JP4146264B2

JP4146264B2 - Method for measuring methylglyoxal-arginine adduct

Info

Publication number: JP4146264B2
Application number: JP2003098826A
Authority: JP
Inventors: 恭一関根; 順子野崎; 寿子川上; 智山田
Original assignee: NOF Corp; LSI Medience Corp
Current assignee: NOF Corp; LSI Medience Corp
Priority date: 2003-04-02
Filing date: 2003-04-02
Publication date: 2008-09-10
Anticipated expiration: 2023-04-02
Also published as: JP2004309147A

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、メチルグリオキサール−アルギニン付加体（以下ＭＧ−ａｄｄｕｃｔということもある）を特異的に測定することを特徴とする測定方法、該測定法を利用した判定方法、及び該測定に利用する測定用キットに関する。さらに詳しくは、少なくともＭＧ−ａｄｄｕｃｔに対する抗体を利用して、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔを測定する際に、検体に対して特定の前処理することを特徴とするＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定法に関する。さらに本発明の測定方法を用いることを特徴とする、糖尿病性合併症の発症・進展に関する判定方法である。
【０００２】
【従来の技術】
メチルグリオキサールの生体内における生成経路として、酵素反応による代謝的生成経路とメイラード反応の前期反応生成物であるアマドリ化合物の不均化分解反応による化学的生成経路が知られている。代謝的生成経路としては、解糖系あるいは脂質由来の中間代謝物であるジヒドロキシアセトンリン酸やグリセルアルデヒド３−リン酸を経由する生成経路、およびグリシン・スレオニンといったアミノ酸代謝の中間代謝物であるアミノアセトンを経由した生成経路が知られている。メチルグリオキサールは、化学的反応性の高い２−オキソアルデヒドであり、古くから細胞毒性を示すことが報告されている。メチルグリオキサールは、タンパク質を構成するアミノ酸側鎖、特に塩基性のリジンやアルギニン側鎖と化学反応し、組織再構成に関わるプロテアーゼやコラゲナーゼの酵素反応を阻害し組織障害を引き起こす一方、代謝・調節に関わる機能タンパクの活性中心を構成するアミノ酸側鎖を修飾失活させることで代謝毒性に関わっている。
【０００３】
メチルグリオキサールは、通常の酸化ストレスの亢進していない状態ではグルタチオンを補酵素とするグリオキサラーゼによりｄ−乳酸に解毒される。しかし、酸化ストレスが亢進しているとされる血糖管理状態の悪い糖尿病患者では、抗酸化物質、特にグルタチオンの供給が不十分となり、メチルグリオキサールの解毒機構に支障を生じ、結果として神経細胞や血管内へ障害を与え、神経障害や網膜症、腎症などの糖尿病性合併症の原因となると考えられている。
【０００４】
糖尿病性合併症の指標としてのメチルグリオキサールの直接定量実現のため、多くの試みがなされてきた。しかし、化学的反応性の高い、含量変化が制御困難なメチルグリオキサールの直接的測定は極めて困難である。
【０００５】
一方、生体内で解毒代謝されない過剰なメチルグリオキサールは高い化学的反応性により、一部は、タンパクのアルギニン側鎖と反応しＭＧ−ａｄｄｕｃｔを形成し、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの一つとして安定なＡＧＥｓの１種であるアルグピリミジンを形成することが報告されている（非特許文献１）。
【０００６】
そこで我々は、メチルグリオキサールの生体への影響を間接的に評価する指標としてアルグピリミジンの測定は、メチルグリオキサールで問題となる試料採取、保管および搬送を容易とし、糖尿病性合併症発症予知、防御および治療法開発のための指標として有用であると考え、鋭意研究を行ってきた。
【０００７】
初めに、先行文献（非特許文献２)を追試し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による血漿・尿中のアルグピリミジン測定を試みた。しかし、文献記載の方法ではピークの同定が不可能であった。我々は、試料を加水分解後、イオン交換クロマトやＯＤＳ固相抽出等により部分精製し、高感度かつ特異的な測定が可能と考えられるアルグピリミジン内因性の蛍光特性を利用した検出法で、改良をさらに進めたＨＰＬＣ条件に供したが、夾雑物質の影響は低減されず、定量することは不可能であった。
【０００８】
さらに、我々は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計）測定法についても測定法構築を試みた。測定は、試料加水分解後、直接測定することは不可能であったため、ＨＰＬＣ測定法において開発し最良と考えられた前処理法、即ちＯＤＳ固相抽出による前処理実施後に行った。しかし、測定材料としては尿のみが測定可能であり、血漿では添加回収試験不成立かつピーク同定困難なため測定は不可能であった（非特許文献３）。
【０００９】
一方、アルグピリミジンを特異的に認識するとされる抗ＭＧモノクローナル抗体（特許文献１）が市販されており、本抗体については、糖尿病性腎症や虚血性の脳梗塞における脳動脈傷害部の特異的免疫染色に有用とする報告（非特許文献４）、糖尿病性網膜症発症部位との関連性を示唆する報告（非特許文献５）、および糖尿病患者において血管合併症発症に有用とされる報告（非特許文献６）があり、ＥＩＡによるＭＧ−ａｄｄｕｃｔ測定に有用な抗体と考えられる。
【００１０】
しかし、2001年11月に開催された第7回国際メイラード反応シンポジュームにてアルグピリミジンの発見者であるＮａｇａｒａｊに代表される、塩酸加水分解に安定である（非特許文献６）とする見解にたつＨＰＬＣ法による測定値報告と、Ｔｈｏｎａｌｌｙに代表される塩酸加水分解に不安定であり酵素反応後に測定する必要がある(非特許文献７)とする見解にたつアミノ酸分析法による測定報告に２分されている。アルグピリミジン自体の安定性と加水分解処理方法の適正が不明確であるため、ＥＩＡ測定値は機器分析法よりも信頼性はより低いと考えられ、既報のＥＩＡ法によるＭＧ−ａｄｄｕｃｔ測定の抱える問題点の本質について省みられることはほとんどなかった。
【００１１】
従来のＥＩＡ法による測定の報告は２報あるが、測定法が抱える共通の本質的問題点はペプチド結合切断に酵素処理を施し、ほう酸除去することなく試料を測定に供することである（非特許文献５および非特許文献８）。特に、生体試料には多種多様な夾雑物質が存在し、タンパク質の加水分解処理に、プロテアーゼ、ペプチダーゼおよび両者を混合する公知の酵素処理法では、アルグピリミジンのαアミノ基あるいはカルボキシル基側に少なからず、未分解のペプチド結合が残存することが予想される。しかし、断片化が不十分な試料であっても交叉反応性の差が小さい場合は、測定値への影響は小さいため採用することは実用上の問題とはならない。
【００１２】
そこで、分解の不十分な試料のモデル物質として、αアミノ基をＢｏｃで保護されたアルグピリミジンと塩酸加水分解による保護基の無い本来のアルグピリミジンとの交叉反応性を比較したところ、本来のアルグピリミジンに対する抗ＭＧモノクローナル抗体（特許文献１）の交叉反応率を１００％とすると、αアミノ基が保護されたものの交叉反応率は１０００％と１０倍強い親和性を示し、正しく測定するには、酵素加水分解処理は適さないことが明白となった。
【００１３】
我々は独自の研究により、上記問題点を明確にし、解決策を発見し、統合させ、本発明の創造に至った。
【００１４】
【先行文献】
【非特許文献１】
ＡｒｃｈｉｅｖｅｓＯｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＡｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９９７，Ｖｏｌ．３４４，Ｎｏ．１，ｐｐ２９−３６
【非特許文献２】
ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２００１、Ｖｏｌ．２９０，Ｎｏ．２、ｐｐ３５３-３５８
【非特許文献３】
２００２年日本薬学会第１２２年会ポスター発表番号：２６[Ｐ]Ｉ−２１５
【非特許文献４】
ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌＯｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９９、Ｖｏｌ．２７４、Ｎｏ．２６、ｐｐ１８４９２−１８５０２
【非特許文献５】
ＣｕｒｒｅｎｔＥｙｅＲｅｓｅａｒｃｈ２００１，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２，ｐｐ１０６−１１５
【非特許文献６】
ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ２００２、Ｖｏｌ．２９７、ｐｐ８６３−８６９
【非特許文献７】
ＢｉｏｃｈｅｍＪ２００２，Ｖｏｌ．３６４，Ｐｔ．１，ｐｐ１〜１４
【非特許文献８】
ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌＯｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９８、Ｖｏｌ．２７３、Ｎｏ．１２、ｐｐ６９２８−６９３６
【特許文献１】
特開平11-246600
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の解決しようとする課題は、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの正確な測定方法の提供である。つまり、従来のＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定の主要な方法は、機器分析によるものであり、構造そのものを検出し、定量することから、構造の一部が変化したり、分解したりすると測定は不可能であった。ＥＩＡような測定系は臨床検査の分野では繁用されているが、これまでＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定については、反応系に副反応が関与し、正確な測定は不可能とされてきた。本発明は、ＥＩＡのような臨床検査の領域で汎用される抗原抗体反応を利用した系によって、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの正確な測定方法を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定にあたり、検体についての前処理における組合せを改良し、特に抗原抗体反応を利用した系によってＭＧ−ａｄｄｕｃｔを測定するための手段を提供し、その測定により、新規な臨床的意義が確立されたことにより本発明を完成した。
【００１７】
本発明は、以下からなる。
１．生体試料中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体を測定する方法において、生体試料の測定前処理として、塩酸加水分解処理工程を含むことを特徴とする測定方法。
２．生体試料を還元処理及び塩酸加水分解処理工程を含むことを特徴とする前項１の測定方法。
３．生体試料を還元処理後に脱ほう酸処理及び塩酸加水分解処理の工程を含むことを特徴とする前項１又は２に記載の測定方法。
４．メチルグリオキサール−アルギニン付加体を測定する方法が、メチルグリオキサール−アルギニン付加体を特異的に認識する抗体を利用する抗原抗体反応系である前項１〜３の何れか一に記載の測定方法。
５．アルグピリミジン構造を特異的に認識する抗体である前項４に記載の測定方法。
６．以下の構成の一を含むＥＩＡ（ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法による測定手段である前項５に記載の測定方法。
１）アルグピリミジン（Ａｒｇｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）あるいはＢｏｃ−アルグピリミジンが固相化されており、固相化抗原と検体中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体とを、メチルグリオキサール−アルギニン付加体に対する抗体と競合的に反応させ、固相化抗原と結合した抗メチルグリオキサール−アルギニン付加体抗体に対して、ペルオキシダーゼ標識抗体を接触させて反応させることによって、検体中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体をアルグピリミジン量として測定する。
２）抗メチルグリオキサール−アルギニン付加体抗体が固相化されており、この固相化抗体と検体とを、所定量の酵素あるいはビオチン等で標識した標識化アルグピリミジンとを接触させ、競合的に反応させ、この固相化抗体と結合した標識化アルグピリミジンを測定することにより、検体中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体をアルグピリミジン量として測定する。
７．前項１〜６の何れか一に記載の測定法による結果を指標とする、糖尿病性合併症の発症、進展の評価方法。
８．前項１〜６の何れか一に記載の測定法に使用する試薬を含んでなる試薬キット。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、検体中のＭＧ−ａｄｄｕｃｔを測定することを対象とする。このＭＧ−ａｄｄｕｃｔが含有する被測定試料としての血液成分とは、被検体より採血、またはヘパリン等の抗凝固剤を添加して採血して得た血液試料を、遠心分離などの常法に基づき成分分離して得られた血漿ないし血清成分である。また、被測定試料としては尿も用いることができる。
【００１９】
本発明で、還元処理とは、検体中に夾雑する本発明の抗原抗体反応による測定に際して使用する抗体と反応する副反応物質を除去することを目的として行う。つまり、測定検体の前処理である。還元処理を行うことで、アマドリ化合物を安定化させ、他のＡＧＥｓ生成を抑制する。還元処理溶液として、０．２Ｎ−ＮａＢＨ_４含む２Ｎ−ＮａＯＨ溶液を調製する。血漿５０μｌに、還元処理溶液５０μｌを添加し、攪拌する。反応は、室温下で３時間〜１８時間行う。
【００２０】
本発明のより好ましい態様においては、上記の還元処理を行ったのち、脱ほう酸処理をおこなう。これにより測定値の信頼性、安定性が期待できる。除去処理は、還元処理後、ほう酸除去溶液として酢酸：メタノール（１：１０）溶液２００μｌを添加し攪拌する。６５℃下、３０秒間反応させ、ほう酸メチルを形成させる。再び６５℃下で、窒素吹きつけにより乾固させる。このほう酸除去操作は２回繰り返すことで、遊離のほう酸を除去することができる。
【００２１】
本発明の更に好ましい別の態様は、検体の塩酸による加水分解である。これにより、蛋白質におけるペプチド結合の切断、αアミノ基の遊離が達成され、生体試料中の蛋白質に結合したアルグピリミジンを測定することが可能となる。塩酸による処理条件は、脱ほう酸処理後、６Ｎ-ＨＣｌ１ｍｌを添加し、攪拌する。１１０℃下、１８時間〜２４時間の塩酸加水分解を行う。
【００２２】
上記のような前処理後、塩酸加水分解物の一部を窒素乾固後、さらに中和処理としてトリエチルアミンを添加し、攪拌する。再び窒素吹き付けによる乾固後、標準品および検体希釈液で再溶解し、ｐＨ７付近に調製する。
【００２３】
検体は、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔを認識する抗体を利用する抗原抗体反応系によって、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定が行われる。抗体は、アルグピリミジン構造を特異的に認識する抗体である。この抗体は既に本発明の共同出願人の日本油脂株式会社によって実用化及び市場に提供されており、例えば特許文献１に開示される。抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のどちらも利用できるが、より好ましくはモノクローナル抗体である。抗体作製動物としてウサギ、ヒツジ、ヤギについていずれも利用でき特に限定されない。以下、本発明で利用される好適な抗体を抗ＭＧモノクローナル抗体として例示することもある。また、本発明で使用する抗原とは、アルグピリミジンあるいはＢｏｃ−アルグピリミジンを意味する。
【００２４】
本発明において利用される抗原抗体反応系における好適な手段は、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法、競合ＥＩＡ法等が例示され、固相に、調製した抗原または抗体を固定化する系が使われる。特に競合ＥＩＡ法が好適である。
【００２５】
固相抗原作製方法は、例えば０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中に、アルグピリミジン５０μｍｏｌとＢＳＡ１μｍｏｌと１．５％グルタルアルデヒド溶液５０μｍｏｌと添加し、水浴にて２５℃下、２．５時間反応させる。次に、ＮａＢＨ_４を約２ｍｇ添加し、攪拌溶解後、ＰＢＳ５Ｌにて４℃下、一晩の透析を行う。次に、ＰＤ−１０カラムを用いて、０．９％ＮａＣｌにてゲル濾過を行う。ＵＶ２８０ｎｍモニターを使用し、アルグピリミジン−ＢＳＡ分画を分取する。最後に、ＢＣＡ法により、タンパク定量し、濃度を算出する。
固相への抗原の固定化法は、公知手法で十分である。固定化条件は、例えばＰＢＳで５μｇ／ｍｌに調製したアルグピリミジン−ＢＳＡ溶液を、マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ加え、４℃下、１８〜２４時間静置する。固相は、当該公知のプレートを用いうる。例えばＣｏａｓｔｅｒＥＩＡ／ＲＩＡＳｔｒｉｐｗｅｌｌ^TMＰｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ^TMＭｏｄｕｌｅｓ（Ｎｕｎｃ社）等が使用できる。
【００２６】
固相への抗体の固定化法は、公知手段で十分である。固定化条件は、例えばｐＨ９．６に調製された緩衝液で、抗体を０．２５〜１０μｇ／ｍｌの終濃度となるように添加し、これをマイクロプレートに適量加え、1〜１０℃、特に好ましくは２〜６℃で、１０〜３０時間、特に好ましくは１５〜２５時間静置し固定化させる。固相は、当該公知のプレートやビーズを用いる。
【００２７】
非特異反応をおさえるためのブロッキング緩衝液は、たとえばブロックエース（大日本製薬）で行う。蛋白質としては、牛血清アルブミン、オヴァアルブミン、スキムミルクなどがあるが、これらはＡＧＥｓ類が検出されるため、ブロックエースを使用する。
ブロッキング剤による固相の処理は、抗体の固定化後に行う。固相が十分に浸漬される状態であれば特に制限はない。処理条件は３７℃下、４時間あるいは所望により、４℃下、一晩静置して反応させる。ブロッキング処理後は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ溶液の洗浄用緩衝液（以下、洗浄液）で十分に洗浄する。
【００２８】
検体との接触
測定にあたって、検体である血漿、血清或いは尿および組織は、至適な濃度に調製する。本発明にあっては、標準品および検体の希釈液を使用する。標準品および検体希釈液は、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液に、非特異反応を抑える為にブロックエースを２５％（Ｖ／Ｖ）を添加する。界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０やグリセリンを添加｛緩衝液中に各０．１％（Ｖ／Ｖ）を含む｝することが好ましい。また所望により、０．９％ＮａＣｌ添加が可能である。さらに保存剤として０．１％ＮａＮ_３を添加することも可能である。
【００２９】
固相化抗原を使った競合ＥＩＡ法による場合は、抗ＭＧモノクローナル抗体を検体と固相化抗原に対して、競合的に反応させる。反応させる抗ＭＧモノクローナル抗体希釈には、抗体希釈液を使用する。抗体希釈液は、０．２Ｍトリス塩酸緩衝液に、ブロックエースを１０％（Ｖ／Ｖ）添加する。界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０やグリセリンを各０．１％（Ｖ／Ｖ）添加することが好ましい。さらに、保存剤として０．１％ＮａＮ_３を添加することも可能である。
【００３０】
調製した抗原または抗体の固定化固相と検体の接触は、自体公知の方法に準ずれば十分である。検体５０μｌを添加し、２５℃下で、好ましくは２時間程度振とう反応させることが望ましい。または所望により、４℃下、一晩静置して反応させてもよい。反応完了後は洗浄液で十分に洗浄する。固相化抗原を使った競合ＥＩＡ法による場合は、この反応により、固相化抗原と抗ＭＧモノクロ−ナル抗体が結合する。
【００３１】
本発明の一態様では、固相化抗原の系を用いた競合ＥＩＡ法により、検体の検出を行う。この系では、上記で反応した抗ＭＧモノクローナル抗体に対して、ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ'）_２抗マウスＩｇ'ｓ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）を反応させることによって定量する。ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ'）_２抗マウスＩｇ'ｓ抗体は、酵素標識抗体希釈液にて調製する。酵素標識抗体希釈液は、ＰＢＳに、界面活性剤として０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加する。所望により、アミノアンチピリンを０．０５％（Ｖ／Ｖ）添加する。さらに所望により、プロクリンを０．２％（Ｖ／Ｖ）添加する。酵素標識抗体は、酵素標識抗体希釈液で５０００倍程度に希釈され、１００μｌが各プレートに添加される。反応時間は、振とうさせながら３０分間程度である。反応完了後、洗浄液にて洗浄し、測定用反応物を得る。
【００３２】
本発明の別の一態様では、固相化抗体の系を用いた競合ＥＩＡにより、検体の検出を行う。この系では、試料中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔと所定量の酵素あるいはビオチン等の標識による標識化アルグピリミジンを、固相化抗体に対して、競合的に反応させることにより測定する。標識化アルグピリミジンの希釈には、酵素標識抗体希釈液の利用が可能であり、酵素標識抗体希釈液で５００〜５００００倍に希釈され、１００μｌが各プレートに添加される。反応時間は、振とうさせながら３０分間程度である。反応完了後、洗浄液にて洗浄し、測定用反応物を得る。
【００３３】
本発明で、ＥＩＡによる酵素は、ペルオキシダーゼ以外にも、アルカリホスファターゼ等も使用できる。
【００３４】
測定は、反応完了後、各酵素に応じた基質を添加し、その反応量から、検体中のＭＧ−ａｄｄｕｃｔをアルグピリミジン量として測定し、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔが特定される。
図１は、Ｂｏｃ−アルグピリミジンを塩酸加水分解によりＢｏｃ基を外し、アルグピリミジンとしたものを標準品とした。アルグピリミジンを標準品として、アルグピリミジン含むＭＧ−ａｄｄｕｃｔ量に応じた検量線を示しており、検体中のＭＧ−ａｄｄｕｃｔの定量が可能であることを示す。塩酸加水分解処理を選択した理由として、公知の酵素処理法ではアルグピリミジンのαアミノ基あるいはカルボキシル基側に少なからず、未分解のペプチド結合が残存することが考えられる。しかし、断片化が不十分な試料であっても交叉反応性の差が小さい場合には、測定値への影響は小さいため採用しても実用上の問題とはならない。αアミノ基をＢｏｃで保護されたアルグピリミジンと塩酸加水分解による保護基の無い本来のアルグピリミジンとの交叉反応性を比較したところ、本来のアルグピリミジンに対する抗ＭＧモノクロナール抗体（特許文献1）の交叉反応率を１００％とすると、αアミノ基が保護されたものの交叉反応率は１０００％と１０倍強い親和性を示したことから、酵素加水分解でなく、塩酸加水分解の方が妥当であると判断した。図２は、Ｂｏｃ−アルグピリミジンを１１０℃下で、１８時間の塩酸加水分解処理を行ったものと、Ｂｏｃ基が付いた状態の未処理のものとの抗ＭＧモノクローナル抗体に対する親和性の差を示す。
【００３５】
（発明の効果）
以上のような方法からなる本発明のＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定方法は、従来にない正確なＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定を可能とし、生体におけるＭＧ−ａｄｄｕｃｔ量測定の新規な意義を提供し、その測定法を利用すれば早期の糖尿病性合併症の新規指標を提供する。以上のような測定法に使用する試薬を構成してなる試薬キットの提供は、新規な臨床診断手段を提供する。
【００３６】
【実施例】
以下で本発明を実施例を用いて説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
【実施例１】
（検体の前処理）
塩酸加水分解処理の具体例
検体２５０μｌに、１２Ｎ−ＨＣｌを２５０μｌ添加し、攪拌する。この後、１１０℃、１８時間の塩酸加水分解処理を行う。この前処理では、反応中にアマドリ化合物化合物が生成することが予想された。
【００３８】
【実施例２】
（検体の前処理）
還元処理、塩酸加水分解処理の具体例
検体２５０μｌに０．２Ｎ−ＮａＢＨ_４含む２Ｎ−ＮａＯＨ溶液を２５０μｌ添加し、攪拌する。室温下、３時間静置し、還元処理を行う。この反応物に１２Ｎ−ＨＣｌを５００μｌ添加し、攪拌する。この後、１１０℃、１８時間の塩酸加水分解処理を行う。還元処理を加えることで、アマドリ化合物を安定化させ、他のＡＧＥｓ生成抑制することが予想されるが、局方水でも、血漿同様の濃度となり、改良の余地があった。
図３は、実施例１と実施例２との結果を比較したものである。検体希釈用緩衝液ブランク、血漿および対照として局方水を血漿と同様に還元処理かつ塩酸加水分解処理した結果とをＯＤ値として示したグラフである。
図４は、図３のＯＤ値を濃度算出した結果を示したグラフである。
【００３９】
【実施例３】
（検体の前処理）
還元処理、脱ほう酸処理、塩酸加水分解処理の具体例
上記実施例２の還元処理後、その１００μｌに、脱ほう酸溶液｛酢酸：メタノール（１：１０）｝を２００μｌ添加し、攪拌後、６５℃、３０秒間反応させる。これを６５℃下窒素吹き付けにより乾固させて、再び脱ほう酸溶液２００μｌ添加し、同じ操作を繰り返す。これにより、ほう酸メチルとして遊離ほう酸を除去する。この脱ほう酸できた窒素乾固物に、６Ｎ−ＨＣｌを１ｍｌ添加し、攪拌する。この後、１１０℃、１８時間の塩酸加水分解処理を行う。脱ほう酸処理により、測定系への影響が是正された。図５は、実施例２と実施例３との結果を比較したものである。血漿、検体希釈用緩衝液ブランク、対照として局方水を血漿と同様に処理した結果とをＯＤ値として示したグラフである。図６は、図５のＯＤ値を濃度算出した結果を示したグラフである。
実施例１、２、３の後、それぞれの塩酸加水分解物の一部をとり、窒素吹き付けにより乾固させる。次に、中和処理としてトリエチルアミンを適量添加し、攪拌する。その後、再び窒素吹き付けにより乾固させ、標準品および検体希釈液にて再溶解する。ここまでの操作が前処理となる。この再溶解したものが、マイクロプレートへ添加するサンプルとなる。
【００４０】
【実施例４】
（試薬の調製）
1)（固相化抗原の調製）
抗原アルグピリミジン−ＢＳＡをＰＢＳによって５μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートに１００μｌずつ加え、４℃で一晩静置し吸着させた。
2)（洗浄）
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ溶液(以下、洗浄液)で3回洗浄を行った。
3)（ブロッキング処理）
２５％ブロックエース溶液を、マイクロプレートに３００μｌずつ加え、３７℃で4時間ブロッキングを行い、その後、洗浄液によって3回洗浄を行った。
【００４１】
【実施例５】
（検体と固相化抗原かつ抗体との接触）
検体希釈液で希釈調製した標準品もしくは実施例１〜３で前処理した検体試料(血漿)を５０μｌずつマイクロプレートに入れた。ついで、抗ＭＧモノクローナル抗体(日本油脂株式会社)（商品番号Ｎ２１３４３０）を、抗体希釈液によって２０００倍に希釈調製した。これを、マイクロプレートに５０μｌずつ加え、室温で２時間振とう反応させた。その後、洗浄液で４回洗浄を行った。
（標識化）
ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ'）_２抗マウスＩｇ'ｓ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）を、標識抗体希釈液によって５０００倍に希釈調製した。これを、マイクロプレートに１００μｌずつ加え、室温で３０分間振とう反応させた。その後、洗浄液で４回洗浄を行った。
（測定）
ＴＭＢＭｉｃｒｏｗｅｌｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社）を、マイクロプレートに１００μｌずつ加えて発色させ、１０〜３０分後に２Ｎ−Ｈ_２ＳＯ_４１００μｌを加えて反応を停止させた。そして、測定波長４５０／６３０ｎｍの吸光度を測定した。
（検量線）
以上の系を使い、アルグピリミジンを標準品とした典型的な検量線を得た。これにより、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定が可能であることが確認できた。
【００４２】
【実施例６】
（ＳＴＺ糖尿病ラットにおける尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定）
ＳＴＺ誘発糖尿病モデルラットは、1週間飼育後、ＳＴＺを投与して作製した。正常群（ＳＤ系ラット、オス、6匹）およびＳＴＺ誘発糖尿病モデルラット群（ＳＤ系ラット、オス、6匹）を使い、ＳＴＺ投与後３週目を基準（０週）とし、８、１２、１６および２４週目に採尿して検体とした。正常ラットも同様に採尿した。この検体を、実施例１、２、３の前処理及び無前処理についての実施例４及び５の測定系で尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔを測定した。
図７には、正常群とＳＴＺ投与群との比較（尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの変化）を、図８には、正常群とＳＴＺ投与群との比較（尿中アルブミンの変化）を示した。尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔは、糖尿病の合併症を生じる前から、正常ラット群と比較して、ＳＴＺ誘発糖尿病モデルラット群では高値を示した（図７）。また尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔは、糖尿病性腎症の指標となる尿中アルブミン（図８）よりも先に変化があり、増加する傾向が認められた。この結果から、尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔ測定は、早期の糖尿病性合併症において有用な指標となることが推測された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明は、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定法として新規な手段を臨床検査の場に提供するものである。この測定系により、糖尿病性合併症についての新規な臨床検査手技を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】標準品アルグピリミジン濃度で作成した検量線のグラフである。
【図２】抗ＭＧモノクローナル抗体のＢｏｃ−アルグピリミジンとアルグピリミジンに対する親和性の差を示したグラフである。
【図３】塩酸加水分解処理と還元処理および塩酸加水分解処理したものとの比較で、ＯＤ値を示したグラフである。
【図４】図２のＯＤ値を濃度算出して示したグラフである。
【図５】還元処理および塩酸加水分解処理と還元後脱ほう酸処理し、塩酸加水分解処理したものとの比較で、ＯＤ値を示したグラフである。
【図６】図４のＯＤ値を濃度算出して示したグラフである。
【図７】尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔ測定において、正常ラット群と比較して、ＳＴＺ誘発糖尿病モデルラット群では高値を示したグラフである。
【図８】尿中アルブミン測定において、正常ラット群とＳＴＺ誘発糖尿病モデルラット群とも、２４週とやや遅く、高値となる濃度変化が認められたグラフである。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a measurement method characterized by specifically measuring a methylglyoxal-arginine adduct (hereinafter sometimes referred to as MG-addact), a determination method using the measurement method, and a measurement used for the measurement. For kits. More specifically, the present invention relates to a method for measuring MG-addact, which comprises subjecting a specimen to specific pretreatment when measuring MG-addact using at least an antibody against MG-addact. Furthermore, it is the determination method regarding the onset and progress of diabetic complications, characterized by using the measurement method of the present invention.
[0002]
[Prior art]
As a production route of methylglyoxal in vivo, a metabolic production route by an enzyme reaction and a chemical production route by a disproportionation decomposition reaction of an Amadori compound which is a pre-reaction product of a Maillard reaction are known. Metabolic production pathways include production pathways via dihydroxyacetone phosphate and glyceraldehyde 3-phosphate, which are glycolytic or lipid-derived intermediate metabolites, and intermediate metabolites of amino acid metabolism such as glycine and threonine. A production route via aminoacetone is known. Methylglyoxal is a highly chemically reactive 2-oxoaldehyde and has been reported to be cytotoxic for a long time. Methylglyoxal chemically reacts with the amino acid side chains that make up proteins, especially basic lysine and arginine side chains, and inhibits the enzyme reaction of proteases and collagenases involved in tissue reorganization, causing tissue damage, but also for metabolism and regulation. It is involved in metabolic toxicity by modifying and inactivating the amino acid side chain that constitutes the active center of the functional protein involved.
[0003]
Methylglyoxal is detoxified to d-lactic acid by glyoxalase using glutathione as a coenzyme in a state where normal oxidative stress is not enhanced. However, in diabetic patients with poor glycemic control, which is said to have increased oxidative stress, the supply of antioxidants, particularly glutathione, is insufficient, which interferes with the detoxification mechanism of methylglyoxal, resulting in nerve cells and blood vessels. It is thought to cause damage to the inside and cause diabetic complications such as neuropathy, retinopathy and nephropathy.
[0004]
Many attempts have been made to realize the direct quantification of methylglyoxal as an indicator of diabetic complications. However, it is very difficult to directly measure methylglyoxal which has high chemical reactivity and whose content change is difficult to control.
[0005]
On the other hand, excess methylglyoxal that is not detoxified and metabolized in vivo is highly chemically reactive, and part of it reacts with the arginine side chain of the protein to form MG-addact, which is one of MG-adducts and is stable AGEs. It has been reported to form one kind of argpyrimidine (Non-patent Document 1).
[0006]
Therefore, as an index to indirectly evaluate the effects of methylglyoxal on the living body, the measurement of argypirimidine facilitates the sampling, storage and transportation of methylglyoxal, which is a problem with methylglyoxal. We thought that it would be useful as an index for the development of treatments, and have conducted extensive research.
[0007]
First, the prior literature (Non-Patent Document 2) was re-examined, and argpyrimidine in plasma and urine was measured by HPLC (High Performance Liquid Chromatography). However, peaks cannot be identified by the methods described in the literature. We have improved the detection method using the intrinsic fluorescence characteristics of argypirimidine, which is considered to be capable of highly sensitive and specific measurement by hydrolyzing the sample and then partially purifying it by ion exchange chromatography or ODS solid phase extraction. However, the influence of contaminants was not reduced and quantification was impossible.
[0008]
Furthermore, we tried to construct a measurement method for LC / MS / MS (liquid chromatography / tandem mass spectrometer) measurement method. Since it was impossible to measure directly after sample hydrolysis, the measurement was performed after the pretreatment method developed in the HPLC measurement method and considered to be the best, that is, after pretreatment by ODS solid phase extraction. However, only urine can be measured as a measurement material, and the measurement was impossible in plasma because the addition recovery test was not possible and peak identification was difficult (Non-patent Document 3).
[0009]
On the other hand, an anti-MG monoclonal antibody (Patent Document 1), which is supposed to specifically recognize argypirimidine, is commercially available. Report useful for immunostaining (Non-Patent Document 4), Report suggesting relevance to the onset of diabetic retinopathy (Non-Patent Document 5), and Report useful for the development of vascular complications in diabetic patients ( Non-Patent Document 6), which is considered to be an antibody useful for MG-addact measurement by EIA.
[0010]
However, at the 7th International Maillard reaction symposium held in November 2001, the view that it was stable to hydrochloric acid hydrolysis (Non-patent Document 6) represented by Nagaraj, the discoverer of Arguprimidine, was reached. The measurement value report by HPLC method and the measurement report by amino acid analysis method based on the view that it is unstable to hydrochloric acid hydrolysis represented by Thonally and needs to be measured after enzyme reaction (Non-patent Document 7). ing. Since the stability of argypirimidine itself and the appropriateness of the hydrolysis treatment are unclear, EIA measurement values are considered to be less reliable than instrumental analysis methods, and problems with MG-addact measurement by the previously reported EIA method Very little was left out about the nature of the point.
[0011]
There are two reports of measurement by the conventional EIA method, but the common essential problem of the measurement method is to subject the peptide bond to enzyme treatment and to use the sample for measurement without removing boric acid (non-patented). Document 5 and Non-Patent Document 8). In particular, biological samples contain a wide variety of contaminants, and in the known enzyme treatment method in which protease, peptidase, and a mixture of both are used for protein hydrolysis treatment, it is not less on the α-amino group or carboxyl group side of argpyrimidine. Undegraded peptide bonds are expected to remain. However, even if the sample is insufficiently fragmented, if the difference in cross-reactivity is small, the influence on the measured value is small, and it is not a practical problem to adopt the sample.
[0012]
Therefore, as a model material for a sample with insufficient degradation, cross-reactivity between an argpyrimidine whose B-amino group was protected with Boc and an original arguprimidine without a protective group by hydrochloric acid hydrolysis was compared. Assuming that the cross-reaction rate of the anti-MG monoclonal antibody against pyrimidine (Patent Document 1) is 100%, the cross-reaction rate of the α-amino group protected is 1000%, showing 10 times stronger affinity. It became clear that enzymatic hydrolysis treatment was not suitable.
[0013]
Through our own research, we have clarified the above problems, discovered solutions, integrated them, and led to the creation of the present invention.
[0014]
[Prior literature]
[Non-Patent Document 1]
Archieves Of Biochemistry And Biophysics, 1997, Vol. 344, no. 1, pp29-36
[Non-Patent Document 2]
Analytical Biochemistry 2001, Vol. 290, no. 2, pp353-358
[Non-Patent Document 3]
Poster Presentation Number: 2002 [P] I-215
[Non-Patent Document 4]
The Journal Of Biological Chemistry 1999, Vol. 274, no. 26, pp18492-18502
[Non-Patent Document 5]
Current Eye Research 2001, Vol. 23, no. 2, pp106-115
[Non-Patent Document 6]
Biochemical And Biophysical Research Communication 2002, Vol. 297, pp 863-869
[Non-Patent Document 7]
Biochem J 2002, Vol. 364, Pt. 1, pp1-14
[Non-Patent Document 8]
The Journal Of Biological Chemistry 1998, Vol. 273, no. 12, pp6928-6936
[Patent Document 1]
JP-A-11-246600
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the present invention is to provide an accurate method for measuring MG-adduct. In other words, the main method of conventional MG-addact measurement is by instrumental analysis. Since the structure itself is detected and quantified, measurement cannot be performed if part of the structure is changed or decomposed. Met. Measurement systems such as EIA are frequently used in the field of clinical tests, but until now, measurement of MG-addact has involved side reactions in the reaction system, making accurate measurement impossible. The present invention is to provide an accurate method for measuring MG-adduct by a system using antigen-antibody reaction widely used in the field of clinical examination such as EIA.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
In the measurement of MG-addact, the present invention provides a means for measuring MG-addact by a system utilizing an antigen-antibody reaction, improving the combination in the pretreatment of the specimen, and by the measurement, The present invention was completed when clinical significance was established.
[0017]
The present invention consists of the following.
1. A method for measuring a methylglyoxal-arginine adduct in a biological sample, comprising a hydrochloric acid hydrolysis treatment step as a pretreatment for measurement of the biological sample.
2. 2. The measuring method according to item 1, wherein the biological sample includes a reduction treatment and a hydrochloric acid hydrolysis treatment step.
3. 3. The measuring method according to item 1 or 2, wherein the biological sample includes steps of deboration treatment and hydrochloric acid hydrolysis treatment after reduction treatment.
4). 4. The measurement method according to any one of items 1 to 3, wherein the method for measuring a methylglyoxal-arginine adduct is an antigen-antibody reaction system using an antibody that specifically recognizes the methylglyoxal-arginine adduct.
5. 5. The method according to item 4 above, which is an antibody that specifically recognizes an argypyrimidine structure.
6). 6. The measuring method according to item 5 above, which is a measuring means by an EIA (Enzyme Immunoassay) method including one of the following configurations.
1) Argpyrimidine or Boc-argiprimidine is immobilized, and the immobilized antigen and the methylglyoxal-arginine adduct in the sample react with each other competitively with an antibody against the methylglyoxal-arginine adduct. Then, the anti-methylglyoxal-arginine adduct antibody bound to the solid-phased antigen is reacted with a peroxidase-labeled antibody so that the methylglyoxal-arginine adduct in the sample is measured as the amount of argypyrimidine.
2) An anti-methylglyoxal-arginine adduct antibody is immobilized, and the immobilized antibody and the sample are contacted with a labeled argypyrimidine labeled with a predetermined amount of enzyme or biotin, etc. By reacting and measuring the labeled argupyrimidine bound to the solid-phased antibody, the methylglyoxal-arginine adduct in the sample is measured as the amount of argupyrimidine.
7). 7. A method for evaluating the onset and progress of diabetic complications, using the result of the measurement method according to any one of items 1 to 6 as an index.
8). A reagent kit comprising a reagent used in the measurement method according to any one of items 1 to 6.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is directed to measuring MG-addact in a specimen. The blood component as the sample to be measured contained in this MG-addact is a blood sample obtained by collecting blood from the subject or adding an anticoagulant such as heparin, based on a conventional method such as centrifugation. It is a plasma or serum component obtained by separating the components. Moreover, urine can also be used as a sample to be measured.
[0019]
In the present invention, the reduction treatment is performed for the purpose of removing side reaction substances that react with the antibody used in the measurement by the antigen-antibody reaction of the present invention, which is contaminated in a specimen. That is, it is a pretreatment of the measurement specimen. By performing the reduction treatment, the Amadori compound is stabilized and the production of other AGEs is suppressed. As a reduction treatment solution, 0.2N-NaBH ₄ Prepare a 2N NaOH solution containing. Add 50 μl of the reduction treatment solution to 50 μl of plasma and stir. The reaction is carried out at room temperature for 3 to 18 hours.
[0020]
In a more preferred embodiment of the present invention, the deboration treatment is performed after the above reduction treatment. Thereby, the reliability and stability of the measured value can be expected. In the removal treatment, 200 μl of an acetic acid: methanol (1:10) solution is added and stirred as a boric acid removal solution after the reduction treatment. The reaction is carried out at 65 ° C. for 30 seconds to form methyl borate. Again, dry at 65 ° C. by blowing nitrogen. This boric acid removing operation can be removed twice to remove free boric acid.
[0021]
Yet another preferred embodiment of the present invention is the hydrolysis of the specimen with hydrochloric acid. Thereby, the cleavage of the peptide bond in the protein and the release of the α-amino group can be achieved, and it becomes possible to measure argpyrimidine bound to the protein in the biological sample. As the treatment conditions with hydrochloric acid, 1 ml of 6N-HCl is added and stirred after deboration treatment. Hydrochloric acid hydrolysis is carried out at 110 ° C. for 18-24 hours.
[0022]
After the pretreatment as described above, a portion of the hydrochloric acid hydrolyzate is dried to nitrogen, and then triethylamine is added and stirred as a neutralization treatment. After drying again by blowing with nitrogen, redissolve with a standard product and a sample diluent, and adjust the pH to around 7.
[0023]
The specimen is measured for MG-addact by an antigen-antibody reaction system using an antibody that recognizes MG-addact. The antibody is an antibody that specifically recognizes the argupyrimidine structure. This antibody has already been put into practical use and marketed by Nippon Oil & Fats Co., Ltd., a joint applicant of the present invention, and disclosed in, for example, Patent Document 1. Although both a polyclonal antibody and a monoclonal antibody can be used as the antibody, a monoclonal antibody is more preferable. Rabbits, sheep, and goats can be used as antibody-producing animals, and are not particularly limited. Hereinafter, a suitable antibody used in the present invention may be exemplified as an anti-MG monoclonal antibody. The antigen used in the present invention means argpyrimidine or Boc-arguprimidine.
[0024]
Examples of suitable means in the antigen-antibody reaction system used in the present invention include RIA, ELISA, immunoblot, and competitive EIA, and a system in which the prepared antigen or antibody is immobilized on a solid phase is used. Is called. The competitive EIA method is particularly suitable.
[0025]
For example, a solid phase antigen is prepared by adding 50 μmol of argpyrimidine, 1 μmol of BSA, and 50 μmol of a 1.5% glutaraldehyde solution in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) at 25 ° C. in a water bath. Let react for 5 hours. Next, NaBH ₄ About 2 mg of is added, dissolved by stirring, and dialyzed overnight at 4 ° C. with 5 L of PBS. Next, gel filtration is performed with 0.9% NaCl using a PD-10 column. Argpyrimidine-BSA fractions are fractionated using a UV 280 nm monitor. Finally, the protein is quantified by BCA method and the concentration is calculated.
As a method for immobilizing an antigen on a solid phase, a known method is sufficient. For immobilization conditions, for example, 100 μl of an argypyrimidine-BSA solution prepared to 5 μg / ml with PBS is added to each well of the microplate, and the mixture is allowed to stand at 4 ° C. for 18 to 24 hours. The known plate can be used as the solid phase. For example, Coaster EIA / RIA Stripwell ^TM Plate (Corning incorporated), Nunc-Immuno ^TM Modules (Nunc) can be used.
[0026]
Known methods are sufficient for immobilizing the antibody on the solid phase. The immobilization conditions are, for example, a buffer adjusted to pH 9.6, an antibody is added so as to have a final concentration of 0.25 to 10 μg / ml, an appropriate amount is added to a microplate, and 1 to 10 ° C., particularly Preferably, it is allowed to stand at 2-6 ° C. for 10-30 hours, particularly preferably 15-25 hours for immobilization. As the solid phase, the known plate or bead is used.
[0027]
For example, Block Ace (Dainippon Pharmaceutical) is used as a blocking buffer for suppressing non-specific reactions. Examples of proteins include bovine serum albumin, ovalbumin, skim milk, etc., and block ace is used for these because AGEs are detected.
The treatment of the solid phase with the blocking agent is performed after the antibody is immobilized. There is no particular limitation as long as the solid phase is sufficiently immersed. The treatment is performed at 37 ° C. for 4 hours or, if desired, at 4 ° C. overnight. After the blocking treatment, the plate is thoroughly washed with a washing buffer solution (hereinafter referred to as washing solution) of a PBS solution containing 0.1% Tween 20 surfactant.
[0028]
Contact with specimen
In the measurement, plasma, serum or urine as a specimen and tissue are prepared to optimum concentrations. In the present invention, a standard product and a diluted sample solution are used. In order to suppress non-specific reaction, 25% (V / V) of Block Ace is added to the 0.1 M Tris-HCl buffer for the standard product and the sample diluent. It is preferable to add Tween 20 or glycerin as a surfactant {including 0.1% (V / V) each in the buffer solution}. If desired, 0.9% NaCl can be added. In addition, 0.1% NaN as a preservative ₃ It is also possible to add.
[0029]
In the case of the competitive EIA method using the immobilized antigen, the anti-MG monoclonal antibody is reacted competitively with the specimen and the immobilized antigen. For dilution of the anti-MG monoclonal antibody to be reacted, an antibody diluent is used. For antibody dilution, 10% (V / V) of Block Ace is added to 0.2 M Tris-HCl buffer. It is preferable to add 0.1% (V / V) of Tween 20 or glycerin as a surfactant. In addition, 0.1% NaN as a preservative ₃ It is also possible to add.
[0030]
The prepared solid phase of the antigen or antibody and the specimen may be contacted according to a method known per se. It is desirable to add 50 μl of the sample and to perform a shaking reaction at 25 ° C., preferably for about 2 hours. Alternatively, if desired, the reaction may be allowed to stand at 4 ° C. overnight. After completion of the reaction, wash thoroughly with a washing solution. In the case of the competitive EIA method using a solid phased antigen, the solid phased antigen and the anti-MG monoclonal antibody are bound by this reaction.
[0031]
In one embodiment of the present invention, the specimen is detected by a competitive EIA method using an immobilized antigen system. In this system, peroxidase-labeled goat F (ab ′) is used against the anti-MG monoclonal antibody reacted above. ₂ Quantification is carried out by reacting with anti-mouse Ig's antibody (BIOSOURCE). Peroxidase-labeled goat F (ab ') ₂ Anti-mouse Ig's antibody is prepared in enzyme-labeled antibody diluent. The enzyme-labeled antibody dilution solution is prepared by adding 0.1% Tween 20 as a surfactant to PBS. If desired, 0.05% (V / V) aminoantipyrine is added. Further, if desired, 0.2% (V / V) of proclin is added. The enzyme-labeled antibody is diluted about 5000 times with an enzyme-labeled antibody diluent, and 100 μl is added to each plate. The reaction time is about 30 minutes with shaking. After completion of the reaction, the reaction product is washed with a washing solution to obtain a measurement reactant.
[0032]
In another embodiment of the present invention, the specimen is detected by competitive EIA using an immobilized antibody system. In this system, MG-addact in a sample and a predetermined amount of enzyme or labeled algoprimidine labeled with biotin or the like are measured by reacting competitively with the immobilized antibody. An enzyme-labeled antibody diluent can be used to dilute the labeled argypirimidine, and is diluted 500 to 50,000 times with the enzyme-labeled antibody diluent, and 100 μl is added to each plate. The reaction time is about 30 minutes with shaking. After completion of the reaction, the reaction product is washed with a washing solution to obtain a measurement reactant.
[0033]
In the present invention, as the enzyme by EIA, alkaline phosphatase or the like can be used in addition to peroxidase.
[0034]
For the measurement, after completion of the reaction, a substrate corresponding to each enzyme is added, and from the reaction amount, MG-addact in the sample is measured as the amount of argpyrimidine, and MG-addact is specified.
FIG. 1 shows a standard product obtained by removing Boc-group from Boc-argipyrimidine by hydrochloric acid hydrolysis to obtain argpyrimidine. A calibration curve corresponding to the amount of MG-addact containing argupyrimidine is shown with argupyrimidine as a standard product, which indicates that MG-addact in the sample can be quantified. As a reason for selecting the hydrochloric acid hydrolysis treatment, it is conceivable that undegraded peptide bonds remain in the α-amino group or carboxyl group side of argpyrimidine in the known enzyme treatment method. However, even if the sample is insufficiently fragmented, if the difference in cross-reactivity is small, the effect on the measured value is small, so even if it is adopted, there is no practical problem. Comparison of cross-reactivity of α-amino group protected Boc with argpyrimidine and non-protected argiprimidine by hydrolysis with hydrochloric acid revealed that anti-MG monoclonal antibody against the original argpyrimidine (Patent Document 1) Assuming that the cross-reaction rate is 100%, the α-amino group was protected, but the cross-reaction rate was 1000%, showing 10 times stronger affinity. Therefore, hydrolysis with hydrochloric acid rather than enzymatic hydrolysis is more appropriate. It was judged. FIG. 2 shows the difference in affinity for anti-MG monoclonal antibody between Boc-argiprimidine treated with hydrochloric acid at 110 ° C. for 18 hours and untreated with Boc group attached. Show.
[0035]
(The invention's effect)
The method for measuring MG-adduct of the present invention comprising the method as described above makes it possible to measure MG-addact in an accurate manner, and provides a new significance for measuring the amount of MG-addact in a living body. Provides a new indicator of early diabetic complications. Providing a reagent kit comprising a reagent used in the above-described measurement method provides a novel clinical diagnostic means.
[0036]
【Example】
The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[0037]
[Example 1]
(Sample pretreatment)
Specific examples of hydrochloric acid hydrolysis treatment
Add 250 μl of 12N HCl to 250 μl of sample and stir. Then, hydrochloric acid hydrolysis treatment is performed at 110 ° C. for 18 hours. In this pretreatment, it was expected that an Amadori compound compound was formed during the reaction.
[0038]
[Example 2]
(Sample pretreatment)
Specific examples of reduction treatment and hydrochloric acid hydrolysis treatment
0.2N-NaBH in 250 μl sample ₄ Add 250 μl of the 2N NaOH solution containing and stir. Allow to stand at room temperature for 3 hours to perform reduction treatment. Add 500 μl of 12N HCl to the reaction and stir. Then, hydrochloric acid hydrolysis treatment is performed at 110 ° C. for 18 hours. By adding a reduction treatment, it is expected that the Amadori compound will be stabilized and the production of other AGEs will be suppressed. However, the concentration in the pharmacopoeia water is similar to that of plasma, and there is room for improvement.
FIG. 3 compares the results of Example 1 and Example 2. It is the graph which showed as a OD value the buffer solution blank for specimen dilution, the result of carrying out reduction treatment and hydrochloric acid hydrolysis treatment of pharmacopoeia water like plasma as a control.
FIG. 4 is a graph showing the result of calculating the concentration of the OD value of FIG.
[0039]
[Example 3]
(Sample pretreatment)
Specific examples of reduction treatment, deboric acid treatment, and hydrochloric acid hydrolysis treatment
After the reduction treatment of Example 2 above, 200 μl of a deborated acid solution {acetic acid: methanol (1:10)} is added to 100 μl thereof, followed by reaction at 65 ° C. for 30 seconds. This is dried and solidified by blowing nitrogen at 65 ° C., 200 μl of deboric acid solution is added again, and the same operation is repeated. This removes free boric acid as methyl borate. 1 ml of 6N-HCl is added to the dried nitrogen solid product that has been deborated and stirred. Then, hydrochloric acid hydrolysis treatment is performed at 110 ° C. for 18 hours. The effect on the measurement system was corrected by the deboration treatment. FIG. 5 compares the results of Example 2 and Example 3. It is the graph which showed as a OD value the result of having processed plasma, the specimen dilution buffer blank, and the pharmacopoeia water as a control similarly to plasma. FIG. 6 is a graph showing the result of calculating the concentration of the OD value of FIG.
After Examples 1, 2, and 3, a portion of each hydrochloric acid hydrolyzate is taken and dried by blowing nitrogen. Next, an appropriate amount of triethylamine is added as a neutralization treatment and stirred. Thereafter, the sample is again dried by nitrogen blowing and redissolved with a standard product and a sample diluent. The operations so far are preprocessing. This redissolved product becomes a sample to be added to the microplate.
[0040]
[Example 4]
(Preparation of reagents)
1) (Preparation of immobilized antigen)
Antigen Argupyrimidine-BSA was diluted with PBS to a concentration of 5 μg / ml, 100 μl each was added to an ELISA microplate, and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption.
2) (Cleaning)
Washing was performed 3 times with a PBS solution containing 0.1% Tween 20 (hereinafter, washing solution).
3) (Blocking process)
300 μl of 25% Block Ace solution was added to each microplate, blocking was performed at 37 ° C. for 4 hours, and then the plate was washed 3 times with a washing solution.
[0041]
[Example 5]
(Contact between specimen and immobilized antigen and antibody)
50 μl each of the standard sample diluted with the sample diluent or the sample sample (plasma) pretreated in Examples 1 to 3 was placed in a microplate. Subsequently, an anti-MG monoclonal antibody (Nippon Yushi Co., Ltd.) (product number N213430) was diluted and prepared 2000 times with an antibody diluent. This was added to a microplate in a volume of 50 μl and shaken at room temperature for 2 hours. Thereafter, washing was performed 4 times with a washing solution.
(Labeling)
Peroxidase-labeled goat F (ab ') ₂ Anti-mouse Ig's antibody (BIOSOURCE) was prepared by diluting 5000 times with a labeled antibody diluent. 100 μl of this was added to a microplate and allowed to shake at room temperature for 30 minutes. Thereafter, washing was performed 4 times with a washing solution.
(Measurement)
TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL) was added to each microplate at 100 μl for color development, and after 10-30 minutes, 2N-H ₂ SO ₄ The reaction was stopped by adding 100 μl. Then, the absorbance at a measurement wavelength of 450/630 nm was measured.
(Calibration curve)
Using the above system, a typical calibration curve using argypirimidine as a standard was obtained. Thereby, it was confirmed that measurement of MG-adduct was possible.
[0042]
[Example 6]
(Measurement of urinary MG-adduct in STZ diabetic rats)
STZ-induced diabetes model rats were prepared by administering STZ after breeding for 1 week. Normal group (SD rat, male, 6 animals) and STZ-induced diabetes model rat group (SD rat, male, 6 animals) were used, and the standard (0 week) was 3 weeks after STZ administration. Urine was collected at 16 and 24 weeks to prepare specimens. Normal rats were collected in the same manner. This sample was measured for urinary MG-addact in the measurement systems of Examples 4 and 5 for the pretreatment and non-pretreatment of Examples 1, 2, and 3.
FIG. 7 shows a comparison between the normal group and the STZ-administered group (change in urinary MG-addact), and FIG. 8 shows a comparison between the normal group and the STZ-administered group (change in urinary albumin). Urinary MG-addact was higher in the STZ-induced diabetic model rat group than in the normal rat group before the complication of diabetes occurred (FIG. 7). In addition, urinary MG-addact had a change before urinary albumin (FIG. 8), which is an index of diabetic nephropathy, and a tendency to increase was observed. From this result, it was speculated that urinary MG-addact measurement would be a useful index in early diabetic complications.
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【The invention's effect】
The present invention provides a novel means for measuring MG-addact in the field of clinical examination. This measurement system provides a novel clinical laboratory procedure for diabetic complications.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph of a calibration curve prepared with a standard product alguprimidine concentration.
FIG. 2 is a graph showing the difference in affinity of anti-MG monoclonal antibodies for Boc-argiprimidine and arguprimidine.
FIG. 3 is a graph showing OD values in comparison between hydrochloric acid hydrolysis treatment, reduction treatment, and hydrochloric acid hydrolysis treatment.
FIG. 4 is a graph showing the concentration of the OD value shown in FIG.
FIG. 5 is a graph showing an OD value in comparison with a reduction treatment and a hydrochloric acid hydrolysis treatment, a reduction boric acid treatment after reduction, and a hydrochloric acid hydrolysis treatment.
6 is a graph showing the concentration of the OD value shown in FIG.
FIG. 7 is a graph showing a higher value in the STZ-induced diabetes model rat group than in the normal rat group in urinary MG-addact measurement.
FIG. 8 is a graph showing a change in the concentration of urinary albumin, which was slightly late at 24 weeks and increased in both the normal rat group and the STZ-induced diabetes model rat group.

Claims

A method for measuring a methylglyoxal-arginine adduct in a biological sample, comprising a hydrochloric acid hydrolysis treatment step as a measurement pretreatment of the biological sample.

The measurement method according to claim 1, wherein the biological sample includes a reduction treatment and a hydrochloric acid hydrolysis treatment step.

The measurement method according to claim 1, wherein the biological sample includes steps of deboration treatment and hydrochloric acid hydrolysis treatment after the reduction treatment.

The measuring method according to any one of claims 1 to 3, wherein the method for measuring a methylglyoxal-arginine adduct is an antigen-antibody reaction system using an antibody that specifically recognizes the methylglyoxal-arginine adduct.

The measurement method according to claim 4, which is an antibody that specifically recognizes an argpyrimidine structure.

6. The measuring method according to claim 5, which is a measuring means by an EIA (Enzyme Immunoassay) method including one of the following configurations.
1) Argpyrimidine or Boc-argiprimidine is immobilized, and the immobilized antigen and the methylglyoxal-arginine adduct in the sample react with each other competitively with an antibody against the methylglyoxal-arginine adduct. Then, the anti-methylglyoxal-arginine adduct antibody bound to the solid-phased antigen is reacted with a peroxidase-labeled antibody so that the methylglyoxal-arginine adduct in the sample is measured as the amount of argypyrimidine.
2) An anti-methylglyoxal-arginine adduct antibody is immobilized, and the immobilized antibody and the sample are contacted with a labeled argypyrimidine labeled with a predetermined amount of enzyme or biotin, etc. By reacting and measuring the labeled argupyrimidine bound to the solid-phased antibody, the methylglyoxal-arginine adduct in the sample is measured as the amount of argupyrimidine.

A method for evaluating the onset and progress of diabetic complications, wherein the result of the measurement method according to any one of claims 1 to 6 is used as an index.

A reagent kit comprising a reagent used in the measurement method according to any one of claims 1 to 6.