JP4105486B2

JP4105486B2 - MAA3, a gene involved in female gametophyte formation

Info

Publication number: JP4105486B2
Application number: JP2002185184A
Authority: JP
Inventors: 清孝岡田; 健太郎清水
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-06-25
Filing date: 2002-06-25
Publication date: 2008-06-25
Anticipated expiration: 2022-06-25
Also published as: JP2004024106A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、雌性配偶体形成に必須のタンパク質、及びそれをコードする遺伝子ＭＡＡ３に関する。
また本発明は、ＭＡＡ３遺伝子を利用して種子の数を減少させる方法、及び外来遺伝子を含まない種子を生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の雌性配偶体は卵細胞と中央細胞を作る一方、花粉管を誘引し、重複受精が起こるという植物有性生殖の中心的な場である。１９世紀から形態学的・比較形態学的な研究の蓄積がある。
例えば、シロイヌナズナの有性生殖を図１に示す。胚珠では、減数分裂が起こり近位端の１細胞が生き残る、続いてｎのままで分裂が進み、７細胞８核の雌性配偶体となる。これは、卵細胞、中央細胞、２つの助細胞、３つの反足細胞からなる。雄ずいの葯では、減数分裂に続く体細胞分裂でｎの花粉（２または３細胞）が作られる。花粉は雌ずいの柱頭まで運ばれると、接着・発芽して花粉管を作る。２つの精細胞が、花粉管によって長い道のりを雌性配偶体まで運ばれ、重複受精する。つまり、雌性配偶体の卵細胞（ｎ）が受精して胚（２ｎ）が作られ、中央細胞（ｎ＋ｎ）が受精すると胚乳（３ｎ）が作られる。
【０００３】
観察の蓄積の一方で、遺伝子レベルの研究は非常に少ない。遺伝子レベルの研究には主に二つのアプローチが考えられる。まず、雌性配偶体に特異的に発現する遺伝子の単離が試みられた。しかしながら、雌性配偶体は雌しべ組織の内部にあるために、周りの組織を大量に含むライブラリーしか作れず、雌性配偶体を取り巻く細胞群の遺伝子ばかりが単離されてしまった（Bewley et al.,2000）。雌性配偶体の発生が同調し、多くの組織を得ることが出来るランを用いることで改善が図られているが、現在までに遺伝子機能の解析は進んでいない（Nadeau,1996）。もう一つのアプローチとして、雌性配偶体発生の突然変異体単離による遺伝学的な研究が考えられる。しかし、雌性配偶体は半数体であり、突然変異体はメンデル遺伝を示さないことなどにより、これまでに雌性配偶体の突然変異体の探索は行われていなかった。
【０００４】
シロイヌナズナで古典的に知られていた雌性配偶体変異体は、Ｒｅｄｅｉ（１９６５）の単離したｇｆ突然変異体のみであり、その他の植物ではトウモロコシに３例報告があるのみである（Sheridan and Huang,1997）。一方、シロイヌナズナで雌性配偶体と関係ない突然変異体として単離され、その後の解析によって雌性配偶体致死であることが遺伝学的に示されている突然変異体はいくつか報告がある。原因遺伝子がすでに単離されているものとしては、ｔｒｐ１、ｔｒｐ４二重突然変異体（Niyogi et al.,1993）、constitutive triple response1（Kieber and Ecker,1994）、prolifera（Springer et al.,1995）である。しかしながら、これらの雌性配偶体表現型は報告されておらず、これらの遺伝子が雌性配偶体発生にどのように機能しているか不明である。
【０００５】
雌性配偶体発生に関する分子遺伝学的な研究により得られる知見は、種なし果実の作出に利用することが期待できる。
果実が商業的価値を持つために栽培される作物の分野では、種子のない果実を生育させうる植物には大きな需要がある。種なし果実の生産のためには、受粉しなくても果実が生育する単為結実を利用する方法が用いられてきた。
単為結実的生育を達成する方法としては、化学的活性成分を使用するか、その種に単為結実的生育性を付与する選抜された突然変異体を使用するか、染色体数の変化（すなわち倍数性）を利用することによっている。
たとえばスイカを例にとると、現在実用化している種なしスイカの作出方法は，３倍性不稔を利用する方法である。しかし，この３倍体種なしスイカは２倍体の普通スイカに比べて品種育成に長い年月がかかること、種子の発芽率が低いこと、果実の品質が劣ること等の理由から広く普及していない。この他、種なしスイカを作出する方法としては植物ホルモンを利用する方法があるが、果実が小さく、また奇形になり易いこと等から実用化していない。この他に、Ｘ線照射によって不活化した花粉で雌花に人工授粉することにより、単為結実を誘導し果実を肥大させる方法なども開発されているが普及していない。
このため、受粉しても種子が形成されない雌性不稔植物の作出を分子遺伝学的メカニズムを利用して達成する方法は、商業的な果実生産のために広範な関心を引くものであった。
【０００６】
本発明者らは以前に、さやの中の種子数が半数になることを指標として雌性配偶体発生の突然変異体のスクリーニングを行った。これは次のような仮定に基づいている。
すなわち、雌性配偶体致死の突然変異をヘテロ接合体として持つ胞子体個体があったとする。減数分裂後、ある雌性配偶体が２つの対立遺伝子のうちどちらかを受け継ぐかはランダムに決まる。そこで、半数の雌性配偶体は野生型の対立遺伝子を受け継ぎ、正常に雌性配偶体発生を行い、重複受精して種子をつくる。一方、残りの半数の雌性配偶体は突然変異型の対立遺伝子を受け継ぎ、致死となるため、種子をつくれない。結果としてさや（つまり雌しべの成熟したもの）の中で、種子数が半数になる。
【０００７】
上記の仮定に基づき、シロイヌナズナのＴ−ＤＮＡ挿入変異体から、さやの中の種子数が半数になることを指標としてスクリーニングを行った。この結果、４つの雌性配偶体発生の突然変異株を単離することができた。雌しべの中で受精できないままに発生を停止している胚珠の形からｍａｇａｔａｍａ（ｍａａ）突然変異体と名付けた（Kentaro K.Shimizu and Kiyotaka Okada、2000、Development、127、4511-4518）。
ｍａｇａｔａｍａ突然変異体の微分干渉顕微鏡による写真を図２に示す。図２Ａで示されるように雌性半数体の半分は発生が異常である。ｍａｇａｔａｍａ（ｍａａ）突然変異体の１つｍａａ３変異体は、図２Ｃに示されるように発生が遅れ、極核の融合が起きていない。
このｍａｇａｔａｍａ突然変異体の原因遺伝子を単離すれば、雌性配偶体形成の分子遺伝学的メカニズムが明らかになることが期待された。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、雌性配偶体致死のｍａｇａｔａｍａ突然変異体の原因遺伝子をクローニングすることを目的とする。また、ｍａｇａｔａｍａ突然変異体の原因遺伝子を利用して雌性配偶体を致死性にさせる方法、種子の数を減少させる方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
雌性配偶体致死のｍａｇａｔａｍａ突然変異体は、ｐＧＶ３８５０：ＨＰＴの挿入系統のスクリーニングから単離された。ｐＧＶ３８５０：ＨＰＴのＴ−ＤＮＡはハイグロマイシン耐性遺伝子を持つ。そこで、ハイグロマイシン耐性を利用して突然変異体がＴ−ＤＮＡと連鎖しているかどうかを調べた。その結果、４つのｍａｇａｔａｍａ突然変異体のうち、ｍａａ３変異体の突然変異形質がＴ−ＤＮＡと連鎖するものであった。
従って、ｍａａ３突然変異体の雌性配偶体致死性はＴ−ＤＮＡによる遺伝子破壊によるものであり、Ｔ−ＤＮＡを指標として雌性配偶体致死の原因遺伝子を単離できる。Ｔ−ＤＮＡの配列を利用したＰＣＲにより原因遺伝子を単離し、発明の課題を解決することとした。
【００１０】
Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーを用いたサザンハイブリダイゼーションの結果、ｍａａ３変異体では一座位にタンデムにＴ−ＤＮＡが挿入されていることが示された。
Ｔ−ＤＮＡのライトボーダー付近を用いたＴＡＩＬ−ＰＣＲを行ったが、近傍のシロイヌナズナゲノム配列は得られなかった。そこで、Ｔ−ＤＮＡのレフトボーダーの近傍配列をＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法を用いて単離することを考えた。
【００１１】
まず、レフトボーダー付近の配列を用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った。するとライトボーダーと同様にレフトボーダーもｍａａ３突然変異と連鎖していた。そこで、レフトボーダー付近の配列のプライマーを用いてＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行い、一つのバンドを得た。このバンドをシークエンスしたところ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー付近の配列に引き続いて、シロイヌナズナ第４染色体のＡＴＦＣＡ４と呼ばれるコンティグ配列の６１４７４−６１５４５ｂｐと一致する配列が見られた。
これが、挿入されたＴ−ＤＮＡに隣接するシロイヌナズナゲノム配列だと考えられる。この領域にｍａａ３変異体の原因遺伝子が存在することをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
【００１２】
Ｔ−ＤＮＡ挿入部位付近は、ゲノムプロジェクトによるアノテーションによれば、ｄｌ３８２１ｗ遺伝子とｄｌ３８２５ｗ遺伝子の間に挟まれた領域であった（Bevan et al.,1998）。
この遺伝子のｃＤＮＡをＰＣＲ法、５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法により単離したところ、２１エキソンからなり長さ２７０８ｂｐであった。アノテーションで予想されなかった第１エキソンがあり、結局Ｔ−ＤＮＡはこの遺伝子の第一イントロンに挿入されて遺伝子を分断していた。そこで、この遺伝子がｍａａ３突然変異の原因遺伝子であると結論づけた。これをＭＡＡ３遺伝子と名付けた。
ＭＡＡ３遺伝子の構造を図３に示す。
【００１３】
ＭＡＡ３遺伝子から予想されるタンパク質は、８１８アミノ酸からなる。この配列を用いて、ＢＬＡＳＴによるホモロジーサーチを行った。機能が知られているもののうちで最も相同性が高いのが出芽酵母のＳｅｎ１ｐであった。Ｓｅｎ１ｐはスーパーファミリーＩに属するヘリカーゼである。また、スーパーファミリーＩヘリカーゼの７つのコンセンサス配列全てがＭＡＡ３の後半に見られた。
ヘリカーゼはｔＲＮＡのスプライシングやｒＲＮＡ、ｍＲＮＡの成熟など様々なＲＮＡのプロセシングに必要な酵素である。
【００１４】
顕微鏡による観察の結果、ｍａａ３変異体は、雌性配偶体の発生が遅延し、また核小体が小さく内部構造が見られないという二つの異常がみられた。
核小体は、タンパク質とＲＮＡからなる核内の構造で、リボソームの合成部位である。このことからＭＡＡ３はｒＲＮＡのプロセシングに関わっており、雌性配偶体においてはＭＡＡ３遺伝子が欠損すると核小体が異常となり発生遅延も引き起こされ、正常な雌性配偶体発生ができないことが明らかになった。
【００１５】
すなわち本発明は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質であって、雌性配偶体形成に必須のタンパク質を提供する。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１６】
また、本発明の遺伝子は、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡであって、雌性配偶体形成に必須のタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００１７】
本発明は、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子ＭＡＡ３を含むベクター、及びそのベクターにより形質転換された形質転換体を提供する。またＭＡＡ３遺伝子の塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補配列を含むヌクレオチドを提供する。
本発明は、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子ＭＡＡ３の発現を抑制して雌性配偶体を致死性にする方法、ＭＡＡ３遺伝子のアンチセンスを植物ゲノムのｎ箇所に挿入して種子の数を２^ｎ分の１にする方法を提供する。また、ＭＡＡ３遺伝子のアンチセンスを特定の対立遺伝子に連鎖するゲノム領域に挿入して、特定の対立遺伝子を含まない種子のみを形成させる方法を提供する。さらに本発明はこれらの方法により得られた形質転換体を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子、及びその利用法を提供するものである。
本発明の遺伝子は、その遺伝子発現を抑制することにより雌性配偶体を致死性にすることができ、種子の数を減少させたり、特定の対立遺伝子を持つ種子を致死させることに利用できるものである。
【００１９】
（Ｉ）本発明のタンパク質、すなわち第１発明及び第２発明のタンパク質は、雌性配偶体形成に必須なタンパク質であり、後記配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
また、この他に後記配列表の配列番号１で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、雌性配偶体形成に必須な機能が失われない程度であればよく、通常１〜約１６４個、好ましくは１〜約８２個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
第２発明のタンパク質は、第１発明のタンパク質のうちシロイヌナズナ由来のものである。
【００２０】
本発明のタンパク質は、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、ＭＡＡ３をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、酵母を用いることが好ましい。
本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを得る方法は、下記の第２発明及び第３発明の項に記載する。
【００２１】
（II）本発明の遺伝子、すなわち第３発明、第４発明及び第５発明の遺伝子は、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子であり、後記配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
また、この他に後記配列表の配列番号２で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質が雌性配偶体形成に必須な機能を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号２で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００２２】
本発明の遺伝子は、適当な植物の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。植物としては本発明の遺伝子を有するものであれば特に限定されず、例えば、アブラナ科、イネ科、キク科、アカザ科の植物などを挙げることができる。
遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジークローニング法などにより好適に実施できる。
植物の地上部を遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡを調製する。これからｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＥＳＴ(expressed sequence tag) データベースの検索によって得られるＭＡＡ３類似配列に相当するプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、雌性配偶体形成に必須なタンパク質のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
得られたｃＤＮＡについては常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定することができる
【００２３】
得られたＭＡＡ３遺伝子のｃＤＮＡから調製した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を用いて、インビトロ翻訳法[Hedigerら、Biochim. Biophys. Acta、第1064巻、360項、1991年]により、ＭＡＡ３タンパク質を合成し、電気泳動によりタンパク質のサイズ、糖付加の有無等を検討することができる。
【００２４】
得られたＭＡＡ３遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号２に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ」[Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Pressより1989に発刊]に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
【００２５】
本発明の遺伝子としては、上記のｃＤＮＡの配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）[Mark, D.F. et al.、Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662項（1984年）] 等によって実施できる。
【００２６】
あるＤＮＡが雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードするかどうかは相補性検定により判断できる。すなわち、そのＤＮＡを内在ＭＡＡ３遺伝子の発現が抑制された植物（例えばシロイヌナズナのｍａａ３変異体）に導入し、それにより雌性不稔が回復するかどうかを調べることにより判断できる。
【００２７】
（III）第６発明は、本発明の遺伝子を含む遺伝子もしくは当該遺伝子の一部を含むベクターを提供する。第７発明は、ＭＡＡ３遺伝子相同組み換えのためのベクターを提供する。第８発明は、ＭＡＡ３遺伝子発現のためのベクターを提供する。第９発明は、これらのベクターで形質転換された形質転換体をそれぞれ提供する。
これらの発明の用いられるベクターは、宿主及び目的に応じて選択することができ、市販のもの又はそれを改良したものを使用することが出来る。形質転換法は宿主及びベクターに応じて好適な方法を選択することが出来る。
【００２８】
第７発明のＭＡＡ３遺伝子相同組み換えのためのベクターは、例えばＭＡＡ３遺伝子が破壊された雌性不稔性植物の作製に用いることができる。本発明のＤＮＡまたはその一部を薬剤耐性遺伝子などのマーカーと結合した後ベクターに組み込み、ＭＡＡ３遺伝子を破壊するためのベクターとすることができる。ベクター及び宿主への形質転換法は、宿主に応じて適したものが選択される。マーカーとしてはカナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられ、形質転換方法としてはエレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。
相同組み換えを行うための本発明のＤＮＡとは、ＭＡＡ３タンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち細胞内で、ゲノム上のＭＡＡ３遺伝子と相同組み換えを起こすことができ、それによってＭＡＡ３遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性があげられる。また、ＭＡＡ３遺伝子のエクソン部分と相同性を有するＤＮＡを必ず含む必要はなく、ＭＡＡ３のゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡであればよい。また相同組み換えを行うためのＤＮＡは本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
【００２９】
（IV）第１０発明、第１１発明、第１２発明は、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上、好ましくは２０塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを提供するものである。
本発明のヌクレオチドは、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用することができ、また、当該タンパク質をコードする遺伝子やそれと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子などを入手する際のプライマーとして使用することができ、さらに、そのアンチセンス鎖などにより雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用することもできる。
【００３０】
（Ｖ）第１３発明は、本発明の遺伝子ＭＡＡ３を利用して雌性配偶体を致死性にする方法を提供する。
植物の有するＭＡＡ３遺伝子の発現を抑制する方法としては、例えば以下のアンチセンス法、ジーンターゲッティング法、遺伝子破壊型タギング法などを利用する方法が挙げられる。
【００３１】
アンチセンス法による本発明の方法は、適当なプロモーターとその下流に配置された逆向きのＭＡＡ３遺伝子（アンチセンスＤＮＡ）とを含むベクターを構築し、それを植物に導入することによりＭＡＡ３遺伝子の発現を抑制する方法である。ここで用いるプロモーターとしては特に限定されず、雌性配偶体においてもプロモーター活性を有するものであればよい。
【００３２】
ジーンターゲッティング法による本発明の方法は、相同組み換えにより本発明の遺伝子ＭＡＡ３の一部に他のＤＮＡを挿入し、ＭＡＡ３遺伝子をノックアウトすることによるＭＡＡ３遺伝子の発現を抑制する方法である。この方法には、第７発明のベクターが利用できる。
また、このような特定の遺伝子をノックアウトする方法としては、例えば、Ｋｅｍｐｉｎらの方法（Kempin et al.Nature 389: 802-803. 1997）に従って行うことができる。すなわち、ＭＡＡ３遺伝子からなるＤＮＡ内にカナマイシン耐性遺伝子などを挿入したターゲッティングベクターを作製し、これを植物に導入し、相同組み替えを起こさせ、植物の有するＭＡＡ３遺伝子をノックアウトする。相同組み換えが起こったかどうかは、ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーションにより確認することが出来る。
【００３３】
遺伝子破壊型タギング法による本発明の方法は、Ｔ−ＤＮＡやトランスポゾンをゲノム中にランダムに挿入させ、ＰＣＲを利用してＭＡＡ３遺伝子破壊株をスクリーニングする方法である。
Ｔ−ＤＮＡタギングに用いるベクターは、特に限定されず、例えば、ｐＢＩＨ１−ＩＧを使用することができる。また、トランスポゾンタギングに使用するトランスポゾンについては、特に限定されず、例えばＡｃ−Ｄｓ系等のＤＮＡ型トランスポゾンや、レトロトランスポゾンを使用することが出来る。
【００３４】
第１４発明は、ＭＡＡ３遺伝子のアンチセンスを植物のｎ箇所に挿入して、種子の数を２^ｎ分の１にする方法を提供する。
植物のゲノムの１カ所にＭＡＡ３遺伝子のアンチセンスを挿入した場合には、減数分裂により雌性配偶体の半数がＭＡＡ３アンチセンスを持ち致死性となる。植物のｎ箇所に挿入すれば、植物の種子数が約２^ｎ分の１に減少させることができる。挿入されたｎ箇所のアンチセンスがゲノム内で連鎖していない場合に２^ｎ分の１であり、連鎖している場合にはやや増減がある。
種なし果実は商品価値を有するものであるが、種子が全くないと果実の成熟が正常ではなく品質が低下することが知られている。本発明の方法により、種子の数を任意に制御することが可能となり、種子が少なく品質の高い商品作物を容易に作出することを可能とするものである。
【００３５】
第１５発明、第１６発明、第１８発明は、特定の遺伝子に連鎖するゲノム領域にアンチセンスを挿入して特定の遺伝子を含まない種子のみを形成させる方法を提供する。
トランスジェニック植物において、導入された外来遺伝子は種子発生以前の段階においてさまざまな利用価値、例えば耐病性や耐寒性などを付与するものである。しかしながら、外来遺伝子が種子内で発現すると種子や胚乳の品質に悪影響を与えることがある。また、現在のところトランスジェニック食品に対する抵抗感があり、食用となる種子（胚乳）に外来遺伝子が含まれないことが望ましい。本発明は、導入された外来遺伝子の近傍のゲノム領域にＭＡＡ３遺伝子のアンチセンスを挿入することにより、減数分裂時に外来遺伝子とＭＡＡ３アンチセンスを連鎖させて、外来遺伝子を有する雌性配偶体を致死にすることを可能とするものである。この方法は、例えば外来遺伝子を導入するときにＭＡＡ３アンチセンスも同じコンストラクトに含めて導入することにより可能となる。この方法により外来遺伝子を種子や胚乳に含まないトランスジェニック植物由来食品を生産することが可能となる。
また、特定の対立遺伝子の近傍のゲノム領域にＭＡＡ３アンチセンスを導入する方法としては、標的となる対立遺伝子の近傍の塩基配列を特定し、相同組み換えを利用してＭＡＡ３アンチセンスを挿入する方法などが可能である。この方法により種子や胚乳の品質に悪影響を及ぼす遺伝子を、種子や胚乳から取り除くことが可能となる。
【００３６】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１：ｍａｇａｔａｍａ突然変異体のスクリーニング
雌性配偶体発生の突然変異の単離法として、さやの中の種子数が半数になることを指標として一次スクリーニングする方法を考えた。
ＷＳ系統とＣｏｌ系統のＴ−ＤＮＡ挿入変異体約５５０ファミリーのスクリーニングを行った。さやで種子数が半数になり、分離比が１対１に近く、また雌性配偶体が１核期に発生し、花粉が正常であるという指標を用いてスクリーニングを行った。その結果、４つの雌性配偶体発生の突然変異体を単離することが出来た。雌しべの中で受精できないままに発生を停止している胚珠の形から、ｍａｇａｔａｍａ（ｍａａ）突然変異体と名付けた。本発明ではｍａａ１、ｍａａ２、ｍａａ３のうち、突然変異とＴ−ＤＮＡが連鎖していたｍａａ３突然変異体について解析を行った。突然変異とＴ−ＤＮＡの連鎖の検定方法は実施例３に記載する。
【００３８】
［植物の栽培方法］
シロイヌナズナArabidopsis thaliana (L.) Heynh.のＷＳ，Ｃｏｌ，Ｌｅｒ野生型を用いた。バーミキュライトに少量のパーライトを混合したものをポットに入れ、表面を細粒のパーライトで覆ってその上に種子を蒔いた。２日間温度４℃においたのち、温度２２℃、湿度５０％前後、５０〜１００μＥ／ｍ^２／ｓｅｃの照明の植物栽培室で育てた。肥料にはハイポネクックス５−１０−５（ハイポネックスジャパン）の１０００倍希釈液を与えた。
［突然変異体のスクリーニング］
基礎生物学研究所遺伝子第一部門で作製されたＷＳのＴ−ＤＮＡ挿入ラインのＴ２の３５６ファミリーをそれぞれ約１５個体ずつ。ここから単離されたｖｗ３８６，ｖｗ４１３，ｖｗ４３８をそれぞれｍａａ１，ｍａａ２，ｍａａ３と名付けた。ｍａａ１はＭＰ５−１ベクター、ｍａａ２とｍａａ３はｐＧＶ３８５０：ＨＰＴベクターを用いて作製されたラインから単離された。
・荒木崇博士によってｐＧＶ３８５０：１００３を用いて作製されたＣｏｌのＴ−ＤＮＡ挿入ラインのＴ２の約１００ファミリー。ここから．ｍａａ４突然変異体が単離された。
【００３９】
実施例２：ｍａａ３変異体の顕微鏡観察。
ｍａａ３突然変異体は雌性配偶体致死であるため、ホモ接合体は全く得られなかった。以下、ｍａａ３突然変異体とはへテロ接合体を指す。へテロ接合体内の雌性配偶体のうち、半数がｍａａ３雌性配偶体、半数が野生型雌性配偶体である。
ＷＳ野生型とのｍａａ３突然変異体の雌性配偶体を、透明化して微分干渉顕微鏡で観察した。雌性配偶体の発生ステージは、本研究の途中で発表されたChristensenら（１９９７）の核の数に基づいたシステムに従った。雌性配偶体の各細胞の核は、周りの細胞の核よりも非常に大きい核小体を一つだけ持つことが知られている。核小体は円形の構造として観察され、微分干渉顕微鏡でも明瞭に見分けられる（Willemse and van Went,1984;Mansfield et al.,1991;Christensen et al.,1997）。
ｍａａ３から受粉直後の雌しべを採取し、内部の雌性配偶体を観察した。すると、野生型表現型の雌性配偶体に混ざって、異常な雌性配偶体が観察された。まず、中央細胞の２つの極核が融合していない。これは、発生ステージとしてはステージＦＧ５に当たる。また、各細胞の核小体が小型である。特に、中央細胞の核小体は融合前後共に、野生型では内部に円い構造が見られるのに対し、ｍａａ３には見られない。ヒマワリなどで中央細胞の核小体には、機能はわからないものの、１，２個の大きな液胞と多数の小さな液胞があることが知られており（Newcomb,1973；総説 Willemse andvan Went,1984）、これに対応するのではないかと思われる。野生型では融合前の二つの核小体のサイズはほぼ同じだが、ｍａａ３ではしばしば大きさに差がある。
図２に微分干渉顕微鏡により撮影された写真を示す。
図２Ａ：雌ずいの中で半数の雌性配偶体は野生型であり、受精して胚発生が進んでいるため肥大化している（ｗｔ）、残りの半数は、雌性配偶体の発生異常のため、コンマ型のステージで停止している（ｍｕ）。（ｅｍ）は発達中の胚を示す。
図２Ｂ：野生型の雌性配偶体を示す。
図２Ｃ：ｍａａ３突然変異体の雌性配偶体を示す。発生が遅れ極核の融合が起こっていない。他の核は焦点外。ａ：反足細胞、ｃ：中央細胞核、ｅ：卵細胞核、ｐ：極核、ｓ：助細胞核、スケールバーは５０μｍ。
【００４０】
［微分干渉顕微鏡による観察］
採集した花をまずエタノール９：酢酸１の溶液につけ、３０分間脱気したのち一晩固定した。９０％エタノール、７０％エタノールに２０分以上ずつつけたのち、Ｈｏｙｅｒ溶液（アラビアゴム７．５ｇ、抱水クロラール１００ｇ、グリセロール５ｍｌを水３０ｍｌに溶かす）にしばらく浸けて透明化した。そして、ＯｌｙｍｐｕｓＳＺＨ実体顕微鏡をもちいて雌しべをダイセクトして胚珠を取り出した。ノマルスキー装置の入ったＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｈｏｔ２顕微鏡で微分干渉像を観察し、ＤＡＴＡＢＡＣＫＤ４カメラで写真を撮影した。または、ノマルスキー装置の入ったＯｌｙｍｐｕｓＡＸ７０顕微鏡で微分干渉像を観察し、ＯｌｙｍｐｕｓＰＭ‐Ｃ５３ＤＸカメラで写真を撮影した。
【００４１】
実施例３：ｍａａ３突然変異体の分子遺伝学的解析
（１）ｍａａ３突然変異とＴ−ＤＮＡの連鎖
ｍａａ３突然変異体は、ｐＧＶ３８５０：ＨＰＴの挿入系統のスクリーニングから単離された。ｐＧＶ３８５０：ＨＰＴのＴ−ＤＮＡはハイグロマイシン耐性遺伝子を持つ。そこで、ｍａａ３突然変異がＴ−ＤＮＡと連鎖しているかどうかを調べるため、ハイグロマイシン耐性を利用した。ｍａａ３へテロ接合体からの次世代の植物５１個体から葉を一枚ずつ採り、ハイグロマイシンを含む培地上に３日間置いた。ｍａａ３突然変異体表現型を示した２３個体から採った葉は、全て緑色のままであった。これはハイグロマイシン耐性であることを示している。一方、野生型の２８個体は全て白色となり、ハイグロマイシン感受性であった。この結果は、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＴ−ＤＮＡが、ｍａａ３突然変異と連鎖しており、かつハイグロマイシン耐性遺伝子がゲノム中の一座位にのみ挿入されていることを示唆する。
さらに連鎖を確認するため、Ｔ−ＤＮＡのライトボーダー付近をプロープとして、ｍａａ３突然変異体４個体由来のＤＮＡに対してサザンハイプリダイゼーションを行った。その結果を図４に示す。すると、４個体全てにおいて、同じバンドパターンが見られた。これは、ｍａａ３突然変異とＴ−ＤＮＡが連鎖していることを示す。また、２本のバンドが見られたことから、一座位にタンデムにＴ−ＤＮＡが挿入されていることが示された。
［ハイグロマイシン耐性の検定］
培地は、１×ガンボーグＢ５塩、ショ糖２％、Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ（ＤＩＦＣＯ）０．８％、ハイグロマイシンＢを５０μｇ／ｍｌ含み、ＫＯＨでｐＨ５．７〜５．８に調製した。植物体の葉を切り取り、培地上に３日間置いた。白色になったものをハイグロマイシン感受性、緑色を維持したものをハイグロマイシン耐性と判定した。
【００４２】
（２）ｍａａ３原因遺伝子の単離
ｍａａ３突然変異がＴ−ＤＮＡと連鎖していることに基づき、Ｔ−ＤＮＡの近傍配列を単離することでｍａａ３遺伝子を単離することを計画した。まず、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法を用いた。レフトボーダー付近を用いた場合、ＰＣＲ産物の増幅が全く見られなかった。ライトボーダー付近を用いた場合、任意プライマーにＡＤ２を用いた場合に、バンドの増幅が見られた。このバンドをシークエンスしたところ、これはシロイヌナズナのゲノム配列ではなく、バイナリーベクターのレフトボーダー近くのＴ−ＤＮＡ外の配列であった。Ｔ−ＤＮＡがタンデムに挿入されているという前節の結果も合わせると、Ｔ−ＤＮＡは、近傍のＴ−ＤＮＡ外の配列も含めて複雑に挿入されていると考えられる。
このために、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法では、Ｔ−ＤＮＡに近接するシロイヌナズナゲノム配列が単離できなかったと考えられる。
この結果は、Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーの少なくとも一つがシロイヌナズナゲノム配列と接していないことを示した。そこで、レフトボーダーの近傍配列をｌｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法を用いて単離することを考えた。まず、レフトボーダー付近の配列を用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った。すると、ライトボーダーと同様に、レフトボーダーもｍａａ３突然変異と連鎖していた。そこで、レフトボーダー付近の配列のプライマーを用いてＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行い、一つのバンドを得た。このバンドをシークエンスしたところ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー付近の配列に引き続いて、シロイヌナズナ第４染色体のＡＴＦＣＡ４と呼ばれるコンティグ配列の６１４７４−６１５４５ｂｐと一致する配列が見られた（図５）。これが、Ｔ−ＤＮＡに隣接するシロイヌナズナゲノム配列だと考えられる。一方、Ｔ−ＤＮＡのレフトボーダーは、末端から３８ｂｐを欠失しており、この欠失にはＴＡＩＬ−ＰＣＲで用いたプライマーの配列が含まれることから、これがＴＡＩＬ−ＰＣＲで増幅しなかった理由だと考えられる。
【００４３】
単離した領域にＭＡＡ３遺伝子が存在することを確認するため、サザンハイブリダイゼーションを行った。プローブには、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲで単離した配列付近にあるＡＴＦＣＡ４の６０４２９−６１２５５ｂｐの配列を用い、ＤＮＡはＨｉｎｄIIIで消化した。ＷＳ野生型ＤＮＡでは、１．３ｋｂのバンドのみが見られたのに対し、ｍａａ３突然変異体（ヘテロ接合体）ＤＮＡでは、１．３ｋｂに加えて５ｋｂのバンドが見られた。これは、この領域にＴ−ＤＮＡが挿入されていることを示す。
また、上記のプローブは、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲで単離されたゲノム配列に対して、Ｔ−ＤＮＡを挟んで反対側に設計したものである。このブローブで突然変異体に特有なバンドが見られたことにより、Ｔ−ＤＮＡの反対側に大きなＤＮＡ欠失がないことが示された。
Ｔ−ＤＮＡ挿入部位付近は、ゲノムプロジェクトによるアノテーションによれば、ｄ１３８２１ｗ遺伝子とｄ１３８２５ｗ遺伝子の間に挟まれた領域であった（Bevan et al.,1998）。アノテーンョンが間違っている可能性を検討するため、ＡＴＦＣＡ４コンティグの６０００１−７００００ｂｐの１０ｋｂをＧＥＮＥＳＣＡＮプログラムにかけて遺伝子構造の予測を行った。すると、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位の２１４ｂｐ下流の６１６８８位に開始コドンがあり１８エキソンからなる遺伝子が予想された（図３）。この後半はｄ１３８２５ｗ遺伝子と一致した。ＮｅｔＰｌａｎｔＧｅｎｅ，ＧＲＡＩＬによる予測も基本的に一致した。そこで、この遺伝子のｃＤＮＡをＰＣＲ法、５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法により単離したところ、２１エキソンからなり長さ２７０８ｂｐであった。プログラムで予想されなかった第一エキソンがあり、結局Ｔ‐ＤＮＡはこの遺伝子の第一イントロンに挿入されて遺伝子を分断していた。そこで、この遺伝子がｍａａ３突然変異の原因遺伝子であると結論づけた。これ以降、ＭＡＡ３遺伝子と表す。
【００４４】
［分子生物学的解析］
一般の試薬類はおもに和研薬、もしくはナカライテスクから購入した。酵素類は主にＴａＫａＲａから購入した。アイソトープ標識した［α‐^３２Ｐ］ｄＣＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。
酵素反応、ＤＮＡプロット、ＰＣＲの方法は、一般的なプロトコールに従った（Sambrook et al.,1989;Sambrook and Russel,2001）。ＰＣＲには特に記さない限りＴａＫａＲａＥｘＴａｑを用いた。ＲＮＡ抽出は、RNeasy P1antMini Kit（QIAGEN）を用いた。ＤＮＡシークエンシングは、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kits（Perkin Elmer）を用いてシークエンス反応をした後、ABI PRISM 377Genetic Analyzer（Perkin E1mer）、ABIPRISM 310 Genetic Analyzer（Perkin E1mer）、ABIPRISM 3100 Genetic Analyzer（Perkin E1mer）で配列を決定した。シークエンスデータはSequencing Analysis ver.3.0（Perkin E1mer）を用いて解析した。
［植物個体からのＤＮＡの抽出］
本葉２枚程度または花序茎頂部数個を徴量遠心管にとり、２００μｌのＣＴＡＢバッファー［３％臭化セチルトリメチルアンモニウム、１．４Ｍ塩化ナトリウム、０．２％２−メルカプトエタノール、２０μＭＥＤＴＡ、１００μＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）］を加えた。乳棒（Ｋｏｎｔｅｓ）をluchi digital homogenizerを用いて高速回転させ、徴量遠心管中の植物組織を十分にすりつぶした。さらに３００μｌのＣＴＡＢバッファーを加えて、６０℃で３０分間保温した。５００μｌのクロロホルムを加え、静かに混合し、５０００ｒｐｍで５分間室温で遠心したのち、水層を新しい微量遠心管に移した。３３３μｌのイソプロパノールを加えて静かに混合した後、室温で１５分間静置し、５０００ｒｐｍで５分間遠心した。上澄みを捨て、７０％エタノールでべレットをリンスし、１００μｌのＴＥ−ＲＮａｓｅ［１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡ］を加えてペレットを溶かした。ＳＳＬＰ法では、これをＤＮＡ溶液として用いた。他の用途の際には、さらにフェノール抽出とクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行い、ＴＥに溶解した。
【００４５】
［ゲノムサザン解析］
Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー付近のプローブには、次の二つのプライマーで増幅したＰＣＲ断片をRandom Primer DNA Labeling Kit（ＴａＫａＲａ）を使って［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。
ＬＢ７１：5' ATGTACTGAATTCACATCCG 3'
ＬＢ１４４０：5' CCTCATTACTGACTGACTGC 3'
Ｔ‐ＤＮＡライトボーダー付近のプロープの作製には、同様に次の二つのプライマーを用いた。
ＲＢ４６１：5' AGTCGCCTAAGGTCACTATC 3'
ＲＢ２２６０：5' GACGAATTAGTGGGAATAGC 3'
ゲノムコンティグＡＴＦＣＡ４の６０４２９−６１２５５ｂｐの配列のプローブには、同様に次の二つのプライマーを用いた。
ｍａａ３ＲＢ１：5' AATGGCATCAAGAGCTTCCGAG 3'
ｍａａ３ＲＢ２：5' AAAACGGCGGTGTAGCTGTAAC 3'
［ＴＡＩＬ−ＰＣＲ］
Ｌｉｕｅｔａｌ．（１９９５），劉（１９９７）の方法に従った。
［ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲ］
石黒（１９９４）、井沢（１９９７）の方法に基づいた。ＨｉｎｄIIIで消化したゲノムＤＮＡを用いたサザンハイブリダイゼーションでは、レフトボーダー付近のプローブで５ｋｂ,４ｋｂのバンドが、ライトボーダー付近のプロープで５ｋｂ，４．５ｋｂのバンドが見られていたことから、共通している５ｋｂのバンドはしフトボーダーとライトボーダーが向かい合っていてゲノム配列に隣接していない可能性が考えられた。このバンドを排除してゲノム配列に隣接したボーダー配列のみを得るため、ｍａａ３突然変異体のゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、アガロースゲルで泳動して４ｋｂ付近を切り出した。セルフライゲーションし、ＳｐｈＩ消化により線状ＤＮＡにした後、レフトボーダー付近に設計した二つのプライマーによるＰＣＲを行い、増幅したバンドを単離した。
ＬＢ１：5' CACGCCATCGATGTAATAATTGTCATTAGATTGT 3'
ＬＢ２：5' GAGCTATTGGCACACGAAGAATGGT 3'
［ｃＤＮＡ塩基配列の決定］
Ｃｏｌ野生型の栄養期茎頂から作製したｃＤＮＡをテンブレートにして、次の二組のプライマー対で増幅したバンドのシークエンスを決定した。
ｌｅｆ１６８０：5' AGCGTGTAATGGCGATCGATAATGGCAAGC 3'
ｐｙｒｏｒＢａｍＨＩ：5' GGAGTTGCTTTGGATCCCCTACCTG 3'
このプライマー対でｃＤＮＡの５’側半分が増幅された。
ｐｙｒｏｆｌＢａｍＨＩ：5' GCTCTGCACTTCTTGCTAAATCTAACCGTG 3'
ｌａｓｔｅｒ７５０６：5' AGTTTAGTCTTCTCCGGCCATGGCTACATC 3'
このブライマー対で、ｃＤＮＡの３’側半分が増幅された。ｃＤＮＡの５’末端と３’末端は、５’／３’ＲＡＣＥＫｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて増幅し、配列を決定した。
【００４６】
（３）ＭＡＡ３タンパク質の予想
ＭＡＡ３遺伝子から予想されるタンパク質は、８１８アミノ酸からなる。この配列を用いて、ＢＬＡＳＴによるホモロジーサーチを行った。機能が知られているもののうちで最も相同性が高いのが出芽酵母のＳｅｎｌｐであった。Ｓｅｎｌｐは、スーパーファミリーＩに属するヘリカーゼである。ｔＲＮＡのスプライシングやｒＲＮＡ、ｍＲＮＡの成熟など様々なＲＮＡのプロセシングに必要であり、Ｓｅｎ１遺伝子は出芽酵母の生存に必須である（DeMariani et al.,1992）。また、出芽酵母のＵｐｆ１ｐとも全長にわたって相同性を示した。Ｕｐｆ２ｐもスーパーファミリーＩに属するヘリカーゼであり、停止コドンが遺伝子中途に入ったｍＲＮＡを分解する経路（nonsense-mediated mRNA decay）で機能している。ただし、ＵｐｆｌｐがＵｐｆ２ｐとの結合ドメインであるシステインリッチ領域をＮ末端に持つのに対し、ＭＡＡ３には存在しない（Leeds et al.,1992;Culbertson,1999）。
シロイヌナズナのデータベースに対し、ＢＬＡＳＴＰ，ＴＢＬＡＳＴＮでサーチを行うと、ＭＡＡ３全長にわたって高い相同性を示す機能未知のputative geneが４つ見つかった。機能が知られているものでは、ＳＤＥ３が全長にわたってやや弱いながらも相同性を示した。ＳＤＥ３は、ＰＴＧＳの異常な突然変異体のみの原因遺伝子として単離されたものである。また、植物のタンパク質としては他に、イネに高い相同性を示すものが一つ見つかった。
これらの配列のアライメントを行った（図６〜８）。ＭＡＡ３はＮ末から７５５番目のアミノ酸までほぼ全長にわたってＳｅｎｌｐなどと相同性を示した。ただ、Ｍ４Ａ３はその他のスーパーファミリーＩへリカーゼに比べ、Ｎ末が短い。スーパーファミリーＩへリカーゼの７つのコンセンサス配列全てがＭＡＡ３の後半に見られた。近隣結合法により、系統樹をＭＡＡ３の４８４番目から７５５番目のアミノ酸に当たる部分を用いて作成した。その結果、ＭＡＡ３は出芽酵母Ｓｅｎｌｐのシロイヌナズナにおける相同タンパク質の一つであることが高いブーツストラップの値で支持された。シロイヌナズナにはさらに３つのＳｅｎｌｐ相同タンパク質がある。
（４）ＭＡＡ３遺伝子の発現解析
ＲＴ−ＰＣＲ法によりＭＡＡ３遺伝子の発現を解析した。花、果実、栄養期茎頂、葉、根と、全ての調べた組織おいて、同じレベルで発現していた。
［ＲＴ−ＰＣＲ］
各組織のＲＮＡ０．４μｇに対し、SuperScript^ＴＭ Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis（GIBCO BRL）を用いて、ＤＮａｓｅ処理しオリゴｄＴプライマーでｃＤＮＡを合成した。２０μｌのうち、０．５μｌと次の二つのプライマーを用い、９４℃３分（９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分）×３５のサイクルでＰＣＲを行った。
ＰｙｒｏｆＢａｍＨＩ‐２：5' GTAGGGGATCCAAAGCAACTCCCAG 3'
ｌａｓｔｅｒ７５０６：5' AGTTTAGTCTTCTCCGGCCATGGCTACATC 3'
ポジティブコントロール反応には、ＡＣＴ８を用いた（An et al.,1996;Aida et al.,1997）。
プライマーは次の二つである。
ＡＣＴ８ｆ：5' ATGAAGATTAAGGTCGTGGCA 3'
ＡＣＴ８ｒ：5' TCCGAGTTTGAAGAGGCTAC 3'
【００４７】
【発明の効果】
本発明の遺伝子ＭＡＡ３を利用することにより、雌性配偶体を致死性にすることができる。
また、本発明の遺伝子を利用することにより、果実などの種子数を減少させることができる。また、トランスジェニック作物などで外来遺伝子を含まない種子（胚乳）のみを形成させる技術を可能にする。
【００４８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】シロイヌナズナの有性生殖を示す。胚珠では、減数分裂が起こり近位端の１細胞が生き残る、続いてｎのままで分裂が進み、７細胞８核の雌性配偶体となる。これは、卵細胞、中央細胞、２つの助細胞、３つの反足細胞からなる。雄ずいの葯では、減数分裂に続く体細胞分裂でｎの花粉（２または３細胞）が作られる。花粉は雌ずいの柱頭まで運ばれると、接着・発芽して花粉管を作る。２つの精細胞が、花粉管によって長い道のりを雌性配偶体まで運ばれ、重複受精する。つまり、雌性配偶体の卵細胞（ｎ）が受精して胚（２ｎ）が作られ、中央細胞（ｎ＋ｎ）が受精すると胚乳（３ｎ）が作られる。
【図２】微分干渉顕微鏡により撮影された写真を示す。
図２Ａ：雌ずいの中で半数の雌性配偶体は野生型であり、受精して胚発生が進んでいるため肥大化している（ｗｔ）、残りの半数は、雌性配偶体の発生異常のため、コンマ型のステージで停止している（ｍａ）。（ｅｍ）は発達中の胚を示す。
図２Ｂ：野生型の雌性配偶体を示す。
図２Ｃ：ｍａａ３突然変異体の雌性配偶体を示す。発生が遅れ極核の融合が起こっていない。他の核は焦点外。ａ：反足細胞、ｃ：中央細胞核、ｅ：卵細胞核、ｐ：極核、ｓ：助細胞核、スケールバーは５０μｍ。
【図３】ＭＡＡ３の遺伝子構造を示す。Ｔ−ＤＮＡ挿入部位の２１４ｂｐ下流に開始コドンがあり１８エキソンからなる遺伝子である。
【図４】Ｔ−ＤＮＡのライトボーダー付近をプロープとして、ｍａａ３突然変異体４個体由来のＤＮＡに対してサザンハイプリダイゼーションを行った結果を示す。すると、４個体全てにおいて、同じバンドパターンが見られた。これは、ｍａａ３突然変異とＴ−ＤＮＡが連鎖していることを示す。また、２本のバンドが見られたことから、一座位にタンデムにＴ−ＤＮＡが挿入されていることが示された。
【図５】ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲにより得られたバンドをシークエンスした結果を示す。Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー付近の配列に引き続いて、シロイヌナズナ第４染色体のＡＴＦＣＡ４と呼ばれるコンティグ配列の６１４７４−６１５４５ｂｐと一致する配列が見られた。
【図６】ＭＡＡ３タンパク質、Ｓｅｎｌｐ、その他のスーパーファミリーＩへリカーゼのアミノ酸配列の比較をしたアラインメントを示す。
【図７】図６のつづきを示す（２ページ目）。
【図８】図６のつづきを示す（３ページ目）。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein essential for female gametophyte formation and a gene MAA3 encoding the same.
The present invention also relates to a method for reducing the number of seeds using the MAA3 gene and a method for producing seeds containing no foreign gene.
[0002]
[Prior art]
The female gametophyte of a plant is the central place of plant sexual reproduction in which it produces egg cells and central cells, while attracting pollen tubes and causing double fertilization. From the 19th century, there has been accumulated morphological and comparative morphological research.
For example, sexual reproduction of Arabidopsis thaliana is shown in FIG. In the ovule, meiosis occurs and one cell at the proximal end survives, and then division continues with n, resulting in a female gametophyte of 7 cells and 8 nuclei. It consists of an egg cell, a central cell, two helper cells, and three antipodal cells. In stamen buds, n pollen (2 or 3 cells) is produced by somatic cell division following meiosis. When pollen is transported to the pistil, it adheres and germinates to form a pollen tube. Two sperm cells are carried a long way through the pollen tube to the female gametophyte, where they are fertilized twice. That is, the egg (n) of the female gametophyte is fertilized to produce an embryo (2n), and the endosperm (3n) is produced when the central cell (n + n) is fertilized.
[0003]
While the accumulation of observations, there are very few gene-level studies. There are two main approaches to gene-level research. First, isolation of a gene specifically expressed in female gametophytes was attempted. However, since the female gametophyte is inside the pistil tissue, only a library containing a large amount of surrounding tissue can be produced, and only genes of the cells surrounding the female gametophyte have been isolated (Bewley et al. 2000). Although the development of female gametophytes is synchronized and improvement has been achieved by using orchids that can obtain many tissues, analysis of gene function has not progressed to date (Nadeau, 1996). Another approach may be genetic studies by isolating mutants of female gametophyte development. However, the search for mutants of the female gametophyte has not been performed so far because the female gametophytes are haploid and the mutants do not show Mendelian inheritance.
[0004]
The only female gametophyte mutant that was classically known in Arabidopsis was the isolated gf mutant of Redei (1965), with only three other cases reported in maize in other plants (Sheridan and Huang 1997). On the other hand, there are several reports of mutants isolated in Arabidopsis as mutants unrelated to female gametophytes and genetically shown to be female gametophyte lethal by subsequent analysis. Among the causative genes that have already been isolated are trp1, trp4 double mutant (Niyogi et al., 1993), constitutive triple response 1 (Kieber and Ecker, 1994), prolifera (Springer et al., 1995) It is. However, these female gametophyte phenotypes have not been reported, and it is unclear how these genes function in female gametophyte development.
[0005]
Knowledge obtained from molecular genetic studies on female gametophyte development can be expected to be used to produce seedless fruits.
In the field of crops grown for their commercial value, there is a great demand for plants that can grow seedless fruits. For the production of seedless fruits, methods have been used that utilize parthenofruits in which the fruits grow without pollination.
Methods for achieving parthenocarpic growth include using chemically active ingredients, using selected mutants that impart parthenocarpy growth to the species, or changing the number of chromosomes (ie, It is by using (polyploidy).
For example, taking watermelon as an example, the method of producing seedless watermelon currently in practical use is a method using triploidy sterility. However, this triploid seedless watermelon is widely used because it takes a long time to cultivate varieties compared to diploid normal watermelon, seed germination rate is low, and fruit quality is inferior. Not. In addition, as a method for producing seedless watermelon, there is a method using a plant hormone, but it has not been put into practical use because the fruit is small and easily deformed. In addition to this, a method of inducing parthenogenesis and enlarging fruits by artificially pollinating female flowers with pollen inactivated by X-ray irradiation has been developed, but has not become widespread.
For this reason, methods for achieving the production of female sterile plants that do not form seeds upon pollination using molecular genetic mechanisms have attracted widespread interest for commercial fruit production.
[0006]
We previously screened female gametophyte mutants using as an index that the number of seeds in the pod was halved. This is based on the following assumptions.
That is, suppose that there is a sporophyte individual having a female gametophyte lethal mutation as a heterozygote. After meiosis, it is randomly determined whether a female gametophyte will inherit either of the two alleles. Therefore, half of the female gametophytes inherit the wild-type allele, normally generate female gametophytes, and produce fertilized by double fertilization. On the other hand, the other half of the female gametophytes inherit the mutant allele and become lethal, so they cannot produce seeds. As a result, in the pod (ie mature pistil), the number of seeds is halved.
[0007]
Based on the above assumptions, screening was performed using T-DNA insertion mutants of Arabidopsis thaliana as an indicator that the number of seeds in the pod became half. As a result, it was possible to isolate four female gametophyte mutants. It was named a magatama (maa) mutant from the shape of an ovule that has stopped developing without being fertilized in the pistil (Kentaro K. Shimizu and Kiyotaka Okada, 2000, Development, 127, 4511-4518).
FIG. 2 shows a photograph of a magatama mutant by a differential interference microscope. As shown in FIG. 2A, half of the female haploids are abnormally generated. The maa3 mutant, one of the magatama (maa) mutants, is delayed in development as shown in FIG. 2C and no fusion of polar nuclei has occurred.
It was expected that the molecular genetic mechanism of female gametophyte formation would be clarified by isolating the causal gene of this magatama mutant.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to clone the causative gene of a female gametophyte lethal magatama mutant. It is another object of the present invention to provide a method for making a female gametophyte lethal by using a catagama mutant causative gene and a method for reducing the number of seeds.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
Female gametophyte lethal magatama mutants were isolated from screening of the pGV3850: HPT insertion line. pGV3850: HPT T-DNA has a hygromycin resistance gene. Therefore, it was examined whether the mutant was linked to T-DNA using hygromycin resistance. As a result, among the four magatama mutants, the mutation trait of the maa3 mutant was linked to T-DNA.
Therefore, lethality of the female gametophyte of the maa3 mutant is due to gene disruption by T-DNA, and the causal gene of female gametophyte lethality can be isolated using T-DNA as an index. The causative gene was isolated by PCR using the sequence of T-DNA to solve the problems of the invention.
[0010]
As a result of Southern hybridization using a light border of T-DNA, it was shown that T-DNA was inserted in tandem at the single locus in the maa3 mutant.
TAIL-PCR using the vicinity of the T-DNA right border was performed, but no neighboring Arabidopsis genome sequence was obtained. Therefore, it was considered to isolate a sequence adjacent to the left border of T-DNA using an inverse PCR method.
[0011]
First, Southern hybridization was performed using a sequence near the left border. Then, like the right border, the left border was linked to the maa3 mutation. Therefore, inverse PCR was performed using a primer having a sequence near the left border to obtain one band. When this band was sequenced, a sequence corresponding to the contig sequence 61474-61545 bp called ATFCA4 of Arabidopsis thaliana chromosome was found following the sequence near the T-DNA left border.
This is thought to be the Arabidopsis genome sequence adjacent to the inserted T-DNA. It was confirmed by Southern hybridization that the causal gene of the maa3 mutant was present in this region.
[0012]
The vicinity of the T-DNA insertion site was a region sandwiched between the dl3821w gene and the dl3825w gene according to the annotation by the genome project (Bevan et al., 1998).
The cDNA of this gene was isolated by PCR method, 5′RACE method and 3′RACE method, and it was composed of 21 exons and had a length of 2708 bp. There was a first exon that was not expected by annotation, and T-DNA was eventually inserted into the first intron of this gene to disrupt the gene. Therefore, it was concluded that this gene is a causal gene for maa3 mutation. This was named MAA3 gene.
The structure of the MAA3 gene is shown in FIG.
[0013]
The protein predicted from the MAA3 gene consists of 818 amino acids. Using this sequence, a homology search by BLAST was performed. Among the known functions, the highest homology was Sen1p of budding yeast. Sen1p is a helicase belonging to Superfamily I. In addition, all seven consensus sequences of superfamily I helicases were found in the second half of MAA3.
Helicase is an enzyme necessary for various RNA processing such as tRNA splicing, rRNA, and mRNA maturation.
[0014]
As a result of microscopic observation, the maa3 mutant showed two abnormalities in which the development of female gametophytes was delayed, the nucleolus was small, and the internal structure was not seen.
The nucleolus is a structure in the nucleus composed of protein and RNA, and is a synthesis site of ribosome. This indicates that MAA3 is involved in rRNA processing, and in the female gametophyte, when the MAA3 gene is deficient, the nucleolus becomes abnormal and delays its development, and normal female gametophyte development cannot be achieved.
[0015]
That is, the present invention provides a protein selected from the following (A) and (B), which is essential for female gametophyte formation.
(A) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[0016]
The gene of the present invention is a gene selected from the following (a) and (b), which is a gene consisting of a DNA encoding a protein essential for female gametophyte formation.
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
[0017]
The present invention provides a vector containing the gene MAA3 encoding a protein essential for female gametophyte formation, and a transformant transformed with the vector. Also provided is a nucleotide comprising a partial sequence of 14 or more consecutive bases in the base sequence of the MAA3 gene or a complementary sequence thereof.
The present invention relates to a method for suppressing the expression of the gene MAA3 encoding a protein essential for female gametophyte formation to make the female gametophyte lethal, by inserting an antisense of the MAA3 gene into n sites in the plant genome. Number 2 ⁿ Provide a way to halve. Further, the present invention provides a method for forming only seeds not containing a specific allele by inserting the antisense of MAA3 gene into a genomic region linked to the specific allele. Furthermore, this invention provides the transformant obtained by these methods.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention provides a gene encoding a protein essential for female gametophyte formation and a method for using the same.
The gene of the present invention can make a female gametophyte lethal by suppressing its gene expression, and can be used to reduce the number of seeds or let a seed having a specific allele be lethal. is there.
[0019]
(I) The protein of the present invention, that is, the proteins of the first and second inventions are proteins essential for female gametophyte formation, and include those having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing below.
In addition, a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing described later can be mentioned. Deletion, substitution, or addition of amino acids may be performed to such an extent that essential functions for female gametophyte formation are not lost, and is usually 1 to about 164, preferably 1 to about 82. Such a protein has a homology of 1-80%, preferably 1-90% amino acid sequence with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
The protein of the second invention is derived from Arabidopsis thaliana among the proteins of the first invention.
[0020]
The protein of the present invention can be produced by a gene recombination technique using cDNA encoding the protein. For example, cDNA encoding MAA3 can be incorporated into an appropriate expression vector, and the resulting recombinant DNA can be introduced into an appropriate host cell. Examples of the expression system (host-vector system) for producing the polypeptide include bacterial and yeast expression systems. Among these, in order to obtain a functional protein, it is preferable to use yeast.
The method for obtaining cDNA encoding the protein of the present invention is described in the following sections of the second and third inventions.
[0021]
(II) The gene of the present invention, that is, the gene of the third, fourth and fifth inventions, is a gene encoding a protein essential for female gametophyte formation, and the base shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing described later The thing which has a sequence is mentioned.
In addition, those containing DNA that can hybridize under stringent conditions with DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing described later. The DNA that can hybridize in this way is not limited as long as the protein encoded by the DNA has a function essential for female gametophyte formation. Such DNA has a homology of 70% or more, preferably 80% or more of the nucleotide sequence with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Such DNA includes mutant genes found in nature, artificially modified mutant genes, homologous genes derived from different organisms, and the like.
In the present invention, hybridization under stringent conditions is usually performed for about 12 hours at a temperature of 37 to 42 ° C. in a hybridization solution of 5 × SSC or an equivalent salt concentration. Preliminary washing can be performed with 5 × SSC or a solution having a salt concentration equivalent thereto, if necessary, followed by washing in a solution having a salt concentration equivalent to 1 × SSC or the like.
[0022]
The gene of the present invention can be isolated and obtained by screening using an appropriate plant tissue or cell as a gene source. The plant is not particularly limited as long as it has the gene of the present invention, and examples thereof include plants of Brassicaceae, Gramineae, Asteraceae, and Rabbitaceae.
Screening and isolation of the gene can be suitably performed by a homology cloning method or the like.
MRNA is prepared from the above-ground part of a plant as a gene source. From this, a cDNA library is constructed, and the cDNA library is screened using a probe corresponding to the MAA3-like sequence obtained by searching an EST (expressed sequence tag) database, whereby the cDNA of a protein essential for female gametophyte formation is obtained. A clone containing can be obtained.
For the obtained cDNA, the base sequence can be determined by a conventional method, the translation region can be analyzed, and the amino acid sequence of the protein encoded thereby can be determined
[0023]
Using the RNA (cRNA) complementary to this prepared from the obtained cDNA of MAA3 gene, MAA3 was prepared by an in vitro translation method [Hediger et al., Biochim. Biophys. Acta, 1064, 360, 1991]. Proteins can be synthesized and the size of the protein, presence or absence of sugar addition, etc. can be examined by electrophoresis.
[0024]
Isolation of homologous genes and chromosomal genes from different tissues and organisms by screening appropriate cDNA libraries or genomic DNA libraries prepared with different gene sources using the resulting MAA3 gene cDNA can do.
In addition, a normal PCR (Polymerase Chain Reaction) method using a synthetic primer designed based on the information of the disclosed base sequence of the gene of the present invention (base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a part thereof) A gene can be isolated from a cDNA library or a genomic DNA library.
A DNA library such as a cDNA library or a genomic DNA library is, for example, a method described in “Molecular cloning” [Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., published by Cold Spring Harbor Press, 1989]. Can be prepared. Alternatively, if there is a commercially available library, it may be used.
[0025]
The gene of the present invention is not limited to the cDNA sequence described above, and a DNA corresponding to the amino acid sequence can be designed and used as a DNA encoding a polypeptide. In this case, 1 to 6 types of codons encoding one amino acid are known, and the selection of codons to be used may be arbitrary. For example, considering the frequency of codon usage of the host used for expression, more efficient expression can be achieved. High arrays can be designed. DNA having the designed base sequence can be obtained by chemical synthesis of DNA, fragmentation and binding of the cDNA, partial modification of the base sequence, and the like. Artificial modification of the base sequence and mutagenesis can be achieved by using site-specific mutagenesis [Mark, DF et al., Proceedings] using primers composed of synthetic oligonucleotides that encode the desired alteration. of National Academy of Sciences, Vol. 81, Paragraph 5562 (1984)].
[0026]
Whether a certain DNA encodes a protein essential for female gametophyte formation can be determined by a complementation assay. That is, it can be determined by introducing the DNA into a plant in which the expression of the endogenous MAA3 gene is suppressed (for example, the maa3 mutant of Arabidopsis thaliana), thereby examining whether female sterility is recovered.
[0027]
(III) The sixth invention provides a gene containing the gene of the present invention or a vector containing a part of the gene. The seventh invention provides a vector for MAA3 gene homologous recombination. The eighth invention provides a vector for MAA3 gene expression. The ninth invention provides transformants transformed with these vectors, respectively.
The vector used in these inventions can be selected according to the host and purpose, and commercially available or improved ones can be used. As the transformation method, a suitable method can be selected depending on the host and the vector.
[0028]
The vector for homologous recombination of the MAA3 gene of the seventh invention can be used, for example, for producing a female sterile plant in which the MAA3 gene is disrupted. The DNA of the present invention or a part thereof can be combined with a marker such as a drug resistance gene and then incorporated into a vector to be a vector for destroying the MAA3 gene. As a method for transformation into a vector and a host, an appropriate one is selected depending on the host. Examples of the marker include a kanamycin resistance gene and a chloramphenicol resistance gene, and examples of the transformation method include an electroporation method and a particle gun method.
The DNA of the present invention for homologous recombination does not need to encode the MAA3 protein, and can undergo homologous recombination with the MAA3 gene on the genome under physiological conditions, that is, in cells, whereby the MAA3 gene It is only necessary to have homology to such an extent that can be destroyed. Such homology is preferably 90% or more, more preferably 95% or more. Moreover, it is not always necessary to include DNA having homology with the exon portion of the MAA3 gene, and any DNA having homology with the genomic DNA of MAA3 may be used. The DNA for performing homologous recombination may be a part of the DNA of the present invention. Here, the term “part” includes those having a length of preferably 50 bases or more, more preferably 100 bases or more.
[0029]
(IV) The tenth, eleventh and twelfth inventions are nucleotides comprising a partial sequence of 14 bases or more, preferably 20 bases or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a complementary sequence thereof. Is to provide.
The nucleotide of the present invention can be used as a probe for detecting a gene encoding a protein essential for female gametophyte formation, and also a gene encoding a protein encoding the protein or a protein highly homologous thereto. Can also be used as a primer for obtaining a gene that encodes a protein essential for female gametophyte formation by its antisense strand or the like.
[0030]
(V) The thirteenth invention provides a method for making a female gametophyte lethal using the gene MAA3 of the present invention.
Examples of methods for suppressing the expression of the MAA3 gene possessed by plants include methods using the following antisense method, gene targeting method, gene disruption tagging method and the like.
[0031]
The method of the present invention based on the antisense method comprises constructing a vector containing an appropriate promoter and a reverse MAA3 gene (antisense DNA) arranged downstream thereof, and introducing the vector into a plant to express the MAA3 gene. It is a method for suppressing The promoter used here is not particularly limited as long as it has promoter activity even in the female gametophyte.
[0032]
The method of the present invention by the gene targeting method is a method of suppressing the expression of the MAA3 gene by inserting another DNA into a part of the gene MAA3 of the present invention by homologous recombination and knocking out the MAA3 gene. In this method, the vector of the seventh invention can be used.
Moreover, as a method of knocking out such a specific gene, it can carry out, for example according to the method of Kempin et al. (Kempin et al. Nature 389: 802-803. 1997). That is, a targeting vector in which a kanamycin resistance gene or the like is inserted into DNA consisting of the MAA3 gene is prepared, introduced into a plant, homologous recombination is caused, and the MAA3 gene possessed by the plant is knocked out. Whether or not homologous recombination has occurred can be confirmed by PCR or Southern hybridization.
[0033]
The method of the present invention based on the gene disruption tagging method is a method in which T-DNA or transposon is randomly inserted into the genome and a MAA3 gene disruption strain is screened using PCR.
The vector used for T-DNA tagging is not particularly limited, and for example, pBIH1-IG can be used. The transposon used for transposon tagging is not particularly limited, and for example, a DNA-type transposon such as an Ac-Ds system or a retrotransposon can be used.
[0034]
14th invention inserts the antisense of MAA3 gene in n place of a plant, and makes the number of seeds 2 ⁿ Provide a way to halve.
When the MAA3 gene antisense is inserted into one site of the plant genome, half of the female gametophytes have MAA3 antisense and become lethal due to meiosis. If it is inserted in n places of the plant, the number of seeds of the plant is about 2 ⁿ It can be reduced by a factor. 2 if the inserted n antisenses are not linked in the genome ⁿ There is a slight increase or decrease when chained.
Seedless fruit has commercial value, but it is known that if there is no seed at all, fruit ripening is not normal and the quality is lowered. According to the method of the present invention, the number of seeds can be arbitrarily controlled, and a product crop with few seeds and high quality can be easily produced.
[0035]
The fifteenth, sixteenth and eighteenth inventions provide methods for forming only seeds that do not contain a specific gene by inserting an antisense into a genomic region linked to the specific gene.
In the transgenic plant, the introduced foreign gene imparts various utility values such as disease resistance and cold resistance before the seed development. However, expression of foreign genes in seeds can adversely affect seed and endosperm quality. Moreover, at present, there is a sense of resistance to transgenic foods, and it is desirable that the edible seeds (endosperm) do not contain foreign genes. The present invention inserts the MAA3 gene antisense into the genomic region in the vicinity of the introduced foreign gene, thereby linking the foreign gene and the MAA3 antisense during meiosis, thereby killing the female gametophyte having the foreign gene. It is possible to do. This method can be achieved, for example, by introducing MAA3 antisense in the same construct when introducing a foreign gene. This method makes it possible to produce a food derived from a transgenic plant that does not contain foreign genes in seeds or endosperm.
In addition, as a method for introducing MAA3 antisense into a genomic region in the vicinity of a specific allele, a method for identifying a base sequence in the vicinity of a target allele and inserting MAA3 antisense using homologous recombination, etc. Is possible. By this method, genes that adversely affect the quality of seeds and endosperm can be removed from the seeds and endosperm.
[0036]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
[0037]
Example 1: Screening of magatama mutants
As a method for isolating female gametophyte mutations, we considered a primary screening method using as an indicator that the number of seeds in the pod was halved.
Screening of about 550 families of WS and Col strain T-DNA insertion mutants was performed. Screening was performed using the indicators that the number of seeds was halved, the segregation ratio was close to 1: 1, the female gametophyte was generated at the 1-nuclear stage, and the pollen was normal. As a result, four female gametophyte mutants could be isolated. From the shape of an ovule that has stopped developing without being fertilized in the pistil, it was named a magatama (maa) mutant. In the present invention, among maa1, maa2, and maa3, the maa3 mutant in which the mutation and T-DNA were linked was analyzed. A method for assaying mutation and T-DNA linkage is described in Example 3.
[0038]
[Plant cultivation method]
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. WS, Col, Ler wild type was used. A mixture of vermiculite and a small amount of perlite was placed in a pot, and the surface was covered with fine perlite and seeds were sown on it. After 2 days at 4 ° C, temperature 22 ° C, humidity around 50%, 50-100μE / m ² Grown in a plant cultivation room with lighting of / sec. The fertilizer was given a 1000-fold diluted solution of Hyponex 5-10-5 (Hyponex Japan).
[Screening of mutants]
Approximately 15 individuals each of the T2 356 family of WS T-DNA insertion lines produced in the First Division of Genes, National Institute for Basic Biology. The isolated vw386, vw413, and vw438 were named maa1, maa2, and maa3, respectively. maa1 was isolated from the MP5-1 vector and maa2 and maa3 were isolated from the line made using the pGV3850: HPT vector.
-About 100 families of T2 of Col T-DNA insertion line made by Dr. Takashi Araki using pGV3850: 1003. from here. The maa4 mutant was isolated.
[0039]
Example 2: Microscopic observation of maa3 mutant.
Since the maa3 mutant is female gametophyte lethal, no homozygote was obtained. Hereinafter, the maa3 mutant refers to a heterozygote. Of the female gametophytes in the heterozygote, half are maa3 female gametophytes and half are wild-type female gametophytes.
Female gametophytes of maa3 mutant with WS wild type were clarified and observed with a differential interference microscope. The developmental stage of female gametophytes followed a system based on the number of nuclei of Christensen et al. (1997) published during the study. It is known that the nucleus of each cell of the female gametophyte has only one nucleolus that is much larger than the nuclei of surrounding cells. Nucleolus is observed as a circular structure and can be clearly distinguished by differential interference microscopy (Willemse and van Went, 1984; Mansfield et al., 1991; Christensen et al., 1997).
A pistil immediately after pollination was collected from maa3, and an internal female gametophyte was observed. Then, an abnormal female gametophyte was observed mixed with a wild-type phenotype female gametophyte. First, the two polar nuclei of the central cell are not fused. This corresponds to the stage FG5 as a generation stage. In addition, the nucleolus of each cell is small. In particular, the nucleolus of the central cell is not seen in maa3, whereas in the wild type, a round structure is seen inside before and after fusion. Although the function of the nucleolus of the central cell, such as sunflower, is unknown, it is known to have one or two large vacuoles and many small vacuoles (Newcomb, 1973; review Willemse andvan Went, 1984). ), I think this is the case. In the wild type, the size of the two nucleoli before fusion is almost the same, but in maa3 there is often a difference in size.
FIG. 2 shows a photograph taken with a differential interference microscope.
FIG. 2A: Half of the female gametophytes in the pistil are wild-type, enlarged due to fertilization and embryo development (wt), the other half are due to abnormal development of female gametophytes It stops at the comma type stage (mu). (Em) indicates a developing embryo.
FIG. 2B: shows wild-type female gametophytes.
FIG. 2C shows the female gametophyte of maa3 mutant. The outbreak has been delayed and no fusion of polar nuclei has occurred. Other nuclei are out of focus. a: antipodocyte, c: central cell nucleus, e: egg cell nucleus, p: polar nucleus, s: assistant cell nucleus, scale bar 50 μm.
[0040]
[Observation with differential interference microscope]
The collected flowers were first placed in an ethanol 9: acetic acid 1 solution, degassed for 30 minutes and then fixed overnight. After soaking in 90% ethanol and 70% ethanol for 20 minutes or longer, the solution was clarified by immersing it in a Hoyer solution (7.5 g of gum arabic, 100 g of chloral hydrate, 5 ml of glycerol dissolved in 30 ml of water) for a while. Then, using an Olympus SZH stereomicroscope, the pistil was dissected and the ovule was taken out. The differential interference image was observed with a Zeiss Axio photo2 microscope equipped with a Nomarski apparatus, and a photograph was taken with a DATABACK D4 camera. Alternatively, differential interference images were observed with an Olympus AX70 microscope equipped with a Nomarski apparatus, and photographs were taken with an Olympus PM-C53DX camera.
[0041]
Example 3: Molecular genetic analysis of maa3 mutant
(1) Maa3 mutation and T-DNA linkage
The maa3 mutant was isolated from a screen of the pGV3850: HPT insertion line. pGV3850: HPT T-DNA has a hygromycin resistance gene. Therefore, hygromycin resistance was used to examine whether the maa3 mutation was linked to T-DNA. Leaves were picked one by one from 51 next-generation plants from maa3 heterozygotes and placed on a medium containing hygromycin for 3 days. All leaves taken from 23 individuals exhibiting the maa3 mutant phenotype remained green. This indicates that it is resistant to hygromycin. On the other hand, all 28 wild type individuals were white and sensitive to hygromycin. This result suggests that the T-DNA containing the hygromycin resistance gene is linked to the maa3 mutation and that the hygromycin resistance gene is inserted only at one locus in the genome.
Further, in order to confirm the linkage, Southern high pridization was performed on DNA derived from 4 maa3 mutants using a probe near the right border of T-DNA. The result is shown in FIG. Then, the same band pattern was seen in all four individuals. This indicates that the maa3 mutation and T-DNA are linked. In addition, since two bands were seen, it was shown that T-DNA was inserted in tandem at the single locus.
[Test for hygromycin resistance]
The medium contained 1 × Gamborg B5 salt, 2% sucrose, 0.8% Bacto-agar (DIFCO), 50 μg / ml hygromycin B, and was adjusted to pH 5.7 to 5.8 with KOH. Plant leaves were cut out and placed on the medium for 3 days. Those that became white were determined to be hygromycin sensitive, and those that remained green were determined to be hygromycin resistant.
[0042]
(2) Isolation of maa3 causative gene
Based on the fact that the maa3 mutation is linked to T-DNA, it was planned to isolate the maa3 gene by isolating the neighboring sequences of T-DNA. First, the TAIL-PCR method was used. When the vicinity of the left border was used, no amplification of the PCR product was observed. When the vicinity of the light border was used, band amplification was observed when AD2 was used as an arbitrary primer. When this band was sequenced, it was not an Arabidopsis genome sequence but a sequence outside the T-DNA near the left border of the binary vector. Combined with the result of the previous section that T-DNA is inserted in tandem, it is considered that T-DNA is inserted in a complicated manner, including sequences outside T-DNA in the vicinity.
For this reason, it is considered that the Arabidopsis genome sequence adjacent to T-DNA could not be isolated by the TAIL-PCR method.
This result indicated that at least one of the T-DNA right borders was not in contact with the Arabidopsis genome sequence. Therefore, it was considered to isolate the left border vicinity sequence using the lnverse PCR method. First, Southern hybridization was performed using a sequence near the left border. Then, like the right border, the left border was linked to the maa3 mutation. Therefore, inverse PCR was performed using a primer having a sequence near the left border to obtain one band. When this band was sequenced, a sequence corresponding to 61474-61545 bp of the contig sequence called ATFCA4 of Arabidopsis thaliana chromosome was found following the sequence near the T-DNA left border (FIG. 5). This is thought to be the Arabidopsis genome sequence adjacent to the T-DNA. On the other hand, the T-DNA left border lacks 38 bp from the end, and since this deletion includes the sequence of the primer used in TAIL-PCR, the reason why this was not amplified by TAIL-PCR It is thought that.
[0043]
Southern hybridization was performed to confirm the presence of MAA3 gene in the isolated region. As a probe, a sequence of 60429-61255 bp of ATFCA4 near the sequence isolated by Inverse PCR was used, and DNA was digested with HindIII. In the WS wild type DNA, only a 1.3 kb band was seen, whereas in the maa3 mutant (heterozygote) DNA, a 5 kb band was seen in addition to 1.3 kb. This indicates that T-DNA has been inserted into this region.
Further, the above probe is designed on the opposite side of the genome sequence isolated by Inverse PCR with T-DNA interposed therebetween. A band characteristic of the mutant was seen in this probe, indicating that there was no large DNA deletion on the opposite side of the T-DNA.
The vicinity of the T-DNA insertion site was a region sandwiched between the d13821w gene and the d13825w gene according to the annotation by the genome project (Bevan et al., 1998). In order to examine the possibility of annotations being wrong, the gene structure was predicted by applying 10kb of 60001-70000bp of ATFCA4 contig to GENESCAN program. Then, a gene consisting of 18 exons with an initiation codon at position 61688 downstream of the T-DNA insertion site by 214 bp was predicted (FIG. 3). This latter half was consistent with the d13825w gene. The prediction by NetPlantGene and GRAIL basically agreed. Therefore, when the cDNA of this gene was isolated by the PCR method, the 5 ′ RACE method, and the 3 ′ RACE method, it was composed of 21 exons and had a length of 2708 bp. There was a first exon that was not anticipated by the program and eventually T-DNA was inserted into the first intron of this gene to disrupt the gene. Therefore, it was concluded that this gene is a causal gene for maa3 mutation. Hereinafter, it is referred to as MAA3 gene.
[0044]
[Molecular biological analysis]
General reagents were purchased mainly from Wakken or Nacalai Tesque. Enzymes were purchased mainly from TaKaRa. Isotope-labeled [α- ³² P] dCTP was purchased from Amersham.
Enzymatic reactions, DNA plots, and PCR methods followed general protocols (Sambrook et al., 1989; Sambrook and Russel, 2001). Unless otherwise specified, PCR used TaKaRa ExTaq. For RNA extraction, RNeasy P1antMini Kit (QIAGEN) was used. DNA sequencing was performed using ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (Perkin Elmer), then ABI PRISM 377 Genetic Analyzer (Perkin E1mer), ABIPRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin E1mer), ABIPRISM 3100 Genetic Analyzer ( Perkin E1mer). Sequence data was analyzed using Sequencing Analysis ver.3.0 (Perkin E1mer).
[Extraction of DNA from plant individuals]
About 2 true leaves or several inflorescence shoots are placed in a collecting centrifuge tube and 200 μl of CTAB buffer [3% cetyltrimethylammonium bromide, 1.4 M sodium chloride, 0.2% 2-mercaptoethanol, 20 μM EDTA, 100 μM] Tris-HCl (pH 8.0)] was added. A pestle (Kontes) was rotated at high speed using a luchi digital homogenizer, and the plant tissue in the collecting centrifuge tube was sufficiently ground. Further, 300 μl of CTAB buffer was added and incubated at 60 ° C. for 30 minutes. 500 μl of chloroform was added, mixed gently, centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes at room temperature, and the aqueous layer was transferred to a new microcentrifuge tube. After adding 333 μl of isopropanol and mixing gently, the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes and centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded, the pellet was rinsed with 70% ethanol, and 100 μl of TE-RNase [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM EDTA, 20 μg / ml RNase A] was added to dissolve the pellet. In the SSLP method, this was used as a DNA solution. In other applications, phenol extraction, chloroform extraction and ethanol precipitation were further performed and dissolved in TE.
[0045]
[Genomic Southern Analysis]
For the probe near the T-DNA left border, a PCR fragment amplified with the following two primers was used [α-) using the Random Primer DNA Labeling Kit (TaKaRa). ³² Labeled with P] dCTP.
LB71: 5 'ATGTACTGAATTCACATCCG 3'
LB1440: 5 'CCTCATTACTGACTGACTGC 3'
Similarly, the following two primers were used for the preparation of the probe near the T-DNA light border.
RB461: 5 'AGTCGCCTAAGGTCACTATC 3'
RB2260: 5 'GACGAATTAGTGGGAATAGC 3'
Similarly, the following two primers were used as a probe having the sequence of 60429-61255 bp of genomic contig ATFCA4.
maa3RB1: 5 'AATGGCATCAAGAGCTTCCGAG 3'
maa3RB2: 5 'AAAACGGCGGTGTAGCTGTAAC 3'
[TAIL-PCR]
Liu et al. (1995) and Liu (1997).
[Inverse PCR]
Based on the method of Ishiguro (1994) and Izawa (1997). In Southern hybridization using genomic DNA digested with HindIII, 5 kb and 4 kb bands were observed in the probe near the left border, and 5 kb and 4.5 kb bands were seen in the probe near the right border. It was considered that the 5 kb band that the border between the right border and the right border is not adjacent to the genome sequence. In order to eliminate this band and obtain only the border sequence adjacent to the genomic sequence, the genomic DNA of the maa3 mutant was digested with HindIII and electrophoresed on an agarose gel to cut out the vicinity of 4 kb. After self-ligation and linearization by SphI digestion, PCR was performed with two primers designed near the left border, and the amplified band was isolated.
LB1: 5 'CACGCCATCGATGTAATAATTGTCATTAGATTGT 3'
LB2: 5 'GAGCTATTGGCACACGAAGAATGGT 3'
[Determination of cDNA base sequence]
The cDNA prepared from the vegetative shoot apex of the Col wild type was converted into a template, and the sequence of bands amplified with the following two primer pairs was determined.
lev1680: 5 'AGCGTGTAATGGCGATCGATAATGGCAAGC 3'
pylorBamHI: 5 'GGAGTTGCTTTGGATCCCCTACCTG 3'
This primer pair amplified the 5 ′ half of the cDNA.
pyroflBamHI: 5 'GCTCTGCACTTCTTGCTAAATCTAACCGTG 3'
laster 7506: 5 'AGTTTAGTCTTCTCCGGCCATGGCTACATC 3'
With this pair of primers, the 3 ′ half of the cDNA was amplified. The 5 ′ and 3 ′ ends of the cDNA were amplified using a 5 ′ / 3 ′ RACE Kit (Roche) and sequenced.
[0046]
(3) Prediction of MAA3 protein
The protein predicted from the MAA3 gene consists of 818 amino acids. Using this sequence, a homology search by BLAST was performed. Among the known functions, the highest homology was Senlp of budding yeast. Senlp is a helicase belonging to Superfamily I. The Sen1 gene is essential for the survival of budding yeast (DeMariani et al., 1992) and is necessary for various RNA processing such as tRNA splicing, rRNA, and mRNA maturation. It also showed homology over the full length with Upf1p of budding yeast. Upf2p is also a helicase belonging to superfamily I, and functions in a pathway (nonsense-mediated mRNA decay) in which a stop codon breaks down the mRNA in the middle of the gene. However, Upflp has a cysteine-rich region, which is a binding domain with Upf2p, at the N-terminus, whereas MAA3 does not exist (Leeds et al., 1992; Culbertson, 1999).
When the database of Arabidopsis thaliana was searched with BLASTP and TBLASTN, four putative genes with unknown functions showing high homology over the entire MAA3 length were found. Among those with known functions, SDE3 showed homology although it was slightly weak over the entire length. SDE3 was isolated as the causative gene only for the abnormal PTGS mutant. In addition, another plant protein was found that showed high homology to rice.
These sequences were aligned (FIGS. 6-8). MAA3 showed homology with Senlp and the like over almost the entire length from the N-terminal to the 755th amino acid. However, M4A3 has a shorter N-terminal than other superfamily I helicases. All seven consensus sequences of superfamily I helicases were found in the second half of MAA3. A phylogenetic tree was created by using the portion corresponding to amino acids 484 to 755 of MAA3 by the neighborhood joining method. As a result, MAA3 was supported by a high bootstrap value to be one of the homologous proteins in Arabidopsis thaliana of the budding yeast Senlp. There are three additional Senlp homologous proteins in Arabidopsis.
(4) MAA3 gene expression analysis
The expression of MAA3 gene was analyzed by RT-PCR method. It was expressed at the same level in flowers, fruits, vegetative shoot tips, leaves, roots, and all examined tissues.
[RT-PCR]
SuperScript for 0.4 μg of RNA in each tissue ^TM Using Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (GIBCO BRL), cDNA was synthesized with DNase treatment and oligo dT primer. PCR was carried out at a cycle of 94 ° C. for 3 minutes (94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute) × 35 using 0.5 μl of 20 μl and the following two primers.
PyrofBamHI-2: 5 'GTAGGGGATCCAAAGCAACTCCCAG 3'
laster 7506: 5 'AGTTTAGTCTTCTCCGGCCATGGCTACATC 3'
ACT8 was used for the positive control reaction (An et al., 1996; Aida et al., 1997).
There are the following two primers.
ACT8f: 5 'ATGAAGATTAAGGTCGTGGCA 3'
ACT8r: 5 'TCCGAGTTTGAAGAGGCTAC 3'
[0047]
【The invention's effect】
By using the gene MAA3 of the present invention, the female gametophyte can be made lethal.
In addition, the number of seeds such as fruits can be reduced by utilizing the gene of the present invention. In addition, it enables a technique for forming only seeds (endosperm) that do not contain foreign genes in transgenic crops.
[0048]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows sexual reproduction of Arabidopsis thaliana. In the ovule, meiosis occurs and one cell at the proximal end survives, and then division continues with n, resulting in a female gametophyte of 7 cells and 8 nuclei. It consists of an egg cell, a central cell, two helper cells, and three antipodal cells. In stamen buds, n pollen (2 or 3 cells) is produced by somatic cell division following meiosis. When pollen is transported to the pistil, it adheres and germinates to form a pollen tube. Two sperm cells are carried a long way through the pollen tube to the female gametophyte, where they are fertilized twice. That is, the egg (n) of the female gametophyte is fertilized to produce an embryo (2n), and the endosperm (3n) is produced when the central cell (n + n) is fertilized.
FIG. 2 shows a photograph taken with a differential interference microscope.
FIG. 2A: Half of the female gametophytes in the pistil are wild-type, enlarged due to fertilization and embryo development (wt), the other half are due to abnormal development of female gametophytes It stops at the comma type stage (ma). (Em) indicates a developing embryo.
FIG. 2B: shows wild-type female gametophytes.
FIG. 2C shows the female gametophyte of maa3 mutant. The outbreak has been delayed and no fusion of polar nuclei has occurred. Other nuclei are out of focus. a: antipodocyte, c: central cell nucleus, e: egg cell nucleus, p: polar nucleus, s: assistant cell nucleus, scale bar 50 μm.
FIG. 3 shows the gene structure of MAA3. This is a gene consisting of 18 exons with a start codon 214 bp downstream of the T-DNA insertion site.
FIG. 4 shows the results of Southern high pridization performed on DNA derived from four maa3 mutants, using the vicinity of the light border of T-DNA as a probe. Then, the same band pattern was seen in all four individuals. This indicates that the maa3 mutation and T-DNA are linked. In addition, since two bands were seen, it was shown that T-DNA was inserted in tandem at the single locus.
FIG. 5 shows the result of sequencing bands obtained by Inverse PCR. Subsequent to the sequence in the vicinity of the T-DNA left border, a sequence corresponding to 61474-61545 bp of a contig sequence called ATFCA4 of Arabidopsis thaliana chromosome 4 was seen.
FIG. 6 shows an alignment of amino acid sequences of MAA3 protein, Senlp, and other superfamily I helicases.
FIG. 7 shows the continuation of FIG. 6 (second page).
FIG. 8 shows the continuation of FIG. 6 (third page).

Claims

A protein selected from the following (A) and (B), which is essential for female gametophyte formation.
(A) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

The protein according to claim 1, which is derived from Arabidopsis thaliana.

A gene encoding the protein according to claim 1 or 2.

A gene consisting of DNA selected from the following (a) and (b), which encodes a protein essential for female gametophyte formation.
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.

The gene according to claim 4, which is derived from Arabidopsis thaliana.

A vector comprising the gene according to claim 3 or a part of the gene.

The vector according to claim 6, which is a vector for performing homologous recombination.

The vector according to claim 6, wherein the vector is an expression plasmid.

A transformant transformed with the vector according to claim 6.

A nucleotide comprising a partial sequence of 20 or more consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence thereof.

The nucleotide according to claim 10, which is used as a probe for detecting a gene encoding a protein essential for female gametophyte formation.

The nucleotide according to claim 10, which is used for modulating the expression of a gene encoding a protein essential for female gametophyte formation.

The method to suppress the expression of the gene in any one of Claims 3-5, and to make a female gametophyte lethal.

A method for reducing the number of seeds according to the insertion by inserting the antisense of the gene according to any one of claims 3 to 5 into n sites of the plant genome.

A method for forming only seeds not containing a specific allele by inserting the antisense of the gene according to any one of claims 3 to 5 into a genomic region linked to the specific allele.

The method according to claim 15, wherein the specific allele is a foreign gene derived from another species.

A transformed plant having a trait modified by the method according to claim 13-16.

A method for producing a transgenic plant-derived food that does not contain a foreign gene in seeds or endosperm by the method according to claim 16.