭ群の方がより高い中和抗体価の上昇を示した（図１５）。またＭ群においては４倍希釈した血清を用いても攻撃試験前の中和抗体を検出できなかった。接種前の抗体価はウエスタンプロットでも同様に検出できなかった。なお一連の実験に用いたネコ（検体番号１〜８）は、病理解剖され、その病理所見より典型的なＦｌＰ症状を呈して死亡したことを確認した。
【００７６】
〔考察〕
ＦＩＰＶは、抗体と結合した結果、感染を増強するＡＤＥ活性を有するため、既存のワクチンによる液性免疫の誘導は、かえって感染を増強することになる。このため、ＦＩＰＶに対する防御には細胞性免疫の誘導が重要となるが、従来のワクチン法では、強い細胞性免疫を誘導することは困難であった。そこで今回、新しいワクチン法としてＤＮＡワクチンによるＦＩＰ発症防御試験を試みた。Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種群では、臨床スコアの値がコントロール群より低く、体重変化、白血球数、赤血球数、ヘマトクリット値は、いったんは減少したものの３頭中２頭で回復した。
【００７７】
また、Ｎ群３頭中１頭は半年以上生存しており、体重、体温、血液検査値、食欲等も正常で、ＦＩＰの発症防御に成功したといえる。さらに、最終的には死亡したものの、Ｎ群のうちの他の１頭は発症後いったんは、体重、血液検査値が回復している。これは、今回のＮ／ｐＣＡＧＧＳ接種によりＦＩＰＶの初期感染が防御できていたことを示している。一方、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種群での結果とは対照的に、Ｍ／ｐＣＡＧＧＳ接種群では臨床スコア、体重、白血球数、赤血球数、ヘマトクリット値など全てのデータにおいてコントロール群と有意な差がない、若しくはコントロール群よりも悪化を示す結果となった。この理由としてＦＩＰＶ構造蛋白ＭがＡＤＥを起こすウイルス側の因子の一つであり、今回Ｍ／ｐＣＡＧＧＳを接種することによりＦＩＰＶの感染が増強した可能性が考えられる。しかし、ワクシニアウイルスを用いたＭ蛋白の免疫実験では感染防御に成功していることから、Ｍ蛋自に関してはＤＮＡワクチンとしては使用できない。
【００７８】
ウイルス中和試験の結果より、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種群における抗体価の上昇が他の群と比較して遅かったことは、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種により初期の感染防御には成功したが、１×１０⁶ＰＦＵという大量のウイルスで攻撃したため宿主免疫系によって排除しきれなかったウイルスが増殖したために、抗体価の上昇が遅れたと考えられる。Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種群より攻撃前に回収された血清を用いたウエスタンプロット解析でも検出できなかったことは、液性免疫より細胞性免疫が主に感染防御に関与していると考えられる。一方、Ｍ／ｐＣＡＧＧＳ接種群ではウイルス中和抗体価の上昇がコントロール群と比較して急激であった。中和抗体価としては検出できなかったものの、Ｍ／ｐＣＡＧＧＳ接種により若干の中和抗体の誘導があり、記億免疫が成立していたことが示唆される。また、ＤＮＡワクチン接種による抗体の誘導がＡＤＥ様感染を引き起こした可能性も考えられる。
【００７９】
今回の感染実験において、Ｎ／ｐＣＡＧＧＳ接種群で完全にはＦＩＰＶ防御が出来なかった理由として、▲１▼１×１０⁶ＰＦＵという大量のウイルスでの攻撃、▲２▼腹腔内投与により、生体内への直接的なウイルスの感染、が挙げられる。これらの結果、ウイルスに対する免疫が生じていても、免疫系によるウイルスの排除がウイルスの増殖速度に追いつかなかった可能性がある。しかし、自然界においてはこれほど大量のウイルスが一度に生体内に感染することは考えにくく、初期感染の防御に効果があるＦＩＰＶのＮタンパクをコードする遺伝子を組み込んだＤＮＡワクチンは、自然感染に似た最適な接種量、接種方法とすることにより、十分効果があると考えられる。
【００８０】
【発明の効果】
以上に示したことから明らかな様に、本発明のＤＮＡワクチンは、防御が困難であったＦＩＰＶ等のコロナウイルス感染症に対して有効に予防／治療できる。
【００８１】
【配列表】

【００８２】

【００８３】

【００８４】

【００８５】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎ遺伝子のアミノ酸配列を基にした系統樹を示す図である。
【図２】Ｍ遺伝子のアミノ酸配列を基にした系統樹を示す図である。
【図３】Ｎ／ｐＣＡＧＧＳの制限酵素切断電気泳動写真を示す図である。
【図４】ＦＩＰＶ接種後のＮ群の臨床スコアの変化を示す図である。
【図５】ＦＩＰＶ接種後のＮ群の体重変化を示す図である。
【図６】ＦＩＰＶ接種後のＮ群の白血球数変化を示す図である。
【図７】ＦＩＰＶ接種後のＮ群のヘマトクリット値変化を示す図である。
【図８】ＦＩＰＶ接種後のＮ群の赤血球数変化を示す図である。
【図９】Ｍ／ｐＣＡＧＧＳの制限酵素切断電気泳動写真を示す図である。
【図１０】ＦＩＰＶ接種後のＭ群の臨床症状スコアの変化を示す図である。
【図１１】ＦＩＰＶ接種後のＭ群の体重変化を示す図である。
【図１２】ＦＩＰＶ接種後のＭ群の白血球数変化を示す図である。
【図１３】ＦＩＰＶ接種後のＭ群のヘマトクリット値変化を示す図である。
【図１４】ＦＩＰＶ接種後のＭ群の赤血球数変化を示す図である。
【図１５】ウイルス中和抗体価を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA vaccine effective for prevention / treatment of coronavirus infection such as a virus (FIPV) causing feline infectious peritonitis (FIP).
[0002]
[Prior art]
Cats have a disease called feline infectious peritonitis (hereinafter referred to as “FIP”). FIP is a cat lethal disease caused by feline infectious peritonitis virus (FIPV) belonging to the coronavirus genus Coronaviridae.
FIP is known to occur easily in cats of 6 months to 5 years of age or purebred cats (Scott, 1991, Pedersen et al., 1983). It is thought that viruses are excreted from the oral and respiratory tract secretions, feces and urine of affected cats, resulting in oral infection. Orally infected virus grows in the pharynx and intestinal epithelium, and after passing through the mucosal barrier, it infects blood macrophages and spreads throughout the body (Hayashi et al. 1983: Scott, 1989).
Cats that develop FIP initially exhibit nonspecific and non-localized symptoms such as fever, loss of appetite, inactivity, weight loss, vomiting, diarrhea, dehydration, and anemia. As symptoms progress, symptoms typically present in wet type, dry type, or mixed FIPs.
[0003]
In the exudative type, exudate accumulates in the abdominal cavity and thoracic cavity, and the normally painless abdominal bloating can be confirmed. If exudate accumulates significantly in the thoracic cavity, it is accompanied by dyspnea. On the other hand, non-wetting type is characterized by suppurative granulomatous inflammation and necrotizing vasculitis in various organs such as abdominal organs such as liver, kidney and spleen, eyes, central nervous system and lung. In general, in the case of wet type FIP, the clinical course is acute, whereas in the case of non-wet type FIP, a chronic or insidious course may be taken and may not be clear. However, in both cases, when clinical symptoms develop, it is almost progressive and fatal.
[0004]
FIPV is about 100 to 150 nm in size, has an envelope, and has a helical nucleocapsid structure inside. As the main structural protein, glycoprotein (spike (S) protein) protruding from the envelope, M protein which is a membrane protein, N protein which is a nucleocapsid protein, and the like can be cited. In addition, genes such as ORF1a, 1b (RNA polymerase), ORF3a, 3b, 3c, 3d, small membrane protein, ORF7a, 7b are present on the FIPV virus genome. However, when immunoblotting analysis was performed on the extract of FIPV-infected cells using FIPV-infected cat serum, S protein (molecular weight 180-205 kDa), M protein (molecular weight 25-30 kDa), N protein (molecular weight 43-50 kDa) 3 The type is detected. Therefore, these three types are considered to be major targets by the immune system.
[0005]
Features of FIPV infection include antibody-dependent enhancement (ADE) (Corapiet al, 1992; Houdatsu et al., 1991; Olsen et al., 1992). ADE is that an antibody, which is a defense mechanism of a living body for excluding foreign substances, promotes infection of FIPV macrophages and worsens symptoms. For this reason, it has been known that inactivated vaccines or attenuated live vaccines for inducing conventional antibodies conversely worsen the symptoms. Due to this ADE action, an effective vaccine against FIP has not yet been developed despite being lethal.
At present, the only existing FIP vaccine is an intranasal vaccine (Primucell FIP; Smith Kline Beecham) using a temperature-sensitive strain of a live attenuated virus. This vaccine is temperature sensitive and grows in the nasopharynx, but there is no systemic growth, promoting nasal and intestinal local mucosal immunity, salivary immunoglobulin A (IgA) and cellular immunity. Furthermore, it has the feature of cross-protecting many strains of FIPV.
[0006]
In various clinical trials using intranasal vaccines, the survival rate is 71 to 85% in the inoculated group when the infection attack occurred 6 months after vaccination or before. The survival rate of the non-vaccinated group is 17-20%.
It has been reported that the effects of intranasal vaccines differ depending on the virus strain and the amount of virus infection (Scott, et al., 1992). If the amount of virus exposure is small, 50% of cats can be protected from FIPV. ^Five TCID ₅₀ The above exposure) hardly protected, and on the contrary, even FIP infection enhancement was observed. In other data, it has been reported that a field cat could not show a significant difference in FIP onset and mortality between the vaccinated group and the non-vaccinated group (Fanton, 1991). In addition, the possibility of reversion to pathogenicity, which is a drawback of live vaccines, is also considered. After all, it can be said that there is still no effective vaccine.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to develop an effective preventive measure against coronaviruses such as FIPV, which has been difficult to protect since there has been no effective vaccine until now, although it is lethal. Is to provide a DNA vaccine that can prevent coronavirus infection such as FIPV, which has been difficult to protect, protect against onset, and treat after onset.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive investigations while paying attention to the above characteristics, the present inventors have found that the object of the present invention can be achieved by the following configuration, and have reached the present invention.
That is, the present invention has the following configuration.
(1) A coronavirus infection comprising a DNA encoding a nucleocapsid protein in a feline infectious peritonitis virus, comprising an expression vector capable of expressing the protein in an applied animal, and physiological saline. DNA vaccine.
(2) DNA encoding the nucleocapsid protein in feline infectious peritonitis virus is
Having the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, or
It has a DNA sequence encoding a nucleocapsid protein that is 95% or more homologous to the DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and can confer immunity to the applied animal.
The DNA vaccine for coronavirus infection as described in (1) above.
(3) The DNA vaccine for coronavirus infection according to (1) above, wherein the DNA encoding the nucleocapsid protein in feline infectious peritonitis virus has the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0009]
JP-A-3-164182 discloses a nucleotide sequence encoding M-protein or N-protein of FIPV 79-1146, suggesting that either M-protein or N-protein can be used as a vaccine. Has been. However, the publication discloses substantially only the nucleotide sequence encoding the M-protein or N-protein of the strain, and does not show the actual effect of the protein as a vaccine.
In H. Vennema, et al., Virology, 181, 327-335, a recombinant vaccinia virus vaccine in which a gene encoding the M-protein or N-protein of FIPV 79-1146 strain was incorporated into vaccinia virus was prepared, We are considering the effect as a vaccine. According to this document, it is described that a recombinant vaccine incorporating an M-protein gene is effective to some extent against the attack of a virulent strain, and that a recombinant vaccine incorporating an N-protein gene is not effective. .
[0010]
In the present invention, as a result of various studies on proteins that can confer immunity in FIPV, it has been difficult to prevent infection in the past by focusing on N-protein among the proteins and making it a unique composition called a DNA vaccine. We have successfully developed a vaccine that can protect against FIP. As will be described later, the M-protein described as having an effect in the above literature surprisingly had no effect as a DNA vaccine, and conversely induced ADE-like activity.
[0011]
The DNA vaccine of the present invention is most effective for the prevention / treatment of FIPV infection, but besides this coronavirus infection, swine infectious gastroenteritis virus infection, swine epidemic diarrhea virus infection, canine coronavirus It is also effective for infectious diseases and coronavirus infections such as feline intestinal coronavirus infection, because these causative viruses are very similar in antigen.
The DNA vaccine of the present invention can be applied to mammals infected with coronaviruses such as cats, dogs, humans, and pigs, but is particularly effective for cats.
The DNA vaccine of the present invention can be used for treatment because even when an infectious disease has developed, it can be expected to recover from the disease by inducing the host immune system, particularly cellular immunity, as described below by administering the DNA vaccine. It is valid.
[0012]
A DNA vaccine, that is, a vaccine in which DNA is taken up into cells by DNA inoculation and an encoded protein (antigen) is synthesized in the cells was reported in the 1990s (Hasset and Whitton, 1996; Ulmer et al, 1993, 1996; John et al., 1997). Proteins expressed from plasmid DNA have been reported to be capable of inducing both cellular immunity and humoral immunity by MHC class I and MHC class II-restricted antigen presentation after antigen processing (Clemike et al., 1996; Tang et al., 1992). In addition, DNA vaccines are considered to be biologically safe compared to conventional live vaccines and inactivated vaccines, and are expected as new vaccine methods against infectious diseases.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, although an embodiment of the invention is described, the present invention is not limited to this.
In the present invention, the gene (DNA) encoding the nucleocapsid protein (also referred to as N-protein) in FIPV can be isolated and cloned from various strains of conventional FIPV, and the N-protein allows FIPV and feline intestine to be cloned. Internal coronaviruses, swine infectious gastroenteritis virus and swine epidemic diarrhea virus can be used in pigs, and those that can confer immunity against canine coronaviruses in dogs.
A gene encoding an N-protein can be cloned, for example, by the following method. RNA is extracted from FIPV grown by a conventional method, cDNA is prepared from the RNA by reverse transcriptase, and PCR method (for example, FIPV NF, FIPV NR, etc.) is used with the cDNA as a template. Specifically, the gene can be amplified by RT-PCR method, and incorporated into a predetermined cloning vector for cloning.
[0014]
In the present invention, the gene encoding N-protein is:
Having the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, or
It preferably has a DNA sequence encoding a nucleocapsid protein that is 95% or more homologous with the DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and can confer immunity to cats, dogs, and pigs. More preferred is the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0015]
As the expression vector, a site having a promoter or SD sequence upstream of a site into which the DNA encoding the N-protein can be inserted so that the gene can be expressed in the animal body can be used. In addition, it is preferable that the expression vector cannot be propagated in the host. For example, this can be achieved by using a prokaryotic cell-derived one as the origin of replication (ori).
Specific examples of expression vectors include plasmids having expression promoters in eukaryotic cells such as plasmids pME18S and pCAGGS.
[0016]
As a method for preparing an expression vector having the above gene, the cloned N-protein-encoding gene and the expression vector are each cleaved with a restriction enzyme, each end-modified, and then combined with DNA ligase. -An expression vector into which a gene encoding a protein has been introduced can be obtained.
The expression vector introduced with the gene encoding the N-protein is added to physiological saline and used as a vaccine.
The amount of the vector added in the vaccine is, for example, 100 μg / ml to 300 μg / ml.
Examples of additives include adjuvants, cytokines, cytokine expression plasmids, and the like, but in terms of side effects, no additives are preferable.
[0017]
As a method for administering the DNA vaccine of the present invention, various tissues such as muscle tissue can be inoculated by means such as injection. It is also possible to inoculate gold particles having the expression vector covered on the surface thereof in a physiological saline solution. This makes cells that take up the expression vector non-selective. The number of inoculations can be inoculated 1 to 3 times as a guide, and the interval between each inoculation can be 1 to 3 weeks. Examples of the dose in a single inoculation include 100 μg / one to 300 μg / one.
[0018]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention still in detail, the content of this invention is not limited by this.
<Manufacture of vaccines>
The N gene and M gene of FIPV strain M91-267 were cloned to produce a ligation reaction product of plasmid DNA and insert DNA.
1. Gene cloning
In the experiment, feline macrophage-like Feline cats whole fetus (fcwf-4) cells, which are feline-derived cultured cells, were used. fcwf-4 cells were transferred to Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Sigma, Chemical), 10% (v / v) inactivated fetal calf serum (FCS) and antibiotics (100 U / ml penicillin, 100 U / ml). What added streptomycin was used as a growth medium and cultured in a 5% carbon dioxide incubator.
[0019]
The virus solution was inoculated into fcwf-4 cells, and the virus was adsorbed to the cells by incubating at 37 ° C. for 60 minutes with gentle mixing every 15 minutes. The virus used was the virulent FIPV strain M91-267 [Mochizuki et al. , J .; Vet. Med. Sci. 59 (4); 253-258 (1997)].
Thereafter, the virus solution was aspirated, and fcwf-4 cells were washed twice with DMEM and then maintained with DMEM without FCS.
The supernatant was collected when cytopathic effect (CPE) was seen in the whole cell and stored at −80 ° C. for a while.
[0020]
(Measurement of infectious value)
The virus solution to be used was measured for infectivity titer by the following method.
Plaque assay was performed to determine the viral infectivity titer. Briefly, fcwf-4 cells were grown to a 90% confluent with a 35 mm diameter dish, inoculated with 200 μl of a virus solution diluted 10-fold in DMEM, and gently mixed every 15 minutes for 60 minutes at 37 ° C. Incubated with. The cells were washed twice with DMEM, and 2 ml of DMEM supplemented with 2% FCS and 1% agarose was layered on each petri dish. CO for 2 days at 37 ° C ₂ The cells were cultured in an incubator, fixed with formalin, stained with 0.05% crystal violet, the number of plaques was counted, and a plaque-forming unit (PFU) value was calculated.
[0021]
In order to clone the N gene and M gene of FIPV M91-267 strain, after the virus strain was infected with a 35 mm petri dish, the cells were collected when CPE spread over the entire surface, and RNA was extracted with RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN) did. 1 μg of the obtained RNA was reverse transcribed by AMV-derived Reverse-transcriptase to prepare cDNA. Using this cDNA as a template
5′-ggatccatggccacacagggaca-3 ′ (FIPVNF) and
5′-ggacccttagttcgtacactcatc-3 ′ (FIPVNR)
The N protein gene was amplified by performing PCR (92 ° C. 1 ′, 45 ° C. 1 ′, 72 ° C. 2 ′, 35 cycles) by LA Taq polymerase.
[0022]
Similarly,
5′-ggatcccatgcatgatgccdata-3 ′ (FIPVMF) and
5'-ggatccttacaccattattataata-3 '(FIPVMR)
Was used to perform PCR (92 ° C. 1 ′, 45 ° C. 1 ′, 72 ° C. 2 ′; 35 cycles) by LA Taq polymerase to amplify the M protein gene.
[0023]
These reaction products were extracted with phenol / chloroform, purified by precipitation in ethanol, and then incorporated into a vector pUC118TA (having two restriction enzyme XcmI cleavage sites) for direct cloning of PCR products. Used for.
[0024]
2. Preparation of expression plasmid for DNA vaccine
(1) Preparation of insert fragment
Plasmid pUC118TA-N containing the gene encoding FIPV N protein was cleaved with BamHI, and a 1.2 kbp fragment containing FIPV N gene was recovered by GeneClean II (BIO-101). The fragment obtained by cutting was blunt-ended with Klenow enzyme and extracted with phenol / chloroform. Thereafter, the extract was precipitated with ethanol, the precipitate was washed with 80% ethanol, dried, and then dissolved in an appropriate amount of sterile water.
[0025]
Similarly, plasmid pUC118TA-M containing the gene encoding FIPV M protein was cleaved with BamHI, and 0.9 kbp containing FIPV-M gene was recovered by Gene Clean II (BIO-101). This was made blunt with Klenow enzyme, extracted with phenol / chloroform, and then the extract was ethanol precipitated. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried, and then dissolved in an appropriate amount of sterile water.
[0026]
(2) Preparation of vector
Here, in order to demonstrate the effectiveness of FIPV N gene for prevention and treatment, as an example, ori of Simian Virus 40, enhancer of cytomegalovirus, chicken beta-actin promoter, and rabbit beta-globulin 3 ′ flanking sequence Were examined using the plasmid pCAGGS (Niwa et.al., 1991) incorporated into pUC13. This plasmid was cleaved with EcoRI and recovered using Gene Clean II (BIO-101).
The digested plasmid pCAGGS was made blunt with Klenow enzyme and extracted with phenol / chloroform. Thereafter, ethanol precipitation was performed, the precipitate was washed with 80% ethanol, dried, and then dissolved in an appropriate amount of sterilized water. This was treated with CIAP (Cal intestinal alkaline phosphatase), then subjected to phenol-chloroform treatment and ethanol precipitation treatment, then washed with 80% ethanol, dried, and then dissolved in an appropriate amount of sterile water.
[0027]
(3) Ligation reaction of plasmid DNA
The plasmid DNA prepared above and the insert DNA were mixed at a molar ratio of 1: 3-5, and an equal amount of DNA Ligation Kit Version 2 Solution I (Takara Shuzo) was added so as to be 10 to 20 μl. N / pCAGGS and M / pCAGGS were constructed by reacting for 12-15 hours.
The constructed N / pCAGGS and M / pCAGGS were confirmed to be target plasmids by digestion with restriction enzymes (FIGS. 3 and 9).
[0028]
Forced infection experiment (animal experiment)
Thirteen-week-old SPF cats (male) were purchased and distributed to three groups: an N / pCAGGS inoculated group, an M / pCAGGS inoculated group, and a pCAGGS inoculated group (control group), and were bred with sterile water and commercially available food.
Using QIAGEN mega kit (manufactured by QIAGEN), 200 μg of the purified DNA per cat was intramuscularly inoculated into the biceps femoris of the right hind limb and inoculated three times at 2-week intervals. Two weeks after the final inoculation, 1 x 10 per head ⁶ PFU FIPV M91-267 strain was inoculated intraperitoneally.
[0029]
Blood was collected from the jugular vein once a week before virus inoculation and twice a week after inoculation, and the erythrocyte count, leukocyte count, hemoglobin value, and hematocrit value were measured with MICROCELL COUNTER F-800 (Sysmex), and FUJI DRI-CHEM5500S ( Urea nitrogen (BUN), creatinine (CRE), alanine aminotransferase (GPT), and aspartate aminotransferase (GOT) in blood were measured by Fuji Medical System Co., Ltd. In addition, the leukocyte percentage ratio (segmented neutrophils, rod-shaped neutrophils, lymphocyte eosinophils, monocytes) was measured from the smear. Separately dispensed blood was centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes at room temperature, and plasma was recovered. After inactivation at 56 ° C. for 30 minutes, neutralization antibody titer measurement and Western blotting analysis were performed.
[0030]
In addition, body temperature, body weight, and food intake were measured once a week before the virus attack and every day after the attack, and stool conditions, depression, and neurological symptoms were observed (Tables 2 to 9 below). The clinical symptoms were scored according to the criteria shown in Table 1. When experimental cats became moribund, they were euthanized by administration of a lethal dose of ketamine and blood sampling, and an autopsy was performed.
The above results are shown in Tables 2 to 9, and FIGS. 4 to 8 and FIGS.
[0031]
<Western blot analysis>
The prepared antigen was mixed with sample buffer (6.25 mM tris-HCl, 2.0% SDS, 5.0% mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.001% promophenol blue) and heated at 100 ° C. for 2 minutes. Electrophoresis on a 12% SDS-PAGE gel (Laemmli et al., 1970). Polyvinylidene difluoride (Millipore) membrane was soaked in 100% ethanol and transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol) in advance, and from the anode side, 3MM paper, membrane, acrylamide The gel was transferred in the order of 3MM paper and transferred at 10V for 1 hour (Towbin et.al., 1979).
[0032]
Then, after blocking with TBS (0.5 M NaCl, 0.02 M Tris [pH 7.5]) added with 3% gelatin (EIA grade, Bio Rad), it was washed three times with TTBS (0.05% Tween-TBS). Next, 1% gelatin TTBS to which feline plasma was added to a 10-fold dilution was added, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then washed three times with TTBS. A peroxidase-labeled goat anti-cat IgG diluted 500-fold was used as a secondary antibody and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After washing 3 times each with TTBS and TBS, diaminobenzine tetraacid salt (Wako) 1 tablet (10 mg) and H ₂ O ₂ Was added to 33 μl of TBS and allowed to react at room temperature.
[0033]
<Virus neutralization test>
The test plasma was serially diluted 2-fold with DMEM, 50 μl each was added to a 96-well plate, and 50 μl of FlPV M91-267 strain (100 PFU per well) was added. After reacting at 37 ° C. for 60 minutes, it was added to fcwf-4 cells grown in a 24-well plate until 90% confluence, and reacted at 37 ° C. for 1 hour with gentle mixing every 15 minutes. Thereafter, the same operation as the measurement of infectious titer was performed, and the number of plaques was calculated. The reciprocal of the highest dilution ratio of plasma at which 75% plaque decreased was the neutralizing antibody titer.
[0034]
<Determination of base sequence>
▲ 1 ▼ Creation of sequence clone
Plasmid pUC118TA-N containing the gene encoding the FIPV N-protein was cleaved with Bg1 II, and two fragments of 0.6 kbp and 0.5 kbp were recovered by Gene Clean II (BIO-101). Since the gene encoding the N-protein of FIPV is cleaved at two sites by Bg1 II, pUC118TA-N is separately cleaved with PstI in order to perform a sequence of about 20 bp between 0.6 kbp and 0.5 kbp. Then, 3.9 kbp was cut out and self-ligated. Similarly, plasmid pUC118TA-M containing the gene encoding FIPV M-protein was cleaved with Bg1 II, and two fragments of 0.5 kbp and 0.4 kbp were recovered by Gene Clean II (BIO-101). Using pBluescript SK (+) as a vector, this was cleaved with BamHI, extracted with phenol / chloroform, precipitated with ethanol, the resulting precipitate was washed with 80% ethanol, dried, It melt | dissolved in the sterilized water and collect | recovered by Gene Clean II (BlO-101 company) after the alkali phosphatase (CIAP; CalIntestine Alkaline Phosphatase) process. The prepared insert DNA and vector were subjected to a ligation reaction by the same procedure as in the preparation of the plasmid for DNA vaccine to construct a clone for sequencing.
[0035]
(2) Sample adjustment
Sample preparation was carried out using DNA sequencing Kit Prime Cycle Sequencing Ready Reaction (PERKIN-ELMER, Great Britain), and DNA base sequence was determined by ABI prism 377 Auto-REQUER ).
[0036]
[Results of experimental example]
1. FIPV N gene and M gene cloning and nucleotide sequence determination
After extracting RNA from M91-267 strain, which was isolated from a cat that died of FIP symptoms and died by Mochizuki et al. (1997) in Japan and known to cause FIP in the cat by intraperitoneal inoculation, N As a result of amplification of the gene and M gene, 1146 bp and 882 bp were detected, respectively. This was cloned into a TA vector (restriction enzyme XcmI cleaved pUC118TA), and the nucleotide sequence was determined. The N gene consisted of 1131 bases encoding 376 amino acid residues (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing). The structural gene of N gene is from 1 to 1128th.
The M gene was composed of 870 bases encoding 289 amino acid residues (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing). The structural gene of M gene is 1st to 867th.
[0037]
As a result of comparing the amino acid sequence with that of the already reported coronavirus, the N protein has the highest homology of 93.4% with that of the 79-1146 strain, and canine coronavirus (CCV) Had 76.4% homology with swine infectious gastroenteritis virus (TGEV). M protein has the highest homology of 90.5% with that of 79-1146, 84.7% with canine coronavirus (CCV), and with swine infectious gastroenteritis virus (TGEV) 88.6%, porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) 52.3%, human coronavirus (HCoV) strain 229E, 45.7% bovine coronavirus (BCoV) 42.9%, turkey 42.3% with coronavirus (TCoV), 39.8% with OC43 strain of human coronavirus (HCoV), 39.3% with mouse hepatitis virus, 27 with chicken infectious bronchitis virus (IBV) .4% homology. In addition, as a result of creating a phylogenetic tree, it was shown that feline coronaviruses are more closely related to coronaviruses derived from other animal species as previously reported (FIGS. 1 and 2).
[0038]
2. Clinical symptoms and measurement results of each sample
Tables 1 to 9 showing the clinical symptom scoring criteria, clinical symptom and each measurement result are shown below. Table 2 shows the results of specimen number 1 in the M group, Table 3 shows the results of specimen number 2 in the M group, Table 4 shows the results of specimen number 3 in the control group, and Table 5 shows the specimens in the control group. As a result of No. 4, Table-6 shows the result of the specimen No. 5 of the control group, Table-7 shows the result of the No. 6 specimen No. 6, Table 8 shows the result of the No. 7 specimen No. 7, and Table 9 shows the N group. The result of specimen number 8 is shown.
[0039]
[Table 1]

[0040]
[Table 2]

[0041]
[Table 3]

[0042]
[Table 4]

[0043]
[Table 5]

[0044]
[Table 6]

[0045]
[Table 7]

[0046]
[Table 8]

[0047]
[Table 9]

[0048]
[Table 10]

[0049]
[Table 11]

[0050]
[Table 12]

[0051]
[Table 13]

[0052]
[Table 14]

[0053]
[Table 15]

[0054]
[Table 16]

[0055]
[Table 17]

[0056]
In the above table, BW represents body weight, BT represents body temperature, Ht represents a hemocrit value, and Hb represents hemoglobin.
Examination of DNA vaccine using gene encoding N-protein of 2 FIPV
The N gene cloned by RT-PCR was incorporated into pCAGGS (N / pCAGGS).
The plasmid DNA dissolved in physiological saline was inoculated into the biceps femoris of SPF cats at 200 μg per animal. Further, immunization was performed 3 times at intervals of 2 weeks. During this time, there were no clinical symptoms. Two weeks after the final immunization, the virulent virus strain M91-267 strain was 1 × 10 ⁶ PFU / 1 ml / 1 animal was inoculated intraperitoneally.
[0057]
The results after the attack test are shown below by item.
(1) Clinical symptoms
[Control group (Sample Nos. 3 to 5)]
In the control group, the body weight began to decrease from the first day after inoculation, between 8th and 22nd days for specimen number 3 (shown in Table-4), and 5-10 days for specimen number 5 (shown in Table-6). There was a reduction of more than 10% between the eyes. The two animals recovered after that, but showed a decrease of 10% or more again on Day 25 from Specimen No. 3 and from Day 24 on Specimen No. 5 (see FIG. 5).
Body temperature was 15, 19-21, 22-26 days for specimen number 3, 19th, 20, 22, 25th day for specimen number 4 (shown in Table-5), 15-17, 19 for specimen number 5 On the 21st day, an exotherm of 40 ° C. or higher was exhibited.
[0058]
The hematocrit value decreased to 25% or less from the third, seventh, and tenth days after the attack in

specimen numbers

5, 4, and 3, respectively, and

specimen numbers

4 and 3 recovered on the 24th and 28th days, respectively. Then, it did not recover to 25% or more (FIG. 7).
The white blood cell count was 6000 / μl or less on the 7th, 10th, 18th, 24th day for the sample number 3, 3rd, 14th to 24th day for the sample number 4 and 3rd, 18th, 24th day for the sample number 5. (FIG. 6).
The percentage of leukocytes was 80% or more in the lobulated neutrophils, 14th to 24th to 31st day for specimen number 3, 31st to 43rd day for specimen number 4, 10th to 26th day for specimen number 5 Met. Monocytes increased to 10% or more on the 7th day on all 3 animals, and eosinophils on the 10th, 14th, 28th, 31st day for the sample number 3 and on the 31st to 43th day for the sample number 4 on the sample number 5 And decreased to 1% or less on

days

7, 18 to 26 (Tables 4 to 6).
[0059]
Diarrhea was observed on

days

3 and 4 for sample # 3 and on day 9 for sample # 4. Anorexia persisted for specimen No. 3 from day 4 onwards, and the amount of food intake reached almost 0 g after day 28. Specimen No. 4 also lost appetite after the 4th day, but appetite had once recovered for 10-21 days. However, the amount of food intake after the 28th day became almost 0 g. Specimen No. 5 showed anorexia almost every day from the first day after inoculation.
Sedation was observed between Specimen No. 3 for 5-19 days, Specimen No. 4 for 4-43 days, and Specimen No. 5 for 19-26 days.
No neurological symptom was observed in Sample No. 4, but Sample No. 3 showed hindlimb wobbling and swiveling on days 15-18 and 20, and Sample No. 5 showed hind limb paralysis and seizures on days 24-26. It was.
[0060]
[Group N (Sample Nos. 6-8)]
In group N, 2 of 3 animals from the first day after inoculation, and the other one had lost weight from the 4th day. Thereafter, recovery and reduction were repeated, but there were a total of 31 days that showed a weight loss of 10% or more in the control group, whereas in specimen N, which showed the greatest decrease in the N group, a maximum of 9 % Decrease and not more than 10% (FIG. 5, Table-8).
Body temperature is Day 15-20, 22, 23 for Specimen No. 7 (shown in Table-8), and Day 14, 16-18, 21, 22, 25-28 for Specimen No. 8 (shown in Table-9) The heat generated at 40 ° C or higher. Specimen No. 6 (shown in Table 7) showed no fever, and the other two animals did not differ from the control group in terms of fever.
[0061]
The number of white blood cells decreased to 6000 / μl or less on the third day of the sample No. 6 and on the seventh day of the sample No. 8, but recovered immediately and decreased again on the 18th day of the sample No. 8, but on the 21st day. The eyes recovered. Specimen No. 7 showed a value of 6000 / μl or less on

days

7, 10, 18-24. Compared with the control group, the N group had the same time when the white blood cell count began to decrease to 6000 / μl or less, but it recovered earlier temporarily (FIG. 6, Tables 7 to 9).
The hematocrit value decreased to 25% or less on the 10th day for specimen No. 6, 7-24th day for specimen No. 7, and 7-18th day for specimen No. 8. The time when the hematocrit value decreased to 25% or less in the N group and the control group was almost the same, and no difference was observed, but in one of the N groups, the recovery was clearly faster (FIG. 7). With respect to the white blood cell percentage ratio, specimen Nos. 7 and 8 showed no difference from the control, but specimen No. 6 showed almost no abnormal value.
Diarrhea was observed on

Day

5, 6, 10, and 19 of Sample No. 6 or Sample No. 7. Since Sample Nos. 6 and 7 were housed in the same cage until the 22nd day, it is unclear where diarrhea occurred. On days 18, 20-22,

specimens

6 and 7 had diarrhea. In sample number 8, diarrhea occurred on days 10, 20-22. Diarrhea occurred more frequently in the N inoculated group than in the control group (Tables 7-9).
[0062]
Anorexia was observed on Day 21 for Specimen No. 6 and on Days 21, 22-26 for Specimen No. 7, but for the reasons mentioned above, it was not clear when the anorexia occurred exactly for Specimen No. 7. is there. In Sample No. 8, food intake once decreased on

days

6 and 7, but recovered immediately. Specimen No. 8 caused anorexia again on the 18th day and after that, especially after the 26th day, the amount of food intake was almost 0 g.
The depression continued from Day 16 on Sample No. 7 and after Day 20 on Sample No. 8 until death.
A neurological symptom was observed only in specimen No. 7, and hindlimb paralysis was observed on the 16th to 18th days and the 22nd to 25th days.
As a result of scoring the above clinical symptoms according to Table 1 (FIG. 4), the points of the N group were lower than the average of the control group at 3, 7, 10, 14 days after inoculation, Significant differences were seen (p <0.05). On the third day, when the score started to increase in the control group, the score of the N group was 0 point, and the onset of clinical symptoms was delayed. From day 14 onward, specimen number 7 in group N was the same as or higher than that in the control group, but in the other two animals it was lower than the average in the control group. Specimen No. 7 in the N group is drowned on the 26th day and Specimen No. 8 is on the 32nd day, so the scores of the N group on the 28th and 35th days are high. Specimen No. 6 always showed a low value within 1 point and became 0 points after 25th. From the above, it was found that the score in the N group began to increase more slowly than the control group, and the clinical score was low.
[0063]
(2) Weight (Figure 5)
In the control group and the N group, a decrease of 1 to 2% was observed on the first day after inoculation (PID). In the control group, it recovered once, but began to decrease again, and decreased by 10.7% compared to before inoculation by the 8th day. Thereafter, in Sample No. 3 (Table 4), it further decreased by 5% by the 17th day after the inoculation, but thereafter increased, and on the 21st day, it decreased by 4% compared to before the inoculation. Specimen Nos. 4 and 5 increased after the 9th day, but Specimen No. 5 began to decrease on the 18th day, and no recovery was observed thereafter. Sample number 4 recovered 8% by day 21. In the control group as a whole, the average decreased by 7% on the 21st day after the inoculation as compared with that before the inoculation. In group N, sample number 7 keeps a constant value while repeating the increase and decrease within 2% after day 2, and further increases in

sample numbers

6 and 8, and the average of group N is inoculated on the 21st day after inoculation. It showed an increase of 8.7% compared to before. There was a significant difference from the control group between 6 and 19 days (p <0.05). As a result, it was shown that weight loss was significantly reduced in the N / pCAGGS group than in the control group.
[0064]
(3) White blood cell count (Fig. 6)
In the control group,

sample numbers

4 and 5 decreased to 6000 / μl or less on the third day after inoculation, and sample number 3 decreased to 3000 / μl or less on the seventh day.

Sample numbers

4 and 5 recovered to 10000 / μl or more on the 7th day, but sample number 4 again decreased to 5000 / μl or less on the 14th day and sample number 5 on the 18th day. In the N group, the sample number 6 decreased to 6000 / μl or less on the third day, and in the

sample numbers

7 and 8, the number decreased on the seventh day. However, all of the three animals recovered to 10000 / μl or more on the 14th day, and in Sample No. 6, they did not decrease to 6000 / μl or less thereafter. Specimen Nos. 7 and 8 again decreased to 5000 / μl or less on the 18th day, and no recovery was observed thereafter in Specimen No. 7. Specimen No. 8 recovered to 10000 / μl or more on the 21st day and did not decrease to 6000 / μl or less thereafter. Thus, on the 14th day, which was 10000 / μl or less in the control group, the average increased to 17600 / μl in the N-inoculated group, and the recovery of the white blood cell count was accelerated by N / pCAGGS inoculation.
[0065]
(4) Hematocrit value (Figure 7)
In the control group, on the 3rd day after inoculation, the average decreased by 5% compared to before the inoculation. Thereafter, it continued to decrease, with Sample No. 5 falling to 25% or less on Day 3 and Sample No. 3 on Day 10. Specimen No. 4 further decreased to 18% on the 14th day, but increased to 20% or more after the 18th day. Specimen No. 5 and Specimen No. 3 decreased to 20% or less on the 7th and 14th days, respectively, and did not recover to 20% or more by the 21st day. On the other hand, in the N group, almost no decrease was observed on the third day, and it was 25% or less because the

specimen numbers

7 and 8 were the seventh day and the specimen number 6 was the tenth day. In Sample No. 6, it recovered to 27% on the 14th day and increased thereafter to 35% on the 21st day. Specimen No. 7 decreased to 19% on the 10th day, but recovered to 22% on the 14th day and did not decrease again below 20% by the 21st day. Sample number 8 recovered to 25% on day 21. Compared with the control group, the N group showed a slow decrease in the hematocrit value, a low degree, and a quick recovery.
[0066]
(5) Red blood cell count (Figure 8)
In the control group, 2 animals were 200 × 10 3 days after inoculation. ^Four A decrease of / μl was shown. Sample No. 5 is 990 × 10 on the seventh day ^Four / Μl, specimen number 4 is 1348 × 10 on the 10th day ^Four / Μl, but on the 14th day, the sample number 4 was again 650 × 10 6 ^Four / L or less, sample number 5 is 500 × 10 ^Four / L or less. Specimen No. 3 starts to decrease on the 7th day and 550 × 10 on the 21st day ^Four / Μl or less. In group N, no significant decrease was observed on the third day after inoculation as in the control group, but sample number 7 was larger on day 7, sample number 6 was on day 10, and sample number 8 was larger on day 14. 550 × 10 ^Four / Μ1 or less. However, all three have recovered afterwards. As described above, the N group decreased from the third day, but the degree of decrease was smaller than that of the control group, and an increase was observed in the N group as compared with the control group that decreased markedly after the 14th day.
[0067]
(6) Survival period
In the control group, sample number 3 died 31 days after inoculation, sample number 4 was 43 days, sample number 5 was dead on day 26, and the average survival time was 33.3 days. In contrast, in group N, specimen number 7 was 26 days, specimen number 8 was 31 days and the control group was not different, but specimen number 6 was alive for 150 days or more, and N / pCAGGS inoculation Successfully defended the onset.
[0068]
(7) Virus neutralization test (Fig. 15) and Western plot analysis
A virus neutralization test was performed using the collected plasma. In the pCAGGS inoculation group (control group), the virus neutralization antibody titer started to increase from the 18th day in the N inoculation group, while it started to increase from the 14th day after the virus inoculation. There was no neutralizing antibody in both groups prior to inoculation (Figure 15). The antibody titer before inoculation could not be detected by Western plot.
[0069]
3. DNA vaccine using FIPV M gene (comparative example)
Similarly to the N gene, the M gene cloned by RT-PCR was incorporated into pCAGGS (M / pCAGGS) (FIG. 9). The plasmid DNA dissolved in physiological saline was inoculated into the biceps femoris of SPF cats at 200 μg per animal. Further, immunization was performed 3 times at intervals of 2 weeks. During this time, there were no clinical symptoms. Two weeks after the final immunization, the virulent virus strain M91-267 strain was 1 × 10 ⁶ PFU / 1 ml / 1 animal was inoculated intraperitoneally. The results after the attack test are shown below by item.
[0070]
(1) Clinical symptoms (Figures 10 to 14, Tables 2 and 3)
In the M group, the weight loss was 10% or more slower than in the control group, but the recovery seen in the control group was not seen in the M group, and the maximum decrease in the control group was 18%. In contrast, the M group showed a maximum reduction of 22% (FIG. 11, Tables 2 and 3). Body temperature generated fever of 40 ° C. or higher on Sample No. 1, 3, 5, 10 to 20 days, and Sample No. 2 on Days 10 to 16, and fever occurred earlier than the control group (Table 2, 3).
The white blood cell count decreased to 6000 / μl or less in the control group on the 3rd day, whereas in the M group, it was slow after the 10th day, but the recovery seen in the control was not seen in the M group. (FIG. 12, Table-2, 3).
Hematocrit values decreased to 25% or less on day 7 to 21 for both

sample numbers

1 and 2, and no difference from the control was observed (FIG. 13, Tables 2 and 3), and the leukocyte percentage ratio was also different from the control. Was not seen. There was no diarrhea, but anorexia continued from day 5 and did not recover. The depression continued from the 12th day on Sample No. 1 and from the 4th day on Sample No. 2 (Tables 2 and 3).
[0071]
Neurological symptoms first occurred in Sample No. 2 of Group M, with hindlimb wobbling on days 14-16 and seizures on days 17, 19-21. On the 22nd day, he was lying down, convulsed and was unable to move at all. In Sample No. 1, hind limb paralysis, turning and seizure occurred on the 17th day. As a result of scoring the above clinical symptoms according to Table 1 (FIG. 10), the points of the M group are lower than the control group for 3 to 7 days after the inoculation, but the M group is higher on the 10th day It was. Thereafter, the M group always exceeded the average of the control group, and showed a significantly higher point than the control group on the 21st day (P <0.05).
After the inoculation, specimen number 2 died on the 22nd day and specimen number 1 died on the 23rd day, so the points of the M group on the 24th day were significantly increased. Thus, the onset of clinical symptoms was suppressed until day 7 in the M inoculation group, but the subsequent increase was earlier than in the control group.
[0072]
(2) White blood cell count (Figure 12)
In the control group, the decrease started from the third day, whereas in the M group, it showed 10000 / μl or more until the seventh day after the inoculation. It was after the 10th day that it started to decrease in the M group. In Sample No. 1, it decreased to 4200 / μl on the 10th day and did not recover thereafter. In the sample No. 2, it decreased to 7600 / μl on the 10th day, and once recovered to 12500 / μl on the 4th day, it decreased to 4200 / μl on the 18th day. Thus, in the very early stage, it was shown that the decrease in the number of white blood cells was suppressed by M / pCAGGS inoculation, but the degree of decrease after starting to decrease was larger in the M group, and in the control group On

day

21, 2 out of 3 animals recovered to 6000 / μl or more, whereas M group showed no recovery.
[0073]
(3) Hematocrit value (Figure 13)
In the control group, a decrease of 5% was observed on the third day after the inoculation, compared with the pre-inoculation, but the M group also showed a decrease of 4.5%. In the M group, both the

sample numbers

1 and 2 decreased to 25% or less on the 7th day, and the sample number 1 became the 10th day and the sample number 2 became the 20% or less on the 14th day. Specimen No. 2 recovered to 20% on the 21st day, but Specimen No. 1 continued to decrease further and decreased to 15% on the 21st day. In the M group, the decrease in hematocrit value is similar to that in the control group.
[0074]
(4) Red blood cell count (Figure 14)
In the control group, there was a significant decrease from the third day after inoculation, but in the M group as well, on the third day after inoculation, 150 × 10 5 compared to before the inoculation. ^Four / Μl decreased. In the control group, recovery was observed once thereafter, but in the M group, the decrease continued thereafter, and in Sample No. 1, 474 × 10 4 on the 10th day ^Four / Μl, 257 × 10 on the 21st day ^Four / Μl. Specimen No. 2 has 552 × 10 on the 14th day ^Four / Μl, then 600 × 10 ^Four / Μl or more did not recover. Thus, in the M group, the temporary recovery seen in the control group was not observed.
[0075]
(5) Survival period (Tables 2 and 3)
The average survival time in the control group was 33.3 days, whereas in the M group, specimen number 1 was shortened by 23 days and specimen number 2 was shortened by 22 days and 10 days. This indicates that the survival period was not prolonged by the M / pCAGGS inoculation, but the death period was accelerated.
(6) Virus neutralization test (Fig. 15) and Western plot analysis
In the M and control groups, the neutralizing antibody increased from the 14th day after the challenge test, and the neutralizing antibody titer in the M group was higher than that in the control group (FIG. 15). In group M, neutralizing antibody before the challenge test could not be detected even when serum diluted 4-fold was used. The antibody titer before inoculation could not be detected in the Western plot as well. It was confirmed that the cats (Sample Nos. 1 to 8) used in the series of experiments were pathologically dissected and died of typical FIP symptoms based on the pathological findings.
[0076]
[Discussion]
Since FIPV has an ADE activity that enhances infection as a result of binding with an antibody, induction of humoral immunity with an existing vaccine will rather enhance infection. For this reason, induction of cellular immunity is important for protection against FIPV, but it has been difficult to induce strong cellular immunity by conventional vaccine methods. Therefore, this time, an FIP onset prevention test using a DNA vaccine was tried as a new vaccine method. In the N / pCAGGS inoculated group, the value of the clinical score was lower than that in the control group, and the body weight change, the white blood cell count, the red blood cell count, and the hematocrit level were once reduced but recovered in 2 out of 3 animals.
[0077]
In addition, 1 out of 3 animals in Group N has survived for more than half a year, and the body weight, body temperature, blood test values, appetite, etc. are normal, and it can be said that FIP has been successfully prevented. Furthermore, although it eventually died, the other one of the N groups had recovered their body weight and blood test values once after onset. This shows that the initial infection with FIPV could be prevented by this N / pCAGGS inoculation. On the other hand, in contrast to the results in the N / pCAGGS inoculated group, the M / pCAGGS inoculated group is not significantly different from the control group in all data such as clinical score, body weight, white blood cell count, red blood cell count, hematocrit value, or The result was worse than the control group. The reason for this is that FIPV structural protein M is one of the factors on the virus side that causes ADE, and it may be possible that FIPV infection was enhanced by inoculation with M / pCAGGS. However, since the M protein immunization experiment using vaccinia virus has succeeded in protecting against infection, the M protein itself cannot be used as a DNA vaccine.
[0078]
From the results of the virus neutralization test, the increase in antibody titer in the N / pCAGGS-inoculated group was slower than that in the other groups. ⁶ It is thought that the increase in antibody titer was delayed because a virus that could not be eliminated by the host immune system because of the attack with a large amount of virus called PFU grew. It was considered that cellular immunity was mainly involved in infection protection rather than humoral immunity because it could not be detected by Western plot analysis using sera collected from the N / pCAGGS-inoculated group before challenge. On the other hand, in the M / pCAGGS inoculated group, the increase in virus neutralizing antibody titer was more rapid than in the control group. Although neutralizing antibody titer could not be detected, there was some neutralizing antibody induction by M / pCAGGS inoculation, suggesting that billion immunization was established. It is also possible that antibody induction by DNA vaccination caused ADE-like infection.
[0079]
In this infection experiment, N / pCAGGS inoculation group could not completely protect FIPV. (1) 1 × 10 ⁶ Attacks with a large amount of virus called PFU, and (2) direct infection of the virus into the living body by intraperitoneal administration. As a result, even if immunity against the virus has occurred, the elimination of the virus by the immune system may not have caught up with the growth rate of the virus. However, in the natural world, it is unlikely that such a large amount of virus can infect a living body at once, and a DNA vaccine incorporating a gene encoding the N protein of FIPV, which is effective in protecting against initial infection, is similar to natural infection. It is considered that there is a sufficient effect by setting the optimal inoculation amount and inoculation method.
[0080]
【The invention's effect】
As is apparent from the above, the DNA vaccine of the present invention can be effectively prevented / treated against coronavirus infections such as FIPV, which have been difficult to protect.
[0081]
[Sequence Listing]

[0082]

[0083]

[0084]

[0085]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a phylogenetic tree based on the amino acid sequence of an N gene.
FIG. 2 is a diagram showing a phylogenetic tree based on the amino acid sequence of the M gene.
FIG. 3 is a view showing an electrophoresis photograph of restriction enzyme cleavage of N / pCAGGS.
FIG. 4 is a graph showing changes in clinical scores of group N after FIPV inoculation.
FIG. 5 is a graph showing changes in body weight of Group N after FIPV inoculation.
FIG. 6 is a graph showing changes in the white blood cell count of group N after FIPV inoculation.
FIG. 7 is a diagram showing a change in hematocrit value of group N after FIPV inoculation.
FIG. 8 shows changes in the number of red blood cells in group N after FIPV inoculation.
FIG. 9 is a diagram showing an electrophoresis photograph of restriction enzyme cleavage of M / pCAGGS.
FIG. 10 is a diagram showing changes in clinical symptom scores of Group M after FIPV inoculation.
FIG. 11 shows changes in body weight of group M after FIPV inoculation.
FIG. 12 is a graph showing changes in white blood cell count in group M after FIPV inoculation.
FIG. 13 is a graph showing changes in hematocrit values in group M after FIPV inoculation.
FIG. 14 shows changes in the number of red blood cells in group M after FIPV inoculation.
FIG. 15 is a graph showing virus neutralizing antibody titers.

Claims

Comprises DNA encoding the nucleocapsid protein of feline infectious peritonitis virus, the protein cat, and expression vectors capable of expressing porcine or in dogs, see containing a physiological saline, in the feline infectious peritonitis virus The DNA encoding the nucleocapsid protein has the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or has a homology of 95% or more with the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Infectious peritonitis virus and feline intestinal coronavirus, porcine infectious gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus in dogs, and nucleocapsid protein that can immunize canine coronavirus in dogs DN for coronavirus infection characterized by Vaccine.

A DNA encoding a nucleocapsid protein in a feline infectious peritonitis virus, comprising a DNA encoding a nucleocapsid protein in a feline infectious peritonitis virus, an expression vector capable of expressing the protein in the cat, and physiological saline; Has a DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or has a homology of 95% or more with the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and feline infectious peritonitis virus and feline intestinal corona A DNA vaccine against a coronavirus infection characterized by having a DNA sequence encoding a nucleocapsid protein capable of conferring immunity against the virus.

A DNA encoding a nucleocapsid protein in a feline infectious peritonitis virus, comprising a DNA encoding a nucleocapsid protein in a feline infectious peritonitis virus, an expression vector capable of expressing the protein in the cat, and physiological saline; A DNA vaccine against coronavirus infection, which has a DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and is capable of conferring immunity against feline infectious peritonitis virus.