JP4153693B2 - 新規なＣａＭＫＫ阻害剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）阻害剤のハイスループットスクリーニング方法、およびカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）に対して選択的に阻害活性を示す７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内カルシウム情報伝達系は、あらゆる細胞において細胞運動、分泌反応など、多岐にわたって機能している。細胞内情報伝達系の初期の反応は主に、遊離細胞内カルシウムが、カルモジュリンなどのカルシウム受容蛋白質へ結合することであると考えられており、これらカルシウム受容蛋白質がキナーゼなどの標的分子の機能を調節する。カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（以下、ＣａＭＫＫと略する）は、その活性発現にカルシウムイオン、カルモジュリンを必須とする蛋白質リン酸化酵素であり、大脳、小脳、膵臓、脾臓などにおいて発現されている。ＣａＭＫＫのin vitro における基質としては、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼ Ｉ、およびＩＶ(ＣａＭ-Ｋ Ｉ、ＩＶ)が挙げられ、これらのキナーゼをリン酸化することにより、活性化すると考えられている。また、アポトーシス促進に関与すると考えられている、ＰＫＢ（Protein kinase B）を直接リン酸化し活性化することが報告されている。その生理的機能としては、既報のin vitro試験結果から、中枢神経系、免疫系における遺伝子発現の制御および中枢神経系における細胞死抑制などが示唆されているが、実際の生体内での機能については、未だ不明な点が多い。その理由の一つは、ＣａＭＫＫの選択的な阻害剤が無かったことである。従って選択的にＣａＭＫＫを阻害する化合物は、ＣａＭＫＫの細胞内カルシウム情報伝達機構における役割、およびＣａＭＫＫが関与する生理機能の解明に必須であると考えられ、in vitro試験およびin vivo試験にＣａＭＫＫ選択的な阻害剤を用いることができれば、ＣａＭＫＫの機能を特定するのが容易になる。
また、ＣａＭＫＫ阻害剤の医薬品としての用途は未だ研究途上にあるが、上述したようなＣａＭＫＫの発現器官および示唆されている生理的機能から考えると、ＣａＭＫＫ阻害剤は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、中枢性疾患等の治療剤として応用できる。
【０００３】
カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼ類の阻害剤としては、中枢神経系初め、広く生体に存在し、多機能を有する、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼＩＩの阻害剤が知られている。具体的には、ＫＮ−６２(J. Biol. Chem., 265, 4315-4320(1990)) 、ＫＮ−９３（Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 968-975(1991)）、ペプチド性の化合物(公開特許公報平１１−１５２２９８)、アラキドン酸、１２−ＨＥＴＥ （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8550-8554(1989) などが挙げられる。ＫＮ−６２は、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼＩＶの阻害剤としても知られている（J. Biol. Chem., 269, 15520-15527(1994)）。しかし、ＣａＭＫＫを阻害する化合物については知られていない。
【０００４】
ＣａＭＫＫ酵素活性のアッセイ方法については、徳光らによってジャーナル・オブ・バイオケミストリー、２７５巻、２６号、２００９０頁に報告されている方法が挙げられる。ここで用いられている方法は、リン酸化源として［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰが用いられている。しかしながら、３２Ｐはエネルギーの高い放射性同位元素であり、この方法をＣａＭＫＫ阻害活性のハイスループットアッセイ系で用いることは位置的に近接するサンプル間で相互の放射活性の干渉作用が大き過ぎ、正確な放射活性測定ができないという点で困難であった。
【０００５】
一方、本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体の分野では、多数の化合物が公知であり、多くは染料または色素、およびその中間体として用いられている。例えば、1,8-ナフトイレンベンズイミダゾール-4（または5）-カルボン酸は、US2820037や有機合成化学第20巻第11号1016頁（1962年）に記載されている。
しかし、医薬用途としては、特開平６−２６３７５９に記載された、抗癌剤として有用な１、８−ナフトイレンベンズイミダゾール誘導体、および、US4670442に記載された、免疫調節剤として有用な１、８−ナフトイレンベンズイミダゾール誘導体が知られているに過ぎない。また、これらの化合物の作用機序については、全く記載されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）阻害剤のハイスループットスクリーニング方法、およびＣａＭＫＫが関与する生理活性を解明するために必須であり、医薬品としても有用な、選択的ＣａＭＫＫ阻害剤を供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、鋭意検討した結果、［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰをリン酸化源として用いることによって、リン酸化された基質を含む多数の反応混合物を１枚のフィルターに吸着させても、近接した反応混合物間の、相互の放射活性の干渉なしに正確な測定ができることを見出した。また、この方法では使用する放射線量を著しく減少させることもできる。これによって、一度に多数のサンプルをアッセイするハイスループットスクリーニング系を構築することができた。
上記の方法を用いて、選択的にＣａＭＫＫを阻害する化合物をスクリーニングした結果、強いＣａＭＫＫ阻害活性を示す７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体を見出すに至った。本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体またはその塩は、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼＩＩに対する阻害活性は低く、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼＩ、ＩＶ、ＭＬＣＫ、プロテインキナーゼＡ、Ｃ、およびp42ＭＡＰキナーゼ等に対してはほとんど阻害活性を示さず、極めて選択的にＣａＭＫＫを阻害することがわかった。このようなプロフィールを有する化合物はこれまで見出されていなかった。
【０００８】
すなわち本発明は、
［１］式（I）：
【化３】
［式中、Ｒ１、またはＲ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、またはハロアルキル基のいずれかである。Ｒ３は水素原子、アルキル基、または置換アルキル基を表し、ＣＯＯＲ３基はナフタレン環のどの位置に置換していてもよい。］で表される、７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体、またはその薬学上許容される塩を有効成分として含有するカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［２］Ｒ１およびＲ２が水素原子である、［１］記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［３］Ｒ３が水素原子である、請求項１または２記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［４］式（II）：
【化４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は前記と同義である。）
で表される７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体、またはその薬学上許容される塩を、有効成分として含有するカルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［５］Ｒ１およびＲ２が水素原子である、［４］記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［６］Ｒ３が水素原子である、［４］または［５］記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［７］式（III）：
【化５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は前記と同義である。）
で表される７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体、またはその薬学上許容される塩を、有効成分として含有するカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤。
［８］Ｒ１およびＲ２が水素原子である、［７］記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［９］Ｒ３が水素原子である、［７］または［８］記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［１０］［１］から［９］記載のカルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤を有効成分として含有する、ＣａＭＫＫの機能が亢進した病態を改善する治療剤、
［１１］［１］から［９］記載のカルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤を有効成分として含有する、アレルギー性疾患、炎症性疾患、または中枢性疾患の治療剤、
［１２］［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰを基質のリン酸化源として用いて酵素反応を行い、リン酸化された基質をフィルターに吸着させてその放射活性を測定することを特徴とする、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）阻害剤のハイスループットスクリーニング方法、
に関するものである。
【０００９】
本発明において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を表し、好ましくはフッ素原子、または塩素原子である。
アルキル基としては炭素数１から４のアルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、プロピル、1−メチルエチル、ブチル、1−メチルプロピル、2−メチルプロピル、２，２−ジメチルエチルなどが挙げられる。
ハロアルキル基とは、１から５個のハロゲン原子が結合したアルキル基を表し、好ましくは、１から３個のハロゲン原子が結合したアルキル基を表す。具体的にはトリフルオロメチル、２−トリフルオロエチル、２−クロロエチルなどが挙げられる。
置換アルキル基における置換基としては、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルカルボニル基、炭素数１から４のアルキルカルボニルオキシ基、炭素数１から４のアルコキシカルボニル基、炭素数１から４のアルコキシカルボニルオキシ基等が挙げられる。
式（Ｉ）〜式（III）における、Ｒ１およびＲ２の好ましい例としては、同一または異なって、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。特に好ましいのは水素原子である。
【００１０】
式（Ｉ）〜式（III）における、Ｒ３の好ましい例としては、水素原子、メチル基、エチル基、アセトキシメチル基、または、ピバロイルオキシメチル基等が挙げられ、特に好ましいものは水素原子である。
本発明におけるＣａＭＫＫ阻害剤は、好ましくは、式（II）で表される化合物、またはその薬学上許容される塩であり、更に好ましくは、式（IV)：
【化６】
で表される化合物、またはその薬学上許容される塩である。
【００１１】
本明細書において、式（Ｉ）〜式（IV）で表される７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体の「薬学上許容される塩」としては、例えば、塩基性塩の場合、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、亜鉛塩等の無機金属塩、メチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、トリヒドロキシメチルアミノメタン等の一級、二級、三級の有機アミン塩、ピリジニウム塩等が挙げられ、酸性塩の場合、塩酸、硝酸、燐酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸、並びにメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの脂肪族、芳香族を含むスルホン酸類、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸などの脂肪族、芳香族を含むカルボン酸のような有機酸との塩を含む。
また、本発明には、式（Ｉ）〜式（IV）で表される７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体またはその塩の水和物、エタノール溶媒和物等の溶媒和物等も含まれる。
【００１２】
式（Ｉ）〜式（IV）で表される化合物は、以下の方法で製造することができる。
製造法１：
US2820037に記載された方法などを用いて、以下の工程で製造することができる。すなわち、
［１］式（１−４）、または式（１−５）で表される化合物の製造工程
【化７】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同義である。Ｘは、ニトロ基、アミノ基、または保護基で保護されたアミノ基を表す。）
Ｏ−置換アニリン誘導体：式（１−２）と、ブロモナフタレン酸無水物：式（１−１）を、必要に応じて酸触媒の存在下、水中、または酢酸、エタノール、ＤＭＦのような極性溶媒を用いて、通常０℃〜250℃の範囲で縮合し、式（１−３）の化合物を製造することができる。Ｘがアミノ基である場合、式（１−３）の化合物は、必要に応じてジシクロヘキシルカルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下、ＤＭＦなどの不活性溶媒中で縮合反応を行い、式（１−４）の化合物、および式（１−５）の化合物へ導くことができる。Ｘが保護基で保護されたアミノ基を表す場合、保護基を脱保護し、アミノ基へと返還した後縮合反応を行うことができる。
また、Ｘがニトロ基の場合、接触水素化反応、鉄、亜鉛などの金属を用いた還元反応を用いてアニリン誘導体を合成し、続いて上述の縮合反応を行うことができる。
式（１−４）の化合物、および式（１−５）の化合物を含む混合物は、そのまま次の反応へ供することも可能であるが、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや、分別再結晶等を用いて、それぞれの位置異性体を分離精製することも可能である。式（１−４）、および（１−５）の異性体は、各々公知化合物であり、１Ｈ−ＮＭＲデータを取得することで区別することができる。（Bull.Chem.Soc.Jpn.,74,173(2001)）
また、式（１−１）の化合物の位置異性体を原料に用いることにより、上記と同様の方法で、式（１−４）の化合物の他の異性体を合成することもできる。
【００１３】
［２］式（２−２）の化合物の製造工程
【化８】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同義である。）
工程１で得られる式（１−４）の化合物、式（１−５）の化合物、またはそれらの混合物等の、式（２−１）で表される化合物から、実施例に記載された方法などを用いて、式（２−２）の化合物を製造することができる。式（２−２）で表される化合物が位置異性体の混合物である場合は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分別再結晶等を用いて位置異性体を分離することもできる。
【００１４】
［３］式（３−１）の化合物の製造工程
【化９】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同義である。）
式（２−２）の化合物に対して、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基、あるいは濃塩酸などの酸の存在下、加水分解反応を行い、式（３−１）で表される本発明の化合物を製造することができる。上記式（３−１）で表される化合物が位置異性体の混合物である場合は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分別再結晶等を用いて位置異性体を分離することもできる。
式（３−１）で表される化合物は、公知の方法でエステル化反応を行い、カルボキシル基をエステルへと変換することができる。該方法については、新実験化学講座（丸善；第２２巻）等に記載されている。
また、前記製造方法で使用されるアミノ基の保護基としては、当業者が通常使用する保護基が挙げられ、保護・脱保護の方法等については、「Protective groups in organic chemistry(第２版/Greene, T.W., John Wiley & Sons, Inc.)に記載された方法等が挙げられる。
【００１５】
本発明において、ＣａＭＫＫは、そのホモログ、アイソフォームも含んでいる。例えばラットＣａＭＫＫの配列は、Anderson, K.A. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 31880-31889 等に記載されているが、ＣａＭＫＫα、およびＣａＭＫＫβの２種類のアイソフォームが知られている。また、ヒトＣａＭＫＫの配列についても上記文献等に開示されている。
【００１６】
本発明におけるハイスループットスクリーニング方法とは、１度に多数のサンプルの酵素阻害活性を評価することができるスクリーニング方法を表し、具体的には、96穴プレート（具体的には、8.5cm ｘ 12.7cmの大きさのものなどが汎用されている。）等を用いて評価する方法等が挙げられる。
本発明のハイスループットスクリーニング方法は、以下の工程を含むものである。すなわち、
［１］96穴Ｖ底プレート等、多数のサンプルを独立した反応槽にサンプリングできる構造を有するプレートの各穴に、被検化合物、ＣａＭＫＫ、カルモジュリンキナーゼＩなどの基質、カルモジュリン、[γ−３３Ｐ]- ＡＴＰを添加して、適当な温度、例えば37℃で、約1時間、リン酸化反応を進行させた後、 ＥＤＴＡ、トリクロロ酢酸、塩酸などの試薬を用いて反応を停止させる。
ここで、基質と酵素の相互作用を促進するために、酵素反応時にコールドのＡＴＰを添加してもよい。また、３３Ｐの取り込みを完全に停止させるために、反応停止時にコールドのＡＴＰを添加してもよい。
［２］各穴の反応液の一部を等量ずつ、シート状のフィルター、好ましくは、リン酸基が導入されたグラスファイバーフィルター上の対応する位置に滴下する。このフィルターをリン酸溶液で５回、エタノールで１回洗浄して未反応の[γ-３３Ｐ]- ＡＴＰを除いた後、乾燥させる。
［３］乾燥後のフィルターにシンチレータ、好ましくは固形シンチレータシートを重ねて熱融解により浸透させ、再固化後、プレートカウンタで[γ-３３Ｐ]の放射活性を定量する。
ここでＣａＭＫＫは、本発明明細書の実施例に示す方法等を用いて調製することができる。
本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体は、前述のように、ＣａＭＫＫに選択的な唯一の阻害剤であり、ＣａＭＫＫ阻害作用を指標とした医薬品のスクリーニング等に用いることができる。例えば、ＣａＭＫＫの機能はそもそも不明であるが、当該化合物を加えることにより、ＣａＭＫＫの機能を阻害した細胞培養系を構築することができる。従って、そのような細胞培養系における生理学的な挙動を調べることによって、ＣａＭＫＫの機能を推定することができる。また、本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体は、ＣａＭＫＫの機能を指標とする種々のスクリーニング系において、陽性、あるいは陰性の対照化合物として用いることができる。
また、本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体は、ＣａＭＫＫの機能亢進が増悪をもたらす疾患の治療剤として用いることができる。
本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体は、これを医薬として用いるにあたり、経口的または非経口的（例えば、静脈内、皮下、もしくは筋肉内注射、局所的、経直腸的、経皮的、または経鼻的）に投与することができる。経口投与のための形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤または懸濁剤などが挙げられ、非経口投与のための形態としては、例えば、注射用水性剤もしくは油性剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、エアロゾル剤、坐剤、貼付剤などが挙げられる。これらの製剤は、従来公知の技術を用いて調製され、許容される通常の担体、賦形剤、結合剤、安定剤等を含有することができる。また、注射剤で用いる場合には許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体またはその医薬上許容される塩の投与量、投与回数は、症状、年令、体重、投与形態によって異なるが、通常は成人に対して本発明化合物の有効成分量として、１日あたり約１〜２０００ｍｇ、好ましくは１０〜５００ｍｇを１回または数回に分けて投与することができる。
【００１７】
【実施例】
以下に実施例および参考例を説明するが、本発明はもとよりこれに限定されるものではない。実施例では、下記の略号が使用されている。
ＤＭＳＯ ＝ ジメチルスルホキシド
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
実施例１
化合物の合成（混合物）
工程１
３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物
３−ブロモ−１，８−ナフタリンジカルボン酸無水物（２．７９ｇ）とＯ−フェニレンジアミン（１．１０ｇ）、酢酸（１５ｍｌ）をＯ−クロロベンゼン（２５ｍｌ）に懸濁させ、１００℃で７時間加熱還流した。反応液を放冷後、結晶を濾取、減圧乾燥した後、標記化合物（２．４９ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：８．８１（ｍ），８．６７−８．４９（ｍ），８．４４（ｍ），８．２５（ｍ），８．０４（ｍ），７．８６（ｍ），７．４９（ｍ）
【００１８】
工程２
３−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物
３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物（１．０ｇ）とシアン化銅（Ｉ）（０．３１ｇ）をピリジン（７．１ｍｌ）に加え、封管中、１５０℃で１０時間加熱した。反応液を放冷後、アンモニア水で希釈し沈殿した結晶を濾取した。濾上物は水で洗液が中性になるまで洗浄し、室温で減圧乾燥し、標記化合物（１．１３ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：８．７８（ｍ），８．６１−８．３７（ｍ），８．１３（ｍ），７．８９（ｍ），７．５２（ｍ）
【００１９】
工程３
３−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物
３−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物（１００ｍｇ）を濃硫酸（１０ｍｌ）、水（１０ｍｌ）、酢酸（５ｍｌ）に懸濁させ、１２０℃で５時間加熱した。反応液を放冷後、６０ｍｌの水に注入し、室温で１時間撹伴した。反応懸濁液をろ過し、濾上物を室温で減圧乾燥して残渣を得た。これを２％水酸化ナトリウム水溶液に懸濁し、１００℃で１時間撹伴した。反応懸濁液をろ過し、濾液を５％塩酸水でｐＨを３に調整した後、酢酸エチルで抽出し有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して減圧濃縮後、標記化合物（８０ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：９．３１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），９．０３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．７２（ｍ），８．３９（ｍ），８．０４−７．８５（ｍ），７．４８（ｍ）。
【００２０】
実施例２
３−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノ リン−７−オンと４−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの分離精製
３−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物（７０μｇ）をＤＭＳＯ（１滴）アセトニトリル（７滴）に溶解し、逆相ＨＰＬＣ条件［カラム，Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（４．６ｍｍ×１５ｃｍ）、移動相，アセトニトリル：水：ＴＦＡ（４５：５５：０．０５）］で分取し、保持時間１０．９分の分画と保持時間１１．７分の分画を得、それぞれを減圧濃縮し、異性体Ａ（７．５μｇ）、異性体Ｂ（８．１μｇ）を得た。
【００２１】
実施例３
ＣａＭＫＫの調製
ラットCaMKKα（配列は以下の文献に記載。Tokumitsu, h. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 19320-19324) は大腸菌(BL21)を用いて以下の条件で発現および精製した。100μg/ml Ampicillin を含むLB-培地において培養し600 nmの吸光度が1.2 となった時点において0.1mM IPTG（終濃度）を加えさらに12-16時間培養した。その後大腸菌を回収し、超音波破砕した後、その上清をMono Qカラムに供しNaCl濃度勾配により溶出した。本方法により粗精製し、純度約９０％の目的とする酵素を得た。
完全精製標品はCaM-セファロースカラムを用いて2mM EGTAを含む溶出液にて溶出することにより純度約９５％以上の目的とする酵素を得た。
酵素標品は50mM HEPES pH7.5, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA, 1mM DTT, 0.1mM PMSF, 40% グリセロール, 10% エチレングリコールに溶解して-30度に保存した。
ラットＣａＭＫＫβは、文献（Tokumitsu, H. et al.（2001）, Bio-chemistry 40, 13925-13932）記載の方法で調製した。
【００２２】
実施例４
ＣａＭ−ＫＩの調製
GST-CaMK-Ｉ(K49E) およびGST-CaM-KI(1-293, K49E)は大腸菌(JM109)を用いて以下の条件で発現および精製した。100μg/ml Ampicillin を含むLB-培地において培養し600 nmの吸光度が1.2 となった時点において1mM IPTG（終濃度）を加えさらに12-16時間培養した。その後大腸菌を回収し、0.1 mM PMSFを含むPBSに溶かし、超音波破砕した後、その上清をグルタチオンセファロースに供した。グルタチオンセファロースを0.1 mM PMSFを含むPBSにより洗浄し、10 mM グルタチオンを含む50 mM Tris pH 8.0 溶液にてGST-融合タンパク質を溶出した。本方法により純度約９０％の目的とする酵素を得た。
精製標品は50mM HEPES pH7.5, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA, 1mM DTT, 0.1mM PMSF, 40% グリセロール, 10% エチレングリコールに溶解して-30度に保存した。
【００２３】
実施例５
ＣａＭＫＫ阻害作用の測定（ハイスループットスクリーニング）
CaMKK（ここではCaMKKαを用いた。）の活性測定は、[γ-33P]-ATPとCaM-KIを基質とし、CaMKKによるリン酸化反応でCaM-KIに導入された[γ-33P]の放射活性を測定することで定量した。以下のアッセイにおいて、各試薬は、緩衝液（10mM Mg(Ac)2、0.1mM CaCl2、1mM DTTを含む50mM HEPES(pH7.5)）に溶解し、使用した。被検化合物は、粉末をDMSOに溶解した後、緩衝液で必要濃度に希釈して使用した。
96穴Ｖ底プレートの各穴に、種々の濃度の被検化合物溶液10μl、CaMKK、CaMK-Ｉ、カルモジュリンを含む溶液10μl、[γ-33P]-ATP、cold ATPを含む溶液10μlを順に添加して、反応を開始させた（反応液総量30μｌ中の各試薬濃度は、CaMKK：CaMKKストック液20μｌ/ml、CaM-KI：67μg/ml、カルモジュリン：1μＭ、[γ-33P]-ATP ：6.7μCi/ml(2.2〜6.7nM)、Cold ATP：0.3μＭ)。37℃で1時間、リン酸化反応を進行させた後、 100mM EDTA、10mM ATPを含む50mM HEPES(pH7.5)を5μｌずつ加えて反応を停止させた。
反応停止後、反応液を15μｌずつ、シート状のグラスファイバーフィルター（Wallac、filtermat P30）の各穴に対応する位置に滴下、浸透させた。このフィルターを150mMリン酸溶液で５回、エタノールで１回洗浄して未反応の[γ-33P]-ATPを除いた後、乾燥させた。
乾燥後のフィルターに固形シンチレータシートを重ねて熱融解により浸透させ、再固化後、フィルターに補足されたCaM-KIに導入されている[γ-33P]の放射活性をプレート用カウンタで測定、定量した。
被験化合物の阻害率は、以下の式により算出した。
阻害率(%)＝100×(A−B)/(A−C)
A：CaMKK添加、被検化合物非添加の場合の放射活性カウント
B：CaMKK添加、被検化合物添加の場合の放射活性カウント
C：CaMKK非添加、被検化合物非添加の場合の放射活性カウント（バックグランド）
1化合物につき４〜５種類の濃度で求めた阻害率を解析して、IC50値を算出した。尚、各濃度においては、Ｎ＝３で測定し、平均値を求めた。実施例１、および実施例２（異性体B）についてIC50値を測定した結果を表１に示す。
【表１】
【００２４】
実施例６
３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの合成
Bull.Chem.Soc.Jpn. 74, 173 (2001)に記載された方法を参考に合成した。４−ブロモ−１，８−ナフチル酸無水物（７６．３ｇ）の酢酸（３００ｍｌ）中に室温下でＯ−フェニレンジアミン（３０．１５ｇ）およびクロロベンゼン（６００ｍｌ）を加えた後、５時間還流撹拌をした。反応液を１０−１５℃に冷却し、結晶を濾取し、３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物（一番晶：８０．２ｇ，二番晶：１１．１ｇ）を得た。一番晶およびほぼ同一組成の結晶（１０３．９９ｇ）を数バッチに分けてクロロホルムで再結晶を繰り返し、４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン（１４．９９ｇ）を得た。二番晶およびほぼ同一組成の結晶（３３．７５ｇ）をあわせて数バッチに分けてクロロホルムを用いてカラムクロマト精製を繰り返し、３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン（１．１６ｇ）を得た。それぞれの異性体の構造は、１H-NMRデータを取得し、上記文献記載のデータと比較することで確認した。
【００２５】
実施例７
化合物の合成（異性体）
工程１
３−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン
【化１０】
実施例６で得た３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン（１．１３ｇ）とシアン化銅（Ｉ）（０．４７ｇ）をピリジン（１０ｍｌ）に加え、封管中、１５０℃で２０時間加熱した。反応液を放冷後、アンモニア水で希釈し沈殿した結晶を濾取した。濾上物は水で洗液が中性になるまで洗浄し、室温で減圧乾燥し、標記化合物を３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンとの混合物として得た。収量０．４５ｇ。ＨＰＬＣ面百値 ８３．５％（３−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：８．８４−８．８０（２Ｈ,ｍ），８．６２（１Ｈ，ｄｄ,Ｊ＝８．０，１．０Ｈｚ），８．５１（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．４６−８．４３（１Ｈ，ｍ），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５，１．０Ｈｚ），７．９４（１Ｈ，ｍ），７．５４（２Ｈ，ｍ）
工程２
３−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン
【化１１】
３−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン（０．４５ｇ）を濃硫酸（５ｍｌ）、水（５ｍｌ）、酢酸（２．５ｍｌ）に懸濁させ、３時間加熱還流した。反応液を放冷後、２７０ｍｌの水に注入し、反応懸濁液をろ取して残渣を得た。これを２％水酸化ナトリウム水溶液に加熱溶解して不溶物を吸引ろ過により除いた。濾液を５％塩酸水でｐＨを２に調整した後、析出した結晶をろ取した。得られた粗結晶を酢酸で再結晶し、標記化合物（０．３６ｇ）を得た。本化合物は、実施例２の異性体ＢとＨＰＬＣ溶出時間保持時間が完全に一致した。本化合物は、１モルの酢酸を含む。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：９．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．８４−８．７６（２Ｈ，ｍ），８．４５（２Ｈ，ｍ），８．０６（１Ｈ，ｍ），７．９２（１Ｈ，ｍ），７．５４（２Ｈ，ｍ），１．９１（３Ｈ，ｓ）
【００２６】
実施例８
化合物の合成（異性体）
工程１
４−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン
【化１２】
実施例６で得た４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン（６．９０ｇ）とシアン化銅（Ｉ）（２．１８ｇ）をピリジン（４０ｍｌ）に加え、封管中、１５０℃で２０時間加熱した。反応液を放冷後、アンモニア水で希釈し沈殿した結晶を濾取した。濾上物は水で洗液が中性になるまで洗浄し、室温で減圧乾燥し、粗シアノ体（４．６０ｇ）を得た。粗シアノ体（０．８ｇ）をカラムクロマトグラフィーで分離精製し、精シアノ体０．５７ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：８．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．４８（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．４３（１Ｈ，ｍ），８．１６（１Ｈ，ｍ），７．９０（１Ｈ，ｍ），７．５４（２Ｈ，ｍ）
工程２
４−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン
【化１３】
４−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン（９９２ｍｇ）を濃硫酸（１０ｍｌ）、水（１０ｍｌ）、酢酸（５ｍｌ）に懸濁させ、１時間加熱還流した。反応液を放冷後、６００ｍｌの水に注入してろ過し、濾上物を室温で減圧乾燥して残渣を得た。これを２％水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、１時間加熱還流した。反応懸濁液をろ過し、濾液を５％塩酸水でｐＨを３に調整した後、析出した結晶をろ取し、酢酸で再結晶した後、標記化合物（１７９ｍｇ）を得た。本化合物は、実施例２の異性体ＡとＨＰＬＣ保持時間が完全に一致した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：９．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．４６−８．３９（２Ｈ，ｍ），８．０１（１Ｈ，ｍ），７．９０（１Ｈ，ｍ），７．５１（２Ｈ，ｍ）
【００２７】
実施例９
実施例５と同様の方法で、実施例７の化合物および実施例８の化合物のＣａＭＫＫ阻害活性を測定した。結果を表２に示した。
【表２】
【００２８】
実施例１０
ＣａＭＫＫ特異性の測定
以下の方法で、各種CaMKK（ここではCaMKKαを用いた。）に対する阻害作用を測定した。
CaMKK(0.28 μg/ml)の活性測定は、100 μM[γ-32P]-ATPと100 μg GST-CaM-KI (1-293, K49E)を基質とし、CaMKKによるリン酸化反応でGST-CaM-KIに導入された[γ-32P]の放射活性を測定することで定量した。反応溶液は10mM Mg(Ac)2、1mM CaCl2、1mMジチオトレイトール, 3 μM カルモデュリンを含む50mM HEPES(pH7.5)）使用し、反応時間は5 分間である。被験化合物（実施例１の化合物）は、粉末をDMSOに溶解した後、DMSOで必要濃度に希釈して終濃度４％DMSO存在下の条件でCaMKKの活性を測定した。反応は２５μl反応溶液のうち15μlをP-81 Phosphocellurose フィルターにスポットすることにより終了させ、75 mM リン酸溶液にて十分に洗浄し、遊離の[γ-32P]-ATPを除去後乾燥させ放射活性をシンチレーションカウンターにより測定し、CaM-KK活性とした。
【００２９】
CaM-KI, CaM-KII, CaM-KIV 活性測定法
CaM-KI(2.5 μg/ml), CaM-KII(0.75 μg/ml), CaM-KIV(0.57 μM) 活性測定は100 μM[γ-32P]-ATPと40 μM syntide-2を基質とし、それぞれのＣａＭ依存性キナーゼによるリン酸化反応でsyntide-2に導入された[γ-32P]の放射活性を測定することで定量した。反応溶液は10mM Mg(Ac)2、1mM CaCl2、1mM DTT, 3 μM カルモデュリンを含む50mM HEPES(pH7.5)）使用し反応時間は5 分間である。被験化合物（実施例１の化合物）は、粉末をDMSOに溶解した後、DMSOで必要濃度に希釈して終濃度４％DMSO存在下の条件（CaM-KK 活性測定と同条件）でCaM-KI, CaM-KII, CaM-KIVの活性を測定した。反応は２５μl反応溶液のうち1５μlをP-81 Phosphocellurose フィルターにスポットすることにより終了させ、75 mM リン酸溶液にて十分に洗浄し、遊離の[γ-32P]-ATPを除去後乾燥させ放射活性をシンチレーションカウンターにより測定し、CaM-KI, CaM-KII, CaM-KIV 活性とした。
結果を表３に示した。
【表３】
【００３０】
実施例１１
CaMKK （ CaMKK α、β）の阻害活性
精製したリコンビナントCaM-KKα(0.3μg/ml)およびCaM-KKβ（0.5μg/ml）と、10または100μgのGST-CaM-K I （1-293, K49E）を、30℃で5分間、50mM HEPES (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、50または100μM [γ-32P]ATPを含む溶液(25μl)中で、1mM CaCl2/2または3μM カルモジュリン（CaM）の存在下、種々の濃度の、実施例7の化合物（最終濃度：0-10μg/ml 4%DMSO溶液）と共にインキュベートした。酵素反応は、[γ-32P]ATP を加えることによって開始し、ホスホセルロース紙（Whatman P-81）上に 15μlをスポットすることによって終了させ、これを75mM リン酸で数回洗浄した。GST-CaM-K I (1-293, K49E)への取り込みは、フィルターの液体シンチレーションカウントを測定することによって定量した。結果を表４に示した。
【００３１】
CaMK I 、 II 、 IV 、および MLCK に対する阻害効果
CaMK Iは、実施例１０と同様に調製した。CaMIIは文献（Tokumitsu et al. （1990）J. Biol. Chem. 265, 4315-4320）に記載の方法で調製した。CaMIVは文献（ Brickey, D.A., et al.（1990）Biochem. Biophys. Res. Commun. 173, 578-584）に記載の方法で調製した。CaM-K I(2.5μg/ml)、CaM-K II(0.75μg/ml)、CaM-K IV（９μg／ml）、またはMLCK（広島大学、Dr. Hiroshi Hosoyaより分与 ,0.6μg/ml）と、40μM Syntide-2（MLCKについては、50μM MLCペプチド）を、30℃で5分間、50mM HEPES (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、50または100μM [γ-32P]ATPを含む溶液(25μl)中で、1mM CaCl2/2または3μM カルモジュリン（CaM）の存在下、種々の濃度の実施例７の化合物（最終濃度：0-10μg/ml 4%DMSO溶液）と共にインキュベートした。プロテインキナーゼ活性は、実施例１０に記載されたホスホセルロースフィルター法で測定した。
【００３２】
PKA 、 PKC 、および p42MAP キナーゼに対する阻害効果
PKA(Promega、8μg/ml)、PKC(Promega、25ng/ml)、またはp42MAPキナーゼ（upstate biotechnology、2μg/ml）を、それぞれ100μM Kemptamide（PKA基質）、100μM Neurograninペプチド（PKC基質；プロメガ製）、または0.4mg/ml Myelin basic protein（p42 MAPキナーゼ基質）と、30℃で5分間、50mM HEPES (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、50μM [γ-32P]ATP (4500cpm/pmol)を含む溶液(25μl)中で、1mM CaCl2/0.4μg/ml ホスファチジルセリンおよび0.1mg/ml BSAの存在下（PKC）、あるいは非存在下（PKAおよびp42MAPキナーゼ）に、種々の濃度の実施例７の化合物（最終濃度：0-10μg/ml 4%DMSO溶液）と共にインキュベートした。プロテインキナーゼ活性は、実施例１０に記載されたホスホセルロースフィルター法で測定した。
結果を表４に示した。
【表４】
【００３３】
実施例１２
ヒト神経芽細胞腫における内因性 CaMKK に対する阻害効果
Ca2+/CaM-非依存型CaMK-IV（305HMDT-DEDD）、機能不全変異型CaMK-IV（305HMDT-DEDD、K71E）、恒常的活性型CaM-KK（1-434）のcDNAを含むリコンビナントアデノウイルスは以下のように調製した。すなわち、pME18sプラスミド中のcDNAを制限酵素で切り出し、末端を平滑化してｐShuttle（Clontech）中に組み込んだ。Adeno-X発現システム（Clontech）を用いて添付のプロトコールに従い、HEK293細胞よりリコンビナントウイルスが得られた。６穴培養プレートに播種してコンフルエントになったSY5Y細胞に、上記のように得られたリコンビナントウイルスを種々の組み合わせで、37℃１時間、10プラーク形成単位／Cellの感染多重度（M.O.I.）で感染させた。感染後、ウイルスは吸引除去し、細胞は更に10%FBSを含むRPMI培地で12時間培養した。その後細胞を6時間、種々の濃度の実施例７の化合物（最終濃度：0-10μg/ml 0.5%DMSO溶液）の存在あるいは非存在下に無血清状態で培養した。細胞を1μM イオノマイシン存在下あるいは非存在下で10分間刺激した後、溶解し、抽出物をSDS-7.5% PAGEに供した。これに抗CaM-K IV抗体（1:2000、Transduction Lab.）または抗phosphoThr286CaM-KII抗体（熊本大 Dr.Koji Fukunagaより供与）を用いてウエスタン・ブロッティングを行った。フィルム上のCaM-K IVの免疫反応性バンドをデンシトメーターでスキャンして数値化し、化合物１がCaM-K IVの活性型形成に及ぼす効果を定量した。結果を図１に示した。
この結果から、実施例７の化合物は細胞膜透過性を有し、ヒト神経芽細胞腫の細胞内で内因性CaM-KKに対しても阻害作用を示すことがわかる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体またはその塩は、その高い選択性のために、ＣａＭＫＫの生理作用を解明するために有用である。更に、本発明の化合物は、高い選択性を示すため、生体内で重要な役割を果たしている他の種類のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼ類を阻害することがない。従ってＣａＭＫＫ由来の病態のみを改善する薬剤の有効成分となり得る。上記のように本発明により、選択的なカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼの阻害剤を提供することが可能になった。
【００３５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Aは、遺伝子組み込みでヒト神経芽細胞腫内に発現させたCa2+/CaM-非依存型CaM-KIVが、細胞内でCaM-KKにより確かに活性型になる（リン酸化される）ことを示す。
Bは、ヒト神経芽細胞腫において遺伝子組み込みにより発現されたCa2+/CaM-非依存型CaM-KIVが内因性CaM-KKにより活性化（リン酸化）され、実施例７の化合物がそれを濃度依存的に阻害していることを示す。
Cは、CaM-KIIのリン酸化に対しては、実施例７の化合物の阻害作用が弱く、その阻害作用がCaMKK特異的であることを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）阻害剤のハイスループットスクリーニング方法、およびカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）に対して選択的に阻害活性を示す７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内カルシウム情報伝達系は、あらゆる細胞において細胞運動、分泌反応など、多岐にわたって機能している。細胞内情報伝達系の初期の反応は主に、遊離細胞内カルシウムが、カルモジュリンなどのカルシウム受容蛋白質へ結合することであると考えられており、これらカルシウム受容蛋白質がキナーゼなどの標的分子の機能を調節する。カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（以下、ＣａＭＫＫと略する）は、その活性発現にカルシウムイオン、カルモジュリンを必須とする蛋白質リン酸化酵素であり、大脳、小脳、膵臓、脾臓などにおいて発現されている。ＣａＭＫＫのin vitro における基質としては、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼ Ｉ、およびＩＶ(ＣａＭ-Ｋ Ｉ、ＩＶ)が挙げられ、これらのキナーゼをリン酸化することにより、活性化すると考えられている。また、アポトーシス促進に関与すると考えられている、ＰＫＢ（Protein kinase B）を直接リン酸化し活性化することが報告されている。その生理的機能としては、既報のin vitro試験結果から、中枢神経系、免疫系における遺伝子発現の制御および中枢神経系における細胞死抑制などが示唆されているが、実際の生体内での機能については、未だ不明な点が多い。その理由の一つは、ＣａＭＫＫの選択的な阻害剤が無かったことである。従って選択的にＣａＭＫＫを阻害する化合物は、ＣａＭＫＫの細胞内カルシウム情報伝達機構における役割、およびＣａＭＫＫが関与する生理機能の解明に必須であると考えられ、in vitro試験およびin vivo試験にＣａＭＫＫ選択的な阻害剤を用いることができれば、ＣａＭＫＫの機能を特定するのが容易になる。
また、ＣａＭＫＫ阻害剤の医薬品としての用途は未だ研究途上にあるが、上述したようなＣａＭＫＫの発現器官および示唆されている生理的機能から考えると、ＣａＭＫＫ阻害剤は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、中枢性疾患等の治療剤として応用できる。
【０００３】
カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼ類の阻害剤としては、中枢神経系初め、広く生体に存在し、多機能を有する、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼＩＩの阻害剤が知られている。具体的には、ＫＮ−６２(J. Biol. Chem., 265, 4315-4320(1990)) 、ＫＮ−９３（Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 968-975(1991)）、ペプチド性の化合物(公開特許公報平１１−１５２２９８)、アラキドン酸、１２−ＨＥＴＥ （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8550-8554(1989) などが挙げられる。ＫＮ−６２は、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼＩＶの阻害剤としても知られている（J. Biol. Chem., 269, 15520-15527(1994)）。しかし、ＣａＭＫＫを阻害する化合物については知られていない。
【０００４】
ＣａＭＫＫ酵素活性のアッセイ方法については、徳光らによってジャーナル・オブ・バイオケミストリー、２７５巻、２６号、２００９０頁に報告されている方法が挙げられる。ここで用いられている方法は、リン酸化源として［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰが用いられている。しかしながら、３２Ｐはエネルギーの高い放射性同位元素であり、この方法をＣａＭＫＫ阻害活性のハイスループットアッセイ系で用いることは位置的に近接するサンプル間で相互の放射活性の干渉作用が大き過ぎ、正確な放射活性測定ができないという点で困難であった。
【０００５】
一方、本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体の分野では、多数の化合物が公知であり、多くは染料または色素、およびその中間体として用いられている。例えば、1,8-ナフトイレンベンズイミダゾール-4（または5）-カルボン酸は、US2820037や有機合成化学第20巻第11号1016頁（1962年）に記載されている。
しかし、医薬用途としては、特開平６−２６３７５９に記載された、抗癌剤として有用な１、８−ナフトイレンベンズイミダゾール誘導体、および、US4670442に記載された、免疫調節剤として有用な１、８−ナフトイレンベンズイミダゾール誘導体が知られているに過ぎない。また、これらの化合物の作用機序については、全く記載されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）阻害剤のハイスループットスクリーニング方法、およびＣａＭＫＫが関与する生理活性を解明するために必須であり、医薬品としても有用な、選択的ＣａＭＫＫ阻害剤を供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、鋭意検討した結果、［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰをリン酸化源として用いることによって、リン酸化された基質を含む多数の反応混合物を１枚のフィルターに吸着させても、近接した反応混合物間の、相互の放射活性の干渉なしに正確な測定ができることを見出した。また、この方法では使用する放射線量を著しく減少させることもできる。これによって、一度に多数のサンプルをアッセイするハイスループットスクリーニング系を構築することができた。
上記の方法を用いて、選択的にＣａＭＫＫを阻害する化合物をスクリーニングした結果、強いＣａＭＫＫ阻害活性を示す７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体を見出すに至った。本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体またはその塩は、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼＩＩに対する阻害活性は低く、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼＩ、ＩＶ、ＭＬＣＫ、プロテインキナーゼＡ、Ｃ、およびp42ＭＡＰキナーゼ等に対してはほとんど阻害活性を示さず、極めて選択的にＣａＭＫＫを阻害することがわかった。このようなプロフィールを有する化合物はこれまで見出されていなかった。
【０００８】
すなわち本発明は、
［１］式（I）：
【化３】
［２］Ｒ１およびＲ２が水素原子である、［１］記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［３］Ｒ３が水素原子である、請求項１または２記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［４］式（II）：
【化４】
で表される７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体、またはその薬学上許容される塩を、有効成分として含有するカルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［５］Ｒ１およびＲ２が水素原子である、［４］記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［６］Ｒ３が水素原子である、［４］または［５］記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［７］式（III）：
【化５】
で表される７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体、またはその薬学上許容される塩を、有効成分として含有するカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤。
［８］Ｒ１およびＲ２が水素原子である、［７］記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［９］Ｒ３が水素原子である、［７］または［８］記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
［１０］［１］から［９］記載のカルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤を有効成分として含有する、ＣａＭＫＫの機能が亢進した病態を改善する治療剤、
［１１］［１］から［９］記載のカルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤を有効成分として含有する、アレルギー性疾患、炎症性疾患、または中枢性疾患の治療剤、
［１２］［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰを基質のリン酸化源として用いて酵素反応を行い、リン酸化された基質をフィルターに吸着させてその放射活性を測定することを特徴とする、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）阻害剤のハイスループットスクリーニング方法、
に関するものである。
【０００９】
本発明において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を表し、好ましくはフッ素原子、または塩素原子である。
アルキル基としては炭素数１から４のアルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、プロピル、1−メチルエチル、ブチル、1−メチルプロピル、2−メチルプロピル、２，２−ジメチルエチルなどが挙げられる。
ハロアルキル基とは、１から５個のハロゲン原子が結合したアルキル基を表し、好ましくは、１から３個のハロゲン原子が結合したアルキル基を表す。具体的にはトリフルオロメチル、２−トリフルオロエチル、２−クロロエチルなどが挙げられる。
置換アルキル基における置換基としては、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のアルキルカルボニル基、炭素数１から４のアルキルカルボニルオキシ基、炭素数１から４のアルコキシカルボニル基、炭素数１から４のアルコキシカルボニルオキシ基等が挙げられる。
式（Ｉ）〜式（III）における、Ｒ１およびＲ２の好ましい例としては、同一または異なって、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。特に好ましいのは水素原子である。
【００１０】
式（Ｉ）〜式（III）における、Ｒ３の好ましい例としては、水素原子、メチル基、エチル基、アセトキシメチル基、または、ピバロイルオキシメチル基等が挙げられ、特に好ましいものは水素原子である。
本発明におけるＣａＭＫＫ阻害剤は、好ましくは、式（II）で表される化合物、またはその薬学上許容される塩であり、更に好ましくは、式（IV)：
【化６】
【００１１】
本明細書において、式（Ｉ）〜式（IV）で表される７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体の「薬学上許容される塩」としては、例えば、塩基性塩の場合、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、亜鉛塩等の無機金属塩、メチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、トリヒドロキシメチルアミノメタン等の一級、二級、三級の有機アミン塩、ピリジニウム塩等が挙げられ、酸性塩の場合、塩酸、硝酸、燐酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸、並びにメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの脂肪族、芳香族を含むスルホン酸類、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸などの脂肪族、芳香族を含むカルボン酸のような有機酸との塩を含む。
また、本発明には、式（Ｉ）〜式（IV）で表される７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体またはその塩の水和物、エタノール溶媒和物等の溶媒和物等も含まれる。
【００１２】
式（Ｉ）〜式（IV）で表される化合物は、以下の方法で製造することができる。
製造法１：
US2820037に記載された方法などを用いて、以下の工程で製造することができる。すなわち、
［１］式（１−４）、または式（１−５）で表される化合物の製造工程
【化７】
Ｏ−置換アニリン誘導体：式（１−２）と、ブロモナフタレン酸無水物：式（１−１）を、必要に応じて酸触媒の存在下、水中、または酢酸、エタノール、ＤＭＦのような極性溶媒を用いて、通常０℃〜250℃の範囲で縮合し、式（１−３）の化合物を製造することができる。Ｘがアミノ基である場合、式（１−３）の化合物は、必要に応じてジシクロヘキシルカルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下、ＤＭＦなどの不活性溶媒中で縮合反応を行い、式（１−４）の化合物、および式（１−５）の化合物へ導くことができる。Ｘが保護基で保護されたアミノ基を表す場合、保護基を脱保護し、アミノ基へと返還した後縮合反応を行うことができる。
また、Ｘがニトロ基の場合、接触水素化反応、鉄、亜鉛などの金属を用いた還元反応を用いてアニリン誘導体を合成し、続いて上述の縮合反応を行うことができる。
式（１−４）の化合物、および式（１−５）の化合物を含む混合物は、そのまま次の反応へ供することも可能であるが、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや、分別再結晶等を用いて、それぞれの位置異性体を分離精製することも可能である。式（１−４）、および（１−５）の異性体は、各々公知化合物であり、１Ｈ−ＮＭＲデータを取得することで区別することができる。（Bull.Chem.Soc.Jpn.,74,173(2001)）
また、式（１−１）の化合物の位置異性体を原料に用いることにより、上記と同様の方法で、式（１−４）の化合物の他の異性体を合成することもできる。
【００１３】
［２］式（２−２）の化合物の製造工程
【化８】
工程１で得られる式（１−４）の化合物、式（１−５）の化合物、またはそれらの混合物等の、式（２−１）で表される化合物から、実施例に記載された方法などを用いて、式（２−２）の化合物を製造することができる。式（２−２）で表される化合物が位置異性体の混合物である場合は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分別再結晶等を用いて位置異性体を分離することもできる。
【００１４】
［３］式（３−１）の化合物の製造工程
【化９】
式（２−２）の化合物に対して、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基、あるいは濃塩酸などの酸の存在下、加水分解反応を行い、式（３−１）で表される本発明の化合物を製造することができる。上記式（３−１）で表される化合物が位置異性体の混合物である場合は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分別再結晶等を用いて位置異性体を分離することもできる。
式（３−１）で表される化合物は、公知の方法でエステル化反応を行い、カルボキシル基をエステルへと変換することができる。該方法については、新実験化学講座（丸善；第２２巻）等に記載されている。
また、前記製造方法で使用されるアミノ基の保護基としては、当業者が通常使用する保護基が挙げられ、保護・脱保護の方法等については、「Protective groups in organic chemistry(第２版/Greene, T.W., John Wiley & Sons, Inc.)に記載された方法等が挙げられる。
【００１５】
本発明において、ＣａＭＫＫは、そのホモログ、アイソフォームも含んでいる。例えばラットＣａＭＫＫの配列は、Anderson, K.A. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 31880-31889 等に記載されているが、ＣａＭＫＫα、およびＣａＭＫＫβの２種類のアイソフォームが知られている。また、ヒトＣａＭＫＫの配列についても上記文献等に開示されている。
【００１６】
本発明におけるハイスループットスクリーニング方法とは、１度に多数のサンプルの酵素阻害活性を評価することができるスクリーニング方法を表し、具体的には、96穴プレート（具体的には、8.5cm ｘ 12.7cmの大きさのものなどが汎用されている。）等を用いて評価する方法等が挙げられる。
本発明のハイスループットスクリーニング方法は、以下の工程を含むものである。すなわち、
［１］96穴Ｖ底プレート等、多数のサンプルを独立した反応槽にサンプリングできる構造を有するプレートの各穴に、被検化合物、ＣａＭＫＫ、カルモジュリンキナーゼＩなどの基質、カルモジュリン、[γ−３３Ｐ]- ＡＴＰを添加して、適当な温度、例えば37℃で、約1時間、リン酸化反応を進行させた後、 ＥＤＴＡ、トリクロロ酢酸、塩酸などの試薬を用いて反応を停止させる。
ここで、基質と酵素の相互作用を促進するために、酵素反応時にコールドのＡＴＰを添加してもよい。また、３３Ｐの取り込みを完全に停止させるために、反応停止時にコールドのＡＴＰを添加してもよい。
［２］各穴の反応液の一部を等量ずつ、シート状のフィルター、好ましくは、リン酸基が導入されたグラスファイバーフィルター上の対応する位置に滴下する。このフィルターをリン酸溶液で５回、エタノールで１回洗浄して未反応の[γ-３３Ｐ]- ＡＴＰを除いた後、乾燥させる。
［３］乾燥後のフィルターにシンチレータ、好ましくは固形シンチレータシートを重ねて熱融解により浸透させ、再固化後、プレートカウンタで[γ-３３Ｐ]の放射活性を定量する。
ここでＣａＭＫＫは、本発明明細書の実施例に示す方法等を用いて調製することができる。
本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体は、前述のように、ＣａＭＫＫに選択的な唯一の阻害剤であり、ＣａＭＫＫ阻害作用を指標とした医薬品のスクリーニング等に用いることができる。例えば、ＣａＭＫＫの機能はそもそも不明であるが、当該化合物を加えることにより、ＣａＭＫＫの機能を阻害した細胞培養系を構築することができる。従って、そのような細胞培養系における生理学的な挙動を調べることによって、ＣａＭＫＫの機能を推定することができる。また、本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体は、ＣａＭＫＫの機能を指標とする種々のスクリーニング系において、陽性、あるいは陰性の対照化合物として用いることができる。
また、本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体は、ＣａＭＫＫの機能亢進が増悪をもたらす疾患の治療剤として用いることができる。
本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体は、これを医薬として用いるにあたり、経口的または非経口的（例えば、静脈内、皮下、もしくは筋肉内注射、局所的、経直腸的、経皮的、または経鼻的）に投与することができる。経口投与のための形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤または懸濁剤などが挙げられ、非経口投与のための形態としては、例えば、注射用水性剤もしくは油性剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、エアロゾル剤、坐剤、貼付剤などが挙げられる。これらの製剤は、従来公知の技術を用いて調製され、許容される通常の担体、賦形剤、結合剤、安定剤等を含有することができる。また、注射剤で用いる場合には許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体またはその医薬上許容される塩の投与量、投与回数は、症状、年令、体重、投与形態によって異なるが、通常は成人に対して本発明化合物の有効成分量として、１日あたり約１〜２０００ｍｇ、好ましくは１０〜５００ｍｇを１回または数回に分けて投与することができる。
【００１７】
【実施例】
以下に実施例および参考例を説明するが、本発明はもとよりこれに限定されるものではない。実施例では、下記の略号が使用されている。
ＤＭＳＯ ＝ ジメチルスルホキシド
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
実施例１
化合物の合成（混合物）
工程１
３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物
３−ブロモ−１，８−ナフタリンジカルボン酸無水物（２．７９ｇ）とＯ−フェニレンジアミン（１．１０ｇ）、酢酸（１５ｍｌ）をＯ−クロロベンゼン（２５ｍｌ）に懸濁させ、１００℃で７時間加熱還流した。反応液を放冷後、結晶を濾取、減圧乾燥した後、標記化合物（２．４９ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：８．８１（ｍ），８．６７−８．４９（ｍ），８．４４（ｍ），８．２５（ｍ），８．０４（ｍ），７．８６（ｍ），７．４９（ｍ）
【００１８】
工程２
３−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物
３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物（１．０ｇ）とシアン化銅（Ｉ）（０．３１ｇ）をピリジン（７．１ｍｌ）に加え、封管中、１５０℃で１０時間加熱した。反応液を放冷後、アンモニア水で希釈し沈殿した結晶を濾取した。濾上物は水で洗液が中性になるまで洗浄し、室温で減圧乾燥し、標記化合物（１．１３ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：８．７８（ｍ），８．６１−８．３７（ｍ），８．１３（ｍ），７．８９（ｍ），７．５２（ｍ）
【００１９】
工程３
３−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物
３−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物（１００ｍｇ）を濃硫酸（１０ｍｌ）、水（１０ｍｌ）、酢酸（５ｍｌ）に懸濁させ、１２０℃で５時間加熱した。反応液を放冷後、６０ｍｌの水に注入し、室温で１時間撹伴した。反応懸濁液をろ過し、濾上物を室温で減圧乾燥して残渣を得た。これを２％水酸化ナトリウム水溶液に懸濁し、１００℃で１時間撹伴した。反応懸濁液をろ過し、濾液を５％塩酸水でｐＨを３に調整した後、酢酸エチルで抽出し有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して減圧濃縮後、標記化合物（８０ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：９．３１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），９．０３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．７２（ｍ），８．３９（ｍ），８．０４−７．８５（ｍ），７．４８（ｍ）。
【００２０】
実施例２
３−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノ リン−７−オンと４−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの分離精製
３−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物（７０μｇ）をＤＭＳＯ（１滴）アセトニトリル（７滴）に溶解し、逆相ＨＰＬＣ条件［カラム，Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（４．６ｍｍ×１５ｃｍ）、移動相，アセトニトリル：水：ＴＦＡ（４５：５５：０．０５）］で分取し、保持時間１０．９分の分画と保持時間１１．７分の分画を得、それぞれを減圧濃縮し、異性体Ａ（７．５μｇ）、異性体Ｂ（８．１μｇ）を得た。
【００２１】
実施例３
ＣａＭＫＫの調製
ラットCaMKKα（配列は以下の文献に記載。Tokumitsu, h. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 19320-19324) は大腸菌(BL21)を用いて以下の条件で発現および精製した。100μg/ml Ampicillin を含むLB-培地において培養し600 nmの吸光度が1.2 となった時点において0.1mM IPTG（終濃度）を加えさらに12-16時間培養した。その後大腸菌を回収し、超音波破砕した後、その上清をMono Qカラムに供しNaCl濃度勾配により溶出した。本方法により粗精製し、純度約９０％の目的とする酵素を得た。
完全精製標品はCaM-セファロースカラムを用いて2mM EGTAを含む溶出液にて溶出することにより純度約９５％以上の目的とする酵素を得た。
酵素標品は50mM HEPES pH7.5, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA, 1mM DTT, 0.1mM PMSF, 40% グリセロール, 10% エチレングリコールに溶解して-30度に保存した。
ラットＣａＭＫＫβは、文献（Tokumitsu, H. et al.（2001）, Bio-chemistry 40, 13925-13932）記載の方法で調製した。
【００２２】
実施例４
ＣａＭ−ＫＩの調製
GST-CaMK-Ｉ(K49E) およびGST-CaM-KI(1-293, K49E)は大腸菌(JM109)を用いて以下の条件で発現および精製した。100μg/ml Ampicillin を含むLB-培地において培養し600 nmの吸光度が1.2 となった時点において1mM IPTG（終濃度）を加えさらに12-16時間培養した。その後大腸菌を回収し、0.1 mM PMSFを含むPBSに溶かし、超音波破砕した後、その上清をグルタチオンセファロースに供した。グルタチオンセファロースを0.1 mM PMSFを含むPBSにより洗浄し、10 mM グルタチオンを含む50 mM Tris pH 8.0 溶液にてGST-融合タンパク質を溶出した。本方法により純度約９０％の目的とする酵素を得た。
精製標品は50mM HEPES pH7.5, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA, 1mM DTT, 0.1mM PMSF, 40% グリセロール, 10% エチレングリコールに溶解して-30度に保存した。
【００２３】
実施例５
ＣａＭＫＫ阻害作用の測定（ハイスループットスクリーニング）
CaMKK（ここではCaMKKαを用いた。）の活性測定は、[γ-33P]-ATPとCaM-KIを基質とし、CaMKKによるリン酸化反応でCaM-KIに導入された[γ-33P]の放射活性を測定することで定量した。以下のアッセイにおいて、各試薬は、緩衝液（10mM Mg(Ac)2、0.1mM CaCl2、1mM DTTを含む50mM HEPES(pH7.5)）に溶解し、使用した。被検化合物は、粉末をDMSOに溶解した後、緩衝液で必要濃度に希釈して使用した。
96穴Ｖ底プレートの各穴に、種々の濃度の被検化合物溶液10μl、CaMKK、CaMK-Ｉ、カルモジュリンを含む溶液10μl、[γ-33P]-ATP、cold ATPを含む溶液10μlを順に添加して、反応を開始させた（反応液総量30μｌ中の各試薬濃度は、CaMKK：CaMKKストック液20μｌ/ml、CaM-KI：67μg/ml、カルモジュリン：1μＭ、[γ-33P]-ATP ：6.7μCi/ml(2.2〜6.7nM)、Cold ATP：0.3μＭ)。37℃で1時間、リン酸化反応を進行させた後、 100mM EDTA、10mM ATPを含む50mM HEPES(pH7.5)を5μｌずつ加えて反応を停止させた。
反応停止後、反応液を15μｌずつ、シート状のグラスファイバーフィルター（Wallac、filtermat P30）の各穴に対応する位置に滴下、浸透させた。このフィルターを150mMリン酸溶液で５回、エタノールで１回洗浄して未反応の[γ-33P]-ATPを除いた後、乾燥させた。
乾燥後のフィルターに固形シンチレータシートを重ねて熱融解により浸透させ、再固化後、フィルターに補足されたCaM-KIに導入されている[γ-33P]の放射活性をプレート用カウンタで測定、定量した。
被験化合物の阻害率は、以下の式により算出した。
阻害率(%)＝100×(A−B)/(A−C)
A：CaMKK添加、被検化合物非添加の場合の放射活性カウント
B：CaMKK添加、被検化合物添加の場合の放射活性カウント
C：CaMKK非添加、被検化合物非添加の場合の放射活性カウント（バックグランド）
1化合物につき４〜５種類の濃度で求めた阻害率を解析して、IC50値を算出した。尚、各濃度においては、Ｎ＝３で測定し、平均値を求めた。実施例１、および実施例２（異性体B）についてIC50値を測定した結果を表１に示す。
【表１】
実施例６
３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの合成
Bull.Chem.Soc.Jpn. 74, 173 (2001)に記載された方法を参考に合成した。４−ブロモ−１，８−ナフチル酸無水物（７６．３ｇ）の酢酸（３００ｍｌ）中に室温下でＯ−フェニレンジアミン（３０．１５ｇ）およびクロロベンゼン（６００ｍｌ）を加えた後、５時間還流撹拌をした。反応液を１０−１５℃に冷却し、結晶を濾取し、３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンおよび４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オンの混合物（一番晶：８０．２ｇ，二番晶：１１．１ｇ）を得た。一番晶およびほぼ同一組成の結晶（１０３．９９ｇ）を数バッチに分けてクロロホルムで再結晶を繰り返し、４−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン（１４．９９ｇ）を得た。二番晶およびほぼ同一組成の結晶（３３．７５ｇ）をあわせて数バッチに分けてクロロホルムを用いてカラムクロマト精製を繰り返し、３−ブロモ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン（１．１６ｇ）を得た。それぞれの異性体の構造は、１H-NMRデータを取得し、上記文献記載のデータと比較することで確認した。
【００２５】
実施例７
化合物の合成（異性体）
工程１
３−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン
【化１０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：８．８４−８．８０（２Ｈ,ｍ），８．６２（１Ｈ，ｄｄ,Ｊ＝８．０，１．０Ｈｚ），８．５１（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．４６−８．４３（１Ｈ，ｍ），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５，１．０Ｈｚ），７．９４（１Ｈ，ｍ），７．５４（２Ｈ，ｍ）
工程２
３−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン
【化１１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：９．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．８４−８．７６（２Ｈ，ｍ），８．４５（２Ｈ，ｍ），８．０６（１Ｈ，ｍ），７．９２（１Ｈ，ｍ），７．５４（２Ｈ，ｍ），１．９１（３Ｈ，ｓ）
【００２６】
実施例８
化合物の合成（異性体）
工程１
４−シアノ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン
【化１２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：８．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．４８（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．４３（１Ｈ，ｍ），８．１６（１Ｈ，ｍ），７．９０（１Ｈ，ｍ），７．５４（２Ｈ，ｍ）
工程２
４−カルボキシ−７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン
【化１３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ，３００ＭＨｚ）δ：９．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），８．４６−８．３９（２Ｈ，ｍ），８．０１（１Ｈ，ｍ），７．９０（１Ｈ，ｍ），７．５１（２Ｈ，ｍ）
【００２７】
実施例９
実施例５と同様の方法で、実施例７の化合物および実施例８の化合物のＣａＭＫＫ阻害活性を測定した。結果を表２に示した。
【表２】
実施例１０
ＣａＭＫＫ特異性の測定
以下の方法で、各種CaMKK（ここではCaMKKαを用いた。）に対する阻害作用を測定した。
CaMKK(0.28 μg/ml)の活性測定は、100 μM[γ-32P]-ATPと100 μg GST-CaM-KI (1-293, K49E)を基質とし、CaMKKによるリン酸化反応でGST-CaM-KIに導入された[γ-32P]の放射活性を測定することで定量した。反応溶液は10mM Mg(Ac)2、1mM CaCl2、1mMジチオトレイトール, 3 μM カルモデュリンを含む50mM HEPES(pH7.5)）使用し、反応時間は5 分間である。被験化合物（実施例１の化合物）は、粉末をDMSOに溶解した後、DMSOで必要濃度に希釈して終濃度４％DMSO存在下の条件でCaMKKの活性を測定した。反応は２５μl反応溶液のうち15μlをP-81 Phosphocellurose フィルターにスポットすることにより終了させ、75 mM リン酸溶液にて十分に洗浄し、遊離の[γ-32P]-ATPを除去後乾燥させ放射活性をシンチレーションカウンターにより測定し、CaM-KK活性とした。
【００２９】
CaM-KI, CaM-KII, CaM-KIV 活性測定法
CaM-KI(2.5 μg/ml), CaM-KII(0.75 μg/ml), CaM-KIV(0.57 μM) 活性測定は100 μM[γ-32P]-ATPと40 μM syntide-2を基質とし、それぞれのＣａＭ依存性キナーゼによるリン酸化反応でsyntide-2に導入された[γ-32P]の放射活性を測定することで定量した。反応溶液は10mM Mg(Ac)2、1mM CaCl2、1mM DTT, 3 μM カルモデュリンを含む50mM HEPES(pH7.5)）使用し反応時間は5 分間である。被験化合物（実施例１の化合物）は、粉末をDMSOに溶解した後、DMSOで必要濃度に希釈して終濃度４％DMSO存在下の条件（CaM-KK 活性測定と同条件）でCaM-KI, CaM-KII, CaM-KIVの活性を測定した。反応は２５μl反応溶液のうち1５μlをP-81 Phosphocellurose フィルターにスポットすることにより終了させ、75 mM リン酸溶液にて十分に洗浄し、遊離の[γ-32P]-ATPを除去後乾燥させ放射活性をシンチレーションカウンターにより測定し、CaM-KI, CaM-KII, CaM-KIV 活性とした。
結果を表３に示した。
【表３】
実施例１１
CaMKK （ CaMKK α、β）の阻害活性
精製したリコンビナントCaM-KKα(0.3μg/ml)およびCaM-KKβ（0.5μg/ml）と、10または100μgのGST-CaM-K I （1-293, K49E）を、30℃で5分間、50mM HEPES (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、50または100μM [γ-32P]ATPを含む溶液(25μl)中で、1mM CaCl2/2または3μM カルモジュリン（CaM）の存在下、種々の濃度の、実施例7の化合物（最終濃度：0-10μg/ml 4%DMSO溶液）と共にインキュベートした。酵素反応は、[γ-32P]ATP を加えることによって開始し、ホスホセルロース紙（Whatman P-81）上に 15μlをスポットすることによって終了させ、これを75mM リン酸で数回洗浄した。GST-CaM-K I (1-293, K49E)への取り込みは、フィルターの液体シンチレーションカウントを測定することによって定量した。結果を表４に示した。
【００３１】
CaMK I 、 II 、 IV 、および MLCK に対する阻害効果
CaMK Iは、実施例１０と同様に調製した。CaMIIは文献（Tokumitsu et al. （1990）J. Biol. Chem. 265, 4315-4320）に記載の方法で調製した。CaMIVは文献（ Brickey, D.A., et al.（1990）Biochem. Biophys. Res. Commun. 173, 578-584）に記載の方法で調製した。CaM-K I(2.5μg/ml)、CaM-K II(0.75μg/ml)、CaM-K IV（９μg／ml）、またはMLCK（広島大学、Dr. Hiroshi Hosoyaより分与 ,0.6μg/ml）と、40μM Syntide-2（MLCKについては、50μM MLCペプチド）を、30℃で5分間、50mM HEPES (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、50または100μM [γ-32P]ATPを含む溶液(25μl)中で、1mM CaCl2/2または3μM カルモジュリン（CaM）の存在下、種々の濃度の実施例７の化合物（最終濃度：0-10μg/ml 4%DMSO溶液）と共にインキュベートした。プロテインキナーゼ活性は、実施例１０に記載されたホスホセルロースフィルター法で測定した。
【００３２】
PKA 、 PKC 、および p42MAP キナーゼに対する阻害効果
PKA(Promega、8μg/ml)、PKC(Promega、25ng/ml)、またはp42MAPキナーゼ（upstate biotechnology、2μg/ml）を、それぞれ100μM Kemptamide（PKA基質）、100μM Neurograninペプチド（PKC基質；プロメガ製）、または0.4mg/ml Myelin basic protein（p42 MAPキナーゼ基質）と、30℃で5分間、50mM HEPES (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、50μM [γ-32P]ATP (4500cpm/pmol)を含む溶液(25μl)中で、1mM CaCl2/0.4μg/ml ホスファチジルセリンおよび0.1mg/ml BSAの存在下（PKC）、あるいは非存在下（PKAおよびp42MAPキナーゼ）に、種々の濃度の実施例７の化合物（最終濃度：0-10μg/ml 4%DMSO溶液）と共にインキュベートした。プロテインキナーゼ活性は、実施例１０に記載されたホスホセルロースフィルター法で測定した。
結果を表４に示した。
【表４】
実施例１２
ヒト神経芽細胞腫における内因性 CaMKK に対する阻害効果
Ca2+/CaM-非依存型CaMK-IV（305HMDT-DEDD）、機能不全変異型CaMK-IV（305HMDT-DEDD、K71E）、恒常的活性型CaM-KK（1-434）のcDNAを含むリコンビナントアデノウイルスは以下のように調製した。すなわち、pME18sプラスミド中のcDNAを制限酵素で切り出し、末端を平滑化してｐShuttle（Clontech）中に組み込んだ。Adeno-X発現システム（Clontech）を用いて添付のプロトコールに従い、HEK293細胞よりリコンビナントウイルスが得られた。６穴培養プレートに播種してコンフルエントになったSY5Y細胞に、上記のように得られたリコンビナントウイルスを種々の組み合わせで、37℃１時間、10プラーク形成単位／Cellの感染多重度（M.O.I.）で感染させた。感染後、ウイルスは吸引除去し、細胞は更に10%FBSを含むRPMI培地で12時間培養した。その後細胞を6時間、種々の濃度の実施例７の化合物（最終濃度：0-10μg/ml 0.5%DMSO溶液）の存在あるいは非存在下に無血清状態で培養した。細胞を1μM イオノマイシン存在下あるいは非存在下で10分間刺激した後、溶解し、抽出物をSDS-7.5% PAGEに供した。これに抗CaM-K IV抗体（1:2000、Transduction Lab.）または抗phosphoThr286CaM-KII抗体（熊本大 Dr.Koji Fukunagaより供与）を用いてウエスタン・ブロッティングを行った。フィルム上のCaM-K IVの免疫反応性バンドをデンシトメーターでスキャンして数値化し、化合物１がCaM-K IVの活性型形成に及ぼす効果を定量した。結果を図１に示した。
この結果から、実施例７の化合物は細胞膜透過性を有し、ヒト神経芽細胞腫の細胞内で内因性CaM-KKに対しても阻害作用を示すことがわかる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の７Ｈ−ベンズイミダゾ−［２，１ａ］ベンズ［ｄｅ］イソキノリン−７−オン誘導体またはその塩は、その高い選択性のために、ＣａＭＫＫの生理作用を解明するために有用である。更に、本発明の化合物は、高い選択性を示すため、生体内で重要な役割を果たしている他の種類のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼ類を阻害することがない。従ってＣａＭＫＫ由来の病態のみを改善する薬剤の有効成分となり得る。上記のように本発明により、選択的なカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼの阻害剤を提供することが可能になった。
【００３５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Aは、遺伝子組み込みでヒト神経芽細胞腫内に発現させたCa2+/CaM-非依存型CaM-KIVが、細胞内でCaM-KKにより確かに活性型になる（リン酸化される）ことを示す。
Bは、ヒト神経芽細胞腫において遺伝子組み込みにより発現されたCa2+/CaM-非依存型CaM-KIVが内因性CaM-KKにより活性化（リン酸化）され、実施例７の化合物がそれを濃度依存的に阻害していることを示す。
Cは、CaM-KIIのリン酸化に対しては、実施例７の化合物の阻害作用が弱く、その阻害作用がCaMKK特異的であることを示す。
Claims (6)
- 式（Ｉ）：
- Ｒ1およびＲ2が水素原子である、請求項１記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤。
- Ｒ3が水素原子である、請求項１または２記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤。
- 式（II）：
- Ｒ1およびＲ2が水素原子である、請求項４記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤。
- Ｒ3が水素原子である、請求項４または５記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤。
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