JP4136725B2 - Chromatograph tube filter - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロマトグラフィー用チューブフィルターに関するものである。
【0002】
【従来の技術】
クロマトグラフィーに於いて、試料の前処理として、試料中の沈殿物を除去するためには遠心分離機を用いて処理したり、各種フィルター等を用いて濾過することが行われている。
然し、液体試料の場合、これらに使用したビン、器具等に試料成分を含んだ液体が残るため、更なる液体による洗浄が必要となり、希釈されることになってしまう。
【0003】
それらを解決するため、HPLCではループ代りにモノリス構造キャピラリーを用いて更に濃縮したり、インチューブSPE(solid phase extraction=固相抽出 )等を用いて濃縮して分析が行われている。(例えば特許文献1参照)
これらの方法は、濃縮率が高く、数百μLの試料を用いるだけで、十分満足できる結果が得られる。
従来の技術に於いては、この数百μL程度の少量の試料を濾過する効率の良い方法がなく、濾過せずにモノリス構造キャピラリーやインチューブSPEなどを用いた分析装置に導入するしか方法がない。しかし、モノリス構造キャピラリーやインチューブSPEは、内径の細いキャピラリー管で構成されており、前処理で取り切れない細かい浮遊物や、取扱い過程で混入する浮遊物は、目詰まりの原因となる。
又、最近では、バイオ関連分析に於いては、数μL程度の極微量液体の取扱いの必要性が増加してきており、キャピラリーなどの細管を用いた分析が重要となってきている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
これらの極微量試料の取扱いは、試料の移し替えなどの従来のバッチ方式では試料ロスが多く、使用困難である。そのためオンラインでのシステムアップした装置が必要となり、装置は大掛りとなり、高額となる。
尚、実際には生体試料は、液体に溶解し難いので、各種システム、モノリス構造キャピラリー等を用いても細いチューブ内部での目詰まりは避けらない。その場合には、インチューブやモノリス構造キャピラリーの交換が必要となり、装置の組直しを要する等の問題が多い。
【0005】
これらを解決できる装置乃至フィルターは存在せず、極微量成分を扱う場合にも遠心分離機などで浮遊物を取り除く面倒な作業が必要不可欠であった。
更に、最近フューズトシリカチューブに直接充填剤を詰めて分離カラムとして或いはガードカラムとして使用することが提案されている。
この際、高圧状態での使用の際には、充填剤が抜け落ちるため、高圧状態での使用には危険が伴っていた。
【0006】
【特許文献1】
特開平2002−79001号公報
【0007】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、極微量の試料を取り扱う際に、試料ロスがなく、大掛かりな装置は必要なく、極めて簡単な器具にて試料、就中液体試料を極めて簡単に濾過し、極少量の液体試料も殆ど手を加えることなく、試料として使用する状態にすることが可能なフィルターを提案せんとするもので、外径3mm以下の適宜長のチューブ端にフィルターを固定してカップフィルターとし、該カップフィルターに、フィルターに達するまでキャピラリーカラム、マイクロシリンジ等の細管を挿通させると共に、該細管をチューブ収納状態でジョイント或いはインジェクターに装着自在としたことを特徴とする。
【0008】
【発明の実施の形態】
以下、図に示す実施形態により、本発明を詳細に説明する。
1はチューブで、外径3mm以下の、テフロン(登録商標)、ピークなどの合成樹脂製でキャピラリーカラム2、シリンジ針3等の細管5を挿通可能で且つ大きな隙間なく適合できる径に形成している。該チューブ1は弾力性を有することが必要である。このチューブ1の内径は、キャピラリーカラム2、シリンジ針3等の細管を挿通可能且つ大きな隙間なく適合できるものであればよく、例えば、キャピラリーカラム2の外径が0.375mmであれば、内径0.4mmのように挿通自在に形成する。又、このチューブ1の長さは、その使用用途に応じ適宜選択できるが、通常の使用時、例えば濾過フィルターとしては液面から、好ましくは30mm以上、上部に位置する程度が使用に便である。又、溶液フィルターとして、溶液中に入れる場合、その液の深さに対応して、又、シリンジ針3等に使用する場合等、例えばフェラル止めに適当な長さに選択できる。
【0009】
4はフィルターで、ステンレス等の金属製、ガラス、石英、パット(ピークテフロン)モノリス構造等の適度の硬度を有する材質で、20Mpa程度の耐圧性を有するものがよい。
このフィルター4のメッシュ乃至スルポア径は使用目的に応じて選択できるが、0.1μm以上50μm位がよい。
又、このフィルター4の厚さは用途に応じ選択できるが、この厚さの変化に応じて溶液の通過量を選定できる。
【0010】
上記フィルター4をチューブ1の一端又は内部に固定させる。この一端の固定はパイプの先端を加熱し、温度により拡開し、フィルター4を挿入し、チューブ1の先端の温度低下により凝縮してフィルター4を締付固定させる。或いは又、フィルター4をチューブ1内に挿通定置させることもできる。
又、チューブ1端を切り口の角を面取りしたり、段を付けることにより、フィルターを挿入し易く出来る。或いは、チューブ1端を加熱溶融させ、フィルターを挿入した後、チューブの冷却により固着させ融着する方法もとられる。この場合はフィルター4を金属、就中ステンレスのメッシュスクリーンを用いることは推奨される。チューブ1の端部にフィルター4を固定した型をカップフィルターとし、チューブ1の内部にフィルター4を挿通した型をミッドフィルターとし、これらを総称してチューブフィルターと云う。
【0011】
【実施例】
〔実施例1〕 内径1.5mm、外径3mm、長さ20cmのテフロン(登録商標)製チューブ1の一端を300℃で加熱して拡開しながら、該拡開部に外径1.58mm、孔径5μm、厚み1mmのステンレス焼結フィルター4を挿入し、融着とその後の冷却により固定し、チューブフィルターとしてのカップフィルターA(以下同じ)とした。(図1)
〔実施例2〕 内径1.5mm、外径3mm、長さ20cmのテフロン(登録商標)製チューブ1の一端を300℃で加熱して拡開しながら、該拡開部に外径1.58mm、孔径5μm、厚み2mmのガラス製フィルター4を挿入し、融着とその後の冷却により固定し、カップフィルターBとした。(図1)
〔実施例3〕 内径1.5mm、外径3mm、長さ20cmのテフロン(登録商標)製チューブ1の一端を200℃で加熱して拡開しながら、該拡開部に外径1.58mm、孔径5μm、厚み2mmのパットフィルター4を挿入し、融着とその後の冷却により固定し、カップフィルターCとした。(図1)
〔実施例4〕 内径0.35mm、外径1.58mm、長さ3cmのピーク製チューブ1の一端を300℃で加熱して拡開しながら、該拡開部に外径0.40mm、孔径2μmのステンレス製メッシュフィルター4を挿入し、融着とその後の冷却により固定し、カップフィルターDとした。(図2)
〔実施例5〕 内径0.35mm、外径1.58mm、長さ3cmのピーク製チューブ1の一端を300℃で加熱して拡開しながら、該拡開部に外径0.37mm、厚み1mmのステンレス焼結フィルター4を挿入し、融着とその後の冷却により固定し、カップフィルターEとした。(図1)
〔実施例6〕 内径0.35mm、外径1.58mm、長さ3cmのテフロン(登録商標)製チューブ1の一端を拡開しながら、該拡開部に外径0.375mm、スルポア径1μm、長さ5mmのモノリス構造のハイブリッドシリカゲルフューズドシリカチューブ41をテフロン(登録商標)製チューブ1を60℃で加熱しながら差込みミッドフィルターFとした。(図3)
〔実施例7〕 内径0.67mm、外径1.58mm、長さ3cmのピーク製チューブ1の一端を200℃で加熱して拡開しながら、該拡開部に外径0.7mm、孔径5μm、厚み2mmのパットフィルター4を挿入し、融着とその後の冷却により固定し、カップフィルターGとした。(図1)
【0012】
〔実施例8〕 内径0.0635mm、外径0.37mm、長さ51cmのピーク製チューブ1の両端2.5mmを、0.01WT%白金触媒を添加した20%ポリシラザンキシレン溶液に漬け、空気中で2時間加熱し、両端2.5mm部分にアモルファスシリカ膜を形成させた。
20%テトラメトシキシラン、10%メチルトリメトキシシラン、5%ポリエチレングリコール、0.1N酢酸溶液をパイプに満たし、シリコンゴムで封管し、80℃で12時間過熱し、1次孔を持つモノリス構造のハイブリッドゾルを内部に作成した。
ポリエチレングリコール添加量で1次孔を0.3〜50μmまでコントロールできる。
ポリエチレングリコールなどの緩衝ポリマーを添加しないアルコキシランだけにより作成したフリットでは、モノリス構造にならず、十分な貫通孔がなく、液圧が高くなった。
中央部分で切断し、結合された両端部分より水を0.5Mpaで流し、両端部分の内面に結合した2.5mmのゾル部分を残し、内表面と結合していない未反応ゾル及び及び未反応試薬を抜いた。
次に、150℃で加熱し、完全にゲル化したモノリス構造を持つハイブリッドシリカゲルフィルター42を一端に作成した長さ25.5cmのカップフィルターHとした。(図4)
アモルファスシリカを表面に作成せず、同様の方法でゲルを作成したものは、表面との結合が生じず、0.5Mpaでの洗浄工程でゾルが全て抜けてしまった。
フィルター作成には、アモルファスシリカ膜を作成後のゲル化が重要と云うことになる。
【0013】
〔実施例9〕 又、溶液フィルターとしての使用について図5,図6により説明する。
ポンプ8に連結したキャピラリーカラム等の細管5により、容器6中の溶液、例えば試料溶液7を吸引する際に、細管5先端に本願チューブフィルターを用い、細管5先端に挿通して本願カップフィルターEを嵌合した状態で容器6中の試料溶液7に投入して、ポンプ8を作動させる。この際、カップフィルターEを細管5に嵌合しただけで、フェラル等の固定具或いは接着等の固定をしないでもよい。
然るとき、フィルター4を介して試料溶液7が吸入されるが、試料溶液7中の浮遊物等はフィルター4により阻止され、濾過された試料溶液7のみが吸引され、細管5、ポンプ8を経て所望のインジェクター91、本カラム92、検出器93等よりなる分析機器9等へ送られる。
【0014】
〔実施例10〕 上記の実施例について具体例を説明する。
HPLC用送液ポンプMP711の溶離液入り口に外径1/16in、内径0.25mm、長さ1mのテフロン(登録商標)細管5を接続し、ポンプ8後に、インジェクター91(内部ループ方式が推奨される。)を経由し、内径0.3mm×150mmイナートシル(登録商標)WP300C8充填カラム92を接続し、更にUV検出器93を接続し、水道水を濾過せず4μL/minの一定流速で流した。
当初、圧力は6Mpaであったが、約30分後には、カラム92の圧力が徐々に上がり始め、1時間後には推奨使用圧力の20Mpaを超え、カラム92が破損した。
同様に、入り口テフロン(登録商標)細管5に本願カップフィルターAを被せて流したところ、2時間後でもカラム92圧力の上がりはなく、圧力の上昇はなかった。
カップフィルターB,Cでも同じ結果となり、溶液濾過に有効であることが実証された。
カップフィルターCに於いては、約6時間後に気泡が入り込み、ポンプの下降が見られた。
同様に作成した、新しいカップフィルターCに交換したところ、気泡の発生はなくなり、汎用のポンプ溶離液フィルターと同様に使用できることが判った。
【0015】
従来から市販されている汎用のステンレス容液フィルターと本発明カップフィルタAで、溶離液を0.1%アセトン水溶液に変えてから、実際の検出器のUV吸収が変化する時間を調べた。
従来のフィルターでは、数100μLの内部容量を持っているため、流し始めから40分後にベースがゆっくりと上昇し、140分後に一定のベースとなった。(図7)
本発明のカップフィルターAでは、パイプ先端にフィルター4が濾過面でしっかりと接触するので、十分な濾過機能を保ちながら通液内部容量は殆んどなくなる。パイプ1内部容量50μL分経過後の10分後に急激にベースが上がり、40分後に安定した(図8)。フィルター4部分の容積が従来のフィルターより小さく、すぐに置換がなされた。
以上のように、キャピラリーLCにおける溶液フィルターとして有効であった。
【0016】
図9,図10,図11により、微量液体の送液の際に、スプリット量の制御を行う場合を説明する。
12は三方ジョイントであって、T字状に形成され、流入部13は流入パイプ14の挿入口15と流入パイプ14を締付固定するオシネ16とフェラル17を備えている。流入パイプ14を挿入口15の隔壁に押付け固定することができるようになっている。内部空間18を挟んで対応位置に同型の流出部19を設け、流出パイプ20を挿入口21の隔壁まで挿入し、オシネ22とフェラル23により固定してある。
【0017】
三方ジョイント12の流入部13と流出部19の側壁に流出部24を流出部19と同型に形成してある。即ち、流出部24は流出パイプ25を挿入口26を隔壁まで挿通し、オシネ等27とフェラル28により固定してある。
フェラル17,23,28はテフロン(登録商標)、ダイフロン、ピークなどの樹脂製のものが繰り返し使用でき、よく使用される。又、オシネ16,22,27とフェラル17,23,28が各々1つになった手締めで使える一体型タイプもある。
【0018】
而して、三方ジョイント12を用いて、スプリットする場合、流入パイプ14より流入部13に流入された液体は、流出部19、同24の液体抵抗に応じて、スプリット量が制御されるのである。そこで、微量液体の送液に於けるスプリット比を調整するため、流出パイプ25には内径の細かいカラムやパイプなどを取付けることになる。然し、内径の細かいカラムは、詰まり易いのが常であり、故障の原因となる。
【0019】
そこで、この流出パイプ25である内径の細いカラムやパイプなどの細管5端部にカップフィルターEを被せて、フェラル28とオシネ27を用いて、流出部24の挿入口26に挿入固定できる。フェラル28とオシネ27が一体型の樹脂製のものでも良い。
然るとき、液抵抗のあるカラムや細いパイプなどの細管5を使用しても、浮遊物等はフィルター4にて止められ、流入することはなく、スプリット抵抗管として機能する。
然も、本願カップフィルターEは、被せてあるため、オシネ27を外すことにより着脱自在である。更に、フェラル28はカップフィルターEに締め込まれているだけであり、カップフィルターEは抵抗管25となるパイプやカラムなどの細管5から簡単に取外すことができ、交換が極めて容易である。詰まるのは、フィルター部分のみであり、簡単に取替えられ、抵抗管としてのカラム等はそのまま使用できる。
【0020】
〔実施例11〕 図11の具体的使用例を以下に示す。
HPLC用送液ポンプMP711の溶離液入り口に外径1/16in、内径0.25mm、長さ1mのテフロン(登録商標)チューブ5を接続し、ポンプ8後にスプリッター用3方ジョイント12を経由し、インジェクター91(内部ループ方式が推奨される。)を経由し、内径0.3mm×150mmのイナートシル(登録商標)WP300C8充填カラム92を接続し、水道水を濾過せず20μL/minの一定流速で流した。
ウラシルを注入した結果、溶出時間は3.5分であった。
スプリッター12には、抵抗管25として内径0.05mm、外径0.375mm、長さ5mのフューズドシリカキャピラリーカラムを取付けた。
当初、圧力は6.0Mpaであったが、40分後にカラム圧が急に上がり、推奨使用圧力の20Mpaを超え、カラム92が破損した。
スプリッター12側の抵抗管25が溶離液の汚れによって詰まってしまったのが原因であった。新しいフューズドシリカキャピラリーカラムに交換したところ、5.8Mpaとなり、溶出時間は3.9分となった。
異なる抵抗管を使用すると、2.9分となった。
結局、抵抗管の作成のバラつきが大きく保持に影響した。
【0021】
本発明カップフィルターEをスプリット流出口24側に取付けたところ、同じように圧力上昇が生じた。然し、カップフィルターEだけを替えて、同じ抵抗管25を使用したところ、同じ圧力で同じ保持時間が得られた。
本発明カップフィルターEを用いれば、抵抗管25本体が詰まらず、何回でも使用でき、再現性のよいデータが得られることになった。
又、当然ながらインジェクター側の入り口に同じ本発明のカップフィルターを入れることにより、インジェクターや本カラムの詰まりを防止することも出来る。
【0022】
次いで、前処理ロボットや注入用軽量シリンジなどのシリンジ針3及び細管5の使用について図12、図13により説明する。
注入用シリンジ針3及び細管5の先端に本願カップフィルターGを嵌合して被覆状態とすると、樹脂製であるため、その弾性により前処理ロボットなどのシリンジ針に被せるだけで、充分シールされる。
そのため、前処理における濾過に十分に使用できる。
従来の減圧濾過や遠心分離などと異なり、シリンジ針3の先部分に濾過のためのフィルター4が接触することになり、試料ロスがなく、微量成分の濾過に適する(図13)。
又、従来、減圧濾過では無理で、加圧濾過を必要とする不要物が多い試料に於いては、例えば、インジェクター91のヘッドに固定する。この固定の際にはフェラル29やオシネ30等を用いて締付固定する。
この締付固定は、チューブ1が樹脂製で弾性があるため、フェラル29等により確実に締付固定が出来る。
フェラル29は、テフロン(登録商標)、ダイフロン、ピークなどの樹脂製のものが繰り返し使用でき、推奨される。
【0023】
その後、プランジャー31により試料溶液を圧入すると、試料溶液中の不純物は、フィルター4により濾過され、インジェクター91のヘッドにシリンジ針32より直接圧入され、インチューブキャピラリーやモノリス構造体等へのダメージとなる浮遊物、他の流入を防ぎ、或いは少なくすることが出来る(図12)。したがって、HPLCに於いて、モノリスキャピラリー、インチューブSPEを用いて試料溶液7を濃縮し、分析を行う場合のそれらに対する詰まりの原因を除去し、インチューブキャピラリーやモノリスキャピラリーの交換の必要性をなくし、或いは減少させることが出来る。
【0024】
〔実施例12〕 図6と同じシステムにより、容器61を用い、細管5にカップフィルターCを取付け、グラジエントモードにした。
試料として、タンパク質を消化したペプチド試料をそのまま4方バルブ用注入ポートを経由し、25μLマイクロシリンジ(702N)で10μLを連続分析した。
図14にそのクロマトグラムを示す。
52回注入後にはカラム圧力の上昇が見られ、54回目に20Mpaを超え、カラムが使用できなくなった。
シリンジ針32の先端に本願カップフィルターGを被せ、バルブに直接接続し、同様に連続分析を行った。30回後にカップフィルターGが詰まり、液の注入が出来なくなったが、新しいカップフィルターCに交換することで問題なく注入できた。
20回毎にカップフィルターGを交換することにより、そのような詰まりもなく連続分析が可能となり、500回注入後でもカラム92の圧力上昇はなかった。
従来分析に於いては、このような試料による詰まりを防ぐため、遠心分離やフィルター濾過を行うが、試料が少量しか得られないタンパク質成分では、ロスが生じ、試料の前処理が出来なかった。又、高価な分析カラムが劣化することを諦めて分析することもあった。
【0025】
本発明のカップフィルターGは、シリンジ針3に簡単に被せることが出来、更にインジェクター91に直接、手締めタイプのジョイント30などで供締めで取付けることが出来るため、粘性試料でもカップと針の周りからの漏れがなくなる。
又、試料による詰まりが生じた場合には、カップフィルターGのみ簡単に取外し交換ができ、連続分析が可能となる。
それにより、濾過や遠心分離などの試料ロスがある前処理なしで注入することが出来る。又、上記試料を10分の1に希釈し、粘性を低くした試料ならば、弾力のある樹脂を被せるため、充分シールされ、金属針などを用いる前処理ロボットにも使用できた。
【0026】
本発明カップフィルターGを前処理ロボットの細管5に被せて、自動濾過を行い、そのまま注入しても、上記実施例と同じように本カラムの劣化を抑えることが出来た(図13)。
本実施例では、タンパクを対象としたため、メタルフリーのパットフィルターを使用しているが、金属影響のない試料ならば、金属製フィルターでもよく、又針径に合せてカップフィルター内径は自由に選択できる。
【0027】
〔実施例13〕 シリンジニードル部分の管内部にモノリス構造物が形成されている場合を例にとって以下に説明する。
200μLシリンジを用い、ニードル部分を外した状態で農薬を添加した水試料を吸引する。次いで、このシリンジに内径200μL、長さ50mm、オクタデシル基で化学修飾されたモノリス構造シリカチューブを取付ける。プランジャーを押下げてモノリス構造部分に通液し、目的成分を保持させる。
全ての試料を抽出後、吸引操作を行い、モノリス構造部分に残った水を除去する。次いで、ニードル部分をシリンジから取外す。別のシリンジで農薬を抽出する有機溶媒(ヘキサン:酢酸エチル=3:1)を20μL計り取る。そのシリンジの先端にモノリス構造部分の形成されたニードルを取付け、ガスクロマトグラフの注入口に差込む。プランジャーを押下げ、溶媒で目的とする農薬成分を溶出し、ガスクロマトグラフに導入する。
【0028】
注入口:40℃〜250℃ 1秒間に1℃昇温(オンカラム注入)
ガスクロマトグラフ温度:40℃(1分)〜250℃(5分) 1分間に15度昇温
カラム:ジメチルポリシロキサンを化学修飾したキャピラリーカラム 内径0.25mm、長さ15m、膜圧0.25mm
検出器:FPD 200℃
この試料分析のクロマトグラムを図15に示す。
1:ダイアジノン 2:イプロベンホス 3:フェニトロチオン 4:イソキサチオン 5:EPN
【0029】
この分析を10回連続分析した。10回注入後には試料の汚れによりプランジャーが詰まり動かなくなった。又、モノリス構造部分には肉眼でも汚れが見られた。
シリンジの先端にカップフィルターAを被せ、同様の操作を行った結果、10回注入後にも動きのもたつきは見られず、1回目と同じピークが得られた。
尚、モノリス構造部分の汚れも見られなかった。
【0030】
〔実施例14〕 本発明フィルターを用いたHPLCカラムについて実施例を図16、図17を用いて示す。
内径0.1mm、外径0.375、長さ150mmのフューズドシリカチューブカラム2に、HPLC用充填剤イナートシル(登録商標)ODS−3 70を35Mpaで、メタノール溶媒で充填した。
カラム2上流側入口に、カップフィルターDを隙間なく取付け、フェラル71、オシネ72を用いて共締めした。フェラル71とオシネ72が一体型のものでも良い。ジョイントの共締め位置(パイプ先端からフェラル71までの長さ73)は、インジェクションジョイントの奥行きに当てて合せ、デッドボリュームが出来ないような位置とした。
キャピラリー保護のため、外側には内径0.5mmのピークチューブ74を被せた。
カラム2下流側出口は、本発明ミッドフィルターFを隙間なく取付けた。ミッドフィルターF以後に圧力がかかる場合では、入り口側のようにジョイントにて共締めしてもよいが、本実施例では、ミッドフイルターF挿通のみとした。
以上のようにHPLCカラムを構成した。
ピークチューブ74等は樹脂製パイプのため、力を加えない限り、外れたりすることはないが、カラム後の抵抗により圧力が掛かる場合や、より取り扱いを行い易くするため、保護管をしっかり固定したい場合などには、図17の例のようにジョイント75を設けることにより、使い易くすることが出来る。
【0031】
従来タイプのカラムでは、フィルターを止めるためのジョイント部分が必ず必要となり、インジェクターには余分な配管を介して接続することになってしまう。
その例を以下に説明する。
内径0.1mm、外径0.375、長さ150mmのフューズドシリカチューブカラム2に、HPLC用充填剤イナートシル(登録商標)ODS−3 70を35Mpaで、メタノール溶媒で充填した。
ジョイント75にフィルター4を打ち込み、充填したキャピラリー2を差込み、フェラル71及びオシネ72にてジョイント75に締め込んだ。出口側も同じようにジョイントを接続し、従来タイプカラムを作成した(図18)。
入口側は、ジョイント75に配管76を奥まで入れ、フェラル71とオシネ72で締付けた。
インジェクター側は、インジェクター91におけるフェラルからの奥行き76に合せて、配管76をフェラル71とオシネ72にて接続した。配管76はオシネ72,72やフェラル71,71が接続できる限り短い長さのものを使用した。
従来カラムに於いては、ジョイント内部にフィルター4が埋め込められ、カラム2内の充填剤70の溶出を防ぐ構造になっている。特に入口側では、別途配管で接続する必要性が生じてしまい、充填剤フィルター入口がその配管の下流側になるため、配管部分は出来るだけ短くしてもまるまるデッドボリュームとなってしまう。
【0032】
本発明カップフィルターを用いたHPLCカラムでは、インジェクションジョイントの奥先までフィルターが入り込むため、配管によるデッドボリュームをなくすことができる。
更に、従来カラムでは、フィルターは充填カラム本体に入れられるか又は、ジョイントに組み込まれてしまうため、フィルターが詰まった場合には、高価なカラム全体の取替えやジョイント部分の取替えが必要となる。
本フィルターのチューブ部分は、弾力性のある樹脂であるため、カップフィルター交換のみでフィルターの目詰まりを直すことができる。
又、従来のフィルター部の打ち込みはジョイント内なので、状態を目視で確かめることができず、打ち込み具合によっては、充填剤の漏れが生じることもある。
本発明フィルターDでは、外側にフィルターが露出するため、目視確認が可能である。ミッドフィルターFにおいても、テフロン(登録商標)などの透過性の樹脂を用いれば、目視確認ができる。又、目視確認ができなくても、取外しが可能なため、カップフィルター単独での漏れ試験が可能である。
【0033】
従来のような配管接続したカラムと本発明インジェクターに直結したカラムで、図6または実施例9の装置を用いて、アセトニトリル/水=65/35、流速0.4μL/min 254nm、注入量10nL、試料1.アセトフェノン、2.ベンゼン、3.トルエン、4.ナフタレンの分析を行い、比較した。
従来カラムでは、シャープなピークが得られなかった(図19)が、本発明カラムでは4番目のナフタレンに於いて、理論段数11000段ピーク対象性1.14と良好な結果が得られた(図20)。
又、カップフィルター交換後でもデータに変化は見られなかった。
【0034】
〔実施例15〕 本発明カップフィルターHにHPLC用充填剤イナートシル(登録商標)ODS−3を35Mpaでメタノール溶媒で充填した。カラム上流側入口にカップフィルターDを隙間なく取付け、ジョイントにて共締めした。ジョイントの共締め位置は、実施例14と同様インジェクションジョイントの奥行きに当てて合せ、デッドボリュームができないような位置とした。カラム下流側は、検出器などの接続ができるようにジョイントにフェラル71とオシネ72で締付け、HPLC用カラムとした(図21)。
更にもう1種HPLC用カラムを作成した。充填されたカップフィルターHのフィルター側の端部を、インジェクター91に取付け、カラム下流側出口は本発明カップフィルターDを隙間なく取付け、ジョイントにて共締めした(図22)。
2種のHPLCカラムとした。
【0035】
図11の装置を用いて、インジェクターの前にスプリットを設けて、アセトニトリル/水/=65/35、流速2μL/min(スプリット1/20)254nm、注入量1nL、試料1.アセトフェノン、2.ベンゼン、3.トルエン、4.ナフタレンを分析した。
実施例14と同じように、両カラムとも理論段数11000段、ピーク対称性1.14と良好な結果が得られた。
カップフィルターHに充填した充填カラムでは、フィルターが内面としっかりと結合しているため、高圧充填が可能で、充填方向と異なる方向で分析してもシャープなピークが得られた。
【0036】
【発明の効果】
本発明の請求項1によれば、外径3mm以下の適宜長のチューブ端にフィルターを固定してカップフィルターとし、該カップフィルターに、フィルターに達するまでキャピラリーカラム、マイクロシリンジ等の細管を挿通させると共に、該細管をチューブ収納状態でジョイント或いはインジェクターに装着自在としたので、キャピラリーカラムやシリンジに挿通装着するだけで、液体試料中の浮遊物、沈殿物の濾過が行われ、試料としての使用可能状態にすることが出来る。然も、大掛かりな装置を必要とせず、操作は極めて容易に、その上簡単な装置で実施でき、又、試料ロスがなく、容器等の洗浄も必要としないので、更に生体試料等の取扱い困難な試料でも、キャピラリーカラム等の目詰まりが回避でき、分析工程も大幅に簡略化できる等実用効果著大である。
【0037】
又、請求項2によれば、カップフィルターは、抵抗管のパイプやカラム等の細管から簡単に取り外せ、交換が簡単である。
【0038】
又、請求項3によれば、シリンジ針3の先部分に濾過のためのフィルター4が接触されるため、試料ロスがない。更に、微量成分の濾過に有用である。
【0039】
又、請求項4によれば、インジェクションジョイントの奥先までカップフィルターが入り込み、フィルターが挿入口に面するため、配管によるデッドボリュームをなくすことが出来る。カップフィルター交換のみでフィルターの目詰まりを直すことが出来る。
【0040】
又、請求項5,6,7によれば、オシネ27を外すことにより、カップフィルターは着脱自在で、抵抗管となるパイプやカラムなどの細管から簡単に取り外すことができ、交換が極めて容易である。
【0041】
更に、請求項8によれば、フィルターの孔径は、0.1〜50μmであるので、請求項1の効果に加えて浮遊物、沈殿物による抵抗管等の目詰まりを回避し、本願カップフィルター通過の液体試料はそのまま殆んど手を加えることなく試料として分析工程へ供給することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明一実施例中央縦断面図
【図2】 本発明他実施例中央縦断面図
【図3】 本発明他実施例中央縦断面図
【図4】 本発明他実施例中央縦断面図
【図5】 本発明一使用例一部縦断側面説明図
【図6】 本発明他使用例概略説明図
【図7】 従来型フィルター使用による検出器を使用したUV吸収の変化を示す図
【図8】 本発明フィルター使用による検出器を使用したUV吸収の変化を示す図
【図9】 三方ジョイントを使用した従来型スプリット制御機構図
【図10】 三方ジョイントを使用した本発明スプリット制御機構図
【図11】 図10の本発明スプリット制御機構の一使用例説明図
【図12】 本発明シリンジ針への使用状態説明図
【図13】 本発明一実施例溶離液濾過状態説明図
【図14】 本発明フィルター利用による図6の装置を用いて得たクロマトグラム
【図15】 本発明一実施例を用いて得たクロマトグラム
【図16】 本発明フィルターを用いた一実施例カラム説明図
【図17】 本発明フィルターを用いた一実施例カラム説明図
【図18】 従来タイプのカラムの一部縦断側面説明図
【図19】 従来の装置を用いて得たクロマトグラム
【図20】 本発明一実施例の装置使用により得られたクロマトグラム
【図21】 本発明一実施例を用いて構成したカラムの一部縦断説明図
【図22】 本発明他実施例を用いて構成したカラムの一部縦断説明図
【符号の説明】
1 チューブ
2 キャピラリーカラム
3 シリンジ針
4 フィルター
5 細管
6 容器
7 試料溶液
8 ポンプ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a chromatography tube filter.
[0002]
[Prior art]
In chromatography, as a pretreatment of a sample, in order to remove a precipitate in the sample, it is treated using a centrifuge or filtered using various filters.
However, in the case of a liquid sample, since the liquid containing the sample component remains in the bottles, instruments, etc. used for these, further washing with the liquid is required and the liquid sample is diluted.
[0003]
In order to solve these problems, in HPLC, analysis is performed by further concentrating using a monolithic capillary instead of a loop or concentrating using in-tube SPE (solid phase extraction). (For example, see Patent Document 1)
These methods have a high concentration rate, and a sufficiently satisfactory result can be obtained only by using a sample of several hundred μL.
In the prior art, there is no efficient method for filtering a small sample of about several hundred μL, and the only method is to introduce it into an analyzer using a monolithic capillary or in-tube SPE without filtering. Absent. However, the monolith structure capillary and the in-tube SPE are constituted by a capillary tube having a small inner diameter, and fine floating matters that cannot be removed by pretreatment and floating matters mixed in the handling process cause clogging.
Recently, in bio-related analysis, the necessity of handling a very small amount of liquid of about several μL has increased, and analysis using a capillary such as a capillary has become important.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The handling of these ultra-small samples is difficult to use due to many sample losses in the conventional batch system such as sample transfer. For this reason, an online system-up device is required, and the device becomes large and expensive.
Actually, since a biological sample is difficult to dissolve in a liquid, clogging inside a thin tube is inevitable even if various systems, monolithic capillaries, or the like are used. In that case, it is necessary to replace the in-tube or the monolith structure capillary, and there are many problems such as requiring reassembly of the apparatus.
[0005]
There are no devices or filters that can solve these problems, and the troublesome work of removing suspended matters with a centrifuge or the like is indispensable even when handling extremely small amounts of components.
Further, recently, it has been proposed that a fused silica tube is directly filled with a filler and used as a separation column or a guard column.
At this time, when used in a high-pressure state, the filler falls out, so there is a danger in using it in a high-pressure state.
[0006]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-79001
[0007]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the present inventor has no sample loss when handling a very small amount of sample, and does not require a large-scale apparatus, and the sample, especially a liquid sample is filtered very easily with an extremely simple instrument. The sample is a filter that can be used as a sample with almost no modification.A filter is fixed to a tube end of an appropriate length having an outer diameter of 3 mm or less to form a cup filter, and a capillary tube, a microsyringe or the like is inserted into the cup filter until the filter reaches the filter, and the tube is stored in a tube storage state. Freely attachable to the injectorIt is characterized by that.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to embodiments shown in the drawings.
1 is a tube made of a synthetic resin such as Teflon (registered trademark), peak, etc., having an outer diameter of 3 mm or less. . The
[0009]
The mesh or sulpore diameter of the
The thickness of the
[0010]
The
In addition, it is possible to easily insert the filter by chamfering the end of the
[0011]
【Example】
[Example 1] One end of a Teflon (registered trademark)
[Example 2] One end of a Teflon (registered trademark)
[Example 3] One end of a Teflon (registered trademark)
[Example 4] One end of a
[Example 5] While one end of a
[Example 6] While expanding one end of a Teflon (registered trademark)
[Example 7] One end of a
[0012]
[Example 8] Both ends of a
20% tetramethoxysilane, 10% methyltrimethoxysilane, 5% polyethylene glycol, 0.1N acetic acid solution is filled into a pipe, sealed with silicon rubber, heated at 80 ° C for 12 hours, and monolith structure with primary pores The hybrid sol was made inside.
The primary pore can be controlled to 0.3 to 50 μm by adding polyethylene glycol.
A frit made only of an alkoxy run to which no buffer polymer such as polyethylene glycol was added did not have a monolith structure, had no sufficient through-holes, and had a high hydraulic pressure.
Cut at the central part, water is flowed from the joined end parts at 0.5 Mpa, leaving a 2.5 mm sol part joined to the inner surface of the both end parts, unreacted sol and unreacted unbound to the inner surface The reagent was removed.
Next, it heated at 150 degreeC and it was set as the cup filter H of 25.5 cm in length which produced the hybrid
In the case where the gel was prepared by the same method without forming the amorphous silica on the surface, the bonding with the surface did not occur, and the sol was completely removed by the cleaning process at 0.5 Mpa.
It can be said that gelation after the formation of the amorphous silica film is important for the production of the filter.
[0013]
[Example 9] Use as a solution filter will be described with reference to Figs.
When sucking the solution in the
At that time, the
[0014]
[Example 10] A specific example of the above example will be described.
A Teflon (registered trademark)
Initially, the pressure was 6 Mpa, but after about 30 minutes, the pressure in the
Similarly, when the cup filter A of the present application was put on the inlet Teflon (registered trademark)
The same results were obtained with cup filters B and C, which proved effective for solution filtration.
In the cup filter C, bubbles entered after about 6 hours, and the pump was lowered.
When it was replaced with a new cup filter C prepared in the same manner, it was found that bubbles were not generated and it could be used in the same manner as a general-purpose pump eluent filter.
[0015]
With a general-purpose stainless steel solution filter commercially available in the past and the cup filter A of the present invention, after changing the eluent to a 0.1% acetone aqueous solution, the time required for the actual UV absorption of the detector to change was examined.
Since the conventional filter has an internal capacity of several hundreds μL, the base slowly rose 40 minutes after the start of flow and became a constant base after 140 minutes. (Fig. 7)
In the cup filter A of the present invention, the
As described above, it was effective as a solution filter in capillary LC.
[0016]
A case where the split amount is controlled when a small amount of liquid is fed will be described with reference to FIGS. 9, 10, and 11.
[0017]
[0018]
Thus, when splitting using the three-way joint 12, the amount of the liquid flowing into the
[0019]
Therefore, the end of the
In this case, even if a
However, since the present cup filter E is covered, it can be detached by removing the
[0020]
[Example 11] A specific example of use of FIG. 11 is shown below.
A Teflon (registered trademark)
As a result of injecting uracil, the elution time was 3.5 minutes.
A fused silica capillary column having an inner diameter of 0.05 mm, an outer diameter of 0.375 mm, and a length of 5 m was attached to the
Initially, the pressure was 6.0 Mpa, but after 40 minutes, the column pressure suddenly increased, exceeding the recommended working pressure of 20 Mpa, and the
The cause was that the
Using a different resistance tube resulted in 2.9 minutes.
In the end, the variation in resistance tube production greatly affected retention.
[0021]
When the cup filter E of the present invention was attached to the
When the cup filter E of the present invention is used, the
Of course, the injector and the column can be prevented from being clogged by inserting the same cup filter of the present invention at the inlet of the injector.
[0022]
Next, the use of a
When the cup filter G of the present application is fitted to the tips of the
Therefore, it can be sufficiently used for filtration in the pretreatment.
Unlike conventional vacuum filtration and centrifugation, the
Conventionally, it is impossible to perform vacuum filtration, and a sample with many unnecessary materials requiring pressure filtration is fixed to the head of the
Since the
As the
[0023]
Thereafter, when the sample solution is press-fitted by the
[0024]
[Example 12] By the same system as FIG. 6, the
As a sample, a peptide sample digested with protein was directly passed through an injection port for a four-way valve, and 10 μL was continuously analyzed with a 25 μL microsyringe (702N).
FIG. 14 shows the chromatogram.
After 52 injections, an increase in column pressure was observed. At the 54th injection, the pressure exceeded 20 Mpa, and the column became unusable.
The tip of the
By changing the cup filter G every 20 times, continuous analysis was possible without such clogging, and the pressure of the
In the conventional analysis, centrifugation or filter filtration is performed to prevent such clogging by the sample. However, protein components that can be obtained in a small amount are lost, and the sample cannot be pretreated. In addition, there was a case where the analysis was given up because the expensive analytical column deteriorated.
[0025]
Since the cup filter G of the present invention can be easily put on the
When the sample is clogged, only the cup filter G can be easily removed and replaced, and continuous analysis is possible.
Thereby, it can inject | pour without pretreatment with sample loss, such as filtration and centrifugation. In addition, if the sample was diluted to 1/10 and the viscosity was lowered, the sample was covered with an elastic resin, so that it was sufficiently sealed and could be used for a pretreatment robot using a metal needle or the like.
[0026]
Even when the cup filter G of the present invention was placed on the
In this example, a protein-free pad filter is used because protein is the target. However, if the sample has no metal influence, a metal filter may be used, and the inner diameter of the cup filter can be freely selected according to the needle diameter. it can.
[0027]
[Example 13] A case where a monolith structure is formed inside the tube of the syringe needle portion will be described below as an example.
Using a 200 μL syringe, the water sample to which the pesticide has been added is aspirated with the needle portion removed. Next, a monolith structure silica tube having an inner diameter of 200 μL, a length of 50 mm, and chemically modified with an octadecyl group is attached to the syringe. The plunger is pushed down and passed through the monolith structure part to hold the target component.
After extracting all samples, a suction operation is performed to remove water remaining in the monolith structure portion. The needle portion is then removed from the syringe. 20 μL of an organic solvent (hexane: ethyl acetate = 3: 1) for extracting the pesticide is measured with another syringe. A needle formed with a monolith structure portion is attached to the tip of the syringe and inserted into the inlet of the gas chromatograph. Push down the plunger to elute the desired agrochemical component with the solvent and introduce it into the gas chromatograph.
[0028]
Inlet: 40 ° C to 250 °
Gas chromatograph temperature: 40 ° C. (1 minute) to 250 ° C. (5 minutes) 15 degree temperature rise per minute
Column: Capillary column chemically modified with dimethylpolysiloxane Inner diameter 0.25 mm, length 15 m, membrane pressure 0.25 mm
Detector: FPD 200 ° C
A chromatogram of this sample analysis is shown in FIG.
1: Diazinon 2: Iprobenfos 3: Fenitrothion 4: Isoxathion 5: EPN
[0029]
This analysis was continuously analyzed 10 times. After 10 injections, the plunger was clogged due to contamination of the sample and stopped moving. In addition, the monolith structure part was stained with the naked eye.
As a result of covering the tip of the syringe with the cup filter A and performing the same operation, there was no swaying movement even after 10 injections, and the same peak as the first was obtained.
In addition, the stain of the monolith structure part was not seen.
[0030]
[Example 14] Examples of the HPLC column using the filter of the present invention will be described with reference to Figs. 16 and 17.
A fused
The cup filter D was attached to the upstream inlet of the
In order to protect the capillaries, a
The mid filter F of the present invention was attached to the downstream outlet of the
The HPLC column was constructed as described above.
The
[0031]
In the conventional type column, a joint portion for stopping the filter is always required, and the injector is connected to the injector via an extra pipe.
An example of this will be described below.
A fused
The
On the inlet side, the
On the injector side, the
In the conventional column, the
[0032]
In the HPLC column using the cup filter of the present invention, since the filter enters the depth of the injection joint, dead volume due to piping can be eliminated.
Further, in the conventional column, the filter is put in the packed column body or incorporated in the joint. Therefore, when the filter is clogged, it is necessary to replace the entire expensive column or the joint part.
Since the tube portion of the filter is made of an elastic resin, the filter can be clogged only by replacing the cup filter.
Further, since the conventional filter portion is driven in the joint, the state cannot be visually confirmed, and the filler may leak depending on the driving state.
In the filter D of the present invention, since the filter is exposed to the outside, visual confirmation is possible. The mid filter F can be visually confirmed by using a permeable resin such as Teflon (registered trademark). Moreover, since it can be removed even if visual confirmation is not possible, a leak test with a cup filter alone is possible.
[0033]
A conventional column connected to a pipe and a column directly connected to the injector of the present invention, using the apparatus of FIG. 6 or Example 9, acetonitrile / water = 65/35, flow rate 0.4 μL / min 254 nm, injection amount 10 nL,
With the conventional column, a sharp peak was not obtained (FIG. 19), but with the fourth naphthalene in the column of the present invention, a good result was obtained with a theoretical plate number of 11000 and a peak coverage of 1.14 (FIG. 19). 20).
In addition, no change was seen in the data even after the cup filter was replaced.
[0034]
[Example 15] A cup filter H of the present invention was filled with a filler for HPLC Inertosyl (registered trademark) ODS-3 at 35 MPa with a methanol solvent. The cup filter D was attached to the column upstream side inlet without any gap, and was fastened together with a joint. The joint tightening position was adjusted to the depth of the injection joint in the same manner as in Example 14 and set to a position where dead volume was not possible. On the downstream side of the column, a HPLC column was obtained by tightening the joint with
Furthermore, another kind of HPLC column was prepared. The end of the filled cup filter H on the filter side was attached to the
Two types of HPLC columns were used.
[0035]
Using the apparatus of FIG. 11, a split is provided in front of the injector, acetonitrile / water / = 65/35,
As in Example 14, good results were obtained with a theoretical plate number of 11,000 and peak symmetry of 1.14 for both columns.
In the packed column packed in the cup filter H, since the filter was firmly bonded to the inner surface, high-pressure packing was possible, and a sharp peak was obtained even when analyzed in a direction different from the packing direction.
[0036]
【The invention's effect】
According to
[0037]
According to
[0038]
or,According to the third aspect, since the
[0039]
According to the fourth aspect of the present invention, since the cup filter enters the depth of the injection joint and the filter faces the insertion port, dead volume due to piping can be eliminated. Filter clogging can be corrected simply by changing the cup filter.
[0040]
According to the fifth, sixth, and seventh aspects, the cup filter can be detached by removing the
[0041]
Furthermore, according to
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a central longitudinal sectional view of an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a longitudinal sectional view of the center of another embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a central longitudinal sectional view of another embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a longitudinal sectional view of the center of another embodiment of the present invention.
FIG. 5 is an explanatory view of a part of a vertical cross-section of an example of use of the present invention.
FIG. 6 is a schematic explanatory diagram of another use example of the present invention.
FIG. 7 shows changes in UV absorption using a detector with a conventional filter.
FIG. 8 is a graph showing changes in UV absorption using a detector using the filter of the present invention.
Fig. 9 Diagram of conventional split control mechanism using three-way joint
FIG. 10: Split control mechanism diagram of the present invention using a three-way joint
11 is an explanatory diagram of an example of use of the split control mechanism of the present invention shown in FIG.
FIG. 12 is an explanatory diagram of the use state of the syringe needle of the present invention.
FIG. 13 is an explanatory diagram of eluent filtration state according to an embodiment of the present invention.
14 is a chromatogram obtained using the apparatus of FIG. 6 using the filter of the present invention.
FIG. 15 is a chromatogram obtained using an example of the present invention.
FIG. 16 is a column explanatory diagram of an embodiment using the filter of the present invention.
FIG. 17 is a column explanatory diagram of an embodiment using the filter of the present invention.
FIG. 18 is an explanatory side view of a part of a conventional column.
FIG. 19 is a chromatogram obtained using a conventional apparatus.
FIG. 20 is a chromatogram obtained by using the apparatus of one embodiment of the present invention.
FIG. 21 is a partial longitudinal cross-sectional explanatory view of a column constructed using one embodiment of the present invention.
FIG. 22 is a partially longitudinal explanatory view of a column configured by using another embodiment of the present invention.
[Explanation of symbols]
1 tube
2 Capillary column
3 Syringe needle
4 Filter
5 tubules
6 containers
7 Sample solution
8 Pump
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