JP4109343B2

JP4109343B2 - Process for producing β-1,4-galactosyl-maltose

Info

Publication number: JP4109343B2
Application number: JP01847798A
Authority: JP
Inventors: 正保高田; 浩一小川; 信之中村
Original assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Current assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2008-07-02
Anticipated expiration: 2018-01-30
Also published as: JPH11215997A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、β-1,4-ガラクトシル−マルトースの製造方法に関する。詳しくは、工業規模で容易に効率よく、かつ、安価にβ-1,4-ガラクトシル−マルトースを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医療現場で各種検査が行われるようになり、膵臓や尿中に含まれるα−アミラーゼ活性も測定されるようになった。α−アミラーゼ活性の測定は重要な検査事項であり、疾病診断の一助になっている。近年、α−アミラーゼの活性測定用基質として、共役酵素を使用しない高感度の基質が開発されている。そのような基質の一つとして、マルトースの還元性末端にフェニル基、ナフチル基又はそれらの誘導体をアグリコンとして結合させたマルトース誘導体であって、その非還元性末端の４位がガラクトースで修飾された構造を持つ化合物が知られている（特開平６−３１５３９９号）。この化合物の化学構造式を以下（化１）に示す。
【０００３】
【化１】

式中、Ｘ¹及びＸ²の少なくとも一方はガラクトシル残基であり、他方は水素原子であり、Ｒはフェニル基、ナフチル基等の修飾基を示す。
上記化合物は、β−１，４−ガラクトシル−マルトースの還元末端に、Ｒで示されるフェニル基、又はナフチル基等の修飾基を付加したものであり、この基質は、例えば、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを原料として製造することができる。
【０００４】
また、このβ−１，４−ガラクトシル−マルトースは、ガラクトシルマルトビオノラクトンの原料としても用いられる。ガラクトシルマルトビオノラクトンは、α−アミラーゼの阻害剤として有効であることが知られている（特開平８−２９１１９２号）。このようにβ−１，４−ガラクトシル−マルトースは、医療現場において欠く事のできないα−アミラーゼ基質やα−アミラーゼ阻害剤の原料となる化合物であるが、その製造方法は実用的に十分確立されているとはいえない。
【０００５】
β−１，４−ガラクトシル−マルトースの一般的な製造方法は、２つある。第一の方法は、マルトース及びガラクトースにβ−ガラクトシダーゼを作用させて、ガラクトシル−マルトースを得る方法である。この方法は、１段階で目的物を生成することができる方法である。第二の方法は、ガラクトースとマルトオリゴ糖にβ−ガラクトシダーゼを作用させ、ガラクトシル−マルトオリゴ糖を得、得られたガラクトシル−マルトオリゴ糖にタカアミラーゼを作用させ、ガラクトシル−マルトースを生成する方法（特開平８−１７３１８０号）である。
【０００６】
第一の方法は、ガラクトシダーゼ糖転移反応を利用して、マルトースの非還元末端の４位を１分子のガラクトースで修飾する方法であるが、重大な欠点がある。この製造方法では、例えば、供与体基質である乳糖存在下、β−ガラクトシダーゼの糖転移反応を行った場合、マルトースへのガラクトシル基転移生成物と乳糖への転移生成物が、同時に生成する。これらの生成物は、ゲル濾過などによる分画において、溶出時間が非常に似通っているため、分画が困難であった。従って、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを生成しても、その後精製することが実質的に不可能であった。
【０００７】
一方、第二の方法にも、２つの問題があった。この方法は、詳しくは、マルトトリオース以上の重合度を持つ直鎖マルトオリゴ糖（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース等）とガラクトシル残基を含む糖の混合物に、β-ガラクトシダーゼを作用させ糖転移反応を行い、マルトオリゴ糖の非還元末端の４位をガラクトースで修飾したガラクトシル−マルトオリゴ糖を調製し、得られたガラクトシル−マルトオリゴ糖にタカアミラーゼを作用させてガラクトシル−マルトオリゴ糖３糖類のみを遊離させて、ガラクトシル−マルトースを得るというものである。
【０００８】
第一の問題は、生成物にβ−１，６−ガラクトシルマルトースが混在し、分離が困難であることである。即ち、マルトオリゴ糖の非還元末端の４位をガラクトースで修飾して得られた生成物には、目的とするβ−１，４−ガラクトシル-マルトオリゴ糖は約１０％（Ｗ／Ｗ）程度しか生成しない。更に、上記反応において、ガラクトースが非還元末端にあるグルコシル基の６位に結合した構造異性体も生成する。このような生成物（混合物）にタカアミラーゼを作用させると、タカアミラーゼはガラクトースが６位に結合した異性体にも作用するためβ-1,４-ガラクトシルマルトースに加えてβ-1,6-ガラクトシルマルトースも生成してしまう。β−１，４体とβ−１，６体とは分子量に差がなく、両者の分画は極めて困難である。
【０００９】
第二の問題は、上記糖転移反応の生成物には、更に主として原料由来の乳糖、転移反応生成物であるガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース、及び／又はガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖等も含まれていることである。これらの糖は、β−１，４−ガラクトシル−マトースと分子量等が近似しているため、これらの糖から目的物を分離し、精製することも容易ではなかった。
【００１０】
第一の問題の解決法として、ガラクトシル−マルトオリゴ糖から、ガラクトースが６位に結合した異性体は遊離することなく、β−１，４−ガラクトシル−マルトースのみ遊離する酵素の使用が考えられる。サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼは、β-1,6-ガラクトシル−マルトオリゴ糖には作用せず、β-1,4-ガラクトシル−マルトースのみを遊離させることが知られている（糖質関連酵素シンポジウム vol.30, p213-221, 1996）。従って、本発明者らは、この酵素を上記タカアミラーゼの代わりに用いることにより、異性体であるβ−１，６−ガラクトシル−マルトースの生成を阻止することができると考えた。
【００１１】
一方、第二の問題の解決法として考えられる方法として、ゲル濾過精製法を挙げることができる。この精製法は一般的にマルトオリゴ糖あるいはその誘導体の高純度品を得る場合に用いられる方法である。しかし、このゲル濾過精製法は、分離能力は高いが処理能力が低く、ゲル自体の価格が高い等の欠点がある。
更に、β−１，４−ガラクトシル-マルトースの誘導体がα-アミラーゼ基質として用いられる際には、９８％以上という高純度を要求される。そのため、β-1,4-ガラクトシル-マルトースの高純度品を得るためには、このゲル濾過精製が二回以上必要であった。従って、工業的規模でβ-1,4-ガラクトシルマルトースあるいはその誘導体の高純度品を製造する場合、生産量が制限され、高価にならざるを得なかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、α−アミラーゼ活性測定の基質の原料及びα−アミラーゼ阻害剤の原料として有用な、高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースの製造方法であって、構造異性体であるβ−１，６−ガラクトシル−マルトースを生成することなく、また、高価で処理能力の低いゲル濾過精製法を用いることなく、工業的規模で簡便に行うことができる製造方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ラクトース並びにガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトース、及びガラクトシル−ガラクトシル−マルトテトラオースからなる群から選ばれる少なくとも１種のガラクトシル−オリゴ糖が共存するβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖（以下、原料混合物という）に、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素を作用させて、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを製造する方法であって、
【００１４】
ラクトースを優先的に加水分解する酵素と上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を優先的に加水分解する酵素とを、上記原料混合物又はβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを含む生成物に作用させて、ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を低分子化する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
従来の方法においては、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖からβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを生成する際、構造異性体であるβ−１，６−ガラクトシル−マルトースも同時に生成することがあった。本発明では、「β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素」をもちいることにより、異性体の生成を排除することに成功した。「β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素」としては、例えば、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼＴＦ９０（日本食品化工（株）製）を使用することができる。この糖化型α−アミラーゼは、ガラクトシル−マルトオリゴ糖から、ガラクト−スが６位に結合した異性体は遊離することなく、β−１，４−ガラクトシル−マルトースのみ遊離することが知られている。従って、同じ分子量を持つため分離が不可能である異性体を生成することがない。これは、後のβ−１，４−ガラクトシル−マルトース精製工程においてその工程を簡便にするという利点がある。「β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素」が、例えば、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼＴＦ９０の場合、基質であるガラクトシル−オリゴ糖１ｇに対して、３０〜２００Ｕを使用することが好ましい。反応は、４５〜６５℃で、ｐＨ４．５〜８．５の範囲で行うことが好ましい。
【００１６】
なお本発明において「β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素」は、上記糖化型α−アミラーゼに限定されるものではなく、異性体を生成することなく、ガラクトシル−マルトオリゴ糖から目的物質であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的に生成することができる酵素であればいずれも使用可能である。
【００１７】
原料混合物中のラクトース及び上記ガラクトシルーオリゴ糖は、目的物のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースと分子量が近似している。そのため、高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトース得るために、これらの化合物をβ−１，４−ガラクトシル−マルトースから分離することが困難であった。本発明では、これらの化合物を、酵素を用いて加水分解することにより低分子化することに着目した。その結果、β−ガラクトシル−マルトオリゴ糖及びβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを分解せず、ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖を優先的に加水分解する酵素群を見出した。これらの酵素を用いることにより、ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖を低分子化することができるようになった。低分子化されたこれらの化合物は、β−１，４−ガラクトシル−マルトースとその分子量が明らかに異なるため、簡易に分離することができる。
【００１８】
低分子化の具体的な方法としては、「ラクトース優先的に加水分解する酵素」及び「上記ガラクトシル−オリゴ糖を優先的に加水分解する酵素」を、上記「原料混合物」又はβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを含む生成物に作用させることにより行うことができる。酵素としては、目的物であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを加水分解せずにラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖を低分子化するものを使用することができる。
【００１９】
「ラクトースを優先的に加水分解する酵素」としては、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素等を用いることができる。
【００２０】
原料混合物に含まれるラクトースを加水分解するには、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいは目的物であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースには作用せずに乳糖を加水分解するβ−ガラクトシダーゼを使用することができる。そのようなβ−ガラクトシダーゼとしては、例えば、β−１，４−ガラクトシル−マルトース難分解性のβ−ガラクトシダーゼを挙げることができる。具体的には、β−ガラクトシダーゼとしては、例えば、クリベロマイセス・フラギルス（Kluyvermyces fragilis）起源の酵素製剤「ラクトザイム」（ノボノルディスクバイオインダストリー（株）製）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyvermyces lactis）起源の酵素製剤「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」（合同酒精（株））等を挙げることができる。これらの酵素は市販品として容易に入手可能である。β−ガラクトシダーゼは、基質であるラクトース１ｇに対して、５〜５０Ｕの量の範囲で使用することが好ましい。その反応は、温度３０〜５０℃でｐＨ５〜８の範囲において行うことができる。
【００２１】
原料混合物中のラクトースを加水分解するためには、乳糖分解能を有するβ−グルコシダーゼを使用することができる。ラクトースを加水分解するために使用することができるβ−グルコシダーゼとしては、例えば，乳糖分解能力を有するアーモンドやサーマス(Thermus)属由来のβ-グルコシダーゼ等を挙げることができる。β−グルコシダーゼは、基質であるラクトース１ｇに対して、５〜１００Ｕの範囲で使用することが好ましい。また、その反応は、温度３０〜６０℃で、ｐＨ５〜８の範囲で行うことができる。
【００２２】
なお本発明において「ラクトースを優先的に加水分解する酵素」はβ−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼに限定されるものではなく、目的物質であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを実質的に分解することなく、ラクトースを分解し得る酵素であればいずれも使用可能である。
【００２３】
「上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を優先的に加水分解する酵素」としては、例えば、β−ガラクタナーゼ等を挙げることができる。
【００２４】
β−ガラクタナーゼは、一般的には、ガラクトース重合体を加水分解する酵素である。本発明においては、β-1,4-ガラクトシル-マルトースあるいはその誘導体を分解せずにガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたは２個以上のガラクトース残基が非還元末端側に結合したマルトオリゴ糖あるいはその誘導体を分解する種類のβ−ガラクタナーゼを使用する。そのようなβ−ガラクタナーゼとして、例えば、β−１，４−ガラクタナーゼを挙げることができる。具体的には、β−ガラクタナーゼとしては、例えば、Bacillus subtilis起源のもの（J.M.Labavitchら，J. Biol.Chem.,251,5904-5910）、Penicillium citrinum起源のもの（澱粉科学，第３６巻, P131-140,1989年）、Aspergillus pulverulent起源の酵素製剤「ペクチナーゼＧアマノ」（天野製薬（株）製） Aspergillus niger起源の酵素製剤「ペクチネックス」（ノボノルディスクバイオインダストリー（株）製）等を挙げることができる。これらの酵素は一般的に入手可能である。β−ガラクタナーゼは、基質である上記ガラクトシル−オリゴ糖１ｇに対して、５〜５０Ｕの範囲で使用することが好ましい。またその反応は、温度３０〜６０℃で、ｐＨ３〜６の範囲で行うことができる。
【００２５】
上記に例示したβ−ガラクタナーゼについては、文献等においてガラクトースの重合体からなる高分子やガラクトース残基からなるガラクトオリゴ糖を加水分解できることは記載されている。しかし、ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖を加水分解することができることは記載されていない。β−ガラクタナーゼが、ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖を加水分解することは、本発明で初めて見いだされたものである。
【００２６】
なお本発明において「上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１つを優先的に加水分解する酵素」はβ−ガラクタナーゼに限定されるものではなく、目的物質であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを実質的に分解することなく、上記ガラクトシル−オリゴ糖を分解し得る酵素であればいずれも使用可能である。
【００２７】
本発明において、必要に応じて、上記の方法により「ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を低分子化して得られたβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを含む生成物」からβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを分離することもできる。この分離工程により、高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを得ることができる。
【００２８】
β−１，４−ガラクトシル−マルトースを含む生成物は、異性体であるβ−１，６体を含まず、残存原料及び副生成物が低分子化されているため、ゲル濾過精製及び逆浸透膜等の工程により精製が可能である。ゲル濾過精製では一般に分子量の大きさによる分離モードが使用されている。単糖とオリゴ糖とでは分子量が相違するためβ−１，４−ガラクトシル−マルトースと他の低分子化された糖化合物を分離することが可能である。従って、上記混合物はゲル濾過精製を用いて容易に分離することができる。一方、逆浸透膜においても、オリゴ糖と単糖類は大量にかつ簡便に分離することができる。この方法を用いてもβ−１，４−ガラクトシル−マルトースと他の低分子化された糖化合物を分離することが可能である。従って、ゲル濾過精製の前処理として逆浸透膜を組み込めば、目的物質の含量が向上しゲル濾過精製工程の生産性の大幅な向上が可能である。また、高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを得るために高価なゲル濾過精製工程を２回繰り返す必要性も排除することができる。
【００２９】
上記β−１，４−ガラクトシル−マルトースの製造方法の「原料混合物」は、例えば、ガラクトシル残基を有する糖及びマルトオリゴ糖に、β−ガラクトシダーゼを作用させて得ることができる。β−ガラクトシダーゼを用いて、マルトオリゴ糖の非還元末端にガラクトースを結合し、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を得ることができる。これは、β−ガラクトシダーゼの糖転移反応によるものである。
【００３０】
糖転移反応に用いることができるβ−ガラクトシダーゼとしては、ラクトース残基をβ−１，４−ガラクトシド結合でマルトオリゴ糖の非還元末端グルコース残基に転移し得る酵素を挙げることができる。一般的に、β−ガラクトシダーゼは各種β-ガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊離する酵素として知られているが、本方法においては、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を生成させる転移活性の強いβ−ガラクトシダーゼを使用することができる。この酵素は、ラクトース残基をβ−１，４−ガラクトシド結合でマルトオリゴ糖の非還元末端グルコース残基に転移する。その結果、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を得ることができる。
【００３１】
β-ガラクトシダーゼとしては、具体的には、特開平３-２６４５９６に述べられているようにバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）起源の酵素製剤「Biolacta」（大和化成（株)製）、アスペルギルス・オリゾエ（Aspergillus oryzoe）起源の酵素製剤「Lactase Fアマノ」（天野製薬（株）製）、同じく「Lactase Y-AO」（ヤクルト（株））、あるいは特開昭６２-１３０６９５記載のクリプトコッカス（Cryptococcus）属起源のものを挙げることができる。更に、ガラクトース残基を主にβ-1,4-結合でマルトオリゴ糖あるいはその誘導体の非還元末端グルコース残基に転移し得るバチルス属あるいはクリプトコッカス属由来の酵素が使用可能であるが、好ましくは温度安定性が高いバチルス属由来の酵素を使用することができる。
【００３２】
ガラクトシル残基を有する糖としては、重合度２以上のβ−１，４−ガラクトシルオリゴ糖又は乳糖等を用いることができる。マルトオリゴ糖としては、グルコースの重合度３〜７の直鎖マルトオリゴ糖、又はこれらの混合物を用いることができる。例えば、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオース等を挙げることができる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の製造法は、高純度のβ−１，４−ガラクトシル-マルト−ス精製することを容易にする。詳しくは、β−１，４−ガラクトシル−マルトースと近似する分子量を持つ、β−１，６体（異性体）を生成することなく、残存原料及び副生成物を低分子化して、分子量による分離工程によりβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを精製することを容易にした。従って、高価で処理能力の低いゲル濾過精製法を用いることなく、工業的規模で簡便に高純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを製造することができるようになり、精製工程の効率が極めて向上した。これは、実用上多大な効果をもたらすものである。
【００３４】
【実施例】
以下に本発明を実施例により更に説明する。
下記の実施例における糖組成は試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、ピーク面積より算出した。ＨＰＬＣは以下の条件で行った。カラム；Shodex RS-pak DC-613 ( 6 I.D.mm×150mm），溶離液；アセトニトリル／水＝70/30(v/v)，流速；0.9 ml/min，カラム温度；室温，検出器；ＲＩモニターまたはＵＶ検出器（310nm）。
また酵素活性測定法は以下のようにして行った。
【００３５】
β - ガラクトシダーゼの活性測定法
0.5mlの0.5%(w/v)p-ニトロフェニルβ-ガラクトシドと25mMリン酸緩衝液(pH6.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間予備加温した。適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlに0.2M炭酸ナトリウム2mlを添加し405nmの吸光度を測定した。遊離したpNP量は検量係数設定用4-ニトロフェノール(和光純薬工業（株）製)を用いて作成した検量線を求めた。なお上記条件で1分間に1μmolのpNPを遊離する酵素量を1単位（U）とした。
【００３６】
β - グルコシダーゼの活性測定法
0.5mlの0.5%(w/v)p-ニトロフェニルβ-グルコシドと25mMリン酸緩衝液(pH6.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間予備加温した。適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlに0.2M炭酸ナトリウム2mlを添加し405nmの吸光度を測定した。pNP量は検量係数設定用4-ニトロフェノール(和光純薬工業(株)製)を用いて検量線を求めた。なお上記条件で1分間に1μmolのpNPを遊離する酵素量を1Uとした。
【００３７】
β - ガラクタナーゼの活性測定法
0.5mlの1.0%大豆アラビノガラクタンと50mMの酢酸緩衝液(pH4.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間予備加温した。適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlにDNS試薬1ml添加し、10分間煮沸後、冷却し、蒸留水5mlを添加後、510nmの吸光度を測定した。遊離した還元糖量はガラクトースを標準として用いて作成した検量線から求めた。なお上記条件で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1Uとした。
【００３８】
サーモモノスポラ（ Thermomonospora ）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼの活性測定法
0.35mlの100mMの酢酸緩衝液(pH6.0)に1.0%になるように可溶性澱粉溶解しし、55℃で5分間予備加温した。適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して55℃、10分間反応させた後、反応液1mlにDNS試薬を1ml添加し、10分間煮沸後、冷却し、蒸留水5mlを添加後、510nmの吸光度を測定した。遊離した還元糖量はグルコースを標準として用いて作成した検量線から求めた。なお上記条件で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1Uとした。
【００３９】
実施例１
各種酵素剤の選択
乳糖19.85g(58.0mmol)及びマルトテトラオース38.7g(58.0 mmol)を100mlの50mMリン酸緩衝液中(pH7.0)に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/mg,大和化成（株）製, Bacillus circulans起源）を200 U添加し40℃で5時間反応させて、β-1,4-ガラクトシル−マルトテトラオースを生成させた。次いで5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5に調整した後、5分間煮沸し、酵素を失活させた。本反応液の糖組成を上記ＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースは10.5%、β-1,6-ガラクトシルマルトテトラオース1.0%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは3.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.0%、ガラクトシル-ラクトースは2.1%、マルトテトラオースは30.5%、ラクトースは24.8%、グルコースは11.5%、ガラクトースは3.7%でその他オリゴ糖は6.7%であった。
【００４０】
上記反応失活液を10倍に希釈した溶液10mlに、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼＴＦ９０（日本食品化工(株)）50 Uと各種酵素剤をそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた糖組成をＨＰＬＣにより分析した結果を表１に示した。
また次に表１の結果から本発明の目的に合致したβ-ガラクトシダーゼ「ラクトザイム」「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」「ＢＧＨ−１０１」（アーモンド由来，東洋紡（株）製）およびβ-1,4-ガラクタナーゼ「ペクチナーゼＧアマノ」「ペクチネックス」を選択し、β-1,4-ガラクタナーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ2種類の酵素剤を順次作用させた場合の加水分解について検討した。上記反応失活液を10倍に希釈した溶液10mlに、まずβ-1,4-ガラクタナーゼ剤をそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた後、酵素を煮沸失活させた。次いでβ-ガラクトシダーゼをそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた糖組成をＨＰＬＣにより分析した結果を表２に示した。
【００４１】
【表１】

＋＋：70〜100%程度分解する
＋：10〜70%程度分解する
± ：〜10%程度分解する
− ：分解しない
【００４２】
【表２】

【００４３】
実施例２
β -1,4- ガラクトシル - マルトースの調製
乳糖2.0kg(5.8mol)及びマルテトラオース3.9kg(5.8mol)を10リットルの50mMリン酸緩衝液中（pH 7.0）に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤（Biolacta、5.4 U/mg,大和化成（株）製）を2 X 10⁴U添加し40℃で5時間反応させ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースを生成させた。次に5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本反応液の糖組成を上記ＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースは10.5%、β-1,6-ガラクトシル-マルトテトラオースは1.0%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは3.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.0%、ガラクトシル-ラクトースは2.1%、マルトテトラオースは30.5%、ラクトースは24.8%、グルコースは11.5%、ガラクトースは3.7%でその他オリゴ糖は6.7%であった。
【００４４】
本反応失活液を10倍に希釈した溶液をpH 6.0に調整し、β-1,4-ガラクトシル-マルトースを生成させるためにサーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼを5 X 10⁴U、反応原料のマルトテトラオース及びアミラーゼの作用により生ずるマルトオリゴ糖を分解するために、Rhizopus nives起源グルコアミラーゼ（生化学工業（株）製）を5 X 10⁵Uおよびガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースを分解するためにAspergillus pulverulent起源の酵素製剤「ペクチナーゼＧアマノ」（天野製薬（株）製）を2 X 10⁵U添加し、37℃で24時間反応させた。
【００４５】
次に本反応失活液のpHを6.5に調整し、原料の乳糖を分解させるために、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyvermyces lactis）起源の酵素製剤「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」（合同酒精（株））を1 X 10⁵U添加し、40℃で24時間反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本液の糖組成をＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトースは12.2 %、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースは1.5%、グルコースが62%、ガラクトースが22%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は2.3%であった。
【００４６】
上記酵素反応液を逆浸透膜モジュール（ＤＫ４０４０ＣＤＡ，デサリネイション社製）を用いて圧力20 kgf/cm²で10時間処理したところ、本液の糖組成は、β-1,4-ガラクトシル-マルトースは57.4%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは5.3%、グルコースが8.8%、ガラクトースが5.5%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は27.5%であった。
【００４７】
本操作により目的とするβ-1,4-ガラクトシル-マルトースは最初の反応終了液の含量に比較して５．５倍に向上した。本液250ml（40%,w/v，固形物として100g）をToyopeal HW-40S（トーソー(株)製）を充填したカラム（13cm,I.D×95cm）を用い、カラム温度；65℃、流速；5ml/min、検出器：ＲＩモニターでゲル濾過により精製し、純度98.5%のβ-ガラクトシル-マルトース49.5g（固形物）を得た。
【００４８】
実施例３
β -1,4- ガラクトシル - マルトースの調製（その２）
実施例２で調製したβ-1,4-ガラクトシル-マルトースは12.2 %の反応液を、さらに高純度にするために、この反応液を原糖液として、樹脂分画法を行った。樹脂は、アルカリ土類金属型強カチオン交換樹脂（ダウケミカル社製造、商品名ダウエックス５０Ｗ×４、Ｍｇ⁺⁺型、架橋度４％）を使用し、内径５．４ｃｍのジャケット付ステンレス製カラムに水懸け濁液で充填し、その液が直列に流れるようにカラム６本を連結して、樹脂槽全長が３０ｍになるように充填した。カラム内温度を７５℃で維持しつつ、原糖液を樹脂に対して、６．６ｖ／ｖ％加え、これに７５℃の温水をＳＶ０．１３の流速で流して分画した。得られた分画品を溶出順にサイドカラムにかけて分画し、純度90%以上ののβ-ガラクトシル-マルトース高含有画分を58.5g採取した。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for producing β-1,4-galactosyl-maltose. Specifically, the present invention relates to a method for producing β-1,4-galactosyl-maltose easily, efficiently and inexpensively on an industrial scale.
[0002]
[Prior art]
Various tests have been conducted at medical sites, and α-amylase activity contained in pancreas and urine has also been measured. The measurement of α-amylase activity is an important test item and helps diagnosis of diseases. In recent years, a highly sensitive substrate that does not use a conjugated enzyme has been developed as a substrate for measuring the activity of α-amylase. One such substrate is a maltose derivative in which a phenyl group, a naphthyl group, or a derivative thereof is bonded as an aglycon to the reducing end of maltose, and the non-reducing end of position 4 is modified with galactose. A compound having a structure is known (Japanese Patent Laid-Open No. 6-315399). The chemical structural formula of this compound is shown below (Chemical Formula 1).
[0003]
[Chemical 1]

Where X¹And X²At least one is a galactosyl residue, the other is a hydrogen atom, and R represents a modifying group such as a phenyl group or a naphthyl group.
The above compound is obtained by adding a modifying group such as a phenyl group represented by R or a naphthyl group to the reducing end of β-1,4-galactosyl-maltose, and this substrate is, for example, β-1,4 -It can be produced using galactosyl-maltose as a raw material.
[0004]
In addition, this β-1,4-galactosyl-maltose is also used as a raw material for galactosyl maltobionolactone. Galactosyl maltobionolactone is known to be effective as an inhibitor of α-amylase (JP-A-8-291192). As described above, β-1,4-galactosyl-maltose is a compound that is a raw material for α-amylase substrates and α-amylase inhibitors that are indispensable in the medical field. I cannot say that.
[0005]
There are two general methods for producing β-1,4-galactosyl-maltose. The first method is a method of obtaining galactosyl-maltose by allowing β-galactosidase to act on maltose and galactose. This method is a method which can produce | generate a target object in one step. In the second method, β-galactosidase is allowed to act on galactose and maltooligosaccharide to obtain galactosyl-maltooligosaccharide, and takaamylase is allowed to act on the obtained galactosyl-maltooligosaccharide (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 8). -173180).
[0006]
The first method uses a galactosidase glycosyltransferase reaction to modify the 4-position of the non-reducing end of maltose with one molecule of galactose, but has a serious drawback. In this production method, for example, when a transglycosylation reaction of β-galactosidase is performed in the presence of lactose which is a donor substrate, a galactosyl group transfer product to maltose and a transfer product to lactose are simultaneously generated. Since these products had very similar elution times in fractionation by gel filtration or the like, fractionation was difficult. Therefore, even if β-1,4-galactosyl-maltose was produced, it was practically impossible to purify thereafter.
[0007]
On the other hand, the second method also had two problems. Specifically, this method works by acting β-galactosidase on a mixture of linear malto-oligosaccharides (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, etc.) having a degree of polymerization higher than maltotriose and sugars containing galactosyl residues. A galactosyl-malto-oligosaccharide in which the 4th position of the non-reducing end of the maltooligosaccharide is modified with galactose, and Taka-amylase is allowed to act on the resulting galactosyl-malto-oligosaccharide to produce only the galactosyl-maltooligosaccharide trisaccharide. To release galactosyl-maltose.
[0008]
The first problem is that β-1,6-galactosyl maltose is mixed in the product and separation is difficult. That is, only about 10% (W / W) of the target β-1,4-galactosyl-maltooligosaccharide is produced in the product obtained by modifying the 4-position of the non-reducing end of maltooligosaccharide with galactose. do not do. Furthermore, in the above reaction, a structural isomer in which galactose is bonded to the 6-position of the glucosyl group at the non-reducing end is also generated. When Takaamylase is allowed to act on such a product (mixture), Takaamylase also acts on an isomer in which galactose is bonded to the 6-position. Therefore, in addition to β-1,4-galactosylmaltose, β-1,6- Galactosyl maltose is also produced. There is no difference in molecular weight between β-1,4 and β-1,6, and fractionation of both is extremely difficult.
[0009]
The second problem is that the product of the above-mentioned transglycosylation reaction includes lactose derived from raw materials, galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose, and / or galactosyl-galactosyl-malto-oligosaccharide, etc. It is included. Since these sugars are similar in molecular weight and the like to β-1,4-galactosyl-matose, it was not easy to separate and purify the target product from these sugars.
[0010]
As a solution to the first problem, it is conceivable to use an enzyme that releases only β-1,4-galactosyl-maltose from galactosyl-malto-oligosaccharide without releasing an isomer in which galactose is bonded to the 6-position. Saccharified α-amylase produced by Thermomonospora genus Actinomycetes does not act on β-1,6-galactosyl-malto-oligosaccharides, and only β-1,4-galactosyl-maltose can be released. Known (Symposium on carbohydrate-related enzymes vol.30, p213-221, 1996). Therefore, the present inventors thought that by using this enzyme in place of the above takaamylase, it was possible to prevent the production of isomer β-1,6-galactosyl-maltose.
[0011]
On the other hand, a gel filtration purification method can be cited as a possible method for solving the second problem. This purification method is generally used for obtaining a high-purity product of maltooligosaccharide or a derivative thereof. However, this gel filtration purification method has drawbacks such as high separation ability but low processing ability and high price of the gel itself.
Furthermore, when a β-1,4-galactosyl-maltose derivative is used as an α-amylase substrate, a high purity of 98% or more is required. Therefore, in order to obtain a high purity product of β-1,4-galactosyl-maltose, this gel filtration purification was required twice or more. Therefore, when producing a high-purity product of β-1,4-galactosyl maltose or a derivative thereof on an industrial scale, the production amount is limited and it has to be expensive.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is a method for producing high-purity β-1,4-galactosyl-maltose useful as a raw material for a substrate for measuring α-amylase activity and a raw material for an α-amylase inhibitor, which is a structural isomer. To provide a production method that can be easily carried out on an industrial scale without producing β-1,6-galactosyl-maltose, which is the above, and without using an expensive and low-performance gel filtration purification method It is in.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to lactose and β-1,4-galactosyl-maltooligo in which at least one galactosyl-oligosaccharide selected from the group consisting of galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose, and galactosyl-galactosyl-maltotetraose coexists A method for producing β-1,4-galactosyl-maltose by reacting sugar (hereinafter referred to as a raw material mixture) with an enzyme that selectively produces β-1,4-galactosyl-maltose,
[0014]
An enzyme preferentially hydrolyzing lactose and an enzyme preferentially hydrolyzing at least one of the galactosyl-oligosaccharides are allowed to act on the raw material mixture or a product containing β-1,4-galactosyl-maltose. Lactose and aboveAt least one galactosyl-oligosaccharideThe present invention relates to a method comprising the step of lowering the molecular weight.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the conventional method, when β-1,4-galactosyl-maltose is produced from β-1,4-galactosyl-maltooligosaccharide, the structural isomer β-1,6-galactosyl-maltose is also produced simultaneously. was there. The present invention succeeded in eliminating the production of isomers by using “an enzyme that selectively produces β-1,4-galactosyl-maltose”. Examples of the “enzyme that selectively produces β-1,4-galactosyl-maltose” include, for example, saccharified α-amylase TF90 produced by Thermomonospora genus Actinomycetes (manufactured by Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd.). Can be used. This saccharified α-amylase is known to liberate only β-1,4-galactosyl-maltose from galactosyl-maltooligosaccharide without liberating an isomer in which galactose is bonded to the 6-position. Therefore, isomers that have the same molecular weight and cannot be separated are not produced. This has the advantage of simplifying the subsequent β-1,4-galactosyl-maltose purification step. In the case where “an enzyme that selectively produces β-1,4-galactosyl-maltose” is, for example, saccharified α-amylase TF90 produced by Thermomonospora genus Actinomyces, galactosyl-oligosaccharide that is a substrate It is preferable to use 30 to 200 U with respect to 1 g. The reaction is preferably carried out at 45 to 65 ° C. and in the range of pH 4.5 to 8.5.
[0016]
In the present invention, the “enzyme that selectively produces β-1,4-galactosyl-maltose” is not limited to the saccharified α-amylase, and galactosyl-malto-oligosaccharide can be produced without producing an isomer. Any enzyme can be used as long as it can selectively produce the target substance β-1,4-galactosyl-maltose.
[0017]
The lactose in the raw material mixture and the galactosyl-oligosaccharide have molecular weights close to those of the target β-1,4-galactosyl-maltose. Therefore, in order to obtain highly purified β-1,4-galactosyl-maltose, it was difficult to separate these compounds from β-1,4-galactosyl-maltose. In the present invention, attention has been focused on reducing the molecular weight of these compounds by hydrolysis using an enzyme. As a result, the present inventors have found an enzyme group that preferentially hydrolyzes lactose and the galactosyl-oligosaccharide without decomposing β-galactosyl-maltooligosaccharide and β-1,4-galactosyl-maltose. By using these enzymes, lactose and the above-mentioned galactosyl-oligosaccharide can be made low molecular. These low molecular weight compounds can be easily separated because their molecular weights are clearly different from those of β-1,4-galactosyl-maltose.
[0018]
As a specific method for reducing the molecular weight, “an enzyme that preferentially hydrolyzes lactose” and “an enzyme that preferentially hydrolyzes the galactosyl-oligosaccharide” are referred to as “the raw material mixture” or β-1,4. It can be carried out by acting on a product containing galactosyl-maltose. As the enzyme, it is possible to use an enzyme that lowers the molecular weight of lactose and the galactosyl-oligosaccharide without hydrolyzing the target β-1,4-galactosyl-maltose.
[0019]
As the “enzyme that preferentially hydrolyzes lactose”, at least one enzyme selected from the group consisting of β-galactosidase and β-glucosidase can be used.
[0020]
In order to hydrolyze the lactose contained in the raw material mixture, it is necessary to use β-galactosidase which hydrolyzes lactose without acting on galactosyl-malto-oligosaccharide or β-1,4-galactosyl-maltose which is the target product. it can. Examples of such β-galactosidase include β-1,4-galactosyl-maltose hardly-degradable β-galactosidase. Specifically, as β-galactosidase, for example, an enzyme preparation “Lactozyme” derived from Kluyvermyces fragilis (manufactured by Novo Nordisk Bioindustry Co., Ltd.), an enzyme preparation derived from Kluyvermyces lactis “GODO-YNL” (joint spirits) can be exemplified. These enzymes are easily available as commercial products. It is preferable to use (beta) -galactosidase in the range of the quantity of 5-50U with respect to 1g of lactose which is a substrate. The reaction can be carried out at a temperature of 30 to 50 ° C. and in a pH range of 5 to 8.
[0021]
In order to hydrolyze lactose in the raw material mixture, β-glucosidase having lactose-degrading ability can be used. Examples of β-glucosidase that can be used to hydrolyze lactose include almond having lactose decomposition ability, β-glucosidase derived from the genus Thermus, and the like. It is preferable to use (beta) -glucosidase in the range of 5-100U with respect to 1g of lactose which is a substrate. The reaction can be carried out at a temperature of 30 to 60 ° C. and in the range of pH 5 to 8.
[0022]
In the present invention, the “enzyme that preferentially hydrolyzes lactose” is not limited to β-galactosidase and β-glucosidase, but substantially decomposes β-1,4-galactosyl-maltose which is a target substance. Any enzyme capable of degrading lactose can be used.
[0023]
Examples of the “enzyme preferentially hydrolyzing at least one of the galactosyl-oligosaccharides” include β-galactanase and the like.
[0024]
β-galactanase is generally an enzyme that hydrolyzes a galactose polymer. In the present invention, malto-oligosaccharide in which galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose or two or more galactose residues are bonded to the non-reducing terminal side without decomposing β-1,4-galactosyl-maltose or a derivative thereof A type of β-galactanase that degrades the derivative is used. Examples of such β-galactanase include β-1,4-galactanase. Specifically, as β-galactanase, for example, those originating from Bacillus subtilis (JM Labavitch et al., J. Biol. Chem., 251,5904-5910), those originating from Penicillium citrinum (Starch Science, Vol. 36) , P131-140, 1989), Aspergillus pulverulent origin enzyme preparation “Pectinase G Amano” (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) Aspergillus niger origin enzyme preparation “Pectinex” (Novo Nordisk Bio Industry Co., Ltd.) Can be mentioned. These enzymes are generally available. β-galactanase is preferably used in a range of 5 to 50 U with respect to 1 g of the galactosyl-oligosaccharide as a substrate. The reaction can be carried out at a temperature of 30 to 60 ° C. and in the range of pH 3 to 6.
[0025]
Regarding the β-galactanase exemplified above, it has been described in literatures that a galactooligosaccharide composed of a polymer composed of a galactose polymer or a galactose residue can be hydrolyzed. However, it is not described that galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose or galactosyl-galactosyl-maltooligosaccharide can be hydrolyzed. It was discovered for the first time in the present invention that β-galactanase hydrolyzes galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose or galactosyl-galactosyl-maltooligosaccharide.
[0026]
In the present invention, the “enzyme that preferentially hydrolyzes at least one of the galactosyl-oligosaccharides” is not limited to β-galactanase, and β-1,4-galactosyl-maltose, which is a target substance, is not limited. Any enzyme capable of degrading the galactosyl-oligosaccharide without substantially degrading can be used.
[0027]
In the present invention, if necessary, from the “product containing β-1,4-galactosyl-maltose obtained by reducing the molecular weight of at least one of lactose and galactosyl-oligosaccharide” according to the above method, β- 1,4-galactosyl-maltose can also be isolated. By this separation step, high-purity β-1,4-galactosyl-maltose can be obtained.
[0028]
Since the product containing β-1,4-galactosyl-maltose does not contain the β-1,6 isomer, and the remaining raw materials and by-products are reduced in molecular weight, gel filtration purification and reverse osmosis Purification can be performed by a process such as a membrane. In gel filtration purification, a separation mode based on the molecular weight is generally used. Since the molecular weights of monosaccharides and oligosaccharides are different, it is possible to separate β-1,4-galactosyl-maltose and other low-molecular sugar compounds. Thus, the mixture can be easily separated using gel filtration purification. On the other hand, oligosaccharides and monosaccharides can be easily separated in large amounts in reverse osmosis membranes. Even using this method, it is possible to separate β-1,4-galactosyl-maltose from other low-molecular sugar compounds. Therefore, if a reverse osmosis membrane is incorporated as a pretreatment for gel filtration purification, the content of the target substance can be improved and the productivity of the gel filtration purification process can be greatly improved. In addition, it is possible to eliminate the necessity of repeating the expensive gel filtration purification process twice in order to obtain high-purity β-1,4-galactosyl-maltose.
[0029]
The “raw material mixture” in the method for producing β-1,4-galactosyl-maltose can be obtained, for example, by allowing β-galactosidase to act on a sugar having a galactosyl residue and malto-oligosaccharide. Using β-galactosidase, galactose can be bonded to the non-reducing end of the maltooligosaccharide to obtain β-1,4-galactosyl-maltooligosaccharide. This is due to the transglycosylation reaction of β-galactosidase.
[0030]
Examples of β-galactosidase that can be used for the transglycosylation reaction include an enzyme that can transfer a lactose residue to a non-reducing terminal glucose residue of maltooligosaccharide by a β-1,4-galactoside bond. In general, β-galactosidase is known as an enzyme that hydrolyzes various β-galactosides to release galactose, but in this method, β-galactosyl-malto-oligosaccharide or a derivative thereof having strong transfer activity is generated. Galactosidase can be used. This enzyme transfers lactose residues to non-reducing terminal glucose residues of maltooligosaccharides by β-1,4-galactoside bonds. As a result, β-1,4-galactosyl-maltooligosaccharide can be obtained.
[0031]
Specific examples of β-galactosidase include, as described in JP-A-3-264596, an enzyme preparation “Biolacta” (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.) derived from Bacillus circulans, Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzoe) -derived enzyme preparation “Lactase F Amano” (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), “Lactase Y-AO” (Yakult Co., Ltd.), or Cryptococcus genus described in JP-A-62-130695 The ones of origin can be mentioned. Furthermore, an enzyme derived from the genus Bacillus or Cryptococcus that can transfer a galactose residue to a non-reducing terminal glucose residue of maltooligosaccharide or its derivative mainly by β-1,4-linkage can be used. A highly stable enzyme derived from the genus Bacillus can be used.
[0032]
As the sugar having a galactosyl residue, β-1,4-galactosyl oligosaccharide or lactose having a polymerization degree of 2 or more can be used. As the maltooligosaccharide, a linear maltooligosaccharide having a polymerization degree of glucose of 3 to 7 or a mixture thereof can be used. Examples thereof include maltotriose, maltotetraose, and maltopentaose.
[0033]
【The invention's effect】
The production method of the present invention makes it easy to purify high-purity β-1,4-galactosyl-maltose. Specifically, the remaining raw materials and by-products are reduced in molecular weight and separated by molecular weight without producing β-1,6 isomers (isomers) having a molecular weight similar to that of β-1,4-galactosyl-maltose. The process facilitated the purification of β-1,4-galactosyl-maltose. Accordingly, it is possible to easily produce high-purity β-1,4-galactosyl-maltose on an industrial scale without using an expensive and low-performance gel filtration purification method, and the efficiency of the purification process is improved. Very improved. This brings about a great effect on practical use.
[0034]
【Example】
The invention is further illustrated by the following examples.
The sugar composition in the following examples was calculated from the peak area by analyzing the sample by high performance liquid chromatography (HPLC). HPLC was performed under the following conditions. Column; Shodex RS-pak DC-613 (6 IDmm × 150mm), eluent: acetonitrile / water = 70/30 (v / v), flow rate: 0.9 ml / min, column temperature; room temperature, detector; RI monitor Or a UV detector (310 nm).
The enzyme activity was measured as follows.
[0035]
β - Galactosidase activity assay
0.5 ml of 0.5% (w / v) p-nitrophenyl β-galactoside and 0.45 ml of 25 mM phosphate buffer (pH 6.5) were mixed and pre-warmed at 35 ° C. for 5 minutes. After adding 0.05 ml of an enzyme solution diluted to an appropriate concentration and reacting at 35 ° C. for 10 minutes, 2 ml of 0.2M sodium carbonate was added to 1 ml of the reaction solution, and the absorbance at 405 nm was measured. The amount of pNP released was determined by a calibration curve prepared using 4-nitrophenol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for setting a calibration coefficient. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of pNP per minute under the above conditions was defined as 1 unit (U).
[0036]
β - Glucosidase activity assay
0.5 ml of 0.5% (w / v) p-nitrophenyl β-glucoside and 0.45 ml of 25 mM phosphate buffer (pH 6.5) were mixed and pre-warmed at 35 ° C. for 5 minutes. After adding 0.05 ml of an enzyme solution diluted to an appropriate concentration and reacting at 35 ° C. for 10 minutes, 2 ml of 0.2M sodium carbonate was added to 1 ml of the reaction solution, and the absorbance at 405 nm was measured. The amount of pNP was determined by a calibration curve using 4-nitrophenol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for setting a calibration coefficient. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of pNP per minute under the above conditions was 1 U.
[0037]
β - Method for measuring galactanase activity
0.5 ml of 1.0% soybean arabinogalactan and 0.45 ml of 50 mM acetate buffer (pH 4.5) were mixed and preheated at 35 ° C. for 5 minutes. After adding 0.05 ml of enzyme solution diluted to an appropriate concentration and reacting at 35 ° C for 10 minutes, adding 1 ml of DNS reagent to 1 ml of reaction solution, boiling for 10 minutes, cooling, adding 5 ml of distilled water, Absorbance was measured. The amount of reducing sugar released was determined from a calibration curve prepared using galactose as a standard. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of reducing sugar per minute under the above conditions was 1 U.
[0038]
Thermo monospora ( Thermomonospora ) Method for measuring the activity of saccharified α-amylase produced by Actinomyces
Soluble starch was dissolved in 0.35 ml of 100 mM acetate buffer (pH 6.0) to 1.0%, and pre-warmed at 55 ° C. for 5 minutes. After adding 0.05 ml of enzyme solution diluted to the appropriate concentration and reacting at 55 ° C for 10 minutes, 1 ml of DNS reagent was added to 1 ml of reaction solution, boiled for 10 minutes, cooled, and 5 ml of distilled water was added. The absorbance was measured. The amount of reducing sugar released was determined from a calibration curve prepared using glucose as a standard. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of reducing sugar per minute under the above conditions was 1 U.
[0039]
Example 1
Selection of various enzyme agents
Lactose (19.85 g, 58.0 mmol) and maltotetraose (38.7 g, 58.0 mmol) were dispersed in 100 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and β-galactosidase preparation “Biolacta” (5.4 U / mg, Daiwa Kasei) 200 U was added, and reacted at 40 ° C. for 5 hours to produce β-1,4-galactosyl-maltotetraose. Subsequently, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme. When the sugar composition of this reaction solution was analyzed by the above HPLC, β-1,4-galactosyl-maltotetraose was 10.5%, β-1,6-galactosylmaltotetraose 1.0%, galactosyl-galactosyl-maltotetraose was 3.2%, galactosyl-galactosyl-lactose 7.0%, galactosyl-lactose 2.1%, maltotetraose 30.5%, lactose 24.8%, glucose 11.5%, galactose 3.7% and other oligosaccharides 6.7% .
[0040]
50 ml of saccharified α-amylase TF90 (Nippon Food Chemical Co., Ltd.) produced by Thermomonospora genus actinomycetes and 50 ml of various enzyme agents were added to 10 ml of a 10-fold dilution of the reaction quenching solution. Table 1 shows the results of HPLC analysis of the sugar composition added with U and reacted at 40 ° C. for 24 hours.
Further, from the results shown in Table 1, β-galactosidase “lactozyme”, “GODO-YNL”, “BGH-101” (derived from almond, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and β-1,4-galactanase that meet the object of the present invention “Pectinase G Amano” and “Pectynex” were selected, and hydrolysis was examined when two kinds of enzyme agents, β-1,4-galactanase and β-galactosidase, were allowed to act sequentially. First, 50 U each of β-1,4-galactanase agent was added to 10 ml of the above-mentioned reaction quenching solution diluted 10-fold, reacted at 40 ° C. for 24 hours, and then the enzyme was inactivated by boiling. . Next, Table 2 shows the results of HPLC analysis of the sugar composition obtained by adding 50 U of β-galactosidase and reacting at 40 ° C. for 24 hours.
[0041]
[Table 1]

++: Decomposes about 70-100%
+: Decomposes about 10 to 70%
±: Decomposes about 10%
−: Do not disassemble
[0042]
[Table 2]

[0043]
Example 2
β -1,4- Galactosyl - Preparation of maltose
Lactose 2.0 kg (5.8 mol) and maltetraose 3.9 kg (5.8 mol) were dispersed in 10 liters of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and a β-galactosidase preparation (Biolacta, 5.4 U / mg, Daiwa Kasei ( 2 x 10)^FourU was added and reacted at 40 ° C. for 5 hours to produce β-1,4-galactosyl-maltotetraose. Next, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme. When the sugar composition of this reaction solution was analyzed by the above HPLC, β-1,4-galactosyl-maltotetraose was 10.5%, β-1,6-galactosyl-maltotetraose was 1.0%, galactosyl-galactosyl-maltotetraose. 3.2% ose, 7.0% galactosyl-galactosyl-lactose, 2.1% galactosyl-lactose, 30.5% maltotetraose, 24.8% lactose, 11.5% glucose, 3.7% galactose and 6.7% other oligosaccharides there were.
[0044]
Saccharified α-amylase produced by actinomycetes of Thermomonospora in order to adjust the solution obtained by diluting this reaction quenching solution 10 times to pH 6.0 to produce β-1,4-galactosyl-maltose 5 x 10^FourU, Rhizopus nives origin glucoamylase (manufactured by Seikagaku Corporation) is used to decompose malto-oligosaccharides produced by the action of reaction raw materials maltotetraose and amylase.^FiveIn order to decompose U and galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose, or galactosyl-galactosyl-maltotetraose, 2 × 10^FiveU was added and reacted at 37 ° C. for 24 hours.
[0045]
Next, in order to adjust the pH of the reaction quenching solution to 6.5 and decompose the raw lactose, an enzyme preparation “GODO-YNL” (joint sake spirits) derived from Kluyvermyces lactis (1 ×) Ten^FiveU was added and reacted at 40 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme. The sugar composition of this solution was analyzed by HPLC. Β-1,4-galactosyl-maltose was 12.2%, galactosyl-galactosyl-maltotriose was 1.5%, glucose was 62%, galactose was 22%, lactose and galactosyl -Other oligosaccharides including lactose and galactosyl-galactosyl-lactose accounted for 2.3%.
[0046]
Using the reverse osmosis membrane module (DK4040CDA, manufactured by Desalination), the enzyme reaction solution was pressured at 20 kgf / cm.²The sugar composition of this solution is 57.4% for β-1,4-galactosyl-maltose, 5.3% for galactosyl-galactosyl-maltotetraose, 8.8% for glucose, 5.5% for galactose, and lactose. And 27.5% of other oligosaccharides including galactosyl-lactose and galactosyl-galactosyl-lactose.
[0047]
By this operation, the intended β-1,4-galactosyl-maltose was improved by a factor of 5.5 compared to the content of the initial reaction solution. Using a column (13 cm, ID × 95 cm) packed with 250 ml (40%, w / v, 100 g as a solid) of this solution and packed with Toyopeal HW-40S (manufactured by Tosoh Corporation), column temperature; 65 ° C., flow rate; Purified by gel filtration at 5 ml / min, detector: RI monitor, 49.5 g (solid) of β-galactosyl-maltose with a purity of 98.5% was obtained.
[0048]
Example 3
β -1,4- Galactosyl - Preparation of maltose (Part 2)
Β-1,4-galactosyl-maltose prepared in Example 2 was subjected to a resin fractionation method using the reaction solution as a raw sugar solution in order to further increase the purity of the 12.2% reaction solution. Resin is alkaline earth metal type strong cation exchange resin (manufactured by Dow Chemical Co., Ltd., trade name Dowex 50W × 4, Mg⁺⁺Mold, cross-linking degree 4%), a stainless steel column with a jacket of 5.4 cm in inner diameter is filled with water suspension, and 6 columns are connected so that the liquid flows in series. Filled to 30 m. While maintaining the column temperature at 75 ° C., 6.6 v / v% of the raw sugar solution was added to the resin, and 75 ° C. warm water was allowed to flow at a flow rate of SV0.13 for fractionation. The resulting fraction was fractionated on a side column in the order of elution, and 58.5 g of a β-galactosyl-maltose-rich fraction having a purity of 90% or more was collected.

Claims

Β-1,4-galactosyl-malto-oligosaccharide (hereinafter referred to as the following): lactose and galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose, and at least one galactosyl-oligosaccharide selected from the group consisting of galactosyl-galactosyl-maltotetraose A method of producing β-1,4-galactosyl-maltose by allowing an enzyme that selectively produces β-1,4-galactosyl-maltose to act on a raw material mixture). at least one enzyme and the galactosyl selected from the group consisting of decomposed β- galactosidase and β- glucosidase - and preferentially hydrolyze β- galactanase at least one oligosaccharide, the raw material mixture or β- Contains 1,4-galactosyl-maltose It is allowed to act on the formed product, lactose and the galactosyl - method characterized by comprising the step of lowering the molecular weight of at least one oligosaccharide.

Claims for obtaining β-1,4-galactosyl-maltose with high purity by separating β-1,4-galactosyl-maltose from a product obtained by reducing the molecular weight of at least one of lactose and galactosyl-oligosaccharide Item 2. The method according to Item 1.

The production method according to claim 1 or 2, wherein the enzyme that selectively generates β-1,4-galactosyl-maltose is a saccharified α-amylase produced by an actinomycete of the genus Thermomonospora.

galactosidase beta-is, beta-galactosyl - The process according to claim 1 maltose Persistence enzyme.

glucosidase β- The production method according to claim 1 which is β- glucosidase with lactose resolution.

β- galactanase is, beta-1,4 galactanase a process according to any one of claims 1 to 5,.

The production method according to any one of claims 1 to 6 , wherein the raw material mixture is obtained by allowing β-galactosidase to act on a sugar having a galactosyl residue and a maltooligosaccharide.

The production method according to claim 7 , wherein β-galactosidase is an enzyme capable of transferring a lactose residue to a non-reducing terminal glucose residue of maltooligosaccharide with a β-1,4-galactoside bond.

The production method according to claim 7 or 8 , wherein the sugar having a galactosyl residue is β-1,4-galactosyl oligosaccharide or lactose having a polymerization degree of 2 or more.

The production method according to any one of claims 7 to 9 , wherein the maltooligosaccharide is a linear maltooligosaccharide having a polymerization degree of glucose of 3 to 7, or a mixture thereof.