JP4145403B2 - Polymer / enzyme conjugate for immunologically active substance measurement - Google Patents

Description

【０００９】
（ただし、式中のＲ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子または炭素原子１〜４のアルキル基を示し、同一または異なる基であってもよい。ｎは２〜４の整数である。）
で示される基を有する親水性単量体（ａ１）と、酵素が化学結合可能な官能基 −Ｒ⁴を含む単量体（ａ２）を含む単量体組成物を重合してなる酵素化学結合可能なる高分子と、酵素とを化学結合して得られる
一般式［II］
【００１０】
【化７】

【００１１】
（ただし、式中のＥは酵素の残基、Ｙ１は酵素中の官能基と前記Ｒ⁴の官能基とから形成された基、ａは０または１、ｂは１以上の数である。）
で示される基を有する高分子／酵素結合体。
（３）親水性単量体（ａ１）が、下記一般式［III］
【００１２】
【化８】

【００１３】
で示される親水性単量体であり、
蛋白質が化学結合可能な官能基−Ｒ⁴を有する単量体（ａ２）であって、−Ｒ⁴がカルボキシル基、アミノ基、水酸基のいずれかの官能基を有する単量体である前記の高分子／酵素結合体。
（４）化学結合可能な官能基−Ｒ⁴を含む単量体が、メタクリル酸または２−アミノメチルメタクリレートである前記の高分子／酵素結合体。
（５）高分子／酵素結合体の酵素が、免疫学的活性物質測定用の酵素である前記の高分子／酵素結合体。
（６）高分子／酵素結合体の未反応の生物学的に特異的な結合を有する物質が化学結合可能な官能基−Ｒ⁴または高分子／酵素結合体の酵素の化学結合が可能な官能基−Ｒ⁵に、更に生物学的に特異的な結合を有する物質を化学結合して得られる一般式［IV］
【００１４】
【化９】

【００１５】
（ただし、式中のＡは生物学的に特異的な結合を有する物質の残基、Ｙ²は生物学的に特異的な結合を有する物質中の官能基と前記−Ｒ⁴または−Ｒ⁵の官能基とから形成された基、ｃは０または１、ｄは１以上の数である。）
で示される基を有する高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体。
（７）前記の高分子／酵素結合体に、生物学的に特異的な結合を有する物質が、未反応の化学結合可能な官能基−Ｒ⁴および高分子／酵素結合体の酵素の化学結合が可能な官能基−Ｒ⁵に、更に化学結合して得られる一般式［IV］
【００１６】
【化１０】

【００１７】
（ただし、式中のＡは生物学的に特異的な結合を有する物質の残基、Ｙ²は生物学的に特異的な結合を有する物質中の官能基と前記−Ｒ⁴または−Ｒ⁵の官能基とから形成された基、ｃは０または１、ｄは１以上の数である。）
で示される基を有する高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体。
（８）生物学的に特異的な結合を有する物質が、抗体、ビオチン、アビジンあるいは抗原のいずれかの物質である前記の高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体。
（９）前記の高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体とを含むことを特徴とする免疫学的活性物質測定試薬。
（１０）被検物質となる免疫学的活性物質を含む検体と、前記の免疫学的活性物質測定試薬とを接触させ、検体中の被検物質と生物学的に特異的な結合を有する物質とを反応させた後に、得られる反応生成物を酵素反応を利用して測定することを特徴とする免疫学的活性物質測定方法。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる化学結合可能な基を有する高分子は、前記の一般式［Ｉ］のホスホリルコリン類似基を有する単量体と、前記化学結合可能な官能基−Ｒ⁴基を有する単量体との組成物を重合して得られる高分子である。この高分子は、−Ｒ⁴基を介して酵素と化学的に結合が可能であるとともに、抗原等の蛋白質や生物学的に特異的な結合を有する物質と化学的に結合が可能であることを意味する。
前記の高分子を構成する親水性単量体（ａ１）は、分子中に重合性の二重結合を有し、さらに一般式［Ｉ］で示される基を有する単量体である。
具体的には、このような化合物としては、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アリルオイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンジルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（スチリルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルオキシカルボニル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アリルオキシカルボニル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アクリロイルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルカルボニルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アリルオキシカルボニルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ブテロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（クロトノイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、エチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、ブチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、ヒドロキシエチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート等が挙げられる。
好ましくは、入手性などから、前記の式［III］で示される、２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２’−トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート（（（以下ＭＰＣと略す）＝２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）が挙げられる。
【００１９】
本発明の前記の高分子の構成成分として用いられる単量体の、酵素が化学結合可能な官能基−Ｒ⁴としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基、メルカプト基、スクシニミジルオキシカルボニル基、イミドエステル基、ハロゲノニトリル基、ハロゲノスルホニル基、ニトロアジドフェニル基、ジアゾトリフルオロアセチル基、イソシアネート基などが挙られる。これらの中では、酵素中のアミノ基あるいは、酵素中の糖鎖を開環させて生じたアルデヒド基との反応が容易である、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、イソシアネート基などがより好ましい。
【００２０】
酵素が化学結合可能な官能基−Ｒ⁴を有する単量体（ａ２）は、分子中に重合性の二重結合を有し、側鎖に酵素が化学結合可能な基（−Ｒ⁴）を有する単量体である。このような化合物としては、具体的には例えば、スチレンカルボン酸、（メタ）アクリル酸、３−ペンテン酸、４−ペンテン酸、３−アリロキシプロピオン酸、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリオイルオキシエチルフタル酸等のカルボキシル基を有する単量体、あるいは、アリルアミン（塩酸塩）、アミノエチル（メタ）アクリレート（塩酸塩）、２−メチルアリルアミン、４−アミノスチレンなどのアミノ基を有する単量体、（メタ）アクリル酸クロリド、（メタ）アクリロイルイソシアネート、（メタ）アクリロイルオキシエチルイソシアネートなどの酵素と反応性を有する基を有する単量体、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドなどの水酸基を有する単量体などが挙げられる。
【００２１】
なかでも、親水性単量体（ａ１）との組み合わせとしては、アミノエチル（メタ）アクリレート（塩酸塩）と前記ＭＰＣとの組み合わせが好ましく挙げられる。
【００２２】
前記親水性単量体（ａ１）の単量体組成物中の含有割合は、単量体組成物中の全単量体中に５〜９５重量％、特に１０〜９０重量％の範囲が好ましい。５重量％未満では得られた高分子／酵素結合体の各種緩衝溶液、各種生理食塩水、あるいは各種培養液などの水溶性溶媒中での溶解性が低くなり好ましくない。一方、酵素が化学結合可能な官能基−Ｒ⁴を有する単量体（ａ２）を含む単量体組成物中の含有割合は、全単量体中、５〜９５重量％、特に１０〜９０重量％の範囲が好ましい。５重量％未満では、化学結合される酵素量が少なくなり、免疫学的活性物質測定感度があまり高感度にならず好ましくない。
【００２３】
本発明において、酵素化学結合可能な高分子は、前記単量体組成物を重合してなる高分子である。この高分子の重量平均分子量は、特に限定されないが、好ましくは、１，０００〜５，０００，０００、より好ましくは、１０，０００〜５００，０００である。
【００２４】
前記酵素化学結合可能な高分子は、前記単量体組成物を、公知の溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合等の方法を用いて、必要に応じて重合系を不活性ガス、例えば、窒素、二酸化炭素、ヘリウムで置換ないし雰囲気下にし、重合温度０〜１００℃、重合時間１０分〜４８時間の条件でラジカル重合させる方法等により調製することができる。重合に際しては、ラジカル重合開始剤を用いることができる。該重合開始剤としは、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロピル）二塩酸塩、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２’−アゾビスイソブチルアミド二水和物、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート｛日本油脂（株）社製、商品名「パーロイル−ＳＡ」、以下ＰＲ−ＳＡと略す）、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート等が挙げられる。またさらには、これらのラジカル重合開始剤は１種または２種以上の混合物が使用できる。
また、前記重合開始剤は、各種レドックス系の促進剤を併用してもよい。重合開始剤の使用量は、単量体組成物１００重量部に対して、０．０１〜５．０重量部が好ましい。
【００２５】
重合体の精製は、再沈殿法、透析法、限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。
【００２６】
本発明に用いられる酵素としては、従来から酵素免疫測定法において使用されている酵素が使用できる。例えば、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペニシリナーゼ、ペルオキシダーゼ、リゾチームなどが挙られる。この中で、酵素免疫測定法において汎用的に用いられるアルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなどが望ましく挙げられる。
また、これらの酵素は、酵素が結合可能な高分子中の−Ｒ⁴が反応する、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、各種糖鎖を開環させたアルデヒド基等の反応性の基を有している。
【００２７】
前記のような酵素と、前記一般式［Ｉ］で表わされる基を有する親水性単量体（ａ１）と、酵素が化学結合可能な官能基−Ｒ4を有する単量体（ａ２）とを含む単量体組成物を重合してなる酵素化学結合可能な高分子とを反応させること、即ち、酵素中の前記官能基と高分子中の−Ｒ⁴を反応させることにより、前記一般式［II］で表される基を有する高分子／酵素結合体が得られる。
【００２８】
ここで、前記一般式［II］においてＹ¹は、前記酵素中の官能基と酵素化学結合可能なる高分子中の−Ｒ4とから形成される基（結合）であり、具体的には、例えば、アミド基、ジカルバミド基、ウレア結合、ジスルフィド結合、イミド酸アミド結合、３−チオスクシンイミド結合（マレイミド基にチオール基が反応して形成された結合）、開環した糖鎖により形成されたアルデヒド基にアミノ基が反応したものを還元して生じる結合基などが挙られる。
【００２９】
前記一般式［II］においてｂは、１以上の数、好ましくは酵素の種類にもよるが１〜１００、さらに好ましくは１〜５０である。ｂが１００を越えると、酵素の種類にもよるが、酵素活性が低下する場合がある。
【００３０】
本発明で用いられる高分子／酵素結合体は、酵素と化学結合可能な高分子と、酵素とを、重量比で１：０．０００１〜５００の割合で含むものである。酵素の重量比が０．０００１未満では免疫学的活性物質測定時に高感度化があまり起きず効率的ではなく、５００を越えると溶解性が低下する、あるいは酵素活性の安定性が低下するので好ましくない。
【００３１】
本発明で用いられる高分子／酵素結合体の製造方法は、次の３とおりがある。高分子／酵素結合体は、前記酵素結合可能なる高分子溶液に、前記酵素を化学反応させることにより得られる。具体的には例えば、
▲１▼高分子中のカルボキシル基と酵素中のアミノ基を反応させる際は、高分子と酵素が溶解している水溶液の中に、水溶性縮合剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ）を反応させる方法。▲２▼高分子中のアミノ基と酵素中の糖鎖を反応させる際は、まず酵素中の糖鎖を過ヨウ素酸により開環させ、生じたアルデヒド基と高分子中のアミノ基を反応させ、その結合を水素化ホウ素ナトリウムで還元させる方法。
▲３▼高分子中のイソシアネート基と酵素中のアミノ基を反応させる際は、酵素溶液の中に高分子溶液を添加する方法。
上記の▲１▼〜▲３▼の反応の際は、かき混ぜ、加熱、超音波処理等により溶解を容易にすることが望ましい。また、透析、希釈、ＰＨ制御、有機溶剤の添加、乾燥、凍結乾燥等の操作を適宜選択して用いることができる。
【００３２】
前記酵素結合可能な高分子溶液と、前記酵素溶液を混合させる際の、高分子および酵素の溶媒としては、同一または異なっていてもよい。例えば、水、各種緩衝溶液、各種生理食塩水、各種培養液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ニトロメタンなどが挙げられ、混合溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルオキシド、アセトニトリル、ジオキサン、アセトン、塩化メチレン、クロロホルム、メチルエチルケトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、トルエン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ｎ−ヘキサン、イソプロピルエーテル、四塩化炭素、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等の有機溶剤と水との混合物等が挙げられる。好ましくは酵素活性の低下が起きにくい、各種緩衝溶液、各種生理食塩水、各種培養液が挙げられる。
【００３３】
本発明に示される、生物学的に特異的な結合を有する物質としては、従来から酵素免疫測定法などにおいて使用されている物質が使用でき、例えば抗体、抗原、アビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチンなどが挙られる。これらの中で、酵素免疫測定法において汎用的に用いられる、抗体、アビジン、ビオチンなどが好ましい。
また、これら生物学的に特異的な結合を有する物質は、高分子／酵素結合体に、生物学的に特異的な結合を有する物質が、未反応の化学結合可能な官能基−Ｒ⁴または、高分子／酵素結合体の酵素の生物学的に特異的な結合を有する物質が化学結合可能な官能基−Ｒ⁵が反応する水酸基、カルボキシル基、カルボキシル基から誘導したスクシンイミドエステル基、アミノ基、各種糖鎖を開環させたアルデヒド基などの反応性の基を有している。また、前記の結合は−Ｒ⁴基に単独でもよいし、酵素中の−Ｒ⁵基に単独でもよいし、あるいは、−Ｒ⁴基および酵素中の−Ｒ⁵基の両方に結合していてもよい。
【００３４】
高分子／酵素結合体の酵素の化学結合が可能な官能基−Ｒ⁵としては、酵素の種類にもよるが、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、糖鎖などがあげられ、生物学的に特異的な結合を有する物質が容易に化学結合可能な、カルボキシル基、アミノ基などが好ましくあげられる。
【００３５】
上記の高分子／酵素結合体に存在する、未反応の−Ｒ⁴または、高分子／酵素結合体の酵素の化学結合可能な官能基−Ｒ⁵に前記生物学的に特異的な結合を有する物質を化学反応することにより、前記一般式［IV］で表される高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質の結合体が得られる。
【００３６】
前記一般式［IV］においてＹ²は、前記生物学的に特異的な結合を有する物質の官能基と高分子／酵素結合体の未反応の−Ｒ⁴または、高分子／酵素結合体の酵素の化学結合可能な官能基−Ｒ⁵とから形成される基（結合）であり、具体的なものとしては、アミド基、ジカルバミド基、ウレア結合、ジスルフィド結合、イミド酸アミド結合、３−チオスクシンイミド結合（マレイミド基にチオール基が反応して形成された結合）、開環した糖鎖により形成されたアルデヒド基にアミノ基が反応したものを還元して結合などが挙られる。
【００３７】
前記一般式［IV］においてｄは、１以上の数、好ましくは酵素の種類にもよるが１〜１００、さらに好ましくは１〜５０である。ｄが１００を越えると、酵素の種類にもよるが、酵素活性が低下する場合がある。
【００３８】
本発明に示される、高分子／酵素結合体に対する生物学的に特異的な結合を有する物質の割合は、（高分子／酵素結合体）：生物学的に特異的な結合を有する物質が重量比で１：０．０００１〜５００の割合で含む物である。生物学的に特異的な結合を有する物質の重量比が０．０００１未満では免疫学的活性物質測定時に高感度化があまり起きず効率的ではなく、５００を越えると溶解性が低下する、あるいは生物学的に特異的な結合を有する物質の安定性が低下するなどの点から好ましくない。
【００３９】
本発明に示される、高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体は、前記高分子／酵素溶液に、前記生物学的に特異的な結合を有する物質を化学反応させることにより得られる。
例えば前記の高分子／酵素結合体の調製例▲１▼〜▲３▼に更に、抗体を反応させる際は▲１▼’高分子／酵素結合体の高分子の未反応のカルボキシル基または酵素中のカルボキシル基と抗体中のアミノ基を反応させる際は、高分子／酵素結合体と生物学的に特異的な結合を有する物質が溶解している水溶液の中に、水溶性縮合剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ）を反応させることにより高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体が得られる。
▲２▼’高分子／酵素結合体の高分子の未反応のアミノ基あるいは、酵素中のアミノ基と抗体中の糖鎖を反応させる際は、未反応のアミノ基とまたは酵素中のアミノ基と生物学的に特異的な結合を有する物質中の糖鎖を反応させる際は、まず生物学的に特異的な結合を有する物質中の糖鎖を過ヨウ素酸により開環させ、生じたアルデヒド基と前記のアミノ基を反応させ、その結合を水素化ホウ素ナトリウムで還元させることにより高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体が得られる。
▲３▼’高分子／酵素結合体中の未反応のイソシアネート基と生物学的に特異的な結合を有する物質中のアミノ基を反応させる際は、高分子／酵素結合体溶液の中に生物学的に特異的な結合を有する物質溶液を添加するだけで高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体が得られる。
上記の▲１▼’〜▲３▼’の反応の際は、かき混ぜ、加熱、超音波処理等により溶解を容易にすることが望ましい。また、透析、希釈、ＰＨ制御、有機溶剤の添加、乾燥、凍結乾燥等の操作を適宜に付加することができる。
【００４０】
前記高分子／酵素結合体溶液と、前記生物学的に特異的な結合を有する物質溶液を混合させる際の溶媒としては、前記の酵素結合可能な高分子溶液と、前記酵素溶液を混合させる際に用いた溶媒と同一のものが使用できる。
【００４１】
本発明の免疫学的活性物質測定試薬は、前記のようにして得られる高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体を含むものであり、高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体だけでなっていても、他の添加剤が配合されていてもよい。また本発明の測定試薬は、個体ないし粉末のような乾燥状態で保管し、使用時に適当な媒体に溶解して使用することもできるし、はじめから液体の形態で試薬とすることもできる。後者の場合、試薬中の高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体の濃度は、蛋白質量として１×１０^-5〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１×１０^-3〜１ｍｇ／ｍＬとするのが望ましい。
【００４２】
前記の添加剤としては、従来から抗原抗体反応を利用した測定試薬に用いられる添加剤が制限なく使用できる。具体的なものとしては、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン等の蛋白質、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社製、商標）等の界面活性剤、メタノール、エタノール、アセトン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン等の有機溶媒等が挙げられる。
【００４３】
また高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体を溶解する媒体としては、酵素活性、生物学的に特異的な結合を有する物質の活性を低下させないで溶解することができる液であれば制限なく使用することができる。具体的には、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス／塩酸緩衝液、水、これらの緩衝液または水と、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベンゼン、アセトン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランとの混合液が挙げられる。例えば有機溶媒が０．１〜４０体積％の混合液などが挙られる。
【００４４】
本発明の高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体の生物学的に特異的な結合を有する物質が抗体の時は、本発明の測定試薬を用いて被検物質を測定するために、従来の酵素で標識した抗体または抗原の代わりに本発明の測定試薬を用いて、公知の酵素免疫測定法により行うことができる。すなわち、被検物質となる免疫学的活性物質を含む検体と、本発明の高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体を接触させ、検体中の被検物質と本発明の測定試薬中の高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体とを抗原抗体反応させた後、得られる抗原抗体反応生成物を酵素の活性を利用して測定する。これにより被検物質の定量または定性を行うことができる。
【００４５】
抗原抗体反応を行う際の、高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体の濃度は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．１１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、反応温度は０〜７０℃、好ましくは免疫学的活性物質が失活しない４〜４０℃、反応系のｐＨは２〜１３、好ましくは４〜１１とするのが望ましい。反応時間は０．１分間〜１６時間、好ましくは１分間〜２時間とするのが望ましい。
【００４６】
反応媒体としては、本発明の測定試薬を溶液状態の試薬にする場合に使用する媒体として例示した前記緩衝液、水またはこれらと有機溶媒との混合液と同様の物が使用できる。また反応系には、本発明の測定試薬に添加することができる添加剤と同様の添加剤を添加することができる。
【００４７】
抗原抗体反応生成物を酵素の活性を利用して測定するには、従来の酵素免疫測定法と同様に、使用した酵素に応じた種々の方法を採用することができる。通常は、酵素の基質を加えて酵素基質反応を進行させ、生成した生成物を測定する方法が採用される。具体的な方法としては、例えば吸光度法、蛍光法、化学発光法などの方法が採用できる。酵素の基質としては、従来の酵素免疫測定法または酵素検出に用いることができる基質を使用することが可能であり、例えばペルオキシダーゼの基質としては１，２−フェニレンジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンなど、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、２−ニトロフェニル・β−Ｄ−ガラクトシド、４−ヒドロフェニル酢酸、４−メトキシ−４−（３−ガラクトジドフェニル）スピロ（１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン）二ナトリウム塩、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、４−メチルウムベリフェリル・β−Ｄ−ガラクトシド、アルカリ性ホスファターゼの基質としては、４−ニトロフェニルホスフェート、４−メチルウムベリフェリル・ホスフェート、４−メトキシ−４−（３−フォスフェートフェニル）スピロ（１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン）二ナトリウム塩などを挙げることができる。
【００４８】
本発明の免疫学的活性物質の測定方法を、従来の酵素免疫測定法において広く利用されているタイタープレートを用いた場合について図１に示した工程により具体的に説明する。
図１は本発明の測定方法を模式的に表したもので通常的に酵素免疫測定法で使用されるタイタープレート、例えば、市販されているポリスチレン製のＭａｘｉｓｏｒｐ Ｆ−９６（ＮＵＮＣ社、商品名）タイタープレートを用いてＳ１〜Ｓ４の４段階の工程を経て行われる。
（１）まず、タイタープレートの各ウエルに抗（測定対照物）抗体を加え、タイタープレート上に抗（測定対照物）抗体を物理吸着により固定する。（Ｓ１）
（２）次に、比検物質となる測定対象物質を含む検体をそのまま、または適当な溶媒で希釈して加え、抗原抗体反応により抗原抗体複合体を形成させる。（Ｓ２）
（３）次に、抗（測定対照物）抗体と酵素からなる高分子／酵素／抗体結合体を含む本発明の高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質を加え、抗原抗体複合体と高分子／酵素／抗体結合体を反応させる。これにより抗原抗体・高分子／酵素／抗体結合体の複合体を生成させる。（Ｓ３）
（４）次に、未反応の抗原抗体・高分子／酵素／抗体複合体を洗浄により除去した後、この酵素に対する基質を大過剰に加え、酵素より基質から生成物を生成ささせる。（Ｓ４）この酵素基質反応により生成物を、例えば、吸光度法、蛍光法、化学発光等の方法により測定する。
この場合、単位抗（測定対象物）抗体に対する酵素量は、酵素を高分子に結合させない従来の試薬を用いた場合に比べて、多くなり、このため生成物の量が増加する。したがって、例えば、測定吸光度が高くなり、高感度のの測定ができるようになる。なお、予め既知量の測定対象物を用いて前記手順と同様にして測定し、これにより作成した検量線と対比することにより検体中の測定対象物を定量することができる。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の高分子／酵素結合体は、ホスホリルコリン類似基に由来するＮ＋基とＯ−基の双極子を有するため、水溶液で安定である。
また、本発明の高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体は、非特異的な吸着も低く安定な結合体である。その結合体は１分子中に含まれる酵素量が通常の酵素標識抗体に比較すると多いため、本発明の高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体を含む測定試薬として医用関係等の検査において有用である。その測定試薬を用いる測定方法は、免疫学的活性物質の測定を行うことにより、短時間で高感度な測定が可能となる。
前記のように、本発明の免疫学的活性物質の測定方法は、単位比検物質に結合する酵素量が従来の方法に比べて多くなるため、単位時間当たりの基質から生成する生成物の量が多くなり、これにより測定吸光度が高くなって高感度で測定することができる。他の酵素活性測定法を採用した場合にも、同様に高感度で測定することができる。このため、本発明の免疫学的活性物質の測定方法は、従来の酵素免疫学的測定法では測定できなかった低濃度の被検物質を測定することもできる。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例によって詳細に説明する。
尚、測定方法は以下に示した。
Ａ−１．高分子の分子量測定−１；
得られた共重合体水溶液を０．５重量％になるよう蒸留水で希釈し、この溶液を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過し、試験溶液とした。
ＧＰＣ分析は、カラムとしてはＧ３０００ＰＷ_XL×２本（東ソー社製）を、溶出溶媒としては蒸留水を、標準物質としてはポリエチレングリコール（ポリマー・ラボラトリー社製）を、検出は視差屈折計を、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、東ソー社製インテグレーター内蔵分子量計算プログラム（ＳＣ−８０２０用ＧＰＣプログラム）を用いて、流速は１．０ｍＬ／分、試料溶液使用量は１００μＬ、カラム温度４０℃で求めた。
【００５１】
Ａ−２．高分子の分子量測定−２；
プロピオン酸０．３６９ｇに、 ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦと略記する）に溶解した０．２ｇ／ｍＬのプロピオン酸コハク酸イミドエステルをＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール溶液４８４５μＬを加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＤＭＦに溶解した０．２ｇ／ｍＬのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド溶液３４４０５μＬを加え室温で３時間インキュベートすることにより、プロピオン酸コハク酸イミド溶液を調製した。１重量％の各重合体水溶液１．０ｍＬに、先に調製したプロピオン酸コハク酸イミド溶液１２００μＬを加え、４℃で一晩インキュベートした。インキュベート終了後、この溶液を透析膜（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ社製、商品名「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ／ｐｏｒ．ｍｅｍｂｒａｎｓ Ｍｗ ＣＯ，６０００〜８０００」）に挿入し、溶液の１０倍の体積の蒸留水を用いて透析操作を行い、１日１回の蒸留水交換を３日間続けることによって精製を行い、精製終了後、各溶液を凍結乾燥した。このプロピル化した各重合体粉末を０．５重量％の塩化リチウムを含むクロロホルム：メタノール＝６：４（Ｖ／Ｖ）に溶解させて、０．５重量％の重量体溶液を調製した。更に、この溶液を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過し、試験溶液とした。
ＧＰＣ分析は、ＭＩＸＥＤ−Ｃ（２本）（ポリマーラボラトリーズ社製）を、溶出溶媒としては０．５重量％の塩化リチウムを含むクロロホルム：メタノール＝６：４（Ｖ／Ｖ）を、標準物質としてはポリメチルメタクリレート（ポリマー・ラボラトリー社製）を、検出は視差屈折計を、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量測定（Ｍｎ）、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は東ソー社製インテグレーター内蔵分子量計算プログラム（ＳＣ−８０２０用ＧＰＣプログラム）を用いて、流速は１．０ｍＬ／分、試料溶液使用量は１００μＬ、カラム温度４０℃で求めた。
【００５２】
Ｂ．共重合体組成比の測定；
得られた重合体溶液を凍結乾燥し重合体粉末を得た。得られた粉末２０ｍｇを重水（Ｄ２Ｏ）１．５ｍＬに溶解させた。得られた重水溶液を日本電子（株）製ＪＮＭ−ＥＸ２７０を用いて¹Ｈ−ＮＭＲ分析を行い、親水性単量体、と酵素が化学結合可能な官能基を有する単量体とのモル比を求めた。
【００５３】
Ｃ．高分子／酵素結合体および、高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体の溶解性および、分子量測定；
得られた高分子／酵素結合体溶液あるいは、高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体溶液を、室温にて１６時間放置後、目視にて沈殿の有無を確認した。
また、得られた高分子／酵素結合体溶液あるいは、高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体溶液を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過した後に、２ｍｇ／ｍＬになるようダルベッコウのリン酸生理的緩衝溶液（以下、ＰＢＳと略記する）で希釈し試験溶液とした。
ＧＰＣ分析は、カラムとしてはＧ４０００ＳＷ_XL×１本（東ソー社製）を、溶出溶媒としては０．３Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を、標準物質としてはチログロブリン（分子量＝６６．９万）、フェリチン（分子量＝４４万）、マウスＩｇＧ（分子量１６万）、西洋ワサビ過酸化酵素（分子量＝４万）、キモトリプシノーゲンＡ（分子量＝２．５万）を、検出はＵＶ検出（２８０ｎｍ）を、流速は０．５ｍＬ／分、試料溶液使用量は４００μＬ、カラム温度３５℃で求めた。
【００５４】
Ｄ．高分子／酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質結合体の酵素／生物学的に特異的な結合を有する物質の結合割合；
酵素が西洋ワサビ過酸化酵素で、生物学的に特異的な結合を有する物質が抗（４−ヒドロキシノネナール）マウス抗体である時は、測定波長が４０３ｎｍで行う以外は、前記Ｃの分子量測定と同様に分析を行い。２８０ｎｍのピーク面積（Ａ₂₈₀）と４０３ｎｍのピーク面積（Ａ₄₀₃）を求め、下記式より西洋ワサビ過酸化酵素／抗（４−ヒドロキシノネナール）マウス抗体（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を求めた。
西洋ワサビ過酸化酵素／抗（４−ヒドロキシノネナール）マウス抗体（ｍｏｌ／ｍｏｌ）＝２．４６×Ａ₄₀₃／（Ａ₂₈₀−０．３１×Ａ₄₀₃）
【００５５】
Ｅ．高分子／酵素／抗体結合体の精製および抗原の測定；
前記Ｃの分子量分析時に、溶出時間１０分〜１５分の溶出液を分取することにより、高分子／酵素／抗体結合体を精製した。
１ｍｍｏｌを４−ヒドロキシノネナール（カイマンケミカル社製）、１ｍｇ／ｍＬ卵白アルブミンのＰＢＳ溶液に添加して３７℃、２時間反応させた。この反応液をＰＢＳにて１００倍に希釈したものをタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６、ＮＵＮＣ社製、商標）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して、２５℃、２時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＰＢＳ で５回洗浄した後に、０．５重量％卵白アルブミンを含むＰＢＳ溶液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して、２５℃、２時間インキュベートした。インキュベート終了後、０．５重量％卵白アルブミンを含むＰＢＳ溶液を除去することにより、４−ヒドロキシノネナール固定化タイタープレート（固定化プレート）を調製した。タイタープレートに、０．５重量％卵白アルブミンを含むＰＢＳ溶液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して、２５℃、２時間インキュベートし、インキュベート終了後、０．５重量％卵白アルブミンを含むＰＢＳ溶液を除去することにより、未固定化タイタープレート（ブランクプレート）を調製した。
前記の方法で精製した高分子／酵素／抗体結合体溶液を、０．５重量％卵白アルブミンを含むＰＢＳ溶液にて１００倍に希釈したものを、前記固定化プレートおよび、前記ブランクプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して、２５℃、２時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＰＢＳ で５回洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発色キットＳＵＭＩＬＯＮ−Ｔ（住友ベークライト社製、商標）を用いて発色させ（酵素−基質反応は、２５℃、２０分間で行い）、
［固定化プレートの吸光度］−［ブランクプレートの吸光度］＝［差吸光度］を求めた。
【００５６】
Ｆ．高分子／酵素／ビオチンの測定；
１０μｇ／ｍＬのアビジン標識抗マウス抗体のＰＢＳ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して、２５℃、２時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＰＢＳ で５回洗浄した後に、０．５重量％卵白アルブミンを含むＰＢＳ溶液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して、４℃、１６時間インキュベートした。インキュベート終了後、０．５重量％卵白アルブミンを含むＰＢＳ溶液を除去することにより、アビジン標識抗体固定化プレート（固定化プレート）を調製した。タイタープレートに、０．５重量％卵白アルブミンを含むＰＢＳ溶液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して、２５℃、２時間インキュベートし、インキュベート終了後、０．５重量％卵白アルブミンを含むＰＢＳ溶液を除去することにより、未固定化タイタープレート（ブランクプレート）を調製した。
前記の方法で精製した高分子／酵素／ビオチン結合体溶液を、０．５重量％卵白アルブミンを含むＰＢＳ溶液にて１０００倍に希釈したものを、前記固定化プレートおよび、前記ブランクプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して、２５℃、２時間インキュベートした。インキュベート終了後、 ＰＢＳ で５回洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発色キットＳＵＭＩＬＯＮ−Ｔ（住友ベークライト社製、商標）を用いて発色させ（酵素−基質反応は、２５℃、３０分間で行い）、［固定化プレートの吸光度］−［ブランクプレートの吸光度］＝［差吸光度］を求めた。
【００５７】
合成例１；ＭＰＣ／メタクリル酸共重合体（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ））の合成−１；
モノマーとして、ＭＰＣ １６．２ｇおよび、メタクリル酸（以下ＭＡと略記する）０．５３ｇを、開始剤として、ＰＲ−ＳＡ ０．３５１ｇを、重合溶媒として蒸留水 ４２．９１９ｇを重合管にとり、均一に溶解させた。この溶液にアルゴンを１０分間吹き込み、封管した。封管終了後７０℃で、６時間重合反応を行った。重合反応終了後、室温に冷却し、重合管を開封した後に、この溶液を透析膜（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ社製、商品名「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ／ｐｏｒ．ｍｅｍｂｒａｎｓ Ｍｗ ＣＯ， ６０００〜８０００」）に挿入し、重合溶液の１０倍の体積の蒸留水を用いて透析操作を行い、１日１回の蒸留水交換を７日間続けることによって透析を行って、未反応のモノマーおよび開始剤を除去することにより、共重合体を精製した。得られた共重合体の分子量測定は前記の分子量測定−１を用いた。分子量測定および、共重合体組成比の結果は表１に示した。
【００５８】
合成例２〜５； ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）の合成−２〜５
モノマー組成を表１に示したように変えた以外は合成例１と同様にして、重合し、精製して共重合体を得た。結果を表１に示した。
【００５９】
合成例６；ＭＰＣ／２−アミノエチルメタクリレート共重合体（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）の合成−１
モノマーとして、ＭＰＣ、１．９８ｇおよび、２−アミノエチルメタクリレート・塩酸塩（以下ＡＥＭＡと略記する）、０．１２ｇを、開始剤として、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下Ｖ−５０と略記する）、０．４０７ｇを、重合溶媒として蒸留水、１２．４９３ｇを重合管にとり、均一に溶解させた。この溶液にアルゴンを１０分間吹き込み、封管した。封管終了後６０℃で、８時間重合反応を行った。重合反応終了後、室温に冷却し、重合管を開封した後に、この溶液を透析膜（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ社製、商品名「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ／ｐｏｒ．ｍｅｍｂｒａｎｓ Ｍｗ ＣＯ， ６０００〜８０００」）に挿入し、重合溶液の１０倍の体積の蒸留水を用いて透析操作を行い、１日１回の蒸留水交換を７日間続けることによって透析を行って、未反応のモノマーおよび開始剤を除去することにより、共重合体を精製した。得られた共重合体の分子量測定は前記の分子量測定−２を用いた。分子量および、共重合体組成比の結果は表２に示した。
【００６０】
合成例７〜１０； ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）の合成−２〜５
モノマー組成を表２に示したように変えた以外は合成例６と同様にして、重合し、精製して共重合体を得た。結果を表２に示した。
【００６１】
【表１】

【００６２】
【表２】

【００６３】
なお、表１および２中のＭｎは数平均分子量をＭｗは重量平均分子量を示す。
【００６４】
実施例１〜５；ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）／ＨＲＰ結合体の調製；
１．０ｍｇ／ｍＬの西洋ワサビ過酸化酵素｛和光純薬工業（株）製、以下、ＨＲＰと略す。｝と、１７．５ｍｇ／ｍＬの合成例１〜５で合成したｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）を溶解させた１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）溶液１０００μＬに、１００ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩｛（株）同仁化学製、以下、ＷＳＣと略記する。｝を溶解させた１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）溶液を４８０μＬ添加して、２５℃で１時間反応させた。その後更に、１００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣを解させた１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）溶液を４８０μＬ添加して、２５℃で６時間反応させた。反応終了後、１ＬのＰＢＳに対する透析（４℃、６時間）を３回繰り返すことにより、未反応のＷＳＣを除去した。前記測定法Ｃに従い溶解性および、分子量測定を行った。測定結果は表３に示した。
【００６５】
実施例６〜１０；ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）／ＨＲＰ結合体の調製
８．０ｍｇ／ｍＬのＨＲＰを溶解させた蒸留水２３．８ｍＬに、０．２Ｍの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を４７６０μＬ添加して、室温で２０分間反応させた。反応終了後、反応液を２Ｌの１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対しての透析（４℃、１２時間）を２回繰り返すことにより、未反応の過ヨウ素酸ナトリウムの除去を行った。透析終了後、０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を４７６μＬ添加した（ＨＲＰ溶液−１）。添加後速やかに、３０００μＬのＨＲＰ溶液−１に、合成例６〜１０で合成した６ｍｇ／ｍＬのｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）を溶解させた１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）３０００μＬを添加して、室温で２時間反応させた。反応終了後、氷冷しながら４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム水溶液を３００μＬ 添加して、４℃、２時間反応させた。反応終了後、１ＬのＰＢＳに対する透析（４℃、６時間）を３回繰り返すことにより、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去した。前記測定法Ｃに従い溶解性および、分子量測定を行った。測定結果は表３に示した。
【００６６】
比較例１；ｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌｙｓ）／ＨＲＰ結合体の調製
実施例６のｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）の代わりに、ポリ−Ｌ−リジン・臭酸塩（重量平均分子量＝１９２００）（以下、 ｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌｙｓ）と略記する。）を用いた以外は実施例６と同様に行った。測定結果は表３に示した。
【００６７】
【表３】

【００６８】
なお表中、
*1；チログロブリンより高分子側で、排除体積付近に結合体のピークが確認された。
*2；排除体積付近からHRP付近までのなだらかな結合体のピークが確認された。
【００６９】
実施例１１〜２０；高分子／ＨＲＰ／ＩｇＧ結合体
０．４ｍｇ／ｍＬの抗（４−ヒドロキシノネナール）マウス抗体（以下ＩｇＧと略記する。）を溶解させた１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１０００μＬに、０．０１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を２００μＬ添加して、室温で２０分間反応させた。反応終了後、反応液を５００ｍＬの１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対しての透析（４℃、１２時間）を２回繰り返すことにより、未反応の過ヨウ素酸ナトリウムの除去を行った。透析終了後、０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を２０μＬ添加した（ＩｇＧ溶液−１）。添加後速やかに、１０００μＬの実施例１〜１０で調製したＨＲＰ濃度が２．０ｍｇ／ｍＬの高分子／ＨＲＰ結合体を溶解させた１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を添加して、室温で２時間反応させた。反応終了後、氷冷しながら４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム水溶液を３００μＬ 添加して、４℃、２時間反応させた。反応終了後、５００ｍＬのＰＢＳに対する透析（４℃、６時間）を３回繰り返すことにより、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去した。
前記測定法Ｃおよび、Ｄに従い溶解性および、分子量測定、ＨＲＰ／ＩｇＧ結合割合の分析を行った。測定結果は表４に示した。また、前記のＥに従い、高分子／酵素／抗体結合体の精製および抗原の測定を行い結果を表４に示した。
【００７０】
比較例２；ＨＲＰ／ＩｇＧ結合体
実施例１１の実施例１で調製したＨＲＰ濃度が２．０ｍｇ／ｍＬの高分子／ＨＲＰ結合体を溶解させた１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）の代わりに、２．０ ｍｇ／ｍＬのＨＲＰを溶解させた１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた以外は実施例１１と同様に行った。測定結果を表４に示した。
【００７１】
【表４】

【００７２】
なお表中
*1；チログロブリンより高分子側で、排除体積付近に結合体のピークが確認された。
*2；未反応のHRPとほぼ同じ位置にピークが確認された。
【００７３】
実施例２１〜３０；高分子／ＨＲＰ／ビオチン結合体
１０００μＬの実施例１〜１０で調製したＨＲＰ濃度が２．０ｍｇ／ｍＬの高分子／ＨＲＰ結合体を溶解させたＰＢＳ溶液に１．０ｍｇ／ｍＬのＮ−スクシンイミジル Ｄ−ビオチン（（株）同仁化学製）をジメチルスルオキシド溶液を５μＬ添加し、４℃、１６時間反応させた。反応終了後、５００ｍＬのＰＢＳに対する透析（４℃、６時間）を３回繰り返すことにより、未反応のＮ−スクシンイミジル Ｄ−ビオチンを除去した。
前記測定法Ｆに従い測定を行い結果を表５に示した。
【００７４】
比較例３；ＨＲＰ／ビオチン結合体
実施例２１の実施例１で調製したＨＲＰ濃度が２．０ｍｇ／ｍＬの高分子／ＨＲＰ結合体を溶解させたＰＢＳ溶液の代わりに、２．０ ｍｇ／ｍＬのＨＲＰを溶解させたＰＢＳ溶液を用いた以外は実施例２１と同様に行った。測定結果を表５に示した。
【００７５】
【表５】

【００７６】
以上の結果から、表３より、ｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌｙｓ）／ＨＲＰ結合体は不溶性であり、可溶性各画の分子量分析を行うと、殆ど高分子化は起きていなかった。一方、ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）−１〜ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）−５および、ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）−１〜ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）−５を用いた高分子／ＨＲＰ結合体は、可溶性であり巨大分子であることが確認された。
また、表４より、ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）−１〜ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）−５および、ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）−１〜ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）−５を用いた高分子／ＨＲＰ／ＩｇＧ結合体は、可溶性であり巨大分子であることが確認された。また、これら高分子／ＨＲＰ／ＩｇＧ結合体を用いることにより、高分子を用いないＨＲＰ／ＩｇＧ結合体と比較すると、差吸光度が１．９倍〜３５．５倍になり、高感度な測定が可能となったことが確認された。
さらに表５より、ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）−１〜ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）−５および、ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）−１〜ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）−５を用いた高分子／ＨＲＰ／ビオチン結合体を用いることにより、高分子を用いないＨＲＰ／ビオチン結合体と比較すると、差吸光度が１．８倍〜３５．８倍になり、高感度な測定が可能となったことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の免疫学的活性物質の高分子／酵素／生物化学的に特異的な結合を有する物質結合体を使用する場合の概要の工程図である。
【図２】図２は実施例１〜１０（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）−１／ＨＲＰ〜ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）−５／ＨＲＰおよび（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）−１／ＨＲＰ〜（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）−５／ＨＲＰのなかの実施例３（ｐｏｌｙ−ｃｏ−ＭＡ）−３／ＨＲＰおよび実施例８（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ）−ｃｏ−ＡＥＭＡ−３／ＨＲＰと、比較例１（ｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌｙｓ）／ＨＲＰの分子量測定結果（ＧＰＣの溶出曲線）を示した。
【図３】図３は実施例１１〜２０（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）−１／ＨＲＰ／ＩｇＧ〜ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＭＡ）−５／ＨＲＰ／ＩｇＧおよび（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）−１／ＨＲＰ／ＩｇＧ〜（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＡＥＭＡ）−５／ＨＲＰ／ＩｇＧと、比較例２、ＨＲＰ／ＩｇＧの分子量測定結果（ＧＰＣの溶出曲線）を示した。
【符号の説明】
１．チログロブリン（分子量６６．９万）
２．フェリチン （分子量４４万）
３．マウスＩｇＧ （分子量１６万）
４．ＨＲＰ （分子量４万）
５．キモトリプシノーゲンＡ（分子量２．５万）[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention uses a polymer / enzyme conjugate, a substance conjugate having a polymer / enzyme / biologically specific bond, an immunologically active substance measuring reagent containing the conjugate, and this reagent. The present invention relates to a method for measuring an immunologically active substance. The reagent for measuring an immunologically active substance of the present invention is used for quantification or qualification of an immunologically active substance (antigen or antibody) in the field of clinical examination or the like.
[0002]
[Prior art]
In recent years, immunologically active substances such as proteins that appear in the living body in association with various diseases have been widely used to detect and utilize for immune diagnosis (antigen-antibody reaction). Measurement methods using such antigen-antibody reaction include radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (FIA), latex turbidimetry, and immunoturbidimetry (TIA). Various methods have been developed.
[0003]
The enzyme immunoassay is a method for measuring an antigen (or antibody) as a test substance using an enzyme-labeled antibody (or antigen), and an enzyme-labeled antibody (or an antigen-antibody reaction) bound to the test substance by an antigen-antibody reaction. In this method, the amount of the enzyme-labeled antigen) is measured by measuring enzyme activity. Such enzyme immunoassay is safe because it does not use a radioactive label, and is widely used for reasons such as excellent quantitativeness.
[0004]
In recent years, more and more sensitive immunoassays have been demanded, and improvements have been made in enzyme immunoassays. For example, washing after adding the specimen to the immobilized antibody, then washing after adding the biotin-labeled antibody, then 1) washing after adding the avidin-labeled enzyme, and then adding the enzyme substrate, 2) It is known to wash after adding abitin, then wash after adding biotin-labeled enzyme, and then add the substrate of the enzyme {"Enzyme immunoassay", edited by Eiji Ishikawa and Kawai Tadashi, Kiyoshi Miyai, published in 1987; Medical School, Inc.}. However, these methods are more sensitive than conventional enzyme immunoassay methods using enzyme-labeled antibodies, but are not yet sensitive enough to measure analytes containing smaller amounts of immunologically active substances. There are problems such as.
[0005]
Further, when 2- (methacryloyloxy) ethyl-2′-trimethylammonio) ethyl phosphate ((hereinafter abbreviated as MPC) = 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) polymer and protein coexist, No change in secondary structure and tertiary structure, but when compared with the case where polyethylene glycol (PEG) and protein coexist, PEG can change secondary structure and tertiary structure in a short time. Already known (Medical Equipment Research Institute Report, Vol. 31, 1997, published by Tokyo Medical and Dental University), ie, modifying a water-soluble polymer such as PEG having a functional group capable of chemically bonding to an enzyme Even so, its solubility is low, non-specific adsorption to containers, etc., or the structure of the enzyme is changed. (Reducing enzyme activity) is a problem.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
A first object of the present invention is to provide a polymer / enzyme conjugate for performing highly sensitive measurement in an enzyme immunoassay.
The second object of the present invention is to provide a polymer / enzyme conjugate / substance conjugate having a biologically specific bond for highly sensitive measurement in enzyme immunoassay.
A third object of the present invention is to provide an immunologically active substance measuring reagent corresponding to a polymer / enzyme conjugate / substance conjugate having a biologically specific bond in an enzyme immunoassay. is there.
The fourth object of the present invention is to provide a method for measuring this immunologically active substance.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of studying the above problems, the present inventors are capable of enzymatic chemical bonding formed by polymerizing a hydrophilic monomer having a specific group and a monomer composition containing a functional group to which the enzyme can chemically bond. It has been found that a polymer / enzyme conjugate can be obtained by chemically bonding a polymer and an enzyme, and further, a polymer / enzyme / obtained by chemically bonding a substance having a biologically specific bond. The inventors have found that a substance conjugate having a biologically specific bond can be obtained, and obtained the knowledge that it is useful as a label for an excellent enzyme immunoassay, thereby completing the present invention.
That is, according to the present invention, the following inventions (1) to (9) are provided.
(1) A polymer / enzyme conjugate obtained by chemically bonding a polymer having a group capable of chemically bonding to a phosphorylcholine-like group and an enzyme.
(2) The following general formula [I]
[0008]
[Chemical 6]

[0009]
(However, R in the formula ¹ , R ² And R ^Three Represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and may be the same or different groups. n is an integer of 2-4. )
A hydrophilic monomer (a1) having a group represented by the formula: ^Four A polymer obtained by polymerizing a monomer composition containing a monomer (a2) containing an enzyme and obtained by chemically bonding an enzyme and a polymer capable of being chemically bonded.
General formula [II]
[0010]
[Chemical 7]

[0011]
(Where E is a residue of the enzyme, Y1 is a functional group in the enzyme and R ^Four A group formed from the functional group of a, a is 0 or 1, and b is a number of 1 or more. )
A polymer / enzyme conjugate having a group represented by:
(3) The hydrophilic monomer (a1) is represented by the following general formula [III]
[0012]
[Chemical 8]

[0013]
Is a hydrophilic monomer represented by
Functional group capable of chemically binding proteins -R ^Four A monomer (a2) having the formula: -R ^Four Wherein the polymer / enzyme conjugate is a monomer having a functional group of any one of a carboxyl group, an amino group and a hydroxyl group.
(4) Functional group capable of chemically bonding -R ^Four The polymer / enzyme conjugate as described above, wherein the monomer containing is methacrylic acid or 2-aminomethyl methacrylate.
(5) The polymer / enzyme conjugate as described above, wherein the enzyme of the polymer / enzyme conjugate is an enzyme for measuring an immunologically active substance.
(6) Functional group -R capable of chemically binding a substance having an unreacted biologically specific bond of a polymer / enzyme conjugate ^Four Or a functional group capable of chemically bonding an enzyme of a polymer / enzyme conjugate -R ^Five In addition, the compound represented by the general formula [IV] obtained by further chemically bonding a substance having a biologically specific bond.
[0014]
[Chemical 9]

[0015]
(Where A is a residue of a substance having a biologically specific bond, Y ² Is a functional group in a substance having a biologically specific bond and said -R ^Four Or -R ^Five A group formed from the above functional group, c is 0 or 1, and d is a number of 1 or more. )
A substance conjugate having a macromolecule / enzyme / biologically specific bond having a group represented by:
(7) A substance having a biologically specific bond to the polymer / enzyme conjugate is converted into an unreacted functional group -R ^Four And a functional group capable of chemically binding an enzyme of a polymer / enzyme conjugate -R ^Five And the general formula [IV] obtained by further chemical bonding
[0016]
[Chemical Formula 10]

[0017]
(Where A is a residue of a substance having a biologically specific bond, Y ² Is a functional group in a substance having a biologically specific bond and said -R ^Four Or -R ^Five A group formed from the above functional group, c is 0 or 1, and d is a number of 1 or more. )
A substance conjugate having a macromolecule / enzyme / biologically specific bond having a group represented by:
(8) The above-mentioned macromolecule / enzyme / substance-binding substance having a biologically specific bond, wherein the substance having a biologically specific bond is any substance of an antibody, biotin, avidin or antigen. .
(9) An immunologically active substance measuring reagent comprising the polymer / enzyme / substance conjugate having a biologically specific bond.
(10) A substance having biologically specific binding to a test substance in a specimen by contacting a specimen containing the immunologically active substance as a test substance with the immunologically active substance measurement reagent. And measuring the obtained reaction product using an enzyme reaction.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The polymer having a chemically bondable group used in the present invention includes the monomer having the phosphorylcholine-like group of the general formula [I] and the chemically bondable functional group -R. ^Four It is a polymer obtained by polymerizing a composition with a monomer having a group. This polymer is -R ^Four It means that it can be chemically bonded to an enzyme via a group and chemically bonded to a protein such as an antigen or a substance having a biologically specific bond.
The hydrophilic monomer (a1) constituting the polymer is a monomer having a polymerizable double bond in the molecule and further having a group represented by the general formula [I].
Specifically, examples of such compounds include 2- (meth) acryloyloxyethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 3- (meth) acryloyloxypropyl-2 ′-(triethylammonio). ) Ethyl phosphate, 4- (meth) acryloyloxybutyl-2 ′-(triethylammonio) ethyl phosphate, 5- (meth) acryloyloxypentyl-2 ′-(triethylammonio) ethyl phosphate, 6- (meth) acryloyl Oxyhexyl-2 ′-(triethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxyethyl-2 ′-(triethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxyethyl-2 ′-(tripropylammoni) E) Ethyl phosphate, 2- ( (Meth) acryloyloxyethyl-2 '-(tributylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxypropyl-2'-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxybutyl-2 '-( Trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxypentyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxyhexyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- ( Vinyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (allyl oiloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (p-vinylbenzyloxy) ethyl-2 ′-( Trimethylammonio) Ethi Phosphate, 2- (styryloxy) ethyl-2 '-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (vinyloxycarbonyl) ethyl-2'-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (allyloxycarbonyl) ethyl- 2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (acryloylamino) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (vinylcarbonylamino) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (allyloxycarbonylamino) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (buteroyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, 2- (crotonoyloxy) ethyl-2 ′ -(Trimethylammo E) Ethyl phosphate, ethyl- (2'-trimethylammonioethyl phosphorylethyl) fumarate, butyl- (2'-trimethylammonioethyl phosphorylethyl) fumarate, hydroxyethyl- (2'-trimethylammonioethyl phosphorylethyl) fumarate Etc.
Preferably, in view of availability, 2- (methacryloyloxy) ethyl-2′-trimethylammonio) ethyl phosphate ((hereinafter abbreviated as MPC) = 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine represented by the above formula [III] ).
[0019]
Functional group -R of the monomer used as a constituent component of the polymer of the present invention capable of chemically bonding with an enzyme ^Four As, for example, carboxyl group, amino group, hydroxyl group, aldehyde group, mercapto group, succinimidyloxycarbonyl group, imide ester group, halogenonitrile group, halogenosulfonyl group, nitroazide phenyl group, diazotrifluoroacetyl group, Isocyanate groups are listed. Among these, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, an isocyanate group, and the like that can easily react with an amino group in an enzyme or an aldehyde group generated by opening a sugar chain in the enzyme are more preferable.
[0020]
Functional group capable of chemically bonding with an enzyme -R ^Four The monomer (a2) having a group has a polymerizable double bond in the molecule, and a group (-R ^Four ). Specific examples of such compounds include styrene carboxylic acid, (meth) acrylic acid, 3-pentenoic acid, 4-pentenoic acid, 3-allyloxypropionic acid, and 2- (meth) acryloyloxyethyl succinic acid. , Monomers having a carboxyl group such as 2- (meth) acryloyloxyethylphthalic acid, or allylamine (hydrochloride), aminoethyl (meth) acrylate (hydrochloride), 2-methylallylamine, 4-aminostyrene A monomer having an amino group such as (meth) acrylic acid chloride, (meth) acryloyl isocyanate, (meth) acryloyloxyethyl isocyanate, a monomer having a group reactive with an enzyme, 2-hydroxyethyl ( Hydroxy acids such as (meth) acrylate and 2-hydroxyethyl (meth) acrylamide Such a monomer having the like.
[0021]
Especially, as a combination with a hydrophilic monomer (a1), the combination of aminoethyl (meth) acrylate (hydrochloride) and said MPC is mentioned preferably.
[0022]
The content ratio of the hydrophilic monomer (a1) in the monomer composition is preferably 5 to 95% by weight, particularly preferably 10 to 90% by weight, based on all monomers in the monomer composition. . If it is less than 5% by weight, the solubility of the obtained polymer / enzyme conjugate in various water-soluble solvents such as various buffer solutions, various physiological saline solutions, or various culture solutions is not preferable. On the other hand, a functional group -R that can be chemically bonded to an enzyme ^Four The content ratio in the monomer composition containing the monomer (a2) having a content of 5 to 95% by weight, particularly preferably 10 to 90% by weight, based on all monomers. If the amount is less than 5% by weight, the amount of chemically bound enzyme decreases, and the sensitivity of immunologically active substance measurement is not so high, which is not preferable.
[0023]
In the present invention, the polymer capable of enzymatic chemical bonding is a polymer obtained by polymerizing the monomer composition. The weight average molecular weight of the polymer is not particularly limited, but is preferably 1,000 to 5,000,000, more preferably 10,000 to 500,000.
[0024]
The enzyme-chemically bondable polymer may be prepared by using the monomer composition by using a known method such as solution polymerization, bulk polymerization, emulsion polymerization, suspension polymerization, or the like. For example, it can be prepared by a method of radical polymerization under conditions of substitution with nitrogen, carbon dioxide or helium or in an atmosphere and a polymerization temperature of 0 to 100 ° C. and a polymerization time of 10 minutes to 48 hours. In the polymerization, a radical polymerization initiator can be used. Examples of the polymerization initiator include 2,2′-azobis (2-amidinopropyl) dihydrochloride, 4,4′-azobis (4-cyanovaleric acid), 2,2′-azobis (2- (5-methyl). -2-imidazolin-2-yl) propane) dihydrochloride, 2,2'-azobisisobutyramide dihydrate, 2,2'-azobisisobutyronitrile, ammonium persulfate, potassium persulfate, peroxidation Benzoyl, diisopropyl peroxydicarbonate, t-butylperoxy-2-ethylhexanoate, t-butylperoxypivalate (manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd., trade name “Perroyl-SA”, hereinafter abbreviated as PR-SA), t-butylperoxydiisobutyrate, lauroyl peroxide, azobisisobutyronitrile, 2,2′-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile), t-butyl Le oxy neodecanoate, and the like. Furthermore, these radical polymerization initiators can be used singly or as a mixture of two or more.
The polymerization initiator may be used in combination with various redox accelerators. As for the usage-amount of a polymerization initiator, 0.01-5.0 weight part is preferable with respect to 100 weight part of monomer compositions.
[0025]
The polymer can be purified by a general purification method such as a reprecipitation method, a dialysis method, or an ultrafiltration method.
[0026]
As the enzyme used in the present invention, an enzyme conventionally used in enzyme immunoassay can be used. Examples thereof include acetylcholinesterase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucoamylase, glucose oxidase, penicillinase, peroxidase, lysozyme and the like. Among these, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, peroxidase and the like that are generally used in enzyme immunoassay are desirable.
In addition, these enzymes include -R in a polymer to which the enzyme can bind. ^Four Have a reactive group such as a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, or an aldehyde group in which various sugar chains are opened.
[0027]
An enzyme as described above, a hydrophilic monomer (a1) having a group represented by the general formula [I], and a monomer (a2) having a functional group -R4 to which the enzyme can chemically bond. Reacting a polymer capable of enzymatic chemical bonding formed by polymerizing the monomer composition, that is, the functional group in the enzyme and -R in the polymer. ^Four Is reacted to obtain a polymer / enzyme conjugate having a group represented by the above general formula [II].
[0028]
Here, in the general formula [II], Y ¹ Is a group (bond) formed from a functional group in the enzyme and —R 4 in the polymer capable of enzymatic chemical bonding. Specifically, for example, amide group, dicarbamide group, urea bond, disulfide bond , Imide acid amide bond, 3-thiosuccinimide bond (bond formed by reaction of thiol group with maleimide group), reduction of amino group reacting with aldehyde group formed by ring-opened sugar chain Examples include linking groups.
[0029]
In the general formula [II], b is a number of 1 or more, preferably 1 to 100, more preferably 1 to 50, depending on the type of enzyme. If b exceeds 100, depending on the type of enzyme, the enzyme activity may decrease.
[0030]
The polymer / enzyme conjugate used in the present invention contains a polymer capable of chemically binding to an enzyme and the enzyme in a weight ratio of 1: 0.0001 to 500. If the enzyme weight ratio is less than 0.0001, the sensitivity is not so high when measuring immunologically active substances, and it is not efficient. If it exceeds 500, the solubility is lowered or the stability of the enzyme activity is reduced, which is preferable. Absent.
[0031]
There are the following three methods for producing the polymer / enzyme conjugate used in the present invention. The polymer / enzyme conjugate is obtained by chemically reacting the enzyme with a polymer solution capable of enzyme binding. Specifically, for example,
(1) When the carboxyl group in the polymer is reacted with the amino group in the enzyme, the water-soluble condensing agent 1-ethyl-3- (3- A method of reacting (dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC). (2) When reacting the amino group in the polymer with the sugar chain in the enzyme, first, the sugar chain in the enzyme is opened with periodic acid, and the resulting aldehyde group is reacted with the amino group in the polymer. The method of reducing the bond with sodium borohydride.
(3) A method of adding a polymer solution to an enzyme solution when reacting an isocyanate group in a polymer with an amino group in an enzyme.
In the above reactions (1) to (3), it is desirable to facilitate dissolution by stirring, heating, sonication or the like. In addition, operations such as dialysis, dilution, pH control, addition of an organic solvent, drying, and freeze-drying can be appropriately selected and used.
[0032]
The polymer solution and the enzyme solvent for mixing the enzyme solution and the enzyme solution may be the same or different. For example, water, various buffer solutions, various physiological saline, various culture solutions, methanol, ethanol, isopropanol, nitromethane, etc. can be mentioned. Examples of the mixed solvent include dimethylformamide, dimethylsulfoxide, acetonitrile, dioxane, acetone, and chloride. A mixture of an organic solvent such as methylene, chloroform, methyl ethyl ketone, ethyl acetate, tetrahydrofuran, toluene, cyclohexane, diethyl ether, n-hexane, isopropyl ether, carbon tetrachloride, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, etc. Can be mentioned. Preferred examples include various buffer solutions, various physiological saline solutions, and various culture solutions in which a decrease in enzyme activity does not easily occur.
[0033]
As the substance having biologically specific binding shown in the present invention, substances conventionally used in enzyme immunoassay and the like can be used, for example, antibody, antigen, avidin, biotin, protein A, protein G, lectin and the like are listed. Among these, antibodies, avidin, biotin and the like that are generally used in enzyme immunoassay are preferable.
Further, these substances having biologically specific bonds are bound to the polymer / enzyme conjugate, and the substances having biologically specific bonds are unreacted chemically-bondable functional groups -R. ^Four Alternatively, a functional group -R to which a substance having a biologically specific bond of an enzyme of a polymer / enzyme conjugate can be chemically bonded. ^Five Have reactive groups such as hydroxyl groups, carboxyl groups, succinimide ester groups derived from carboxyl groups, amino groups, and aldehyde groups obtained by opening various sugar chains. The bond is -R. ^Four May be used alone or in the enzyme -R ^Five The group may be alone or -R ^Four -R in groups and enzymes ^Five It may be bonded to both of the groups.
[0034]
Functional group capable of chemical bonding of enzyme of polymer / enzyme conjugate -R ^Five Depending on the type of enzyme, there may be mentioned hydroxyl group, carboxyl group, amino group, sugar chain, etc., and a substance having biologically specific bond can be easily chemically bonded to carboxyl group, amino group Etc. are preferred.
[0035]
Unreacted -R present in the polymer / enzyme conjugate ^Four Alternatively, a functional group -R capable of chemically binding an enzyme of a polymer / enzyme conjugate ^Five By chemically reacting the substance having the biologically specific bond to the above, a conjugate of the polymer / enzyme / substance having the biologically specific bond represented by the general formula [IV] is obtained. can get.
[0036]
In the general formula [IV], Y ² Is a functional group of the biologically specific substance and an unreacted -R of the polymer / enzyme conjugate. ^Four Alternatively, a functional group -R capable of chemically binding an enzyme of a polymer / enzyme conjugate ^Five Specifically, amide group, dicarbamide group, urea bond, disulfide bond, imido acid amide bond, 3-thiosuccinimide bond (maleimide group reacts with thiol group). A bond formed by reducing an amino group reacted with an aldehyde group formed by a ring-opened sugar chain.
[0037]
In the general formula [IV], d is 1 or more, preferably 1 to 100, more preferably 1 to 50, although it depends on the type of enzyme. If d exceeds 100, the enzyme activity may decrease depending on the type of enzyme.
[0038]
The ratio of the substance having biologically specific binding to the polymer / enzyme conjugate shown in the present invention is (polymer / enzyme conjugate): the weight of the substance having biologically specific binding is It is a thing contained in the ratio of 1: 0.0001-500 by ratio. If the weight ratio of the substance having biologically specific binding is less than 0.0001, high sensitivity does not occur at the time of immunologically active substance measurement, and it is not efficient, and if it exceeds 500, the solubility decreases, or This is not preferable from the viewpoint that the stability of a substance having a biologically specific bond is lowered.
[0039]
The substance conjugate having a polymer / enzyme / biologically specific bond shown in the present invention causes the substance having the biologically specific bond to chemically react with the polymer / enzyme solution. Can be obtained.
For example, in the preparation examples (1) to (3) of the polymer / enzyme conjugate described above, when the antibody is further reacted, (1) 'the polymer / enzyme conjugate polymer unreacted carboxyl group or in the enzyme In the reaction of the carboxyl group of the antibody with the amino group in the antibody, the water-soluble condensing agent 1 is added in an aqueous solution in which a substance having a biologically specific bond with the polymer / enzyme conjugate is dissolved. Reaction of ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC) gives a substance conjugate having a polymer / enzyme / biologically specific bond.
(2) 'When reacting the unreacted amino group of the polymer / enzyme conjugate or the amino group in the enzyme with the sugar chain in the antibody, the unreacted amino group or the amino group in the enzyme When a sugar chain in a substance having a biologically specific bond is reacted with a sugar chain in the substance having a biologically specific bond, the aldehyde formed is first opened by periodic acid. A substance conjugate having a polymer / enzyme / biologically specific bond can be obtained by reacting a group with the amino group and reducing the bond with sodium borohydride.
(3) When reacting an unreacted isocyanate group in a polymer / enzyme conjugate with an amino group in a substance having a biologically specific bond, a biological substance is contained in the polymer / enzyme conjugate solution. A substance conjugate having a polymer / enzyme / biologically specific bond can be obtained simply by adding a substance solution having a chemically specific bond.
In the above reactions (1) to (3), it is desirable to facilitate dissolution by stirring, heating, ultrasonic treatment or the like. In addition, operations such as dialysis, dilution, pH control, addition of an organic solvent, drying, and freeze-drying can be added as appropriate.
[0040]
As a solvent for mixing the polymer / enzyme conjugate solution and the substance solution having the biologically specific bond, the enzyme-bondable polymer solution and the enzyme solution are mixed. The same solvent as used in can be used.
[0041]
The reagent for measuring an immunologically active substance of the present invention comprises a polymer / enzyme / substance conjugate having a biologically specific bond obtained as described above. Even if it consists only of the substance conjugate | bonded_body which has an especially specific coupling | bonding, the other additive may be mix | blended. The measurement reagent of the present invention can be stored in a dry state such as a solid or powder, and can be used by dissolving in a suitable medium at the time of use, or can be used as a reagent in liquid form from the beginning. In the latter case, the concentration of the polymer / enzyme / substance conjugate having biologically specific binding in the reagent is 1 × 10 5 as protein mass. ^-Five -10 mg / mL, preferably 1 x 10 ^-3 ˜1 mg / mL is desirable.
[0042]
As said additive, the additive conventionally used for the measuring reagent using an antigen antibody reaction can be used without a restriction | limiting. Specific examples include proteins such as bovine serum albumin and ovalbumin, surfactants such as sodium dodecyl sulfate, Tween 20 (trade name, manufactured by ICI), methanol, ethanol, acetone, N, N′-dimethylformamide, tetrahydrofuran An organic solvent such as
[0043]
As a medium for dissolving a substance / conjugate having a polymer / enzyme / biologically specific bond, it can be dissolved without reducing the enzyme activity or the activity of a substance having a biologically specific bond. Any liquid can be used without limitation. Specifically, phosphate buffer, carbonate buffer, acetate buffer, Tris / hydrochloric acid buffer, water, these buffers or water, methanol, ethanol, propanol, t-butanol, benzene, acetone, N, A mixed solution with N′-dimethylformamide and tetrahydrofuran is mentioned. For example, a mixed solution containing 0.1 to 40% by volume of an organic solvent can be used.
[0044]
When the substance having a biologically specific bond of the polymer / enzyme / substance conjugate having a biologically specific bond of the present invention is an antibody, a test substance using the measurement reagent of the present invention Can be measured by a known enzyme immunoassay method using the measurement reagent of the present invention in place of an antibody or antigen labeled with a conventional enzyme. That is, a specimen containing an immunologically active substance as a test substance is brought into contact with a substance conjugate having the specific binding of the polymer / enzyme / biologically of the present invention, and the test substance in the specimen and this substance are contacted. After the antigen-antibody reaction of the polymer / enzyme / substance conjugate having biologically specific binding in the measurement reagent of the invention, the resulting antigen-antibody reaction product is measured using the enzyme activity. . As a result, the test substance can be quantified or qualitatively determined.
[0045]
The concentration of the substance / conjugate having a macromolecule / enzyme / biologically specific bond in the antigen-antibody reaction is 0.01 ng / mL to 100 μg / mL, preferably 0.11 ng / mL to 10 μg / mL. mL, the reaction temperature is 0 to 70 ° C., preferably 4 to 40 ° C. at which the immunologically active substance is not deactivated, and the pH of the reaction system is 2 to 13, preferably 4 to 11. The reaction time is 0.1 minute to 16 hours, preferably 1 minute to 2 hours.
[0046]
As the reaction medium, the same buffer solution, water, or a mixture of these and an organic solvent exemplified as a medium used when the measurement reagent of the present invention is used as a solution state reagent can be used. Moreover, the same additive as the additive which can be added to the measuring reagent of this invention can be added to a reaction system.
[0047]
In order to measure the antigen-antibody reaction product by utilizing the activity of the enzyme, various methods according to the enzyme used can be adopted as in the conventional enzyme immunoassay. In general, a method is employed in which an enzyme substrate is added to cause the enzyme substrate reaction to proceed and the produced product is measured. As a specific method, for example, methods such as an absorbance method, a fluorescence method, and a chemiluminescence method can be employed. As the enzyme substrate, a substrate that can be used for conventional enzyme immunoassay or enzyme detection can be used. For example, as a substrate for peroxidase, 1,2-phenylenediamine, 3,3 ′, 5, As a substrate for β-D-galactosidase such as 5′-tetramethylbenzidine, 2-nitrophenyl · β-D-galactoside, 4-hydrophenylacetic acid, 4-methoxy-4- (3-galactozidophenyl) spiro As a substrate of (1,2-dioxetane-3,2′-adamantane) disodium salt, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, 4-methylumbelliferyl β-D-galactoside, alkaline phosphatase, 4 -Nitrophenyl phosphate, 4-methylumbelliferyl phosphate, 4-methoxy-4- (3- O scan phosphate phenyl) spiro (1,2-dioxetane-3,2'-adamantane), and the like disodium salt.
[0048]
The method for measuring an immunologically active substance of the present invention will be specifically described with reference to the steps shown in FIG. 1 in the case where a titer plate widely used in conventional enzyme immunoassay is used.
FIG. 1 schematically shows a measurement method of the present invention. A titer plate usually used in an enzyme immunoassay, for example, commercially available polystyrene Maxisorp F-96 (NUNC, trade name). It is performed through a four-stage process of S1 to S4 using a titer plate.
(1) First, an anti- (measurement control) antibody is added to each well of the titer plate, and the anti- (measurement control) antibody is immobilized on the titer plate by physical adsorption. (S1)
(2) Next, a specimen containing a measurement target substance to be a specific test substance is added as it is or diluted with an appropriate solvent, and an antigen-antibody complex is formed by an antigen-antibody reaction. (S2)
(3) Next, a substance having a polymer / enzyme / biologically specific binding of the present invention including a polymer / enzyme / antibody conjugate comprising an anti- (measurement control) antibody and an enzyme is added, and an antigen is added. The antibody complex is reacted with the polymer / enzyme / antibody conjugate. As a result, a complex of antigen-antibody / polymer / enzyme / antibody conjugate is produced. (S3)
(4) Next, the unreacted antigen-antibody / polymer / enzyme / antibody complex is removed by washing, and then a substrate for the enzyme is added in a large excess to produce a product from the substrate from the enzyme. (S4) The product obtained by the enzyme substrate reaction is measured by a method such as an absorbance method, a fluorescence method, or chemiluminescence.
In this case, the amount of the enzyme for the unit anti- (measurement target) antibody is larger than that in the case of using a conventional reagent that does not bind the enzyme to the polymer, and thus the amount of the product increases. Therefore, for example, the measured absorbance becomes high, and a highly sensitive measurement can be performed. It should be noted that the measurement object in the sample can be quantified by measuring in advance in the same manner as in the above procedure using a known amount of the measurement object, and comparing with the calibration curve created thereby.
[0049]
【The invention's effect】
Since the polymer / enzyme conjugate of the present invention has a dipole of N + group and O- group derived from a phosphorylcholine-like group, it is stable in an aqueous solution.
The substance conjugate having a polymer / enzyme / biologically specific bond of the present invention is a stable conjugate with low non-specific adsorption. Since the amount of the enzyme contained in one molecule is larger than that of a normal enzyme-labeled antibody, the measurement reagent includes a substance / conjugate having a high molecular / enzyme / biologically specific bond according to the present invention. This is useful in medical examinations. The measurement method using the measurement reagent enables highly sensitive measurement in a short time by measuring an immunologically active substance.
As described above, in the method for measuring an immunologically active substance of the present invention, the amount of the enzyme bound to the unit ratio test substance is larger than that of the conventional method, so that the amount of product produced from the substrate per unit time As a result, the measured absorbance is increased and measurement can be performed with high sensitivity. Similarly, when other enzyme activity measurement methods are employed, the measurement can be performed with high sensitivity. For this reason, the method for measuring an immunologically active substance of the present invention can also measure a low concentration of a test substance that could not be measured by a conventional enzyme immunoassay.
[0050]
【Example】
Hereinafter, the embodiment will be described in detail.
The measurement method is shown below.
A-1. Measurement of molecular weight of polymer-1
The resulting aqueous copolymer solution was diluted with distilled water to 0.5 wt%, and this solution was filtered through a 0.45 μm membrane filter to obtain a test solution.
GPC analysis uses G3000PW as the column _XL × 2 (manufactured by Tosoh Corporation), distilled water as elution solvent, polyethylene glycol (manufactured by Polymer Laboratories) as standard substance, detection using parallax refractometer, weight average molecular weight (Mw), number average molecular weight (Mn) and molecular weight distribution (Mw / Mn) were calculated using a Tosoh integrator built-in molecular weight calculation program (GPC program for SC-8020), flow rate was 1.0 mL / min, sample solution usage was 100 μL, column temperature It calculated | required at 40 degreeC.
[0051]
A-2. Measurement of molecular weight of polymer-2;
To 0.369 g of propionic acid, add 4845 μL of an N, N′-carbonyldiimidazole solution of 0.2 g / mL propionic acid succinimide ester dissolved in dimethylformamide (hereinafter abbreviated as DMF), and incubate at room temperature for 1 hour. did. After the incubation was completed, 34405 μL of a 0.2 g / mL N-hydroxysuccinimide solution dissolved in DMF was added and incubated at room temperature for 3 hours to prepare a propionic acid succinimide solution. To 1.0 mL of each 1% by weight of each polymer aqueous solution, 1200 μL of the propionic acid succinimide solution prepared above was added and incubated at 4 ° C. overnight. After completion of the incubation, this solution is inserted into a dialysis membrane (trade name “Spectrum / po. Membrane Mw CO, 6000 to 8000” manufactured by Spectrum Medical Industries, Inc.), and distilled water having a volume 10 times that of the solution is used. A dialysis operation was performed, and purification was performed by continuously exchanging distilled water once a day for 3 days. After purification, each solution was lyophilized. Each propylated polymer powder was dissolved in chloroform: methanol = 6: 4 (V / V) containing 0.5 wt% lithium chloride to prepare a 0.5 wt% weight solution. Further, this solution was filtered through a 0.45 μm membrane filter to obtain a test solution.
GPC analysis was performed using MIXED-C (2) (manufactured by Polymer Laboratories) as an elution solvent, chloroform: methanol = 6: 4 (V / V) containing 0.5% by weight of lithium chloride as a standard substance. Is polymethylmethacrylate (manufactured by Polymer Laboratories), detection is a parallax refractometer, weight average molecular weight (Mw), number average molecular weight measurement (Mn), molecular weight distribution (Mw / Mn) is a molecular weight calculation with a built-in integrator manufactured by Tosoh Corporation Using a program (GPC program for SC-8020), the flow rate was 1.0 mL / min, the sample solution usage was 100 μL, and the column temperature was 40 ° C.
[0052]
B. Measurement of copolymer composition ratio;
The obtained polymer solution was freeze-dried to obtain a polymer powder. 20 mg of the obtained powder was dissolved in 1.5 mL of heavy water (D2O). The resulting heavy aqueous solution was used with JNM-EX270 manufactured by JEOL Ltd. ¹ H-NMR analysis was performed to determine the molar ratio between the hydrophilic monomer and the monomer having a functional group capable of chemically bonding with the enzyme.
[0053]
C. Solubility and molecular weight measurement of polymer / enzyme conjugate and substance conjugate with polymer / enzyme / biologically specific binding;
The obtained polymer / enzyme conjugate solution or the polymer / enzyme / substance conjugate solution having biologically specific binding was allowed to stand at room temperature for 16 hours, and the presence or absence of precipitation was visually confirmed. .
Moreover, after the obtained polymer / enzyme conjugate solution or the polymer / enzyme / substance conjugate solution having biologically specific binding is filtered through a 0.45 μm membrane filter, the concentration becomes 2 mg / mL. The solution was diluted with Dulbecco's phosphate physiological buffer solution (hereinafter abbreviated as PBS).
GPC analysis uses G4000SW as the column. _XL × 1 (manufactured by Tosoh Corporation), 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.3 M NaCl as an elution solvent, thyroglobulin (molecular weight = 669,000), ferritin (molecular weight) as standard substances = 440,000), mouse IgG (molecular weight 160,000), horseradish peroxidase (molecular weight = 40,000), chymotrypsinogen A (molecular weight = 25,000), UV detection (280 nm) for detection, flow rate 0 5 mL / min, sample solution usage was 400 μL, and column temperature was 35 ° C.
[0054]
D. The binding ratio of the polymer / enzyme / substance conjugate with biologically specific binding / enzyme / biological specific binding;
When the enzyme is horseradish peroxidase and the biologically specific substance is an anti- (4-hydroxynonenal) mouse antibody, the molecular weight measurement of C is performed except that the measurement wavelength is 403 nm. Do the same analysis. 280 nm peak area (A ₂₈₀ ) And 403 nm peak area (A ₄₀₃ ) And horseradish peroxidase / anti- (4-hydroxynonenal) mouse antibody (mol / mol) was determined from the following formula.
Horseradish peroxidase / anti- (4-hydroxynonenal) mouse antibody (mol / mol) = 2.46 × A ₄₀₃ / (A ₂₈₀ −0.31 × A ₄₀₃ )
[0055]
E. Purification of macromolecule / enzyme / antibody conjugate and measurement of antigen;
During the molecular weight analysis of C, the polymer / enzyme / antibody conjugate was purified by fractionating the eluate having an elution time of 10 to 15 minutes.
1 mmol of 4-hydroxynonenal (manufactured by Caiman Chemical) was added to a PBS solution of 1 mg / mL ovalbumin and reacted at 37 ° C. for 2 hours. A solution obtained by diluting the reaction solution 100 times with PBS was added to a titer plate (Maxisorp F96, trade name, manufactured by NUNC) at 100 μL / well and incubated at 25 ° C. for 2 hours. After completion of the incubation, the plate was washed 5 times with PBS, and then added with 250 μL / well of a PBS solution containing 0.5 wt% ovalbumin and incubated at 25 ° C. for 2 hours. After completion of the incubation, a 4-hydroxynonenal-immobilized titer plate (immobilized plate) was prepared by removing the PBS solution containing 0.5% by weight ovalbumin. Add 250 μL / well of a PBS solution containing 0.5 wt% ovalbumin to the titer plate, incubate at 25 ° C. for 2 hours, and remove the PBS solution containing 0.5 wt% ovalbumin after completion of the incubation. Thus, an unimmobilized titer plate (blank plate) was prepared.
The polymer / enzyme / antibody conjugate solution purified by the above method was diluted 100 times with a PBS solution containing 0.5% by weight ovalbumin, and 100 μL / ml was added to the immobilized plate and the blank plate. Well was added and incubated at 25 ° C. for 2 hours. After the incubation, the plate was washed 5 times with PBS, and then developed with a peroxidase coloring kit SUMILON-T (trademark, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) (enzyme-substrate reaction was performed at 25 ° C. for 20 minutes)
[Absorbance of immobilized plate]-[Absorbance of blank plate] = [Difference in absorbance] was determined.
[0056]
F. Measurement of polymer / enzyme / biotin;
A PBS solution of 10 μg / mL avidin-labeled anti-mouse antibody was added at 100 μL / well and incubated at 25 ° C. for 2 hours. After completion of the incubation, the plate was washed 5 times with PBS, 250 μL / well of a PBS solution containing 0.5% by weight ovalbumin was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 16 hours. After completion of the incubation, a PBS solution containing 0.5% by weight ovalbumin was removed to prepare an avidin-labeled antibody-immobilized plate (immobilized plate). Add 250 μL / well of a PBS solution containing 0.5 wt% ovalbumin to the titer plate, incubate at 25 ° C. for 2 hours, and remove the PBS solution containing 0.5 wt% ovalbumin after completion of the incubation. Thus, an unimmobilized titer plate (blank plate) was prepared.
A solution obtained by diluting the polymer / enzyme / biotin conjugate solution purified by the above method 1000 times with a PBS solution containing 0.5% by weight ovalbumin was added to the immobilized plate and the blank plate at 100 μL / Well was added and incubated at 25 ° C. for 2 hours. After the incubation, the plate was washed 5 times with PBS, and then developed with a peroxidase coloring kit SUMILON-T (trademark, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) (enzyme-substrate reaction was performed at 25 ° C. for 30 minutes), Absorbance of plate] − [Absorbance of blank plate] = [Difference in absorbance] was determined.
[0057]
Synthesis Example 1; Synthesis of MPC / methacrylic acid copolymer (poly (MPC-co-MA) -1);
As a monomer, take 16.2 g of MPC and 0.53 g of methacrylic acid (hereinafter abbreviated as MA), 0.351 g of PR-SA as an initiator, and 42.919 g of distilled water as a polymerization solvent in a polymerization tube. Dissolved. Argon was bubbled through this solution for 10 minutes and sealed. After completion of the sealed tube, a polymerization reaction was carried out at 70 ° C. for 6 hours. After completion of the polymerization reaction, the mixture was cooled to room temperature and the polymerization tube was opened, and this solution was then inserted into a dialysis membrane (trade name “Spectrum / po. Membrane Mw CO, 6000 to 8000” manufactured by Spectrum Medical Industries). By dialysis using distilled water having a volume 10 times that of the polymerization solution, and dialysis by continuously exchanging distilled water once a day for 7 days to remove unreacted monomers and initiators. The copolymer was purified. The molecular weight of the obtained copolymer was measured using the molecular weight measurement-1. The results of molecular weight measurement and copolymer composition ratio are shown in Table 1.
[0058]
Synthesis Examples 2 to 5; Synthesis of poly (MPC-co-MA) -2 to 5
A copolymer was obtained by polymerization and purification in the same manner as in Synthesis Example 1 except that the monomer composition was changed as shown in Table 1. The results are shown in Table 1.
[0059]
Synthesis Example 6; Synthesis of MPC / 2-aminoethyl methacrylate copolymer (poly (MPC-co-AEMA) -1
As a monomer, MPC, 1.98 g, 2-aminoethyl methacrylate hydrochloride (hereinafter abbreviated as AEMA), 0.12 g, and 2,2′-azobisisobutylnitrile (hereinafter referred to as V-50) as an initiator (Abbreviated), 0.407 g was distilled water as a polymerization solvent, and 12.493 g was taken in a polymerization tube and dissolved uniformly. Argon was bubbled through this solution for 10 minutes and sealed. After completion of the sealed tube, a polymerization reaction was carried out at 60 ° C. for 8 hours. After completion of the polymerization reaction, the mixture was cooled to room temperature and the polymerization tube was opened, and this solution was then inserted into a dialysis membrane (trade name “Spectrum / po. Membrane Mw CO, 6000 to 8000” manufactured by Spectrum Medical Industries). By dialysis using distilled water having a volume 10 times that of the polymerization solution, and dialysis by continuously exchanging distilled water once a day for 7 days to remove unreacted monomers and initiators. The copolymer was purified. The molecular weight of the obtained copolymer was measured using the molecular weight measurement-2. The results of molecular weight and copolymer composition ratio are shown in Table 2.
[0060]
Synthesis Examples 7 to 10; Synthesis of poly (MPC-co-AEMA) -2 to 5
A copolymer was obtained by polymerization and purification in the same manner as in Synthesis Example 6 except that the monomer composition was changed as shown in Table 2. The results are shown in Table 2.
[0061]
[Table 1]

[0062]
[Table 2]

[0063]
In Tables 1 and 2, Mn represents the number average molecular weight, and Mw represents the weight average molecular weight.
[0064]
Examples 1-5; Preparation of poly (MPC-co-MA) / HRP conjugates;
1.0 mg / mL horseradish peroxidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter abbreviated as HRP). } And 1000 μL of 100 mM phosphate buffer solution (pH 6.9) in which poly (MPC-co-MA) synthesized in 17.5 mg / mL Synthesis Examples 1 to 5 was dissolved, 100 mg / mL 1-ethyl -3- (3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide / hydrochloride {manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd., hereinafter abbreviated as WSC. } Was added, and 480 μL of a 100 mM phosphate buffer solution (pH 6.9) solution was added and reacted at 25 ° C. for 1 hour. Thereafter, 480 μL of a 100 mM phosphate buffer solution (pH 6.9) in which 100 mg / mL WSC was dissolved was added and reacted at 25 ° C. for 6 hours. After the reaction was completed, dialysis (4 ° C., 6 hours) against 1 L of PBS was repeated three times to remove unreacted WSC. According to the above measurement method C, solubility and molecular weight were measured. The measurement results are shown in Table 3.
[0065]
Examples 6-10; Preparation of poly (MPC-co-AEMA) / HRP conjugate
To 23.8 mL of distilled water in which 8.0 mg / mL HRP was dissolved, 4760 μL of 0.2 M sodium periodate aqueous solution was added and reacted at room temperature for 20 minutes. After completion of the reaction, unreacted sodium periodate was removed by repeating dialysis (4 ° C., 12 hours) against 2 L of 1 mM acetate buffer (pH 4.5) twice. After completion of dialysis, 476 μL of 0.2 M carbonate buffer (pH 9.5) was added (HRP solution-1). Immediately after the addition, 3000 μL of 10 mM carbonate buffer (pH 9.5) in which 6 mg / mL poly (MPC-co-AEMA) synthesized in Synthesis Examples 6 to 10 was dissolved was added to 3000 μL of HRP solution-1. And reacted at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, 300 μL of 4 mg / mL sodium borohydride aqueous solution was added while cooling with ice, and reacted at 4 ° C. for 2 hours. After completion of the reaction, unreacted sodium borohydride was removed by repeating dialysis (4 ° C., 6 hours) against 1 L of PBS three times. According to the above measurement method C, solubility and molecular weight were measured. The measurement results are shown in Table 3.
[0066]
Comparative Example 1; Preparation of poly (L-Lys) / HRP conjugate
Instead of poly (MPC-co-AEMA) in Example 6, poly-L-lysine / bromide (weight average molecular weight = 19200) (hereinafter abbreviated as poly (L-Lys)) was used. Was carried out in the same manner as in Example 6. The measurement results are shown in Table 3.
[0067]
[Table 3]

[0068]
In the table,
* 1: A conjugate peak was observed near the excluded volume on the polymer side of thyroglobulin.
* 2: A gentle conjugate peak from around the excluded volume to around HRP was confirmed.
[0069]
Examples 11 to 20; polymer / HRP / IgG conjugate
200 μL of 0.01 M sodium periodate aqueous solution was added to 1000 μL of 1 mM acetate buffer (pH 4.5) in which 0.4 mg / mL anti- (4-hydroxynonenal) mouse antibody (hereinafter abbreviated as IgG) was dissolved. The reaction was allowed to proceed for 20 minutes at room temperature. After completion of the reaction, unreacted sodium periodate was removed by repeating dialysis (4 ° C., 12 hours) against 500 mL of 1 mM acetate buffer (pH 4.5) twice. After completion of dialysis, 20 μL of 0.2 M carbonate buffer (pH 9.5) was added (IgG solution-1). Immediately after the addition, 1000 μL of 1 mM acetate buffer (pH 4.5) in which the polymer / HRP conjugate having a HRP concentration of 2.0 mg / mL prepared in Examples 1 to 10 was dissolved was added at room temperature. The reaction was performed for 2 hours. After completion of the reaction, 300 μL of 4 mg / mL sodium borohydride aqueous solution was added while cooling with ice, and reacted at 4 ° C. for 2 hours. After the reaction was completed, dialysis (4 ° C., 6 hours) against 500 mL of PBS was repeated three times to remove unreacted sodium borohydride.
According to the above measuring methods C and D, solubility, molecular weight measurement, and HRP / IgG binding ratio analysis were performed. The measurement results are shown in Table 4. Further, according to the above E, the polymer / enzyme / antibody conjugate was purified and the antigen was measured, and the results are shown in Table 4.
[0070]
Comparative Example 2; HRP / IgG conjugate
Instead of 1 mM acetate buffer (pH 4.5) in which the polymer / HRP conjugate having a HRP concentration of 2.0 mg / mL prepared in Example 1 of Example 11 was dissolved, 2.0 mg / mL HRP The same procedure as in Example 11 was performed except that 1 mM acetate buffer solution (pH 4.5) in which was dissolved was used. The measurement results are shown in Table 4.
[0071]
[Table 4]

[0072]
In the table
* 1: A conjugate peak was observed near the excluded volume on the polymer side of thyroglobulin.
* 2: A peak was confirmed at almost the same position as unreacted HRP.
[0073]
Examples 21-30; polymer / HRP / biotin conjugate
1000 mg of N-succinimidyl D-biotin (Donjin Chemical Co., Ltd.) in a PBS solution in which the polymer / HRP conjugate having an HRP concentration of 2.0 mg / mL prepared in Examples 1 to 10 was dissolved. 5 μL of dimethyl sulfoxide solution was added and reacted at 4 ° C. for 16 hours. After completion of the reaction, unreacted N-succinimidyl D-biotin was removed by repeating dialysis (4 ° C., 6 hours) against 500 mL of PBS three times.
The measurement was performed according to the measurement method F, and the results are shown in Table 5.
[0074]
Comparative Example 3; HRP / biotin conjugate
Instead of the PBS solution in which the polymer / HRP conjugate having a HRP concentration of 2.0 mg / mL prepared in Example 21 of Example 21 was dissolved, a PBS solution in which 2.0 mg / mL HRP was dissolved was used. The same operation as in Example 21 was carried out except that it was used. The measurement results are shown in Table 5.
[0075]
[Table 5]

[0076]
From the above results, it can be seen from Table 3 that the poly (L-Lys) / HRP conjugate is insoluble, and when the molecular weight analysis of each soluble fraction was performed, almost no polymerization occurred. On the other hand, poly (MPC-co-MA) -1 to poly (MPC-co-MA) -5 and poly (MPC-co-AEMA) -1 to poly (MPC-co-AEMA) -5 were used. The molecule / HRP conjugate was confirmed to be soluble and a macromolecule.
From Table 4, poly (MPC-co-MA) -1 to poly (MPC-co-MA) -5 and poly (MPC-co-AEMA) -1 to poly (MPC-co-AEMA) -5 It was confirmed that the polymer / HRP / IgG conjugate using was soluble and a macromolecule. Also, by using these polymer / HRP / IgG conjugates, the differential absorbance is 1.9 times to 35.5 times that of HRP / IgG conjugates that do not use polymers, and high sensitivity measurement is possible. It was confirmed that it was possible.
Furthermore, from Table 5, poly (MPC-co-MA) -1 to poly (MPC-co-MA) -5 and poly (MPC-co-AEMA) -1 to poly (MPC-co-AEMA) -5 By using the polymer / HRP / biotin conjugate used, the differential absorbance is 1.8 to 35.8 times that of the HRP / biotin conjugate not using the polymer, enabling highly sensitive measurements. It was confirmed that
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic process diagram in the case of using a substance conjugate having a polymer / enzyme / biochemically specific binding of an immunologically active substance of the present invention.
FIG. 2 shows Examples 1 to 10 (poly (MPC-co-MA) -1 / HRP to poly (MPC-co-MA) -5 / HRP and (poly (MPC-co-AEMA) -1). / HRP to (poly (MPC-co-AEMA) -5 / HRP Example 3 (poly-co-MA) -3 / HRP and Example 8 (poly (MPC) -co-AEMA-3 / HRP)) And Comparative Example 1 (poly (L-Lys) / HRP molecular weight measurement result (elution curve of GPC)).
FIG. 3 shows Examples 11 to 20 (poly (MPC-co-MA) -1 / HRP / IgG to poly (MPC-co-MA) -5 / HRP / IgG and (poly (MPC-co- AEMA) -1 / HRP / IgG˜ (poly (MPC-co-AEMA) -5 / HRP / IgG and Comparative Example 2, HRP / IgG molecular weight measurement results (GPC elution curve) are shown.
[Explanation of symbols]
1. Thyroglobulin (molecular weight 669,000)
2. Ferritin (molecular weight: 440,000)
3. Mouse IgG (molecular weight 160,000)
4). HRP (Molecular weight 40,000)
5. Chymotrypsinogen A (molecular weight 25,000)

Claims (1)

Following formula [ III ]

A polymer obtained by polymerizing a monomer composition comprising a hydrophilic monomer (a1) represented by formula (1) and a monomer (a2) which is methacrylic acid or 2-aminoethyl (meth) acrylate, and immunology A polymer / enzyme conjugate for measuring an immunologically active substance obtained by chemically binding an enzyme for measuring an active substance .

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