JP4151092B2 - Method for producing oligohyaluronic acid or a salt thereof - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、化粧品、食品等に広範囲に利用されるオリゴヒアルロン酸もしくはその塩（以下、これらを略称してオリゴヒアルロン酸（塩）という）をヒアルロン酸分解能を有する酵素を用いることでより簡便に、かつ迅速に製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、ヒアルロン酸もしくはその塩（以下、これらを略称してヒアルロン酸（塩）という）の製造は工業的には、主ににわとりのとさかから抽出する方法（抽出法）もしくはヒアルロン酸生産能を有する微生物を培地に培養して該培養液より採取する方法（発酵法）により行われている。得られるヒアルロン酸（塩）の分子量は数百万から１万以下に至るまで種々のヒアルロン酸（塩）が製造されている。
近年、低分子量ヒアルロン酸（塩）については従来の分子量の物に比べ高濃度で使用でき、ベトツキ感がないなどの特性を有することが明らかとなり、また、糖の重合度で１０〜１４糖の低分子量ヒアルロン酸（塩）に血管形成促進作用があることが報告されている。このため低分子量ヒアルロン酸（塩）特にここでいう平均分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸（塩）の需要の増大が期待されている。
【０００３】
該低分子量ヒアルロン酸（塩）の製造法としては、ヒアルロン酸分解酵素を用いる方法（特開昭６２−７９７９０公報）、酸、アルカリを用いる方法（特開昭６３−５７６０２公報、特開平１−２６６１０２公報）や次亜塩素酸などの酸化剤を用いる方法（特開平２−２４５１９３公報）が提案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ヒアルロン酸分解酵素を用いる場合、その酵素が高価格のため製造コストが高くなり、また、生成物より該分解酵素を除去する操作が煩雑であり、さらに反応制御が大変難しい。酸、アルカリを使用する方法では、工業的には安価に処理できるものの平均分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸（塩）を製造する場合、過激な条件で尚かつ長時間の処理が必要であり、変色も発生する。また、次亜塩素酸などの酸化剤を用いる方法ではヒアルロン酸（塩）を酸化的に分解するためにヒアルロン酸（塩）の還元末端及び非還元末端に加水分解反応では発生しない新たな化学構造の末端が生成し、医薬、化粧品、食品に使用する場合、問題となる。
【０００５】
本発明者らはかかる従来法の問題点を解決すべく鋭意研究した。その結果、ヒアルロン酸（塩）の水溶液に、ヒアルロン酸（塩）分解能を有する分解酵素を添加し、５〜５０℃で該ヒアルロン酸（塩）を分解したのち、分画分子量１万以下の限外ろ過膜に供することにより、該分解酵素と該分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸（塩）水溶液とを分離したのち、該オリゴヒアルロン酸水溶液を、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール及びアセトンのなかから選ばれる少なくとも一種以上の貧溶媒を用いて晶析することにより高純度のオリゴヒアルロン酸（塩）が得られることを見い出し、この知見に基づき、本発明を完成した。 以上の記述から、明かなように、本発明の目的は、簡単かつ安価に分子量１万以下の高純度オリゴヒアルロン酸（塩）を製造する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
（１）ヒアルロン酸もしくはその塩（以下、これらを略してヒアルロン酸（塩）という）の水溶液に、該ヒアルロン酸（塩）分解能を有する酵素を添加して温度５℃〜５０℃で該ヒアルロン酸（塩）を分解した後、分画分子量１万以下の限外ろ過膜を用いて分解酵素と分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩を分離し、該オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液に、０．３モル／リットル以上になるように塩化ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムを添加し、その後オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液の５〜１０倍容量の、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール及びアセトンのなかから選ばれる少なくとも一種以上に、該オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液を添加して晶析し、分画分子量１万以下の限外ろ過膜で分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩より分離したヒアルロン酸（塩）の分解能を有する酵素を繰り返し使用することを特徴とする高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
（２）ヒアルロン酸（塩）が微生物が産出したヒアルロン酸（塩）もしくは動物の生体より抽出したヒアルロン酸（塩）である前記第１項記載の高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
（３）ヒアルロン酸（塩）を産出する微生物がストレプトコッカス属のストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Strescoccus equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ (Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ(Streptococcus dysgalactiae）もしくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcus zooepidemicus)である前記第２項記載の高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
（４）ヒアルロン酸分解能を有する酵素が、ヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）、ヒアルロノグルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３６）およびヒアルロネートリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１）から選ばれる１種以上である前記第１項記載の高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【０００７】
本発明でオリゴヒアルロン酸（塩）とはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析による平均分子量が１万以下のヒアルロン酸（塩）をいう。
該ＨＰＬＣによる平均分子量の測定はカラム（Shodx Ionpak KS806およびIonpak KS-G）を用いた。溶出液として０．２モル／リットルの塩化ナトリウム水溶液を用い、流速１．０ミリリットル／分で流した。検出は２０６ｎｍで行った。平均分子量は分子量既知のヒアルロン酸ナトリウムで作製した検量線より計算した。
【０００８】
本発明に使用するヒアルロン酸（塩）は、ヒアルロン酸生産菌により発酵生産され、精製されたヒアルロン酸（塩）もしくはニワトリの鶏冠などの動物組織より抽出、精製されたヒアルロン酸（塩）の水溶液を用いる。もちろん一度粉末としたヒアルロン酸（塩）を用いても差し支えない。水溶液としたヒアルロン酸（塩）にヒアルロン酸分解能を有する酵素、たとえばヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）、ヒアルロノグルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３６）およびヒアルロネートリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１）の少なくとも１種以上を、ヒアルロン酸ナトリウム量に対して１／５００〜１倍量添加後、温度５〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃で３０分以上、好ましくは６時間以上分解した後、分画分子量１万以下の限外ろ過膜を用いて平均分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸（塩）とヒアルロン酸分解能を有する酵素を分離する。分離されたオリゴヒアルロン酸（塩）へ塩濃度が０．１モル／リットル以上に好ましくは０．２〜０．４モル／リットルになるように塩化ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムを添加後、１０℃以下まで冷却し、その５〜１０倍容量、好ましくは７倍容量の１０℃以下に冷却したエタノール、メタノール、イソプロピルアルコールもしくはアセトンの少なくとも一種以上の貧溶媒に添加して晶析することにより、高純度のオリゴヒアルロン酸が得られる。 一方、分離されたヒアルロン酸分解能を有する酵素は溶液の状態で低温で冷蔵保存し、繰り返し使用することができる。
【０００９】
本発明に使用するヒアルロン酸生産菌としてはストレプトコッカス属、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Strescoccus equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ(Strepto- coccus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcuszooepidemicus)等を挙げることができる。
【００１０】
以下の説明で％は重量（ｇ）／容量（ｄｌ）％をいう。
本発明に用いる培地はヒアルロン酸生産菌を培養するのに通常、用いられる培地を用いればよく、例えばグルコース３．０％、酵母エキス１．０％、リン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分でｐＨ６．０〜８．５に調整されたものを用いることができる。
【００１１】
本発明の培養では通気撹拌培養でも振トウ培養のいずれを用いてもよく培養温度は２０℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３８℃にて培養する。培養は２０〜７０時間を要し、培養液の粘度上昇がみられなくなった時点で停止する。
【００１２】
本発明の精製では培養液から遠心分離もしくは加圧ろ過にて菌体をろ過し、限外ろ過膜にてろ過液より不純物を透析除去したものも用いることができる。
【００１３】
【実施例】
以下にその実施例を示す。
なお、ヒアルロン酸（塩）の純度測定は化粧品種別配合規格（ヒアルロン酸ナトリウム（２））記載のグルクロン酸定量法に従った。また、ここでいう高純度とはグルクロン酸含有量で４０．０〜５０．０重量％のものをいう。
なお、実施例および比較例で用いた％とは、断らない限り重量（ｇ）／容量（ｄｌ）％を意味する。
【００１４】
実施例１
炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高いヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。
この粉末１００ｇを０．０５モル／リットル酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０リットルに溶解し、３７℃でヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）１０ｇを添加、溶解し、攪拌を続ける。６時間後、分画分子量６０００の限外ろ過膜（旭化成製、SIP1013）に通し、ヒアルロン酸分解酵素よりオリゴヒアルロン酸を分離する。分離されたオリゴヒアルロン酸水溶液に、塩化ナトリウムを０．３モル／リットルになるように添加、溶解後、１０℃まで冷却し、その溶液をその７倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添加して晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行い、９２ｇのオリゴヒアルロン酸ナトリウムを得た。
この操作で得られたオリゴヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰＬＣ法で５３００であった。また、純度はグルクロン酸含有量で４５％以上であった。使用した酵素を２ヶ月冷蔵保存した後同様な操作で処理し得られたオリゴヒアルロン酸（塩）の平均分子量は６３００であった。純度はグルクロン酸含有量で４５重量％以上であった。
【００１５】
比較例１
炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高いヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。
この粉末１００ｇを０．０５モル／リットル酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０リットルに溶解し３７℃でヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）１０ｇ添加溶解し、攪拌を続ける。６時間後１００℃で６分間煮沸する。室温まで冷却後、発生したヒアルロノグルコサミニダーゼの変成物をろ過除去し、ろ過液に塩化ナトリウムを０．３モル／リットルになるように添加溶解後、活性炭白鷺A50W(武田薬品工業製）１５０ｇを添加し１時間撹拌する。活性炭をろ過除去し、１０℃まで冷却する。その水溶液をその７倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添加することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行い、８７ｇのオリゴヒアルロン酸ナトリウムを得た。
この操作で得られたオリゴヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰＬＣ法で７８００であった。また、純度はグルクロン酸含有量で４５重量％以上であった。反応に使用したあとのヒアルロン酸（塩）分解能を有する酵素はその分解能を喪失してしまい、繰り返し使用することはできなかった。
【００１６】
比較例２
炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高いヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。
この粉末１００ｇを０．１規定塩酸水溶液２０リットルに溶解し４５℃で２４時間撹拌する。その後、６規定の苛性ソーダ水にて中和した。塩化ナトリウム濃度が０．３モル／リットルになるように添加溶解後、１０℃まで冷却し、その水溶液をその３倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添加することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行い、６５ｇヒアルロン酸ナトリウムを得た。この操作で得られたヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰＬＣ法で６３０００であった。また、純度はグルクロン酸含有量で４５重量％以上であった。
【００１７】
比較例３
炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高いヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。
この粉末１００ｇを０．１規定苛性ソーダ水溶液２０リットルに溶解し４５℃で２４時間撹拌する。その後、６規定の塩酸にて中和した。塩化ナトリウム濃度が０．３モル／リットルになるように添加溶解後、１０℃まで冷却し、その水溶液をその３倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添加することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行い、６０ｇのヒアルロン酸ナトリウムを得た。この操作で得られたヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰＬＣ法で５５０００であった。また、純度はグルクロン酸含有量で４５重量％以上であった。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、ヒアルロン酸（塩）水溶液をヒアルロン酸分解能を有する酵素で分解し、限外ろ過膜でその酵素とオリゴヒアルロン酸（塩）を分離することにより、従来に比べ遥かに単純な工程でかつ安価に純度の高いオリゴヒアルロン酸（塩）を容易に製造することができる。BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention uses oligohyaluronic acid or a salt thereof (hereinafter abbreviated as oligohyaluronic acid (salt)) widely used in pharmaceuticals, cosmetics, foods, etc. by using an enzyme having hyaluronic acid decomposing ability. The present invention relates to a method for simple and rapid production.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, hyaluronic acid or a salt thereof (hereinafter abbreviated as hyaluronic acid (salt)) is industrially produced mainly by a method (extraction method) or extraction from hyaluronic acid. It is carried out by a method (fermentation method) of culturing microorganisms in a medium and collecting the microorganism from the culture solution. Various hyaluronic acids (salts) have been produced with the molecular weight of the resulting hyaluronic acid (salts) ranging from several million to 10,000 or less.
In recent years, it has been clarified that low molecular weight hyaluronic acid (salt) can be used at a higher concentration than conventional molecular weight products, has no stickiness, and has a sugar polymerization degree of 10-14 sugars. It has been reported that low molecular weight hyaluronic acid (salt) has an angiogenesis promoting action. For this reason, an increase in demand for low molecular weight hyaluronic acid (salt), particularly oligohyaluronic acid (salt) having an average molecular weight of 10,000 or less is expected.
[0003]
As a method for producing the low molecular weight hyaluronic acid (salt), a method using a hyaluronic acid-degrading enzyme (Japanese Patent Laid-Open No. 62-79790), a method using an acid and an alkali (Japanese Patent Laid-Open No. 63-57602, Japanese Patent Laid-Open No. Hei 1) No. 266102) and a method using an oxidizing agent such as hypochlorous acid (JP-A-2-245193) has been proposed.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, when hyaluronic acid-degrading enzyme is used, the production cost is high because the enzyme is expensive, the operation for removing the degrading enzyme from the product is complicated, and the reaction control is very difficult. In the method using acid and alkali, although it can be industrially processed at low cost, when producing an oligohyaluronic acid (salt) having an average molecular weight of 10,000 or less, a long-time treatment is required under extreme conditions. Discoloration also occurs. In addition, a method using an oxidizing agent such as hypochlorous acid has a new chemical structure that does not occur in the reducing and non-reducing ends of hyaluronic acid (salt) due to oxidative degradation of hyaluronic acid (salt). This is a problem when it is used in medicine, cosmetics and food.
[0005]
The present inventors diligently studied to solve the problems of the conventional method. As a result, after adding a degrading enzyme having hyaluronic acid (salt) resolution to an aqueous solution of hyaluronic acid (salt) and decomposing the hyaluronic acid (salt) at 5 to 50 ° C., the molecular weight limit is 10,000 or less. After the degradation enzyme and the oligohyaluronic acid (salt) aqueous solution having a molecular weight of 10,000 or less are separated by using an outer filtration membrane, the oligohyaluronic acid aqueous solution is selected from ethanol, methanol, isopropyl alcohol, and acetone. It was found that high-purity oligohyaluronic acid (salt) was obtained by crystallization using at least one kind of poor solvent, and the present invention was completed based on this finding. As is apparent from the above description, an object of the present invention is to provide a method for producing a high-purity oligohyaluronic acid (salt) having a molecular weight of 10,000 or less easily and inexpensively.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
(1) An enzyme having the ability to degrade hyaluronic acid (salt) is added to an aqueous solution of hyaluronic acid or a salt thereof (hereinafter abbreviated as hyaluronic acid (salt)), and the hyaluronic acid is heated at a temperature of 5 ° C to 50 ° C. After decomposing (salt), decomposing enzyme and oligohyaluronic acid having a molecular weight of 10,000 or less or a salt thereof are separated using an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 10,000 or less. Add sodium chloride or sodium acetate to 0.3 mol / liter or more, and then choose from ethanol, methanol, isopropyl alcohol and acetone in an amount of 5 to 10 times the volume of an aqueous solution of oligohyaluronic acid or a salt thereof. on at least one or more kinds, by adding an aqueous solution of said oligonucleotide hyaluronic acid or a salt thereof and crystallization, fractional molecular weight 1 Man以 High purity oligo hyaluronic acid or the preparation of its salts, characterized in that repeated use enzymes having a resolution of ultrafiltration membrane with a molecular weight of 10,000 or less oligo hyaluronic acid or hyaluronic acid isolated from its salt (salt) of .
(2) The method for producing high-purity oligohyaluronic acid or a salt thereof according to the above item (1), wherein the hyaluronic acid (salt) is hyaluronic acid (salt) produced by a microorganism or hyaluronic acid (salt) extracted from an animal body.
(3) Streptococcus pyogenes (Streptococcus pyogenes), Streptococcus equisimilis, Streptococcus equi (Streptococcus equi), Streptococcus e The method for producing high-purity oligohyaluronic acid or a salt thereof according to the above item 2, which is Streptococcus zooepidemicus.
(4) Enzymes with hyaluronic acid resolution are hyaluronoglucosaminidase (EC 3.2.1.35), hyaluronoglucuronidase (EC 3.2.1.36) and hyaluronate lyase (EC 4.2.2. The method for producing a high-purity oligohyaluronic acid or a salt thereof according to the above item 1, which is one or more selected from 1).
[0007]
In the present invention, oligohyaluronic acid (salt) refers to hyaluronic acid (salt) having an average molecular weight of 10,000 or less by HPLC (high performance liquid chromatography) analysis.
The average molecular weight was measured by HPLC using columns (Shodx Ionpak KS806 and Ionpak KS-G). A 0.2 mol / liter sodium chloride aqueous solution was used as an eluent and flowed at a flow rate of 1.0 ml / min. Detection was performed at 206 nm. The average molecular weight was calculated from a calibration curve prepared with sodium hyaluronate with a known molecular weight.
[0008]
The hyaluronic acid (salt) used in the present invention is an aqueous solution of hyaluronic acid (salt) fermented and produced by hyaluronic acid-producing bacteria, extracted from purified animal tissues such as chicken caps, and purified. Is used. Of course, hyaluronic acid (salt) once powdered may be used. Hyaluronic acid (salt) in the form of an aqueous solution having hyaluronic acid-degrading enzymes such as hyaluronoglucosaminidase (EC 3.2.1.35), hyaluronoglucuronidase (EC 3.2.1.36) and hyaluronate lyase (EC After adding at least one kind of 4.2.2.1) to 1/500 to 1 times the amount of sodium hyaluronate, the temperature is 5 to 50 ° C., preferably 25 to 40 ° C. for 30 minutes or more, preferably After decomposing for 6 hours or more, oligohyaluronic acid (salt) having an average molecular weight of 10,000 or less is separated from an enzyme having a hyaluronic acid resolution using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 10,000 or less. Sodium chloride or sodium acetate is added to the separated oligohyaluronic acid (salt) so that the salt concentration is 0.1 mol / liter or more, preferably 0.2 to 0.4 mol / liter, and then to 10 ° C. or less. It is cooled and added to at least one poor solvent of ethanol, methanol, isopropyl alcohol or acetone cooled to 5 to 10 times volume, preferably 7 times volume or less of 10 ° C. Oligohyaluronic acid is obtained . On the other hand, the separated enzyme having the ability to decompose hyaluronic acid can be refrigerated at a low temperature in a solution state and repeatedly used.
[0009]
Examples of the hyaluronic acid-producing bacteria used in the present invention include Streptococcus genus, for example, Streptococcus pyogenes, Streptococcus equisimilis, Streptococcus equi dia (Streptococcus equi And Streptococcus zooepidemicus and the like.
[0010]
In the following description,% means weight (g) / volume (dl)%.
As the medium used in the present invention, a medium usually used for culturing hyaluronic acid-producing bacteria may be used. For example, glucose 3.0%, yeast extract 1.0%, potassium phosphate 1% 0.3%, phosphate A component containing 0.2% dipotassium, 0.01% sodium thiosulfate, 0.01% magnesium sulfate heptahydrate, 0.002% sodium sulfite, 0.001% cobalt chloride, 0.001% manganese chloride, pH 6 Those adjusted to 0.0 to 8.5 can be used.
[0011]
In the culture of the present invention, either aeration stirring culture or shaking tow culture may be used, and the culture temperature is 20 ° C to 40 ° C, preferably 30 ° C to 38 ° C. The culture takes 20 to 70 hours, and is stopped when no increase in the viscosity of the culture solution is observed.
[0012]
In the purification of the present invention, it is also possible to use a product obtained by filtering bacterial cells from a culture solution by centrifugal separation or pressure filtration, and removing impurities from the filtrate by dialysis using an ultrafiltration membrane.
[0013]
【Example】
Examples are shown below.
The purity of hyaluronic acid (salt) was measured according to the glucuronic acid quantification method described in the formulation standard for cosmetic varieties (sodium hyaluronate (2)). Moreover, the high purity as used herein means that having a glucuronic acid content of 40.0 to 50.0% by weight.
Note that% used in Examples and Comparative Examples means weight (g) / volume (dl)% unless otherwise specified.
[0014]
Example 1
Glucose 6.1% as a carbon source, yeast extract 1.6% as a nitrogen source, 1 potassium phosphate 0.3%, 2 potassium phosphate 0.2%, sodium thiosulfate 0.01% as other salts, Streptococcus pre-cultured at 37 ° C. for 12 hours in a medium prepared with ingredients containing 0.01% magnesium sulfate heptahydrate, 0.002% sodium sulfite, 0.001% cobalt chloride, and 0.001% manganese chloride. Inoculate 1/18 volume of zooepidemicus (FERM BP878) and incubate at 37 ° C. After diluting the culture solution twice with pure water, the cells were removed by centrifugation, crystallized with twice the volume of ethanol of the removal solution, and dried to obtain high purity sodium hyaluronate.
100 g of this powder is dissolved in 10 liters of 0.05 mol / liter acetate buffer (pH 5.0), 10 g of hyaluronoglucosaminidase (EC 3.2.1.35) is added and dissolved at 37 ° C., and stirring is continued. . After 6 hours, the mixture is passed through an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 6000 (Asahi Kasei, SIP1013), and oligohyaluronic acid is separated from hyaluronic acid-degrading enzyme. Sodium chloride was added to the separated oligohyaluronic acid aqueous solution at 0.3 mol / liter, dissolved, cooled to 10 ° C, and the solution was added to 7 times its volume of 10 ° C ethanol with stirring. Crystallization was performed. The precipitate was collected and vacuum-dried to obtain 92 g of sodium oligohyaluronate.
The average molecular weight of sodium oligohyaluronate obtained by this operation was 5300 by HPLC. The purity was 45% or more in terms of glucuronic acid content. The average molecular weight of oligohyaluronic acid (salt) obtained by refrigerated storage of the used enzyme for 2 months and treated in the same manner was 6300. The purity was 45% by weight or more in terms of glucuronic acid content.
[0015]
Comparative Example 1
Glucose 6.1% as a carbon source, yeast extract 1.6% as a nitrogen source, 1 potassium phosphate 0.3%, 2 potassium phosphate 0.2%, sodium thiosulfate 0.01% as other salts, Streptococcus pre-cultured at 37 ° C. for 12 hours in a medium prepared with ingredients containing 0.01% magnesium sulfate heptahydrate, 0.002% sodium sulfite, 0.001% cobalt chloride, and 0.001% manganese chloride. Inoculate 1/18 volume of zooepidemicus (FERM BP878) and incubate at 37 ° C. After diluting the culture solution twice with pure water, the cells were removed by centrifugation, crystallized with twice the volume of ethanol of the removal solution, and dried to obtain high purity sodium hyaluronate.
100 g of this powder is dissolved in 10 liters of 0.05 mol / liter acetate buffer (pH 5.0), 10 g of hyaluronoglucosaminidase (EC 3.2.1.35) is added and dissolved at 37 ° C., and stirring is continued. After 6 hours, boil at 100 ° C. for 6 minutes. After cooling to room temperature, the generated denatured product of hyaluronoglucosaminidase was removed by filtration. Sodium chloride was added and dissolved in the filtrate to a concentration of 0.3 mol / liter. And stir for 1 hour. The activated carbon is filtered off and cooled to 10 ° C. Crystallization was performed by adding the aqueous solution to 7 times volume of ethanol at 10 ° C. with stirring. The precipitate was collected and vacuum-dried to obtain 87 g of sodium oligohyaluronate.
The average molecular weight of sodium oligohyaluronate obtained by this operation was 7800 by HPLC. The purity was 45% by weight or more in terms of glucuronic acid content. The enzyme having the hyaluronic acid (salt) decomposability after use in the reaction lost its decomposability and could not be used repeatedly.
[0016]
Comparative Example 2
Glucose 6.1% as a carbon source, yeast extract 1.6% as a nitrogen source, 1 potassium phosphate 0.3%, 2 potassium phosphate 0.2%, sodium thiosulfate 0.01% as other salts, Streptococcus pre-cultured at 37 ° C. for 12 hours in a medium prepared with ingredients containing 0.01% magnesium sulfate heptahydrate, 0.002% sodium sulfite, 0.001% cobalt chloride, and 0.001% manganese chloride. Inoculate 1/18 volume of zooepidemicus (FERM BP878) and incubate at 37 ° C. After diluting the culture solution twice with pure water, the cells were removed by centrifugation, crystallized with twice the volume of ethanol of the removal solution, and dried to obtain high purity sodium hyaluronate.
100 g of this powder is dissolved in 20 liters of a 0.1 N aqueous hydrochloric acid solution and stirred at 45 ° C. for 24 hours. Thereafter, the mixture was neutralized with 6N caustic soda water. After adding and dissolving so that the sodium chloride concentration was 0.3 mol / liter, the solution was cooled to 10 ° C., and the aqueous solution was added to ethanol having a volume of 3 times 10 ° C. with stirring while crystallization was performed. The precipitate was collected and vacuum dried to obtain 65 g sodium hyaluronate. The average molecular weight of sodium hyaluronate obtained by this operation was 63,000 by HPLC. The purity was 45% by weight or more in terms of glucuronic acid content.
[0017]
Comparative Example 3
Glucose 6.1% as a carbon source, yeast extract 1.6% as a nitrogen source, 1 potassium phosphate 0.3%, 2 potassium phosphate 0.2%, sodium thiosulfate 0.01% as other salts, Streptococcus pre-cultured at 37 ° C. for 12 hours in a medium prepared with ingredients containing 0.01% magnesium sulfate heptahydrate, 0.002% sodium sulfite, 0.001% cobalt chloride, and 0.001% manganese chloride. Inoculate 1/18 volume of zooepidemicus (FERM BP878) and incubate at 37 ° C. After diluting the culture solution twice with pure water, the cells were removed by centrifugation, crystallized with twice the volume of ethanol of the removal solution, and dried to obtain high purity sodium hyaluronate.
100 g of this powder is dissolved in 20 liters of 0.1N aqueous sodium hydroxide solution and stirred at 45 ° C. for 24 hours. Thereafter, the mixture was neutralized with 6N hydrochloric acid. After adding and dissolving so that the sodium chloride concentration was 0.3 mol / liter, the solution was cooled to 10 ° C., and the aqueous solution was added to ethanol having a volume of 3 times 10 ° C. with stirring while crystallization was performed. The precipitate was collected and vacuum-dried to obtain 60 g of sodium hyaluronate. The average molecular weight of sodium hyaluronate obtained by this operation was 55000 by HPLC. The purity was 45% by weight or more in terms of glucuronic acid content.
[0018]
【The invention's effect】
According to the production method of the present invention, a hyaluronic acid (salt) aqueous solution is decomposed with an enzyme having hyaluronic acid decomposing ability, and the enzyme and oligohyaluronic acid (salt) are separated by an ultrafiltration membrane, so that it is far more than conventional. In addition, oligohyaluronic acid (salt) having a high purity can be easily produced with a simple process at low cost.
Claims (4)
【０００１】Enzymes with hyaluronic acid resolution are from hyaluronoglucosaminidase (EC 3.2.1.35), hyaluronoglucuronidase (EC 3.2.1.36) and hyaluronate lyase (EC 4.2.2.1). The method for producing high-purity oligohyaluronic acid or a salt thereof according to claim 1, which is one or more selected.
[0001]
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