JP4124397B2 - Bacteria with the ability to eliminate phthalates - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌およびその利用に関する。より詳細には、本発明は、フタル酸エステルを消失させる能力を有するＧｏｒｄｏｎｉａ属の細菌に関する。本発明は特に、フタル酸エステルを消失させる能力を有するＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓに、ならびにフタル酸エステルを消失させる能力を有する菌を用いるフタル酸エステルを消失させる方法、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌および培地の濃縮物を含むフタル酸エステルを消失させるための組成物、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌および培地の濃縮物を含むフタル酸エステル消失用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、環境ホルモンと総称される物質が、社会的に大きな問題を引き起こしている。環境ホルモンは、内分泌撹乱物質とも呼ばれ、極微量であっても、人間をはじめとする動物の体内で内分泌系を撹乱する作用を有する、人工または植物由来の化学物質である。環境ホルモンは、人間をはじめとする動物に対して明白な毒性効果を有することが指摘されている。環境ホルモンの作用によって、動物では、性転換、精子密度の減少等の生殖器官形成の異常が起きる。これらの異常は種の絶滅に繋がりかねない。それゆえ、自然環境から環境ホルモンを除去することが重要な課題となっている。
【０００３】
環境ホルモンの中でも、フタル酸エステルは、プラスチックを製造する際の可塑剤として用いられ、多量に製造および使用される。フタル酸エステルは環境中に放出されても生物分解されにくく、動物に対して長期にわたって影響を及ぼし続ける。それゆえ、自然環境からのフタル酸エステルの除去が重要な課題となっている。
【０００４】
Ｋｕｒａｎｅ，Ｒ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９７；８２９；１１８−３４には、Ｒｈｏｄｏｃｃｏｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓのほか数種の細菌がフタル酸エステルを分解することが記されているが、明確に示されているのはＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１という菌に限られている。それゆえ、フタル酸エステルを消失させる能力が高い細菌を単離することが望まれている。フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌を用いてフタル酸エステルを消失させる方法を提供することもまた望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、フタル酸エステルを消失させる能力を有する新たな微生物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株が優れたフタル酸ジ−２−エチルヘキシル消失能を有することを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【０００７】
本発明の細菌は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌であって、ここで１０8個／ｍｌの該細菌を５００ｐｐｍの以下の式：
【０００８】
【化５】
を有するフタル酸エステルを含む規定培地中で３０℃にて３０時間培養した場合に、該フタル酸エステルの８０％以上が消失し、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素およびアルキルからなる群から選択されるがＲ1およびＲ2は同時に水素ではない。
【００１０】
１つの実施態様では、上記細菌は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓであり得る。
【００１１】
１つの実施態様では、上記フタル酸エステルは、環境ホルモンであり得る。
【００１２】
１つの実施態様では、上記アルキルは、独立して、１〜１５個の炭素原子を有し得る。
【００１３】
１つの実施態様では、上記式においてＲ1およびＲ2の少なくとも一方は、２−エチルヘキシル基であり得る。
【００１４】
１つの実施態様では、上記フタル酸エステルは、フタル酸ジ−２−エチルヘキシルであり得る。
【００１５】
１つの実施態様では、上記規定培地は、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏液、およびＮＢ培地からなる群より選択され得る。
【００１６】
本発明のＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されている。
【００１７】
本発明の方法は、フタル酸エステルを消失させる方法ある。この方法は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌を、以下の式：
【００１８】
【化６】
を有するフタル酸エステルを含む溶液中で培養する工程を包含する。ここで、該細菌は、１０8個／ｍｌの該細菌を５００ｐｐｍのフタル酸エステルを含む規定培地中で３０℃にて３０時間培養した場合に、該フタル酸エステルの８０％以上を消失させる細菌であり、Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素およびアルキルからなる群から選択されるがＲ1およびＲ2は同時に水素ではない。
【００２０】
１つの実施態様では、上記細菌は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓであり得る。
【００２１】
１つの実施態様では、本発明の方法では、上記フタル酸エステルは、環境ホルモンであり得る。
【００２２】
１つの実施態様では、本発明の方法では、上記アルキルは、独立して、１〜１５個の炭素原子を有し得る。
【００２３】
１つの実施態様では、本発明の方法では、Ｒ1およびＲ2の少なくとも一方は、２−エチルヘキシル基であり得る。
【００２４】
１つの実施態様では、本発明の方法では、上記フタル酸エステルは、フタル酸ジ−２−エチルヘキシルであり得る。
【００２５】
１つの実施態様では、本発明の方法では、上記規定培地は、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏液、およびＮＢ培地からなる群より選択され得る。
【００２６】
１つの実施態様では、本発明の方法では、上記細菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓであり得る。
【００２７】
本発明の組成物は、フタル酸エステルを消失させるための組成物である。この組成物は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌、および培地の濃縮物を含み、ここで、該細菌は、１０8個／ｍｌの該細菌を５００ｐｐｍの以下の式：
【００２８】
【化７】
を有するフタル酸エステルを含む規定培地中で３０℃にて３０時間培養した場合に、該フタル酸エステルの８０％以上を消失させる細菌であり、Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素およびアルキルからなる群から選択されるがＲ1およびＲ2は同時に水素ではなく、ここで該濃縮物は、フタル酸エステル消失を所望するサンプルと混合したときに、該細菌の増殖に適切である。
【００３０】
１つの実施態様では、本発明の組成物では、上記濃縮物は、上記サンプルと混合されたときに、該濃縮物と該サンプルとの混合物に対して、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏液、およびＮＢ培地からなる群より選択される培地の成分を含む組成を提供し得る。
【００３１】
１つの実施態様では、本発明の組成物では、上記濃縮物および上記規定培地は、それぞれ、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏液、およびＮＢ培地からなる群より選択される培地の濃縮物および規定培地であり得る。
【００３２】
本発明のキットは、フタル酸エステルを消失させるためのキットである。このキットは、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌、および培地の濃縮物を備え、ここで、該細菌は、１０8個／ｍｌの該細菌を５００ｐｐｍの以下の式：
【００３３】
【化８】
を有するフタル酸エステルを含む規定培地中で３０℃にて３０時間培養した場合に、該フタル酸エステルの８０％以上を消失させる菌であり、Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素およびアルキルからなる群から選択されるがＲ1およびＲ2は同時に水素ではなく、ここで該濃縮物は、フタル酸エステル消失を所望するサンプルと混合したときに、該細菌の増殖に適切である。
【００３５】
１つの実施態様では、本発明のキットでは、上記細菌は、生物活性を復元させ得る状態にあり、前記培地の濃縮物が乾燥粉末状態にあり得る。
【００３６】
１つの実施態様では、本発明のキットでは、上記濃縮物は、上記サンプルと混合されたときに、該濃縮物と該サンプルとの混合物に対して、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏液、およびＮＢ培地からなる群より選択される培地の成分を含む組成を提供し得る。
【００３７】
１つの実施態様では、本発明のキットでは、上記濃縮物および上記規定培地は、それぞれ、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏液、およびＮＢ培地からなる群より選択される培地の濃縮物および規定培地であり得る。
【００３８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３９】
本発明のＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、フタル酸エステル分解能を有する。Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、グラム陽性高ＧＣ含量細菌である。Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、ミコール酸含有放線菌群に分類され、ノカルジア科に属する。本発明のＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓを、フタル酸エステルを含む規定培地中で３０℃にて３０時間培養した場合、フタル酸エステルの８０％以上が消失し、好ましくは９０％以上が消失し、より好ましくは９５％以上が消失し、そして最も好ましくは１００％消失する。
【００４０】
本発明のＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓのＰ８２１９株は、工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として、２０００年１１月６日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。
【００４１】
本明細書中では、「フタル酸エステル」とは、以下の式に示す構造を有するフタル酸エステルをいう：
【００４２】
【化９】
上記化学式において、Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素およびアルキルからなる群から選択されるがＲ1およびＲ2は同時に水素ではない。好ましくは、Ｒ1およびＲ2は同時にアルキルである。
【００４４】
本明細書中で用いられる「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の、不飽和結合を有さない炭化水素基を表し、特に指定がない場合、任意の鎖長を有する。
【００４５】
アルキルの例として、ｎ−メチル、ｎ−エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デセニル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−イコサニル、ｎ−ヘニコサニル、ｎ−ドコサニル、ｎ−トリアコンチルなどが挙げられる。
【００４６】
例えば、アルキルが「１〜１５個の炭素原子を有するアルキル」として記載されている場合、この基は例えば、ｎ−メチル、ｎ−エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デセニル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−イコサニル、ｎ−ヘニコサニル、ｎ−ドコサニル、ｎ−トリアコンチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニルまたはイソノニルを意味し得る。
【００４７】
好ましくは、アルキルは、独立して、１〜１５個の炭素原子を有するアルキルである。アルキルは、独立して、好ましくは２〜１５個、より好ましくは３〜１５個、さらにより好ましくは４〜１５個、さらにより好ましくは５〜１４個、さらにより好ましくは６〜１３個、さらにより好ましくは７〜１２個、さらにより好ましくは８〜１１個の炭素原子を有するアルキルであり、最も好ましくは８個の炭素原子を有するアルキルである。より好ましくは、Ｒ1およびＲ2の少なくとも一方は、２−エチルヘキシル基であり、さらにより好ましくはＲ1およびＲ2はいずれも２−エチルヘキシル基である。
【００４８】
フタル酸エステルは、好ましくは、環境ホルモンである。本明細書中で用いられる「環境ホルモン」とは、ホルモン様の作用を有する物質であって、ホルモンのかかわる過程を撹乱する物質をいう。環境ホルモンは、内分泌撹乱物質とも呼ばれる。環境ホルモンとして作用するフタル酸エステルの例としては、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジノニル、フタル酸ジイソノニル、フタル酸ジエチルなどが挙げられる。
【００４９】
本明細書中で用いられる「規定培地」とは、構成成分が全て規定されている培地をいう。規定培地は、一般的な細菌の培地であり得、例えば、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏培地、ＮＢ培地などの培地である。
【００５０】
Ｍ９培地の組成は、以下の実施例２に示すとおりである。普通ブイヨン培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、肉エキス３ｇ、ペプトン１０ｇ、および塩化ナトリウム５ｇを含み、ｐＨが７．０に調整された培地である。ハートインフュジョン培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、ウシ心臓滲出液５００ｇ、ペプトン１０ｇ、および塩化ナトリウム５ｇを含み、ｐＨが７．４に調整された培地である。トリプトソイブイヨン培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、トリプトン１７ｇ、ソイペプトン３ｇ、ブドウ糖２．５ｇ、および塩化ナトリウム５ｇを含み、ｐＨが７．３に調整された培地である。ツァペックドックス氏培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、ショ糖 ３０ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、ＮａＮＯ3 ２ｇ、およびＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇを含み、ｐＨが５．６に調整された培地である。ＮＢ培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、肉エキス３ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス２ｇ、および塩化ナトリウム２ｇを含み、ｐＨが７．０に調整された培地である。
【００５１】
本明細書中で用いられる「消失」とは、何らかの作用により、フタル酸エステルが検出されなくなることをいう。フタル酸エステルの消失は、フタル酸エステルの２つのエステル部分のうちのいずれか一方にのみ生じたエステル分解に起因してもよい。消失をもたらす原因の例としては、エステル分解、アルキル鎖の切断などが挙げられる。好ましくは、消失は、フタル酸エステルの２つのエステル部分のエステル分解によって生じる。
【００５２】
本発明のＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、当該分野で公知のスクリーニング方法によって天然のサンプルから単離され得る。このようなスクリーニング方法の例として、フタル酸エステルを唯一の炭素源としてサンプルの培養を行い、フタル酸エステルを消失させる細菌を濃縮し、そして単離する方法が挙げられる。天然のサンプルは、例えば、フタル酸エステルを排出する工場の汚水、下水処理場の活性汚泥、廃棄物処理場の土壌などであり得る。
【００５３】
あるいは、本発明のＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、フタル酸エステル分解能を保持していさえすれば、ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託された菌株に変異誘発処理を行うことにより得られるか、または天然に変異を受けた誘導体であってもよい。そのような変異誘発処理は当該分野で周知であり、そのような変異誘発処理を行うための変異原としては、α線、β線、γ線およびＸ線のような物理的変異原、ならびにニトロソグアニジンおよびベンゾピレンのような化学的変異原が挙げられる。
【００５４】
本発明のフタル酸エステルの分解方法では、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌を用いる。この方法では、上記で規定したフタル酸エステルを含む溶液中で培養する工程を包含する。この方法で用いられる溶液は、フタル酸エステルを消失させることを所望するサンプル自体であってもよいし、このサンプルに無機塩（例えば、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、ＮＨ4ＣｌおよびＮａＣｌ）を添加して、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌の培養に、より適したものとなるように成分を調整したものであってもよい。好ましくは、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌の培養に適切であるように成分の調整を行う。
【００５５】
本発明の方法では、例えば、フタル酸エステルを少なくとも部分的に消失させることが所望されるサンプルに、無機成分などを添加して、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌の培養に適切な溶液を調製する。次いで、この溶液に、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌を添加する。添加する細菌は、予め前培養を行って順調に増殖している状態にあってもよいし、そうでなくともよい。予め前培養を行うことが好ましい。溶液に添加する細菌の量は、適切に選択され得るが、代表的には、溶液１ｍｌあたり約１０3〜１０9個、好ましくは約１０4〜１０8個、より好ましくは約１０6〜１０8個である。
【００５６】
フタル酸エステルを含む溶液に、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌を添加した後、この溶液は、約１０℃〜約４５℃、好ましくは約２０℃〜約４０℃、最も好ましくは約３０℃にて培養される。培養を行う際には、溶液を攪拌してもよいし、攪拌しなくともよい。好ましくは、溶液を攪拌しながら培養を行う。
【００５７】
本発明のフタル酸エステルを消失させるための組成物は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌、および培地の濃縮物を含む。培地の濃縮物は、フタル酸エステル消失を所望するサンプルと混合したときに、細菌の増殖に適切である。培地の濃縮物の例としては、前記濃縮物が、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏液、およびＮＢ培地からなる群より選択される培地の濃縮物である。本発明の組成物は、例えば、フタル酸エステルを少なくとも部分的に消失させることが所望されるサンプルと混合して使用するために好適である。
【００５８】
本発明のフタル酸エステルを消失させるためのキットは、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌、および培地の濃縮物を備える。このキットにおいては、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌は、生物活性を復元させ得る状態にあることが好ましい。例えば、このような細菌は、ガラス、プラスチックなどで作製された管状物中に封入され得る。また、細菌は、ゼラチンなどのコーティング剤で包まれたカプセル剤（好ましくは、ソフトカプセル剤）中に封入され得る。培地の濃縮物は、乾燥粉末状態にあることが好ましい。
【００５９】
【実施例】
（実施例１：フタル酸エステル分解菌の単離）
約５００種類の土壌サンプルを滅菌水中に懸濁した。寒天を２．０％添加したＭ９培地中にこの懸濁したサンプル１００μｌプレーティングした。このプレート上にフタル酸ジエチルヘキシルの油滴を置き、２５℃にて２４０時間インキュベートした。これにより、フタル酸−２−ジエチルヘキシルを利用し得る細菌のコロニーが得られた。これら３つのコロニーから細菌株を純化した。最終的に、１株の細菌コロニーを選択した。この株を、Ｐ８２１９株と命名した。
【００６０】
斜面培地とした標準寒天培地（水を溶媒として培地１リットル中に酵母エキス２．５ｇ、トリプトン５ｇ、グルコース１ｇ、および寒天１５ｇを含む；ｐＨ７．１）上でＰ８２１９株が示した菌学的性状を以下の表１に示す。
【００６１】
【表１】
（実施例２：フタル酸エステル分解菌の同定）
上記実施例１で得られた株の種を同定するために、Ｐ８２１９の１６Ｓ ｒ−ＤＮＡの塩基配列を決定し、これをＤＮＡデータベースの配列と比較した。詳細には、以下の通りである。
【００６３】
（１）ＤＮＡの調製
まず、Ｐ８２１９株を、２０ｍｌのＤＥＨＰ含有Ｍ９培地（１０００ｐｐｍのＤＥＨＰを含有するＭ９培地）に植菌し、３０℃のロータリーシェーカーにて１８０ｒｐｍにて３日間培養した。Ｍ９培地の組成は、以下の表２に示す通りである。
【００６４】
【表２】
得られた培養液を、１４，０００ｒｐｍにて１分間遠心分離を行い、上清を除去し、菌体を集菌した。得られた菌体に、Ｉｓｏｐｌａｎｔ ２キット（株式会社ニッポンジーン、富山市）のＳｏｌｕｔｉｏｎ １を３００μｌ加え、ボルテックスで撹拌し、よく懸濁させた。ピペッティングでさらに懸濁した。
【００６６】
次いで、Ｉｓｏｐｌａｎｔ ２キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ ２を１５０μｌ加え、ボルテックスで１０秒間撹拌し、よく懸濁させた。得られた懸濁液を５０℃で１０分間インキュベートすることにより、反応させた。次いで、インキュベート後の懸濁液にＩｓｏｐｌａｎｔ ２キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ ３−Ａを１００μｌ、Ｉｓｏｐｌａｎｔ ２キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ３−Ｂを１２０μｌ加えて攪拌した。続いてこの混合物を氷中にて１０分間反応させた。
【００６７】
反応後、１４００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、上清を取り出した。エッペンドルフチューブ中の上清５００μｌに対して、９９％エタノールを１０００μｌ加え、手でゆっくりと振り混ぜた。この操作によって、ＤＮＡが糸状になって現われた。次いで、７０％エタノールを１０００μｌ含むエッペンドルフに、この糸状のＤＮＡを加え、ピペッティングすることによって糸状のＤＮＡをよくリンスした。次いで、３０００ｒｐｍにて１０秒間遠心分離し、上清を除去した。得られたＤＮＡの沈澱を、５分間、減圧乾燥した。乾燥したＤＮＡに、５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．０および１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えて溶かし、ＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液を、４℃にて保存した。
【００６８】
（２）ＰＣＲによる１６Ｓ ｒ−ＤＮＡの増幅
ＤＮＡデーターベースを用いて、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓの近縁属で保存されている１６Ｓ ｒＲＮＡの領域の配列を決定した。この配列を参考にして、ＰＣＲプライマー（ｍａｒｉｓ ｆ１およびｍａｒｉｓ ｒ１）を作製した。ｍａｒｉｓ ｆ１の配列は、５’−ＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＴ−３’である（配列番号３）。ｍａｒｉｓ ｒ１の配列は、５’−ＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＧＴＴＧＣ−３’である（配列番号４）。
【００６９】
Ｐ８２１９株の総ＤＮＡを鋳型に１６Ｓ ｒ−ＤＮＡを増幅した。すなわち、１２μｌのプレミックス（１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4 ２μｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ、１単位／μｌ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−）１μｌ；東洋紡社製）に、各々５０ｐｍｏｌ／μｌのプライマーｍａｒｉｓ ｆ１およびｍａｒｉｓ ｒ１をそれぞれ２μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌのＰ８２１９株の総ＤＮＡを１μｌ、１単位／μｌのＫＯＤ−Ｐｌｕｓを１μｌ、２回蒸留水を３２μｌ添加して、合計容量を５０μｌとし、混合した。この混合液を、ＧｅｎｅＡｎｐ．ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ−２４００を使用して以下の反応条件でＰＣＲ増幅した：９４℃にて２分間反応の後、９４℃にて１５秒間、５５℃にて２秒間、および６８℃にて１分間の反応を４０サイクル行うことにより、ＰＣＲ産物を得た。増幅後、ＰＣＲ産物を４℃にて保存した。
【００７０】
（３）電気泳動によるＤＮＡの増幅の確認およびＤＮＡの切り出し
３００ｍｌ容の三角フラスコにＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ酢酸、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）を５０ｍｌ加え、さらにアガロースを０．７５ｇ（１．５％）加えた。樹脂フィルムで三角フラスコに蓋をした。三角フラスコを電子レンジで約１分間加熱し、アガロースを完全に融解させた。三角フラスコ内の溶液の温度が約６０℃に冷えてからエチジウムブロマイドを２μｌ加えた。その後、この溶液をゲル版に流し込み、３０分間程放置した。完全にゲルが固まったら電気泳動装置にセットし、ＴＡＥ緩衝液を流し込んだ。
【００７１】
パラフィルム上にＢＰＢ溶液（水を溶媒として、溶液の重量を基準として、ブロモフェノールブルー ０．１２５重量％およびＦｉｃｏｌｌ（ｔｙｐｅ ４００）１５重量％）を１μｌとり、ＤＮＡ（ＰＣＲ産物、またはコントロールのλＤＮＡ（λＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ１で切断したもの））１０μｌとよく混合した。
【００７２】
調製した試料の全量を電気泳動装置内のゲルに供与し、１００Ｖにて３０分間泳動した。
【００７３】
カッターナイフをエタノールにつけ、火であぶって滅菌を行った。
【００７４】
その後、Ｎｉｇｈｔｈａｗｋにてバンドを確認しながらゲルを切り出した。切り出したゲルを、エッペンドルフチューブに移した。
【００７５】
（４）増幅されたＤＮＡの精製
切り出したゲルを含むエッペンドルフチューブに、ＮａＩ（ｕｌｔｒａ ｓａｌｔ；Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｌａｎａ Ｂｅａｃｈ ＣＡ）を３００μｌ加えた。エッペンドルフチューブを３７℃のサーモヒーターにて１分間温めた。エッペンドルフチューブの内容物をよく撹拌し、完全にゲルを融解させた。
【００７６】
融解したゲルを含むエッペンドルフチューブに、ガラスマトリックス（ｕｌｔｒａ ｂｉｎｄ；Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｌａｎａ Ｂｅａｃｈ ＣＡ）を５μｌ加えた。ボルテックスを用いてエッペンドルフチューブの内容物を撹拌し、よく懸濁させた。室温にて５分間放置した。
【００７７】
５分間放置したエッペンドルフチューブを、１０，０００ｒｐｍにて２５秒間、遠心分離機にかけた（これを、フラッシングという）。ピペットマンを用いて上清を取り除き、沈澱を得た。
【００７８】
エッペンドルフチューブ中の沈澱に、ｕｌｔｒａ ｗａｓｈ（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｌａｎａ Ｂｅａｃｈ ＣＡ）を１，０００μｌ加えてリンスした。１０，０００ｒｐｍにて２５秒間、遠心分離機にかけた。ピペットマンを用いて上清を取り除き、沈澱を得た。フラッシング １０，０００ｒｐｍにて２５秒間、遠心分離機にかけた。ピペットマンを用いて上清を取り除き、沈澱を得た。
【００７９】
２０μｌの滅菌水を加え、ピペッティングすることにより、沈澱をよく溶かした。室温にて５分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて２０秒間遠心分離機にかけた。上清を別のエッペンドルフチューブに素早く移した。得られた上清は、１６Ｓ ｒ−ＤＮＡ溶液である。１６Ｓ ｒ−ＤＮＡ溶液を、配列決定反応に使用するまでは４℃にて保存した。
【００８０】
（５）配列決定反応
ｍａｒｉｓ ｆ１およびｍａｒｉｓ ｒ１を配列決定反応用プライマーとして用いて決定反応を行い、１６Ｓ ｒ−ＤＮＡの配列を増幅した。増幅した１６Ｓｒ−ＤＮＡを配列決定した。上記（４）で得た１６Ｓ ｒ−ＤＮＡをテンプレートとして用いた。
【００８１】
詳細には、ｍａｒｉｓ ｆ１プライマー１μｌ、テンプレート ５μｌ、ターミネータープレミックス（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、千葉、日本）８μｌ、および二回蒸留水６μｌを含む反応物２０μｌ、またはｍａｒｉｓ ｒ１プライマー１μｌ、テンプレート５μｌ、ターミネータープレミックス８μｌ、および二回蒸留水６μｌを含む反応物２０μｌについて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９６℃にて１分間の後に、９６℃にて１０秒間、５０℃にて５秒間、および６０℃にて４分間の反応を２５サイクル行い、配列決定用ＰＣＲ産物を得た。得られた配列決定用ＰＣＲ産物を、精製するまで４℃にて保存した。
【００８２】
（６）ＤＮＡの精製
上記（５）で得られた配列決定用ＰＣＲ産物を、チビタン（小型遠心機）を用いて１０秒間遠心分離した（すなわち、フラッシングした）。それぞれ２０μｌのＤＮＡ溶液（上清）を、２本のエッペンドルフチューブに移した。３Ｍ酢酸ナトリウム２μｌを各々のエッペンドルフチューブに加えた。さらに、９５％エタノール５０μｌをエッペンドルフチューブに加えた。次いで、各々のエッペンドルフチューブの内容物をボルテックスを用いて１０秒間撹拌した後、室温にて１５分間放置した。
【００８３】
次いで、各々のエッペンドルフチューブを、１５０００ｒｐｍにて２０分間、遠心分離機にかけた。遠心分離後の各々のエッペンドルフチューブに、７０％エタノールを２５０μｌ加えた。次いで、各々のエッペンドルフチューブを、１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離機にかけた。遠心分離後、上清（すなわち、エタノール画分）を２００μｌ取り除き、沈澱を得た。この沈澱に、５分間の減圧乾燥を行った。
【００８４】
乾燥した沈澱に、ＴＳＲ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ，ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を２０μｌ加えた後、ボルテックスを用いて１分間撹拌し、溶液を得た。次いで、チビタンを用いて、この溶液を１０秒間遠心分離した（フラッシング）。９５℃のサーモヒーターを用いてこの溶液を２分間温め、沈澱を完全に溶かした。温めた後、この溶液を含むエッペンドルフチューブを素早く氷中に移し２分間冷却した。
【００８５】
冷却後の溶液を測定用チューブに移し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにセットして塩基配列を決定した。このようにして、増幅したＤＮＡ断片を直接配列決定し、塩基配列の一部を決定した。
【００８６】
さらに、決定した配列をもとに新たな配列決定用プライマー（ｆ２、ｒ２、およびｒ３）を作成し、直接配列決定を行った。これを繰り返し、増幅ＤＮＡの全長の塩基配列を決めた。
【００８７】
決定した塩基配列の情報を基に、最初の領域の外側に新たなプライマー対（ｆ０、およびｒ０）を作製し、再びＰＣＲ増幅を行って、全長１５５７ｂｐの領域の塩基配列（配列番号１）を決定した。これらのプライマーの位置関係を、図１に示す。矢印は、ＰＣＲ増幅によってポリヌクレオチド鎖の伸長が起きる方向を示す。
【００８８】
決定した塩基配列（配列番号１）を既存のＤＮＡデータベースに対してホモロジー検索した。この結果、Ｐ８２１９の１６Ｓ ｒＤＮＡと最もホモロジーの高い配列は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓの１６ＳｒＤＮＡであることがわかった。Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を、配列番号２に示す。Ｐ８２１９の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列とＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓの１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列との間のアライメントの結果を、図２Ａ〜図２Ｃに示す。図２Ａ〜図２Ｃでは、★は、これら２つの間で塩基が同一であることを示す。
【００８９】
さらに、既存のＤＮＡデータベースに対してホモロジー検索した結果、Ｐ２０８１２株の塩基配列とホモロジーの高い塩基配列を有する菌およびＰ２０８１２について、Ｐａｇｅ，Ｒ．Ｄ．Ｍ．１９９６．ＴＲＥＥＶＩＥＷ：Ａｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｏｎ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １２：３５７−３５８を用いて進化系統樹を作成した。得られた進化系統樹を図３に示す。図３において、特定の２つの菌の間に存在する横線の長さの合計が、その２つの菌の間の進化距離を示している。進化距離が短いほど近縁であると考えられる。
【００９０】
このアライメントの結果、Ｐ８２１９の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓの１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と最大４塩基のみが異なっていた。率にすると９９．７％同一であることが判明した。したがって、Ｐ８２１９はＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓであると分類された。
【００９１】
（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株の炭素源資化性）
本発明者らが単離したＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株が文献で公知のＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓと同じ炭素源資化性を有するか確認するために、炭素源資化性を調べて、文献で公知のＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓの炭素源資化性と比較した。詳細には、以下の通りである。
【００９２】
（１）各種炭素源を含む酵母基本培地の作製
各種の酵母窒素基本（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）培地を作製した。酵母窒素基本培地の成分は、水を溶媒として０．０２ｇ／ｌ 酵母抽出物、１．７４ｇ／ｌ Ｋ2ＨＰＯ4、０．３６ｇ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4、０．０１ｇ／ｌ炭素源を含む。炭素源としては、ラムノース、フタル酸、Ｌ−バリン、アラビトール、ｐ−アミノ安息香酸、ＤＬロイシン、グルコン酸、アスパラギン酸、プロリン、アラニン、４−ヒドロキシ安息香酸、クエン酸３カリウム、コハク酸ナトリウム、グルコース、またはスクロースのいずれか１種を用いた。
【００９３】
まず、１リットルのビーカーに脱イオン水を適量加え、必要量の酵母抽出物、Ｋ2ＨＰＯ4およびＫＨ2ＰＯ4を加えて溶解させた後、脱イオン水で１リットルにメスアップした。メスアップして得られた混合物を、５０ｍｌずつ１００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、次いで０．０１ｇ／ｌになる量の炭素源を加えてよく混合し、ｐＨを７．５に調整した。次いで、得られた各種培地を、１２１℃で１５分間、オートクレーブで滅菌した。
【００９４】
ブランクとして、炭素源を加えない培地を同様に作製した。
【００９５】
（２）前培養
３００ｍｌ容の三角フラスコに、炭素源としてプロリンを用いた１００ｍｌの酵母窒素基本培地を分注し、１２１℃にて１５分間オートクレーブ滅菌を行い、前培養用培地を得た。次いで、クリーンベンチ内で、前培養用培地にＰ８２１９株の保存菌を２白金耳植菌した。植菌後、３０℃のロータリーシェイカーで２４時間培養した。
【００９６】
（３）本培養
前培養後、菌の増殖した培地を、各種の本培養用培地に対して３容量％（すなわち、それぞれ１．５ｍｌ）ずつ加えることにより植菌した。植菌後直ちにフラスコを攪拌して、植菌した菌株を分散させた。菌株が均質に分散したら、得られた分散液を、１種類の培地につき３サンプルずつ、９６穴プレートの各ウェルに各１００μｌ分注した。次いで、プレートを３０℃の恒温室に置くことにより、７時間静置培養した。
【００９７】
培養終了後、クリーンベンチ内で呈色試薬（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ；同仁堂化学製）を、培養物を含む各ウェルに各５μｌずつ加え、次いで、３０℃の恒温室にて２４時間呈色反応させた。
【００９８】
呈色反応終了後、各ウェルから５０μｌの反応液を計り取り、分光光度計によってＯＤ４４５ｎｍを測定した。測定結果を以下の表３に示す。
【００９９】
【表３】
上記において呈色試薬を培養物に加えることにより、呈色反応が起こる。この呈色反応は、細胞数に比例するので、呈色反応の起きた溶液の吸光度を測定することによって、相対的に培養物中の細胞数を測定することが可能である。
【０１０１】
種々の炭素源を唯一の炭素源として使用した培地を調製し、細菌をそれぞれの培地に均等に植菌すると、その細菌の炭素源資化能に依存して細胞数に相違が生じる。すなわち、炭素源を資化できる細菌の数は増加するが、炭素源を資化できない細胞の数は増加しない。それゆえ、呈色反応後の培養物の吸光度を測定することにより、その細菌の種々の炭素源の資化能を把握することが可能である。従って、今回の実験では、吸光度の測定によって、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株の種々の炭素源の資化性に関する正確なデータを取得することができる。
【０１０２】
表３では、１種類の培地について得られた３つのサンプルのＯＤ４４５ｎｍでの測定値の平均値から、ブランクの３つのサンプルのＯＤ４４５ｎｍでの測定値の平均値を引いた値を最終値として示す。最終値が０より大きな場合、Ｐ８２１９株はその培地に加えられた炭素源を資化する能力があると判断し、資化能の欄に「あり」と標記した。一方、最終値が０以下である場合、資化能がないと判断し、資化能の欄に「なし」と標記した。
【０１０３】
この結果、Ｐ８２１９株は、ラムノース、Ｌ−バリン、アラビトール、ＤＬロイシン、グルコン酸、プロリン、アラニン、クエン酸３カリウム、グルコース、およびスクロースを資化する能力を有することがわかった。
【０１０４】
また、表３では、「Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ ｓｐ．Ｎｏｖ．，ａ ｒｕｂｂｅｒ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ａｕｔｏｍｏｂｉｌｅ ｔｙｒｅ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９９ １０月；４９第４部：１７８５−９１頁に記載されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓの炭素源資化能と比較し、資化能が一致した場合には「一致」と示し、一致しない場合には「不一致」と示した。
【０１０５】
この結果、Ｐ８２１９株は、フタル酸、アスパラギン酸およびヒドロキシ安息香酸を資化せず、ＤＬロイシンおよびアラニンを資化するという点で、文献に記載されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓと異なっていた。
【０１０６】
これらのことから、本願のＰ８２１９株は、文献に記載されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓとは生化学的性質が異なる、新規な株であることがわかった。
【０１０７】
（実施例４：Ｐ８２１９株を培養したときのフタル酸ジエチルヘキシル濃度の経時変化）
フタル酸ジエチルヘキシル（ＤＥＨＰ）を含有する培地中でＧｏｒｄｏｎｉａｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株を培養したときのＤＥＨＰ濃度の変化を測定した。これによってＤＥＨＰを完全に分解するのに要する時間を把握した。詳細には以下の通りである。
【０１０８】
（１）ＤＥＨＰ含有Ｍ９培地の調製
ＣａＣｌ2、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ以外の成分を含むＭ９培地を調製し、３００ｍｌ容量の三角フラスコに１００ｍｌを各々分注した。三角フラスコに蓋をして１２１℃にて１５分間オートクレーブ滅菌した後、適切な量のＣａＣｌ2およびＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏの溶液を無菌的に加えた。
【０１０９】
次いで、クリーンベンチ内で各々１００ｍｌのＭ９培地にＤＥＨＰを５０μｌずつ無菌的に加えた。これを仮に５００ｐｐｍと表現した。
【０１１０】
（２）前培養
上記（１）で調製したＤＥＨＰ含有Ｍ９培地にＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株を植菌し、３０℃のロータリシェイカーにて３日間、１８０ｒｐｍにて培養した。
【０１１１】
（３）本培養
上記（２）で３日間培養した前培養から３ｍｌ（すなわち、３％）を採取し、上記（１）で調製したＤＥＨＰ含有Ｍ９培地に植菌した。次いで、各々の測定時間（０時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２７時間、２９時間、３０時間、３１時間、および３２時間）まで３０℃のロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍにて培養した。
【０１１２】
（４）ＤＥＨＰ濃度の測定
各々の測定時間で、培養液にクロロホルム−メタノールの１：１混合液を１００ｍｌ加えた。但しブランクに関しては、植菌後すぐにクロロホルム−メタノール混合液を加えた。次いで、３０℃のロータリーシェイカーを用いて１５分間撹拌した。
【０１１３】
攪拌後、１０分間静置すると、培養液層と有機溶媒層とが分離した。上層が培養液層であり、下層が有機溶媒層である。有機溶媒層を蓋付き試験管に５ｍｌ採取した（各測定時間につき３本ずつ採取した）。採取した有機溶媒層を、３０００ｒｐｍにて５分間、遠心分離した。分離した有機溶媒層２００μｌを別の蓋付き試験管に採取した。この有機溶媒層に２８００μｌのクロロホルム−メタノールを加えて１５倍希釈とし、ボルテックスを用いてよく撹拌した。
【０１１４】
全量（３０００μｌ）を用いて２３５ｎｍにおける吸光スペクトルを測定し、２３５ｎｍの吸収極大値からＤＥＨＰ濃度を求めた。なお、この方法を用いて得られたＤＥＨＰ濃度はガスクロマトグラフィーによる測定値とよく一致した。したがって、吸光スペクトルによる測定は、一定の実験条件の範囲内で、簡便にＤＥＨＰの量を測定し得る方法であると考えられる。
【０１１５】
（５）結果
測定のデータを以下の表４に示す。
【０１１６】
【表４】
ブランクである０時間、６時間、および１２時間に関しては測定誤差の範囲にあると判断し、５００ｐｐｍとした。
【０１１８】
培地中のＤＥＨＰ濃度の経時変化のグラフを、図４に示す。
【０１１９】
本実施例により、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓＰ８２１９株は、培養３１時間にて５００ｐｐｍのＤＥＨＰを完全に分解する能力を持っていることが明らかとなった。また、培養開始から１２時間までは、ＤＥＨＰ分解能にみかけ上のラグがあることが分かった。
【０１２０】
本実施例のデータは、ピペットマン操作による誤差を減少させるため同一サンプルを３回採取し、誤差の大きいデータを削除した。そのために正確なデータであると判断できる。また、ガスクロマトグラフィーによって測定したＤＥＨＰ量の経時変化についてのグラフも、図４のグラフと同様に３０時間前後にて５００ｐｐｍのＤＥＨＰを分解した。そのため、今回の測定結果は、確かな再現性が得られたといえる。
【０１２１】
前培養に関しては、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株がペレット状の菌塊から分散を始めた３日目が最適であることが確認された。
【０１２２】
（実施例４：ＤＥＨＰの添加濃度とＤＥＨＰ分解の経時変化との関係）
Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９の増殖は、時間の経過に伴って指数関数的に増加すると考えられる。１０００ｐｐｍで添加したＤＥＨＰの分解の経時変化を測定し、５００ｐｐｍでＤＥＨＰを添加した場合と比べて、分解に２倍の時間を要さなければ、菌によって生産される酵素量が多くなっている可能性がある。そこで、ＤＥＨＰの添加濃度とＤＥＨＰ分解の経時変化との関係を調べた。
【０１２３】
（１）ＤＥＨＰ含有Ｍ９培地の調製
添加したＤＥＨＰの量を１００μｌ（すなわち、１０００ｐｐｍ）ずつに変更した以外は、上記実施例３の（１）と同様にしたＤＥＨＰ含有Ｍ９培地を調製した。
【０１２４】
（２）前培養
上記（１）で調製したＤＥＨＰ含有Ｍ９培地にＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株を植菌し、３０℃のロータリシェイカーにて３日間、１８０ｒｐｍにて培養した。
【０１２５】
（３）本培養
上記（２）で３日間培養した前培養から３ｍｌ（すなわち、３％）を採取し、上記（１）で調製したＤＥＨＰ含有Ｍ９培地に植菌した。次いで、各々の測定時間（０時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、および５６時間）まで３０℃のロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍにて培養した。
【０１２６】
（４）ＤＥＨＰ濃度の測定
各測定時間につき２本ずつサンプルを調製したこと、および最終段階で得られた有機溶媒層２００μｌに５６００μｌのクロロホルム−メタノールを加えて３０倍希釈としたこと以外は、上記実施例３と同様にＤＥＨＰ量の測定を行った。
【０１２７】
（５）結果
測定のデータを以下の表５に示す。
【０１２８】
【表５】
培地中のＤＥＨＰ濃度の経時変化のグラフを、図５に示す。図５では、１０００ｐｐｍで添加したＤＥＨＰを含む培地（実施例４）、および５００ｐｐｍで添加したＤＥＨＰを含む培地（実施例３）の両方の場合の経時変化を示す。１０００ｐｐｍのＤＥＨＰは、５０時間の培養で完全に分解された。
【０１３０】
この結果、ＤＥＨＰの減少はＤＥＨＰの濃度に関係ないこと、ＤＥＨＰの濃度に関係なくＤＥＨＰ分解の見かけのラグは約１５時間であること、およびＤＥＨＰが分解され始めるとほぼ直線に減少することが認められた。
【０１３１】
【発明の効果】
本発明により、フタル酸エステルを分解するＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓが提供される。この菌を用いることにより、環境ホルモンを消失させ得る。さらにこの菌を用いることにより、規定培地においてでも環境ホルモンが効率良く消失され得る。
【０１３２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株の１６Ｓ ｒ−ＤＮＡと、そのＤＮＡの配列決定のために用いたプライマーとの位置関係を模式的に示す。ｍａｒｉｓ ｆ１およびｍａｒｉｓ ｒ１は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓの近縁属で保存されている１６Ｓ ｒ−ＤＮＡの配列に基づいて設計されたプライマーである。ｆ２、ｒ２およびｒ３は、ｍａｒｉｓ ｆ１およびｍａｒｉｓ ｒ１を用いて決定された配列から設計されたプライマーである。ｆ０およびｒ０は、決定された配列から設計されたプライマーであり、最初に用いたプライマーｍａｒｉｓ ｆ１およびｍａｒｉｓ ｒの外側の領域に対応する。
【図２Ａ】Ｐ８２１９の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列とＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓの１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列との間のアライメントを示す。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】図２Ｂの続きである。
【図２Ｄ】図２Ｃの続きである。
【図３】Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９の１６Ｓ ｒＤＮＡとホモロジーが高い１５菌株およびＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９について作成された進化系統樹を示す模式図である。
【図４】５００ｐｐｍのＤＥＨＰを含むＭ９培地でＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９を培養した場合の、培地中のＤＥＨＰ濃度の経時変化を示すグラフである。
【図５】１０００ｐｐｍまたは５００ｐｐｍのＤＥＨＰを含むＭ９培地でＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９を培養した場合の、培地中のＤＥＨＰ濃度の経時変化を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a bacterium having an ability to eliminate a phthalate ester and use thereof. More particularly, the present invention relates to bacteria of the genus Gordonia that have the ability to eliminate phthalate esters. In particular, the present invention relates to Gordonia polyisoprenivorans having the ability to eliminate phthalate esters, as well as a method for eliminating phthalate esters using bacteria having the ability to eliminate phthalate esters, bacteria having the ability to eliminate phthalate esters, and The present invention relates to a composition for eliminating a phthalate ester containing a medium concentrate, a bacterium having the ability to eliminate a phthalate ester, and a kit for eliminating a phthalate ester containing a medium concentrate.
[0002]
[Prior art]
In recent years, substances collectively called environmental hormones have caused great social problems. Environmental hormones are also called endocrine disruptors, and are artificial or plant-derived chemical substances that have the effect of disrupting the endocrine system in the body of animals, including humans, even in trace amounts. It has been pointed out that environmental hormones have a clear toxic effect on animals including humans. The effects of environmental hormones cause abnormalities in reproductive organ formation, such as sex change and decreased sperm density. These abnormalities can lead to species extinction. Therefore, removing environmental hormones from the natural environment has become an important issue.
[0003]
Among environmental hormones, phthalate esters are used as plasticizers in the production of plastics, and are produced and used in large quantities. Phthalate esters are less biodegradable when released into the environment and continue to affect animals for long periods of time. Therefore, removal of phthalates from the natural environment is an important issue.
[0004]
Kurane, R.A. Et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997; 829; 118-34 describe that Rhodococcus erythropolis and several other bacteria degrade phthalates, but it is clearly shown in R. It is limited to a bacterium called erythropolis S-1. Therefore, it is desirable to isolate bacteria having a high ability to eliminate phthalate esters. It was also desired to provide a method for eliminating phthalates using bacteria having the ability to eliminate phthalates.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is intended to solve the above problems, and an object thereof is to provide a new microorganism having an ability to eliminate phthalate esters.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that Gordonia polyisoprenivorans strain P8219 has an excellent ability to eliminate di-2-ethylhexyl phthalate, and based on this, the present invention has been completed.
[0007]
The bacterium of the present invention is a bacterium belonging to the genus Gordonia having the ability to eliminate a phthalate ester. 8 500 ppm of the bacteria / ml of the following formula:
[0008]
[Chemical formula 5]
When culturing at 30 ° C. for 30 hours in a defined medium containing phthalate having a concentration of 80% or more of the phthalate disappears, where R 1 And R 2 Are independently selected from the group consisting of hydrogen and alkyl, but R 1 And R 2 Is not hydrogen at the same time.
[0010]
In one embodiment, the bacterium may be Gordonia polyisoprenivorans.
[0011]
In one embodiment, the phthalate ester can be an environmental hormone.
[0012]
In one embodiment, the alkyl can independently have 1 to 15 carbon atoms.
[0013]
In one embodiment, R in the above formula 1 And R 2 At least one of may be a 2-ethylhexyl group.
[0014]
In one embodiment, the phthalate ester can be di-2-ethylhexyl phthalate.
[0015]
In one embodiment, the defined medium may be selected from the group consisting of M9 medium, normal bouillon medium, heart infusion medium, tryptosy bouillon medium, zapec docx solution, and NB medium.
[0016]
Gordonia polyisoprenivorans of the present invention has been deposited under the accession number FERM P-18102 of the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0017]
The method of the present invention is a method for eliminating phthalate esters. In this method, a bacterium belonging to the genus Gordonia having the ability to eliminate phthalates is represented by the following formula:
[0018]
[Chemical 6]
Culturing in a solution containing a phthalate ester having Here, the bacteria are 10 8 A bacterium that loses 80% or more of the phthalate ester when cultured at 30 ° C. for 30 hours in a defined medium containing 500 ppm of phthalate ester / ml, 1 And R 2 Are independently selected from the group consisting of hydrogen and alkyl, but R 1 And R 2 Is not hydrogen at the same time.
[0020]
In one embodiment, the bacterium may be Gordonia polyisoprenivorans.
[0021]
In one embodiment, in the method of the present invention, the phthalate ester may be an environmental hormone.
[0022]
In one embodiment, in the method of the invention, the alkyl can independently have 1 to 15 carbon atoms.
[0023]
In one embodiment, the method of the present invention provides R 1 And R 2 At least one of may be a 2-ethylhexyl group.
[0024]
In one embodiment, in the method of the present invention, the phthalate ester may be di-2-ethylhexyl phthalate.
[0025]
In one embodiment, in the method of the present invention, the defined medium may be selected from the group consisting of M9 medium, normal bouillon medium, heart infusion medium, tryptosy bouillon medium, zapek dox solution, and NB medium. .
[0026]
In one embodiment, in the method of the present invention, the bacterium may be Gordonia polyisoprevivorans deposited under the Institute of Biotechnology, Industrial Technology Research Institute accession number FERM P-18102.
[0027]
The composition of the present invention is a composition for eliminating phthalate esters. The composition comprises a bacterium belonging to the genus Gordonia having the ability to eliminate phthalate esters, and a concentrate of the medium, wherein the bacterium is 10 8 500 ppm of the bacteria / ml of the following formula:
[0028]
[Chemical 7]
Is a bacterium that loses 80% or more of the phthalate ester when cultivated in a defined medium containing phthalate ester having a pH of 30 ° C. for 30 hours. 1 And R 2 Are independently selected from the group consisting of hydrogen and alkyl, but R 1 And R 2 Are not simultaneously hydrogen, where the concentrate is suitable for growth of the bacteria when mixed with a sample in which phthalate disappearance is desired.
[0030]
In one embodiment, in the composition of the present invention, when the concentrate is mixed with the sample, the concentrate is mixed with M9 medium, normal bouillon medium, heart infusion. A composition comprising a component of a medium selected from the group consisting of a medium, a tryptic soy bouillon medium, a Czapek Docs solution, and an NB medium may be provided.
[0031]
In one embodiment, in the composition of the present invention, the concentrate and the defined medium are M9 medium, normal bouillon medium, heart infusion medium, tryptosy bouillon medium, zapek dox solution, and NB medium, respectively. A concentrate of medium selected from the group consisting of and a defined medium.
[0032]
The kit of the present invention is a kit for eliminating a phthalate ester. The kit comprises a bacterium belonging to the genus Gordonia that has the ability to eliminate phthalate esters, and a concentrate of the medium, wherein the bacterium is 10 8 500 ppm of the bacteria / ml of the following formula:
[0033]
[Chemical 8]
Is a bacterium that eliminates 80% or more of the phthalate ester when cultured in a defined medium containing phthalate ester having a pH of 30 ° C. for 30 hours, and R 1 And R 2 Are independently selected from the group consisting of hydrogen and alkyl, but R 1 And R 2 Are not simultaneously hydrogen, where the concentrate is suitable for growth of the bacteria when mixed with a sample in which phthalate disappearance is desired.
[0035]
In one embodiment, in the kit of the present invention, the bacterium can be restored to biological activity, and the concentrate of the medium can be in a dry powder state.
[0036]
In one embodiment, in the kit of the present invention, when the concentrate is mixed with the sample, M9 medium, normal broth medium, heart infusion medium is mixed with the mixture of the concentrate and the sample. A composition comprising a component of a medium selected from the group consisting of: a tryptic soy bouillon medium, a Czapedoc liquid, and an NB medium.
[0037]
In one embodiment, in the kit of the present invention, the concentrate and the defined medium are respectively from M9 medium, normal bouillon medium, heart infusion medium, tryptosy bouillon medium, zapek dox solution, and NB medium. It can be a concentrate of medium selected from the group consisting of and a defined medium.
[0038]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0039]
The Gordonia polyisoprenivorans of the present invention have phthalate ester resolution. Gordonia polyisoprenivorans is a gram-positive high GC content bacterium. Gordonia polyisoprenivorans are classified into the mycolic acid-containing actinomycetes group and belong to the Nocardia family. When Gordonia polyisoprenivorans of the present invention is cultured in a defined medium containing phthalate ester at 30 ° C. for 30 hours, 80% or more of the phthalate ester disappears, preferably 90% or more disappears, more preferably 95 % Or more disappear, and most preferably 100% disappears.
[0040]
The P8219 strain of Gordonia polyisoprenivorans of the present invention was deposited with the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on November 6, 2000, as Biotechnology Industrial Technology Laboratory accession number FERM P-18102.
[0041]
As used herein, “phthalate ester” refers to a phthalate ester having the structure shown in the following formula:
[0042]
[Chemical 9]
In the above chemical formula, R 1 And R 2 Are independently selected from the group consisting of hydrogen and alkyl, but R 1 And R 2 Is not hydrogen at the same time. Preferably R 1 And R 2 Are simultaneously alkyl.
[0044]
As used herein, “alkyl” refers to a straight or branched chain hydrocarbon group having no unsaturated bond, and has an arbitrary chain length unless otherwise specified.
[0045]
Examples of alkyl include n-methyl, n-ethyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, n-hexyl, n-heptyl, n-octyl, n-nonyl, n-decenyl, n-undecyl, Examples include n-dodecyl, n-tridecyl, n-tetradecyl, n-pentadecyl, n-icosanyl, n-henicosanyl, n-docosanyl, n-triacontyl and the like.
[0046]
For example, when alkyl is described as “alkyl having 1 to 15 carbon atoms”, the group may be, for example, n-methyl, n-ethyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, n- Hexyl, n-heptyl, n-octyl, n-nonyl, n-decenyl, n-undecyl, n-dodecyl, n-tridecyl, n-tetradecyl, n-pentadecyl, n-icosanyl, n-henicosanyl, n-docosanyl , N-triacontyl, isobutyl, tert-butyl, isopentyl, tert-pentyl, neopentyl, 2-ethylhexyl, n-nonyl or isononyl.
[0047]
Preferably, alkyl is independently alkyl having 1 to 15 carbon atoms. Alkyl is preferably preferably 2-15, more preferably 3-15, even more preferably 4-15, even more preferably 5-14, even more preferably 6-13, even more More preferred is an alkyl having 7 to 12, even more preferred 8 to 11 carbon atoms, and most preferred is an alkyl having 8 carbon atoms. More preferably, R 1 And R 2 At least one of them is a 2-ethylhexyl group, and even more preferably R 1 And R 2 Are all 2-ethylhexyl groups.
[0048]
The phthalate ester is preferably an environmental hormone. As used herein, “environmental hormone” refers to a substance having a hormone-like action and disturbing a process involving hormones. Environmental hormones are also called endocrine disruptors. Examples of phthalic acid esters that act as environmental hormones include di-2-ethylhexyl phthalate, dibutyl phthalate, dinonyl phthalate, diisononyl phthalate, and diethyl phthalate.
[0049]
As used herein, “defined medium” refers to a medium in which all components are defined. The defined medium may be a general bacterial medium, for example, a medium such as M9 medium, normal bouillon medium, heart infusion medium, tryptosy bouillon medium, Czapec-Dox medium, NB medium, and the like.
[0050]
The composition of the M9 medium is as shown in Example 2 below. Ordinary bouillon medium contains 3 g of meat extract, 10 g of peptone, and 5 g of sodium chloride per liter of medium using water as a solvent, and has a pH adjusted to 7.0. The heart infusion medium is a medium containing 500 g of bovine heart exudate, 10 g of peptone, and 5 g of sodium chloride per liter of medium using water as a solvent and having a pH adjusted to 7.4. The tryptic soy bouillon medium contains 17 g of tryptone, 3 g of soy peptone, 2.5 g of glucose, and 5 g of sodium chloride per liter of medium using water as a solvent, and the pH is adjusted to 7.3. Czapec Dok's medium uses 30g of sucrose per liter of medium with water as the solvent 2 HPO Four 1g MgSO Four ・ 7H 2 O 0.5g, KCl 0.5g, NaNO Three 2 g, and FeSO Four ・ 7H 2 A medium containing 0.01 g of O and having a pH adjusted to 5.6. The NB medium contains 3 g of meat extract, 5 g of polypeptone, 2 g of yeast extract, and 2 g of sodium chloride per liter of medium using water as a solvent, and the pH is adjusted to 7.0.
[0051]
As used herein, “disappearance” means that phthalate is no longer detected due to some action. The disappearance of the phthalate ester may be due to ester decomposition occurring only in one of the two ester moieties of the phthalate ester. Examples of causes causing disappearance include ester decomposition, alkyl chain cleavage and the like. Preferably, the disappearance occurs by esterification of the two ester moieties of the phthalate ester.
[0052]
The Gordonia polyisoprenivorans of the present invention can be isolated from natural samples by screening methods known in the art. An example of such a screening method is a method of culturing a sample using phthalate ester as a sole carbon source, concentrating and isolating bacteria that eliminate phthalate ester. Natural samples can be, for example, factory sewage that discharges phthalates, activated sludge from sewage treatment plants, soil from waste treatment plants, and the like.
[0053]
Alternatively, the Gordonia polyisoprenivorans of the present invention can be obtained by subjecting a strain deposited as FERM P-18102 to mutagenesis or having been naturally mutated as long as it retains phthalate ester resolution. It may be a derivative. Such mutagenesis treatments are well known in the art, and mutagens for performing such mutagenesis treatments include physical mutagens such as α-rays, β-rays, γ-rays and X-rays, and nitroso. Chemical mutagens such as guanidine and benzopyrene.
[0054]
In the method for decomposing a phthalate according to the present invention, a bacterium belonging to the genus Gordonia and having an ability to eliminate the phthalate is used. This method includes the step of culturing in a solution containing the phthalate ester defined above. The solution used in this method may be the sample itself that desires to eliminate the phthalate ester, or it may contain an inorganic salt (eg, Na 2 HPO Four , KH 2 PO Four , NH Four Cl and NaCl) may be added to adjust the components so that they are more suitable for culturing bacteria having the ability to eliminate phthalate esters. Preferably, the ingredients are adjusted to be suitable for culturing bacteria having the ability to eliminate phthalate esters.
[0055]
In the method of the present invention, for example, a solution suitable for culturing bacteria having an ability to eliminate phthalate ester by adding an inorganic component or the like to a sample in which it is desired to at least partially eliminate phthalate ester. To prepare. Next, bacteria having the ability to eliminate the phthalate ester are added to this solution. The bacterium to be added may be in a state in which pre-culture has been performed in advance and is growing smoothly or not. Pre-culture is preferably performed in advance. The amount of bacteria added to the solution can be selected appropriately, but typically is about 10 per ml of solution. Three -10 9 Pieces, preferably about 10 Four -10 8 , More preferably about 10 6 -10 8 It is a piece.
[0056]
After the addition of bacteria having the ability to dissipate the phthalate ester to the solution containing the phthalate ester, the solution is about 10 ° C to about 45 ° C, preferably about 20 ° C to about 40 ° C, most preferably about 30 ° C. Incubate at ℃. When culturing, the solution may or may not be stirred. Preferably, the culture is performed while stirring the solution.
[0057]
The composition for eliminating a phthalate ester of the present invention includes a bacterium belonging to the genus Gordonia having an ability to eliminate a phthalate ester, and a culture medium concentrate. The media concentrate is suitable for bacterial growth when mixed with a sample in which phthalate disappearance is desired. As an example of the medium concentrate, the concentrate is a medium selected from the group consisting of M9 medium, normal bouillon medium, heart infusion medium, tryptosy bouillon medium, Czapek Dox solution, and NB medium. It is a thing. The composition of the present invention is suitable for use, for example, in admixture with a sample where it is desired to at least partially eliminate the phthalate ester.
[0058]
The kit for eliminating a phthalate ester according to the present invention comprises a bacterium belonging to the genus Gordonia having an ability to eliminate a phthalate ester, and a culture medium concentrate. In this kit, it is preferable that the bacterium having the ability to eliminate the phthalate ester is in a state where the biological activity can be restored. For example, such bacteria can be encapsulated in a tube made of glass, plastic or the like. Bacteria can be encapsulated in a capsule (preferably a soft capsule) wrapped with a coating agent such as gelatin. The medium concentrate is preferably in a dry powder state.
[0059]
【Example】
(Example 1: Isolation of phthalate ester-degrading bacteria)
About 500 soil samples were suspended in sterile water. 100 μl of this suspended sample was plated in M9 medium supplemented with 2.0% agar. Oil droplets of diethylhexyl phthalate were placed on the plate and incubated at 25 ° C. for 240 hours. Thereby, a bacterial colony capable of utilizing 2-diethylhexyl phthalate was obtained. Bacterial strains were purified from these three colonies. Finally, one bacterial colony was selected. This strain was designated as P8219 strain.
[0060]
Mycological properties of the P8219 strain on a standard agar medium (containing 2.5 g yeast extract, 5 g tryptone, 1 g glucose, and 15 g agar; pH 7.1 in 1 liter medium using water as a solvent) as a slant medium Is shown in Table 1 below.
[0061]
[Table 1]
(Example 2: Identification of phthalate ester-degrading bacteria)
In order to identify the species of the strain obtained in Example 1 above, the base sequence of 16S r-DNA of P8219 was determined and compared with the sequence of the DNA database. The details are as follows.
[0063]
(1) Preparation of DNA
First, the P8219 strain was inoculated into 20 ml of DEHP-containing M9 medium (M9 medium containing 1000 ppm of DEHP) and cultured at 180 rpm on a rotary shaker at 30 ° C. for 3 days. The composition of the M9 medium is as shown in Table 2 below.
[0064]
[Table 2]
The obtained culture solution was centrifuged at 14,000 rpm for 1 minute, the supernatant was removed, and the cells were collected. 300 μl of
[0066]
Next, 150 μl of Isoplant 2 kit Solution 2 was added, and the mixture was vortexed for 10 seconds to be well suspended. The resulting suspension was allowed to react by incubating at 50 ° C. for 10 minutes. Next, 100 μl of Isoplant 2 Kit Solution 3-A and 120 μl of Isoplant 2 Kit Solution 3-B were added to the suspension after incubation and stirred. Subsequently, this mixture was reacted in ice for 10 minutes.
[0067]
After the reaction, the mixture was centrifuged at 1400 rpm for 10 minutes, and the supernatant was taken out. To 500 μl of the supernatant in the Eppendorf tube, 1000 μl of 99% ethanol was added and gently shaken by hand. By this operation, the DNA appeared as a filament. Next, the filamentous DNA was thoroughly rinsed by adding the filamentous DNA to an Eppendorf containing 1000 μl of 70% ethanol and pipetting. Subsequently, centrifugation was performed at 3000 rpm for 10 seconds, and the supernatant was removed. The resulting DNA precipitate was dried under reduced pressure for 5 minutes. To the dried DNA, 50 μl of TE buffer (10 mM Tris · HCl, pH 7.0 and 1 mM EDTA) was added and dissolved to obtain a DNA solution. The obtained DNA solution was stored at 4 ° C.
[0068]
(2) Amplification of 16S r-DNA by PCR
A DNA database was used to sequence the region of 16S rRNA that is conserved in related genera of Rhodococcus. With reference to this sequence, PCR primers (maris f1 and maris r1) were prepared. The sequence of maris f1 is 5′-CATGCAAGTCGAACGGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 3). The sequence of maris r1 is 5′-ATTCACCGCAGCGGTGC-3 ′ (SEQ ID NO: 4).
[0069]
16S r-DNA was amplified using the total DNA of the P8219 strain as a template. That is, 12 μl premix (10 ×
[0070]
(3) Confirmation of DNA amplification by electrophoresis and excision of DNA
50 ml of TAE buffer (40 mM Tris, 40 mM acetic acid, and 1 mM EDTA) was added to a 300 ml Erlenmeyer flask, and 0.75 g (1.5%) of agarose was further added. The Erlenmeyer flask was capped with a resin film. The Erlenmeyer flask was heated in a microwave oven for about 1 minute to completely melt the agarose. After the temperature of the solution in the Erlenmeyer flask cooled to about 60 ° C., 2 μl of ethidium bromide was added. Thereafter, this solution was poured into a gel plate and left for about 30 minutes. When the gel was completely solidified, it was set in an electrophoresis apparatus and TAE buffer was poured.
[0071]
Take 1 μl of BPB solution (0.125% by weight of bromophenol blue and 15% by weight of Ficoll (type 400) based on the weight of the solution, based on the weight of the solution, using water as a solvent) on parafilm, and add DNA (PCR product or control λDNA). (ΛDNA cut with HindIII and EcoR1)) well mixed with 10 μl.
[0072]
The total amount of the prepared sample was donated to the gel in the electrophoresis apparatus and electrophoresed at 100 V for 30 minutes.
[0073]
A cutter knife was placed in ethanol and sterilized by fire.
[0074]
Thereafter, the gel was cut out while confirming the band with Nightthawk. The excised gel was transferred to an Eppendorf tube.
[0075]
(4) Purification of amplified DNA
300 μl of NaI (ultra salt; Mo Bio Laboratories, Inc., Solana Beach CA) was added to the Eppendorf tube containing the cut-out gel. The Eppendorf tube was warmed with a 37 ° C. thermo heater for 1 minute. The contents of the Eppendorf tube were stirred well to completely melt the gel.
[0076]
5 μl of glass matrix (ultra bind; Mo Bio Laboratories, Inc., Solana Beach CA) was added to the Eppendorf tube containing the melted gel. The contents of the Eppendorf tube were stirred using a vortex and suspended well. Left at room temperature for 5 minutes.
[0077]
The Eppendorf tube left for 5 minutes was centrifuged at 10,000 rpm for 25 seconds (this is called flushing). The supernatant was removed using Pipetman to obtain a precipitate.
[0078]
The precipitate in the Eppendorf tube was rinsed by adding 1,000 μl of ultra wash (Mo Bio Laboratories, Inc., Solana Beach CA). Centrifuge for 25 seconds at 10,000 rpm. The supernatant was removed using Pipetman to obtain a precipitate. Flushing Centrifuged at 10,000 rpm for 25 seconds. The supernatant was removed using Pipetman to obtain a precipitate.
[0079]
20 μl of sterilized water was added, and the precipitate was dissolved well by pipetting. After leaving at room temperature for 5 minutes, it was centrifuged at 15,000 rpm for 20 seconds. The supernatant was quickly transferred to another eppendorf tube. The obtained supernatant is a 16S r-DNA solution. The 16S r-DNA solution was stored at 4 ° C. until used for sequencing reactions.
[0080]
(5) Sequencing reaction
Determination reaction was performed using maris f1 and maris r1 as primers for sequencing reaction, and the sequence of 16S r-DNA was amplified. Amplified 16Sr-DNA was sequenced. The 16S r-DNA obtained in (4) above was used as a template.
[0081]
Specifically, 1 μl of maris f1 primer, 5 μl of template, terminator premix (BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit; PE Biosystems, Chiba, Japan), 8 μl of primer or 20 μl of reaction product of 6 μl of double distilled water ar PCR was performed on 20 μl of reaction containing 1 μl,
[0082]
(6) DNA purification
The PCR product for sequencing obtained in the above (5) was centrifuged (ie, flushed) for 10 seconds using Chibitan (small centrifuge). 20 μl of each DNA solution (supernatant) was transferred to two Eppendorf tubes. 2 μl of 3M sodium acetate was added to each Eppendorf tube. In addition, 50 μl of 95% ethanol was added to the Eppendorf tube. Next, the contents of each Eppendorf tube were stirred for 10 seconds using a vortex and then allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
[0083]
Each Eppendorf tube was then centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes. To each Eppendorf tube after centrifugation, 250 μl of 70% ethanol was added. Each Eppendorf tube was then centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes. After centrifugation, 200 μl of the supernatant (that is, ethanol fraction) was removed to obtain a precipitate. This precipitate was dried under reduced pressure for 5 minutes.
[0084]
20 μl of TSR (Template Suppression Reagent, PE Biosystems) was added to the dried precipitate, followed by stirring for 1 minute using a vortex to obtain a solution. The solution was then centrifuged for 10 seconds (flushing) using Chibitan. The solution was warmed for 2 minutes using a 95 ° C. thermo-heater to completely dissolve the precipitate. After warming, the Eppendorf tube containing this solution was quickly transferred into ice and cooled for 2 minutes.
[0085]
The solution after cooling was transferred to a measuring tube and set in an ABI PRISM 310 Genetic Analyzer to determine the base sequence. Thus, the amplified DNA fragment was directly sequenced, and a part of the base sequence was determined.
[0086]
Furthermore, new sequencing primers (f2, r2, and r3) were prepared based on the determined sequence, and the sequencing was performed directly. This was repeated to determine the full-length base sequence of the amplified DNA.
[0087]
Based on the determined base sequence information, a new primer pair (f0 and r0) is prepared outside the first region, PCR amplification is performed again, and the base sequence (SEQ ID NO: 1) of the total length 1557 bp is determined. Were determined. The positional relationship of these primers is shown in FIG. The arrow indicates the direction in which the elongation of the polynucleotide chain occurs by PCR amplification.
[0088]
The determined base sequence (SEQ ID NO: 1) was subjected to homology search against an existing DNA database. As a result, it was found that the sequence having the highest homology with 16S rDNA of P8219 was 16S rDNA of Gordonia polyisoprenivorans. The base sequence of 16S rDNA of Gordonia polyisoprenivorans is shown in SEQ ID NO: 2. The alignment results between the base sequence of 16S rDNA of P8219 and the base sequence of 16S rDNA of Gordonia polyisoprenivorans are shown in FIGS. 2A to 2C. In FIGS. 2A-2C, * indicates that the base is the same between the two.
[0089]
Furthermore, as a result of homology search with respect to the existing DNA database, as for P20812 having a high homology with the base sequence of the P20812 strain and P20812, Page, R. D. M.M. 1996. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers. Evolutionary phylogenetic trees were generated using Computer Applications in the Biosciences 12: 357-358. The resulting evolutionary tree is shown in FIG. In FIG. 3, the sum of the lengths of horizontal lines existing between two specific bacteria indicates the evolution distance between the two bacteria. The shorter the evolution distance, the closer it is considered.
[0090]
As a result of this alignment, the base sequence of 16S rDNA of P8219 was different from the base sequence of 16S rDNA of Gordonia polyisoprenivorans only by a maximum of 4 bases. The ratio was found to be 99.7% identical. Therefore, P8219 was classified as Gordonia polyisoprenivorans.
[0091]
(Carbon source utilization of Gordonia polyisoprenivorans P8219 strain)
In order to confirm whether the Gordonia polyisoprenivorans strain P8219 isolated by the present inventors has the same carbon source assimilability as the Gordonia polyisoprenivorans known in the literature, the carbon source assimilability was examined, and Gordonia polyisoporisporispo Compared with carbon source utilization. The details are as follows.
[0092]
(1) Preparation of yeast basic medium containing various carbon sources
Various yeast nitrogen basic media were prepared. The components of the yeast nitrogen basic medium are 0.02 g / l yeast extract and 1.74 g / l K using water as a solvent. 2 HPO Four 0.36 g / l KH 2 PO Four 0.01 g / l carbon source. Examples of carbon sources include rhamnose, phthalic acid, L-valine, arabitol, p-aminobenzoic acid, DL leucine, gluconic acid, aspartic acid, proline, alanine, 4-hydroxybenzoic acid, tripotassium citrate, sodium succinate, Either one of glucose and sucrose was used.
[0093]
First, an appropriate amount of deionized water is added to a 1 liter beaker, and the required amount of yeast extract, K 2 HPO Four And KH 2 PO Four Was added and dissolved, and the volume was made up to 1 liter with deionized water. The mixture obtained by measuring up was dispensed in 50 ml aliquots into 100 ml Erlenmeyer flasks, and then mixed well by adding a carbon source in an amount of 0.01 g / l to adjust the pH to 7.5. Subsequently, the obtained various culture media were sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes.
[0094]
As a blank, a medium without adding a carbon source was similarly prepared.
[0095]
(2) Pre-culture
100 ml yeast nitrogen basic medium using proline as a carbon source was dispensed into a 300 ml Erlenmeyer flask, and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes to obtain a preculture medium. Next, in a clean bench, 2 platinum ears of P8219 stocks were inoculated into the preculture medium. After inoculation, the cells were cultured for 24 hours on a rotary shaker at 30 ° C.
[0096]
(3) Main culture
After the preculture, the medium in which the bacteria were grown was inoculated by adding 3% by volume (that is, 1.5 ml each) to various main culture media. Immediately after the inoculation, the flask was stirred to disperse the inoculated strain. When the strain was homogeneously dispersed, 100 μl of each of the resulting dispersions was dispensed into each well of a 96-well plate, 3 samples per medium. Next, the plate was placed in a thermostatic chamber at 30 ° C., and cultured for 7 hours.
[0097]
After completion of the culture, a coloring reagent (Cell Counting Kit; manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.) was added to each well containing the culture in a volume of 5 μl each, and then allowed to undergo a color reaction in a constant temperature room at 30 ° C. for 24 hours. .
[0098]
After completion of the color reaction, 50 μl of the reaction solution was weighed from each well, and OD445 nm was measured with a spectrophotometer. The measurement results are shown in Table 3 below.
[0099]
[Table 3]
In the above, a color reaction occurs by adding a color reagent to the culture. Since this color reaction is proportional to the number of cells, it is possible to relatively measure the number of cells in the culture by measuring the absorbance of the solution in which the color reaction has occurred.
[0101]
When media using various carbon sources as the sole carbon source are prepared and the bacteria are evenly inoculated in the respective media, the number of cells varies depending on the ability of the bacteria to assimilate the carbon source. That is, the number of bacteria that can assimilate the carbon source increases, but the number of cells that cannot assimilate the carbon source does not increase. Therefore, by measuring the absorbance of the culture after the color reaction, it is possible to grasp the assimilation ability of various carbon sources of the bacteria. Therefore, in this experiment, accurate data on the assimilation of various carbon sources of Gordonia polyisoprenivorans P8219 strain can be obtained by measuring the absorbance.
[0102]
In Table 3, a value obtained by subtracting the average value of the measured values at OD445 nm of the three blank samples from the average value of the measured values at OD445 nm of the three samples obtained for one type of medium is shown as the final value. When the final value was larger than 0, the P8219 strain was judged to have the ability to assimilate the carbon source added to the medium, and was marked as “Yes” in the assimilation ability column. On the other hand, when the final value was 0 or less, it was determined that there was no assimilation ability, and “None” was marked in the column of assimilation ability.
[0103]
As a result, the P8219 strain was found to have the ability to assimilate rhamnose, L-valine, arabitol, DL leucine, gluconic acid, proline, alanine, tripotassium citrate, glucose, and sucrose.
[0104]
Further, in Table 3, “Gordonia polyprenovivorans sp. Nov., a rubber-degrading actinomycetate isolated from an automobile tire”, Int. J. et al. Syst. Bacteriol. 1999 Oct; 49 Part 4: 1785-91. Compared to Gordonia polyisoprenivorans' carbon source utilization ability, it shows “coincidence” when the utilization is identical, Disagreement ”.
[0105]
As a result, the P8219 strain was different from Gordonia polyisoprevivorans described in the literature in that it does not assimilate phthalic acid, aspartic acid and hydroxybenzoic acid, but assimilate DL leucine and alanine.
[0106]
From these facts, it was found that the P8219 strain of the present application is a novel strain having different biochemical properties from Gordonia polyisoprenivorans described in the literature.
[0107]
(Example 4: Temporal change in diethylhexyl phthalate concentration when P8219 strain was cultured)
The change in DEHP concentration when Gordonia polyisoprenivorans strain P8219 was cultured in a medium containing diethylhexyl phthalate (DEHP) was measured. Thus, the time required to completely decompose DEHP was grasped. Details are as follows.
[0108]
(1) Preparation of DEHP-containing M9 medium
CaCl 2 , MgSO Four ・ 7H 2 M9 medium containing components other than O was prepared, and 100 ml each was dispensed into a 300 ml Erlenmeyer flask. Cover the Erlenmeyer flask and autoclave at 121 ° C for 15 minutes, then add appropriate amount of CaCl 2 And MgSO Four ・ 7H 2 A solution of O was aseptically added.
[0109]
Subsequently, 50 μl of DEHP was aseptically added to 100 ml of M9 medium in a clean bench. This was temporarily expressed as 500 ppm.
[0110]
(2) Pre-culture
The Gordonia polyisoprenivorans P8219 strain was inoculated into the DEHP-containing M9 medium prepared in (1) above, and cultured at 180 rpm for 3 days on a rotary shaker at 30 ° C.
[0111]
(3) Main culture
3 ml (that is, 3%) was collected from the preculture cultured for 3 days in (2) above, and inoculated into the DEHP-containing M9 medium prepared in (1) above. Then at 180 rpm using a 30 ° C. rotary shaker until each measurement time (0 hours, 6 hours, 12 hours, 18 hours, 24 hours, 27 hours, 29 hours, 30 hours, 31 hours, and 32 hours) Cultured.
[0112]
(4) DEHP concentration measurement
At each measurement time, 100 ml of a 1: 1 mixture of chloroform-methanol was added to the culture solution. However, for the blank, a chloroform-methanol mixture was added immediately after inoculation. Subsequently, it stirred for 15 minutes using the 30 degreeC rotary shaker.
[0113]
When the mixture was allowed to stand for 10 minutes after stirring, the culture solution layer and the organic solvent layer were separated. The upper layer is a culture solution layer, and the lower layer is an organic solvent layer. 5 ml of the organic solvent layer was collected in a test tube with a lid (three samples were collected for each measurement time). The collected organic solvent layer was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes. 200 μl of the separated organic solvent layer was collected in another test tube with a lid. To this organic solvent layer, 2800 μl of chloroform-methanol was added to make a 15-fold dilution, and the mixture was well stirred using a vortex.
[0114]
The absorption spectrum at 235 nm was measured using the total amount (3000 μl), and the DEHP concentration was determined from the absorption maximum at 235 nm. The DEHP concentration obtained using this method was in good agreement with the value measured by gas chromatography. Therefore, the measurement by the absorption spectrum is considered to be a method that can easily measure the amount of DEHP within a range of certain experimental conditions.
[0115]
(5) Results
The measurement data is shown in Table 4 below.
[0116]
[Table 4]
The blanks of 0 hours, 6 hours, and 12 hours were judged to be within the measurement error range, and were set to 500 ppm.
[0118]
A graph of the change over time in the DEHP concentration in the medium is shown in FIG.
[0119]
From this example, it was clarified that the Gordonia polyisoprenivorans strain P8219 has the ability to completely degrade 500 ppm of DEHP in 31 hours of culture. It was also found that there was an apparent lag in DEHP resolution from the start of culture to 12 hours.
[0120]
For the data of this example, the same sample was taken three times to reduce the error due to the Pipetman operation, and data with a large error was deleted. Therefore, it can be determined that the data is accurate. Moreover, the graph about the time-dependent change of the amount of DEHP measured by gas chromatography also decomposed | decomposed 500 ppm DEHP in about 30 hours like the graph of FIG. Therefore, it can be said that the reproducibility of this measurement result was obtained.
[0121]
Regarding pre-culture, it was confirmed that the third day when Gordonia polyisoprenivorans P8219 strain started to disperse from the pellet-shaped bacterial mass was optimal.
[0122]
(Example 4: Relationship between addition concentration of DEHP and change over time of DEHP decomposition)
The growth of Gordonia polyisoprenivorans P8219 is thought to increase exponentially over time. Measure the time course of degradation of DEHP added at 1000 ppm, and the amount of enzyme produced by the bacteria can be increased if the degradation does not take twice as long as when DEHP is added at 500 ppm There is sex. Therefore, the relationship between the DEHP addition concentration and the change over time in DEHP decomposition was examined.
[0123]
(1) Preparation of DEHP-containing M9 medium
A DEHP-containing M9 medium was prepared in the same manner as in Example 1 (1) except that the amount of added DEHP was changed to 100 μl (ie, 1000 ppm).
[0124]
(2) Pre-culture
The Gordonia polyisoprenivorans P8219 strain was inoculated into the DEHP-containing M9 medium prepared in (1) above, and cultured at 180 rpm for 3 days on a rotary shaker at 30 ° C.
[0125]
(3) Main culture
3 ml (that is, 3%) was collected from the preculture cultured for 3 days in (2) above, and inoculated into the DEHP-containing M9 medium prepared in (1) above. Then at 180 rpm using a rotary shaker at 30 ° C. until each measurement time (0 hours, 6 hours, 12 hours, 18 hours, 24 hours, 30 hours, 36 hours, 42 hours, 48 hours and 56 hours) Cultured.
[0126]
(4) DEHP concentration measurement
DEHP as in Example 3 except that two samples were prepared for each measurement time, and 5600 μl of chloroform-methanol was added to 200 μl of the organic solvent layer obtained in the final stage to make a 30-fold dilution. The quantity was measured.
[0127]
(5) Results
The measurement data is shown in Table 5 below.
[0128]
[Table 5]
A graph of the change over time in the DEHP concentration in the medium is shown in FIG. FIG. 5 shows the changes over time for both the medium containing DEHP added at 1000 ppm (Example 4) and the medium containing DEHP added at 500 ppm (Example 3). 1000 ppm of DEHP was completely degraded after 50 hours of culture.
[0130]
As a result, it is recognized that the decrease in DEHP is not related to the concentration of DEHP, the apparent lag of DEHP decomposition is about 15 hours regardless of the concentration of DEHP, and decreases almost linearly when DEHP begins to decompose. It was.
[0131]
【The invention's effect】
According to the present invention, Gordonia polyisoprenivorans that decompose phthalate esters are provided. By using this bacterium, environmental hormones can be eliminated. Furthermore, by using this bacterium, environmental hormones can be efficiently lost even in a defined medium.
[0132]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 schematically shows the positional relationship between 16S r-DNA of Gordonia polyisoprenivorans strain P8219 and the primers used for sequencing the DNA. maris f1 and maris r1 are primers designed based on the sequence of 16S r-DNA conserved in the related genera of Rhodococcus. f2, r2 and r3 are primers designed from sequences determined using maris f1 and maris r1. f0 and r0 are primers designed from the determined sequence and correspond to the outer region of the initially used primers maris f1 and maris r.
FIG. 2A shows an alignment between the base sequence of 16S rDNA of P8219 and the base sequence of 16S rDNA of Gordonia polyisoprenivorans.
FIG. 2B is a continuation of FIG. 2A.
FIG. 2C is a continuation of FIG. 2B.
FIG. 2D is a continuation of FIG. 2C.
FIG. 3 is a schematic diagram showing an evolutionary tree created for 15 strains having high homology to 16S rDNA of Gordonia polyisoprenivorans P8219 and Gordonia polyisoprenivorans P8219.
FIG. 4 is a graph showing the change over time in the concentration of DEHP in the medium when Gordonia polyisoprenivorans P8219 is cultured in M9 medium containing 500 ppm of DEHP.
FIG. 5 is a graph showing changes in DEHP concentration in the medium over time when Gordonia polyisoprenivorans P8219 is cultured in M9 medium containing 1000 ppm or 500 ppm of DEHP.
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