JP4092201B2 - Method of detecting pathogenic microorganisms - Google Patents

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Description

技術分野本発明は、病原微生物の検出に有用なオリゴヌクレオチドプローブ、プライマー、これらを使用する病原微生物の検出方法、ならびに該方法のためのキットに関する。 TECHNICAL FIELD The present invention is useful oligonucleotide probes for the detection of pathogenic microorganisms, primers, detection methods of pathogenic microorganisms using these, and to a kit for the method.
背景技術病原微生物の検出方法としては、当該微生物由来のタンパク質を免疫学的に検出する方法あるいは当該微生物由来の遺伝子の特定の領域を核酸増幅反応により増幅して検出する方法等が知られている。 The detection methods of the background art pathogenic microorganisms, a method for detecting a specific region of the gene of the method or from the microorganism to detect the protein from the microorganism immunologically amplified by nucleic acid amplification reaction and the like are known . 上記遺伝子の特定の領域を検出する方法としては、核酸増幅反応を用いる検出法が例示される。 As a method for detecting a specific region of the gene, detection methods using nucleic acid amplification reactions are exemplified. 該核酸増幅反応としては、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号に記載のポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)、トレンズ イン バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology)第10巻、146〜152頁(1992)に記載の当該方法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写PCR法(RT−PCR法)、1989年6月14日に公開された欧州特許出願第320,308号に記述されているリガーゼ連鎖反応(LCR;ligase chain reaction)法、PCR プロトコールズ(PCR Protocols,Academic Press.Inc.,1990)245〜252頁に記述されている転写増幅システム(TAS;transcri The nucleic acid amplification reaction, U.S. Pat. No. 4,683,195, the polymerase chain reaction method described in JP No. 4,683,202 and No. 4,800,159 (PCR method), Trends in Biotechnology (Trends in Biotechnology) Vol. 10, 146-152 pages (the method and reverse transcriptase reverse transcription PCR method reacting a combination of (RT-PCR method described in 1992)), European published on June 14, 1989 It is written by and ligase chain reaction Patent application No. 320,308 (LCR; ligase chain reaction) method, PCR Protocols (. PCR Protocols, Academic Press.Inc, 1990) 245~252 page transfer has been described in the amplification system (TAS; transcri tion−based amplification system)法が挙げられる。 tion-based amplification system) method.
また、等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。 Further, exemplary nucleic acid amplification methods have been developed in an isothermal state. 例えば、特公平7−114718号に記載の鎖置換型増幅(SDA;strand displacement amplification)法、自立複製(3SR;self−sustained sequence replication)法、日本国特許番号第2650159号に記載の核酸配列増幅(NASBA;nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(transcription−mediated amplification)法、日本国特許番号第2710159号に記載のQβレプリカーゼ法、さらに米国特許番号第5,824,517号、国際公開第99/09211号パンフレット、国際公開第95/25180号パンフレットあるいは、国際公開第99/ For example, strand displacement amplification as described in KOKOKU No. 7-114718 (SDA; strand displacement amplification) method, self-replication (3SR; self-sustained sequence replication) method, a nucleic acid sequence amplification according to Japanese Patent No. 2650159 (NASBA; nucleic acid sequence based amplification) method, TMA (transcription-mediated amplification) method, Q [beta] replicase method described in Japanese Patent No. 2710159, further U.S. Patent No. 5,824,517, WO 99 / 09211 pamphlet, International Publication No. WO 95/25180 pamphlet or, International Publication No. 99 / 9081号パンフレット等に記載の種々の改良SDA法が挙げられる。 9081 pamphlet, etc. various modified SDA methods are mentioned according to. 米国特許番号第5,916,777号には等温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記載されている。 U.S. Patent No. 5,916,777 describes a enzymatic synthesis method of oligonucleotides under isothermal conditions. さらに、国際公開第00/28082号パンフレットに記載のLAMP(Loop−mediated Isothermal Amplification)法、国際公開第00/56877号パンフレットに記載のICAN(Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids)法がある。 In addition, LAMP described in WO 00/28082 pamphlet (Loop-mediated Isothermal Amplification) method, there is a ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) method described in WO 00/56877 pamphlet .
このように、病原微生物の検出方法において利用できる核酸増幅法はいろいろあるが、実際の病原微生物を検査する現場が要求する検出感度を満たすように、それぞれの核酸増幅反応に適した標的核酸領域、それぞれの核酸増幅方法に適したプライマーならびにそれぞれの核酸増幅反応に続く標的核酸検出方法に適したプローブを選択することは困難であった。 Thus, many there although nucleic acid amplification methods that can be used in the detection method of the pathogenic microorganism, to meet the detection sensitivity site to check the actual pathogenic microorganisms requires the target nucleic acid region suitable for each nucleic acid amplification reaction, it is difficult to select a probe that is suitable for the primer and the target nucleic acid detection method following the respective nucleic acid amplification reaction appropriate for each method of nucleic acid amplification. さらに、低ランニングコストで、かつ再現性のある結果を得ることができる病原微生物の検出方法が求められていた。 Furthermore, at low running cost, and the detection method of the pathogenic microorganisms which can be obtained reproducible results it has been desired. 以下、病原微生物として、結核菌群、リン菌、クラミジア、C型肝炎ウイルス(HCV)を例に挙げて説明する。 Hereinafter, a pathogenic microorganism, Mycobacterium tuberculosis, is explained as phosphorus bacteria, chlamydia, C hepatitis virus (HCV) as an example.
(a)結核菌群結核は、過去において人間の死因の上位を占める疾患であり、種々の治療法が開発された現在においてもなお多数の患者が存在する。 (A) Mycobacterium tuberculosis Tuberculosis is a disease which occupies the top of the human deaths in the past, still many patients present in the current that various treatment methods have been developed.
結核の診断は、従来、培養法、塗抹法によって行われてきたが、結核菌は発育が遅いことから、検査結果が得られるまで1〜8週間、通常約1ヶ月と迅速性に欠け、正確さも70%以下であるなど十分な診断法ではなかった。 Diagnosis of tuberculosis is conventionally culture method has been carried out by smearing method, missing since Mycobacterium tuberculosis is a slow growing, 1-8 weeks until the test result is obtained, the usually about 1 month and rapidity, accuracy It was not or else sufficient diagnostic method, or the like is 70% or less. このような背景から、近年、結核菌の遺伝子をターゲットとした、喀痰などからの直接、迅速、正確な検出法ならびに試薬が開発されている。 Against this background, in recent years, the gene of Mycobacterium tuberculosis targeting, such as direct from sputum, rapid, accurate detection methods and reagents have been developed. 上記結核菌群には、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovis BCG、Mycobacterium africanum、Mycobacterium microti、Mycobacterium canettiが含まれる。 The aforementioned Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, include Mycobacterium Canetti.
例えば、喀痰などの検体からDNAを抽出し、PCR法により結核菌の存在を迅速に検出する方法[ランセット(Lancet)、第8671号、第1069頁(1989)]が報告されている。 For example, DNA is extracted from a specimen such as sputum, a method for rapidly detecting the presence of Mycobacterium tuberculosis by PCR [Lancet (Lancet), No. 8671, pp. 1069 (1989)] have been reported. 該方法は結核菌の65kDa抗原をコードする遺伝子をターゲットとしてPCR法により増幅し、電気泳動法で検出する方法である。 Method the gene encoding the 65kDa antigen of M. tuberculosis was amplified by PCR as a target, a method for detecting by electrophoresis. また、16SリボソームRNAを増幅し、増幅産物を化学発光プローブで検出するキットも市販されている[ジェン−プローブ(Gen−Probe)社]。 Moreover, to amplify the 16S ribosomal RNA, a kit for detecting the amplification product chemiluminescent probes are also commercially available [Gen - Probe (Gen-Probe) Corporation. さらに、16SリボソームRNAをコードするDNAをターゲットとしたPCRキットも市販されている(ロシュ社)。 In addition, PCR kits that target DNA encoding the 16S ribosomal RNA are commercially available (Roche).
一方、結核菌群に特異的なIS6110という遺伝子の配列が公表されており[ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)、第18巻、第188頁(1990年)]、結核菌群の検出のためのプローブとして有用であろうことが記載されている。 On the other hand, it has been published sequence of the gene that specific IS6110 in Mycobacterium tuberculosis is [Nucleic Acids Research (Nucleic Acids Research), Vol. 18, pp. 188 (1990)], detection of Mycobacterium tuberculosis it is described that will be useful as probes for. 実際、PCR法によるIS6110遺伝子の検出方法が報告されている[ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(J.Clin.Microbiol.)、第28巻、第2668頁(1990)]。 Indeed, the detection method of IS6110 gene has been reported by the PCR method [Journal of Clinical Microbiology (J.Clin.Microbiol.), Vol. 28, pp. 2668 (1990)]. その後、IS6110遺伝子をターゲットとしたPCR法に関する論文は多数報告され、その有用性が記載されている。 Thereafter, paper is reported many related PCR method targeting the IS6110 gene, it has been described their usefulness. また、PCR法とは別の核酸増幅法であるSDA法によるIS6110遺伝子の検出に関する日本特許第2814422号、LCR法によるIS6110遺伝子の検出に関する特表平10−500023号がある。 Furthermore, there is Japanese Patent No. 2814422, Kohyo No. 10-500023 relates to the detection of IS6110 gene by LCR method for the detection of IS6110 gene by SDA method is another nucleic acid amplification method and the PCR method.
しかしながら、上記の結核菌の検出方法は臨床の現場ではまだまだ満足できる方法ではなく、さらなる改善が要望されている。 However, the detection method of the Mycobacterium tuberculosis is not a method still satisfactory in clinical practice, further improvement is desired. 例えば、リボソームRNA遺伝子をターゲットとした核酸増幅検出法が広く報告されているが、あくまでもMycobacterium属に共通な部分を増幅し、種特異的なプローブで結核菌を同定するものである。 For example, although nucleic acid amplification detection method ribosomal RNA gene targeting has been widely reported, merely amplifies the common parts to the genus Mycobacterium, which is one that identifies Mycobacterium tuberculosis at the species-specific probes. 該方法では結核菌への特異性を決定するのはプローブの配列だけであり、検出感度の点を含めて不安があり、培養陽性検体であっても検出できない症例が存在することが多々報告されている。 The method is only the sequence of the probe to determine the specificity of the M. tuberculosis, there is anxiety, including the point of detection sensitivity, it is reported many that case can not be detected even culture positive samples present ing. 一方、特異性と検出感度を上げるため上記のようにIS6110という結核菌特異的な遺伝子をターゲットとしたPCR法も報告されている。 On the other hand, also it has been reported specificity and sensitivity PCR method targeting the Mycobacterium tuberculosis-specific genes, IS6110 as described above to increase the. しかし、7つの施設でのIS6110をターゲットとした検査の比較研究では、当該方法による偽陽性の割合が3〜77%、感度が2〜90%と各施設ごとに検査結果が大きく異なることが明らかとされている[ジャーナル オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー、第32巻、第277頁(1994)]。 However, the IS6110 of seven facilities in comparative study of the inspection targeting, ratio 3 to 77% false positives due to the method, the sensitivity is apparently the inspection results to differ that for each facility and 2-90% and it has been that [journal of Clinical Microbiology, Vol. 32, pp. 277 (1994)].
一方、検体からの核酸の抽出方法も煩雑で、検査員の感染という面でも十分配慮された抽出法ではなかった。 Meanwhile, method of extracting nucleic acids from the sample is also complicated, it was not sufficient consideration has been extracted method in terms of infection inspectors.
また、増幅産物の検出法においてハイブリダイゼーション法が利用されるが、従来は増幅された二本鎖の核酸をまず液層で強アルカリで変成させ、次に変成した一本鎖核酸を剥がれた相補的核酸の共存下で中性条件でプローブとハイブリダイズさせる方法が用いられていた(ロシュ社アンプリコアキット説明書)。 Although hybridization method is utilized in detection of amplification products, conventionally denatured nucleic acids of the double-stranded amplified first in strong alkali in a liquid layer was peeled then denatured single-stranded nucleic acid is complementary method of probe hybridized were used in neutral conditions in the presence of nucleic acid (Roche amplifier core kit manual). これでは、プローブのハイブリダイゼーションが、2本鎖から剥がれた相補的増幅核酸に競合的に妨害され感度・特異性が上がらないという問題点があった。 In this, hybridization probes, competitively disturbed sensitivity and specificity to a complementary amplified nucleic acid detached from the double-stranded there is a problem that does not increase. すなわち、増幅された二本鎖DNAをいったんアルカリ変性によって一本鎖とし、これを中和した後に中性条件下でプローブとハイブリダイズさせていた。 That is, the amplified double-stranded DNA and single-stranded by temporarily alkali denatured, was hybridized with a probe under neutral conditions after neutralizing it. また、アルカリ変性を嫌って熱変性を行う場合もあったが、これでは多数の検体を精度良く検査することは不可能であった。 Also, there were some cases of performing thermal denaturation hated alkaline denaturation, this was not possible to accurately inspect a large number of samples. このため、工程も多く、また一本鎖とされたDNAの一方がプローブと競合してハイブリダイズし、標的核酸の検出感度を低下させることにもなった。 Therefore, step many, also hybridized conflict one of DNA and single-stranded probe, it was also reducing the sensitivity of detection of target nucleic acid.
また、従来の方法ならびに市販のキットでは検体採取から結果報告まで約6時間以上を要し、結核症という感染症であるがゆえに一刻も早い診断と患者隔離などの対処が要求されるにもかかわらず、検体採取から結果報告とそれに伴う患者への対処が即日対応できず翌日になってしまい、結核感染の伝播を最小限に食い止めることができないという公衆衛生上重大な問題点が解決されず残っていた。 Though Further, in the conventional method and commercially available kits it took more than about 6 hours to report results from the specimen collection, to deal with such is a infection of tuberculosis therefore be early diagnosis and patient isolation moment is required not, to deal with patients with the results reported, and then specimen collection has become the next day can not deal the same day, the remaining not resolve the public health on the serious problem of not being able to stave off to minimize the propagation of tuberculosis infection which was.
以上のように公開されている情報から、結核菌に対する信頼でき、かつ医療の場に有用なものは未だ存在しないことが明らかになった。 The information that is published as above, reliable on M. tuberculosis, and useful in medical field became yet clear that there is no.
(b)リン菌リン菌(すなわちナイセリア・ゴノルホエア、Neisseria gonorrhoeae)は、アメリカ合衆国において最も一般的に報告される細菌感染の1つである淋病の病原体である。 (B) phosphorus bacteria phosphorus bacteria (i.e. Neisseria Gonoruhoea, Neisseria gonorrhoeae) is the most commonly reported pathogens gonorrhea, one of the bacterial infection in the United States. Miyada and Born,1991,Mol. Miyada and Born, 1991, Mol. Cell. Cell. Probes 5:327−335;アメリカ特許第5,256,536号;及びアメリカ特許第5,525,717号は、N. Probes 5: 327-335; US Patent No. 5,256,536; and US Patent No. 5,525,717 is, N. ゴノルホエア シトシンDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子(M.Ngo PII)の配列と有意な相同性を有するオープンリーディングフレーム(ORF1)を含むゲノムフラグメントに由来するDNAプローブを用いてのN. N. of using DNA probes derived from the genomic fragment containing the open reading frame (ORF1) having a sequence with significant homology Gonoruhoea cytosine DNA methyltransferase gene (M.Ngo PII) ゴノルホエアの検出を記載している。 It describes the detection of Gonoruhoea. しかしながら、リン菌を特異的にかつ十分な感度で検出できる方法はなかった。 However, a method which can be detected by specific and sensitive enough phosphorus bacteria did.
また、リン菌により感染された患者は、クラミジア トラコマチス(Chlamydia trachomatis)にも感染している事例が報告されている。 Also, patients infected with phosphorus bacteria have been reported cases are also infected with Chlamydia trachomatis (Chlamydia trachomatis).
(c)クラミジア「クラミジア」とはクラミジア属に属する微生物をいう。 It refers to a microorganism belonging to the Chlamydia genus and (c) Chlamydia "chlamydia". クラミジア属の三つの種、クラミジア トラコマチス(C.trachomatis)、クラミジアシッタシ(C.psittaci)、クラミジア ニューモニエ(C.pneumoniae)はヒト宿主に感染し、疾患を起こしうることから臨床的に重要である。 Three species of Chlamydia, Chlamydia trachomatis (C. trachomatis), Chlamydia Powerful Shi (C. psittaci), Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) infects human host, it is clinically important because it can cause disease . 特にクラミジア トラコマチスは、男女両性で性器感染症を引き起こす、先進社会で最も一般的な性的伝染病であると報告されている。 In particular, Chlamydia trachomatis causes genital infections in both sexes, has been reported to be the most common sexually infectious diseases in the developed society. 従って、クラミジア トラコマチスを特異的に、そして適時に検出できる方法および試薬が必要とされている。 Therefore, specifically Chlamydia trachomatis, and methods and reagents capable of detecting in time are needed.
(d)HCV (D) HCV
従来より、血清等の試料中のHCVの検出は、逆転写PCR(RT−PCR)法により行われている。 Conventionally, the detection of HCV in a sample such as serum is accomplished by reverse transcription PCR (RT-PCR) method. この方法は、(1)血清からのHCVのRNAの抽出、(2)抽出したRNAを鋳型としたcDNAの合成、(3)温度を上下させるPCR法による増幅、(4)固定化プローブとのハイブリダイゼーション、(5)未反応試薬の洗浄除去、(6)標識試薬との反応、(7)未反応試薬の洗浄除去、(8)発色試薬の添加、(9)発色停止薬の添加、(10)吸光度の測定の計10工程で行われている。 The method comprises: (1) Extraction of HCV RNA from the serum, (2) extracted RNA synthesis of cDNA as a template, (3) amplification by the PCR method to lower the temperature, and (4) immobilized probe hybridization, (5) washing and removing unreacted reagent, (6) reaction of the labeled reagent, (7) washing away unreacted reagent, (8) the addition of the color reagent, (9) addition of color stop agents, ( 10) it is performed in a total of 10 steps of absorbance measurement. また、J. In addition, J. Virol. Virol. Methods Vol. Methods Vol. 64,pp147−159(1997)記載のリアルタイム検出PCR法を用いたホモジニアス検出法によるHCV検出も検討されている。 64, HCV detection has been studied by homogeneous detection method using pp147-159 (1997) Real-time detection PCR method described.
上記のようにHCVを高感度に簡便に、かつ大量検体を迅速にかつ安価に測定することは、血液製剤、輸血、献血の品質管理、治療経過の判定、症例のモニタリング、あるいは治療費用の低減の観点からも非常に重要である。 Conveniently with high sensitivity HCV as described above, a large amount specimen to be quickly and inexpensively measured, blood products, blood transfusion, quality control of blood donation, the determination of the course of treatment, cases of monitoring or reduced treatment costs, it is very important from the point of view. しかしながら、上記PCR法では温度の厳密な制御が必須であり、そのための測定機械は複雑かつ大掛かりなものとなる一方で、その処理能力は、現時点では5時間で96検体が限界である。 However, in the above PCR method is essential strict control of temperature, the measuring machine for the while becomes complicated and large-scaled, the processing capacity at the moment is limited to 96 specimens in 5 hours. そのため、血液センターや臨床検査センターで要求される2時間に1000検体以上という大量検体を測定することは不可能であった。 Therefore, it was not possible to measure the mass sample of 1000 sample over two hours required by blood center and clinical testing centers.
このように従来の方法は、いろいろな問題をかかえており、一定時間内に多数の検体中のHCV核酸を簡便に短時間で測定する技術が求められていた。 Thus, the conventional method is burdened with various problems, a technique for measuring a short time convenient to HCV nucleic acids in many specimens within a predetermined period of time has been demanded.
発明の目的本発明の主な目的は、一定時間内に多数の検体について病原微生物を高感度で正確に、かつ、簡便に短時間で、さらに安価で測定する手段を提供することにある。 The main purpose of the object of the Invention The present invention pathogenic microorganisms for a large number of analytes within a certain time accurately with high sensitivity and conveniently in a short time, to provide a means for further measurements at low cost.
発明の概要本発明者らは鋭意研究の結果、従来の核酸増幅方法より優れた核酸増幅方法を利用した病原微生物の検出方法を見出した。 SUMMARY OF THE INVENTION The inventors have conducted intensive studies and found a method for detecting a pathogenic microorganism that exploit the excellent nucleic acid amplification methods than conventional nucleic acid amplification method. また、該方法のための標的核酸増幅用キメラオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的核酸検出用プローブを見出した。 Also found the target nucleic acid amplification chimeric oligonucleotide primer and the target nucleic acid detection probe for the method. さらに、該方法のためのキットを構築し、、本発明を完成するに至った。 In addition, it has led to the completion of the kit to build a ,, according to the invention for the method.
すなわち本発明の第1の発明は、結核菌群のMycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovisBCG、Mycobacterium africanum、Mycobacterium microti及び/又はMycobacterium canettiを検出可能なプローブであって、配列表の配列番号39記載の塩基配列あるいはその一部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号11記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。 That first aspect of the present invention, tuberculosis of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovisBCG, Mycobacterium africanum, a detectable probe to Mycobacterium microti and / or Mycobacterium Canetti, of SEQ ID NO 39 nucleotide sequence described or relates to a probe, wherein it is a base sequence of SEQ ID NO: 11, wherein the probe or sequence listing, characterized by containing a part.
本発明の第2の発明は、リン菌のNeisseria gonorrhoeaeを検出可能なプローブであって、配列表の配列番号27記載の塩基配列あるいはその一部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号21記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。 The second aspect of the present invention is a detectable probe to Neisseria gonorrhoeae phosphorus bacteria, of SEQ ID NO: 27 in the Sequence Table nucleotide sequence or a probe, or the sequence listing, characterized by comprising a part thereof It relates to a probe, wherein it is a base sequence of SEQ ID NO: 21, wherein.
本発明の第3の発明は、クラミジアのChlamydia trachomatisを検出可能なプローブであって、配列表の配列番号22記載の塩基配列あるいはその一部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号20記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。 A third aspect of the present invention is a detection probes capable Chlamydia Chlamydia trachomatis, the base sequence of SEQ ID NO: 22 in the Sequence Table, or sequence of the probe or sequence listing, characterized by comprising a part thereof It relates to a probe, wherein it is a base sequence of No. 20 described.
本発明の第4の発明は、HCVを検出可能なプローブであって、配列表の配列番号34、35記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。 Fourth aspect of the present invention is a detectable probe to HCV, a probe, wherein it is a base sequence of SEQ ID NO: 34, 35 in the Sequence Listing.
本発明の第5の発明は、アルカリ領域において病原微生物の標的核酸にハイブリダイズ可能なプローブに関する。 A fifth invention of the present invention relates hybridizable probe to a target nucleic acid of a pathogenic microorganism in the alkaline range. 本発明の第5の発明においてpH8〜14のアルカリ領域において病原微生物の標的核酸にハイブリダイズ可能なプローブが好適であり、当該病原微生物の標的核酸は結核菌、リン菌、クラミジア、HCV由来の標的核酸のいずれかであるプローブが好ましい。 Fifth hybridizable probe to a target nucleic acid of a pathogenic microorganism in the alkaline range of pH8~14 in the invention of the present invention is the preferred, the target nucleic acid tuberculosis of the pathogenic microorganism, phosphorus bacteria, chlamydia, target-derived HCV probe is either a nucleic acid is preferred. また、病原微生物の標的核酸は結核菌群のIS6110遺伝子、リン菌のcppB遺伝子、クラミジアのpLGV440、HCVの5'非翻訳領域の塩基配列から選択され、該遺伝子にハイブリダイズ可能なプローブが好適に使用できる。 Further, IS6110 gene of a target nucleic acid group tuberculosis pathogenic microorganisms, cppB gene phosphorus bacteria is selected from Chlamydia pLGV440, HCV 5 'nucleotide sequence of the untranslated region hybridizable probes suitably in the gene It can be used. 該プローブとしては、結核菌群のIS6110遺伝子に存在する配列表の配列番号39に示される塩基配列、又はその一部を含有する塩基配列からなるプローブ、好ましくは配列表の配列番号11に示される塩基配列からなるプローブが例示される。 As the probe, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 39 in the sequence listing that exist in IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis, or probe having a nucleotide sequence comprising a part thereof, preferably as shown in SEQ ID NO: 11 in Sequence Listing probe having a nucleotide sequence is exemplified. また、リン菌のcppB遺伝子に存在する配列表の配列番号27に示される塩基配列、又はその一部を含有する塩基配列からなるプローブ、好ましくは配列表の配列番号21に示される塩基配列からなるプローブが例示される。 Further, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing that exists cppB gene phosphorus bacteria, or probe having a nucleotide sequence comprising a part thereof, preferably comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 probe is illustrated. また、クラミジアのpLGV440に存在する配列表の配列番号22に示される塩基配列、又はその一部を含有する塩基配列からなるプローブ、好ましくは配列表の配列番号20に示される塩基配列からなるプローブが例示される。 Further, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22 present in pLGV440 Chlamydia, or probe having a nucleotide sequence comprising a part thereof, the probe preferably having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 It is exemplified. さらにHCVの5'非翻訳領域に存在する配列表の配列番号34、35に示される塩基配列、又はその一部を含有する塩基配列からなるプローブ、好ましくは配列表の配列番号34、35に示される塩基配列からなるプローブが例示される。 Further nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34, 35 in the sequence listing which is present in the 5 'untranslated region of HCV, or a probe comprising a nucleotide sequence comprising a part thereof, preferably SEQ ID NO: 34, 35 of the Sequence Listing probe consisting of the nucleotide sequence are exemplified.
本発明の第1〜第5の発明のプローブは、標識を付加されていてもよい。 First to fifth probe of the invention of the present invention, it may be added a label. 該プローブは、配列表の配列番号11、20、21、34、35で示される塩基配列のうち連続する8塩基ないし53塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、標的核酸とハイブリダイズした場合には蛍光強度が抑制されず、標的核酸とハイブリダイズしない場合は蛍光強度が抑制されるように蛍光標識されたものであることを特徴とする病原微生物検出用プローブであってもよい。 The probe is an oligonucleotide having a nucleotide sequence consisting of consecutive 8 bases to 53 bases of the base sequence indicated in SEQ ID NO: 11,20,21,34,35 in the sequence listing, hybridized to the target nucleic acid fluorescence intensity is not suppressed in the case, it may be a pathogenic microorganism detection probe, wherein if not hybridized to the target nucleic acid are those fluorescent intensity was fluorescently labeled so are suppressed. また、配列表の配列番号11、20、21、34、35に示される塩基配列のうち、連続する8塩基以上からなる病原微生物検出用プローブであってもよく、その5'末端がローダミン系蛍光色素またはオキサジン系蛍光色素で標識されたプローブであって、配列表の配列番号34に示される塩基配列のうち、連続する8塩基以上からなることを特徴とする病原微生物検出用プローブであってもよい。 Further, in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11,20,21,34,35 of the Sequence Listing, it may be a pathogenic microorganism detection probe consisting of 8 bases or more consecutive, rhodamine-based fluorescent its 5 'end a probe labeled with a dye or an oxazine fluorescent dye, in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 of the sequence Listing, even pathogenic microorganism detection probe characterized in that it consists 8 bases or more consecutive good. 当該標識蛍光色素がレポーター蛍光色素及びクエンチャー色素を有するプローブであって、配列表の配列番号11、20、21、34、35に示される塩基配列のうち、連続する8塩基以上からなることを特徴とする病原微生物検出用プローブであってもよい。 A probe in which the labeling fluorescent dye having a reporter fluorescent dye and a quencher dye, in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11,20,21,34,35 of the Sequence Listing, in that it consists of 8 bases or more consecutive it may be a pathogenic microorganism detection probe characterized. 上記レポーター色素は、フルオレッセイン系色素であり、クエンチャー色素がDABCYL系色素であってもよい。 The reporter dye is a fluorescein-based dye, a quencher dye may be a DABCYL-based dye. さらに、蛍光物質、色素、酵素、ビオチン、金コロイド、および放射性同位体から選択される標識を付加されているプローブが好適に使用できる。 Further, a fluorescent substance, dye, enzyme, biotin, colloidal gold, and a probe which is added a label selected from a radioactive isotope can be preferably used.
本発明の第6の発明は、本発明の第1〜第5の発明のプローブを使用し、病原微生物の標的核酸とハイブリダイゼーションを行う工程を包含する病原微生物の検出方法に関する。 Sixth aspect of the present invention, using a probe of the first to fifth invention of the present invention relates to a method for detecting a pathogenic microorganism comprising the step of performing a target nucleic acid and hybridization of pathogenic microorganisms. 本発明の第6の発明において、アルカリ領域で病原微生物の標的核酸とハイブリダイゼーションを行うことができる。 In a sixth aspect of the present invention, it is possible to perform a target nucleic acid and hybridization of pathogenic microorganisms in the alkaline range. また、当該病原微生物としては結核菌群、リン菌、クラミジア、HCVが例示される。 Further, the Mycobacterium tuberculosis as pathogenic microorganisms, phosphorus bacteria, chlamydia, HCV are exemplified. 当該病原微生物が結核菌群の場合、標的核酸はIS6110遺伝子またはその断片が好適であり、結核菌由来のIS6110遺伝子および/またはその断片を増幅した後に、増幅物と本発明の第1または第5の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。 If the pathogenic microorganism is Mycobacterium tuberculosis, the target nucleic acid is suitably IS6110 gene or fragment thereof, the first or fifth after amplifying the IS6110 gene and / or fragment thereof from Mycobacterium tuberculosis, the amplification product and the present invention it is preferred to carry out the hybridization between the probe of the invention. また、配列表の配列番号36、37にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用して結核菌群由来のIS6110遺伝子および/またはその断片が増幅されることが好ましい。 Further, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 36 and 37 in the sequence listing, or the IS6110 gene and / or fragment thereof from Mycobacterium tuberculosis using primers having a part overlapping sequences are amplified in the sequence It is preferred. また、病原微生物がリン菌の場合、標的核酸はcppB遺伝子またはその断片が好適であり、リン菌由来のcppB遺伝子および/またはその断片を増幅した後に、増幅物と本発明の第2または第5の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。 Also, if the pathogenic microorganism is a phosphorus bacteria, the target nucleic acid is suitably cppB genes or fragments thereof, second or fifth after amplifying the cppB gene and / or fragment thereof from phosphorus bacteria amplificates with the present invention it is preferred to carry out the hybridization between the probe of the invention. また、配列表の配列番号28、29にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用してリン菌由来のcppB遺伝子および/またはその断片が増幅されることが好ましい。 Further, it cppB gene and / or fragment thereof from phosphorus bacteria using primers having overlapping sequence part the nucleotide sequence, or the sequence shown in SEQ ID NO: 28 and 29 of the sequence listing is amplified preferable. また、病原微生物がクラミジアの場合、標的核酸はpLGV440またはその断片が好適であり、クラミジア由来のpLGV440および/またはその断片を増幅した後に、増幅物と本発明の第3または第5の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。 Also, if the pathogenic microorganism is Chlamydia, the target nucleic acid is suitably pLGV440 or fragment thereof, after amplifying the pLGV440 and / or fragment thereof from Chlamydia, amplificates a third or fifth probe of the invention of the present invention it is preferable to perform hybridization between. また、配列表の配列番号23〜26にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用してクラミジア由来のpLGV440および/またはその断片が増幅されることが好ましい。 Further, preferably pLGV440 and / or fragment thereof from Chlamydia is amplified using primers having overlapping sequence part the nucleotide sequence, or the sequence shown in SEQ ID NO: 23-26 in the Sequence Listing. また、病原微生物がHCVの場合、標的核酸はHCVの5'非翻訳領域またはその断片が好適であり、HCV由来の5'非翻訳領域および/またはその断片を増幅した後に、増幅物と本発明の第4または第5の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。 Also, if the pathogenic microorganism is HCV, the target nucleic acid is 'a suitable non-translated region or fragment thereof, 5 from HCV' 5 of HCV after amplifying the untranslated regions and / or fragments thereof, amplificates with the present invention it is preferred to carry out the hybridization between the fourth or fifth probe of the invention of the. また、配列表の配列番号30〜33にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用してHCV由来の5'非翻訳領域および/またはその断片が増幅されることが好ましい。 Furthermore, 5 'untranslated region and / or fragment thereof from HCV is amplified using primers having overlapping sequence part the nucleotide sequence, or the sequence shown in SEQ ID NO: 30 to 33 in the sequence listing it is preferable.
本発明の第7の発明は、本発明の第6の発明の病原微生物の標的核酸の検出方法を用いて結核菌群、リン菌、クラミジア、HCV由来の核酸を検出する工程を包含する病原微生物の検出方法に関する。 Seventh aspect of the present invention, pathogenic microorganisms comprising the step of detecting a sixth detecting method Mycobacterium tuberculosis using the target nucleic acid of a pathogenic microorganism of the invention, phosphorus bacteria, chlamydia, nucleic acid from HCV of the present invention of a method for detecting.
本発明の第8の発明は、下記工程を包含する核酸増幅方法で得られる増幅核酸を検出することを特徴とする病原微生物の検出方法。 Eighth aspect of the present invention, the detection method of the pathogenic microorganisms and detecting the amplified nucleic acid obtained in encompasses nucleic acid amplification method the following steps.
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3'末端又は3'末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、;および、 (A) nucleic acid as a template, a deoxyribonucleotide triphosphate, DNA polymerase having strand displacement activity, at least one primer, and steps RNaseH are mixed to prepare a reaction mixture; wherein said primer is a template is substantially complementary to the nucleotide sequence of a nucleic acid contains at least deoxyribonucleotides or nucleotide those selected from analog and ribonucleotide, the ribonucleotide being positioned at the 3 'end or 3' end of the primer a chimeric oligonucleotide primer; and,
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、 (B) sufficient time to form a reaction product, the step of incubating the reaction mixture,
に関する。 On. 本発明の第8の発明において、さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物を使用することが好ましい。 In an eighth aspect of the present invention, it is preferable to use a reaction mixture containing the chimeric oligonucleotide primer having a substantially homologous sequence to the nucleotide sequence of the nucleic acid further as a template. また、当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーが下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーであるものが好適に使用できる。 Moreover, those the chimeric oligonucleotide primer is a chimeric oligonucleotide primer represented by the following general formula can be suitably used.
一般式:5'−dNa−Nb−dNc−3' The general formula: 5'-dNa-Nb-dNc-3 '
(a:11以上の整数、b:1以上の整数、c:0または1以上の整数、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよい) (A: 11 or more integer, b: an integer of 1 or more, c: 0 or an integer of 1 or more, dN: deoxyribonucleotide and / or nucleotide analogs, N: unmodified ribonucleotide and / or modified ribonucleotide, Incidentally, dNa some sites dN may be substituted by N)
また、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーのcが0であってもよく、ヌクレオチドアナログがデオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが(α−S)リボヌクレオチドであってもよい。 Further, c of the chimeric oligonucleotide primer may be 0, nucleotide analogs deoxyribonucleotides inosine nucleotides, deoxyribonucleotides uracil nucleotide, modified ribonucleotides (alpha-S) may be a ribonucleotide. また、配列表の配列番号13〜16、23〜26、28〜31でそれぞれ表される塩基配列からなるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することが好ましい。 Further, it is preferable to use a chimeric oligonucleotide primer having the nucleotide sequence represented in SEQ ID NOs: 13~16,23~26,28~31 in the sequence listing. さらに、本発明の第1〜第5の発明のプローブを用いて増幅核酸を検出する工程を包含してもよい。 It may further include the step of detecting the amplified nucleic acid with a probe of the first to fifth invention of the present invention.
本発明の第9の発明は、下記一般式で表される病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。 Ninth aspect of the present invention relates to a chimeric oligonucleotide primer for pathogenic microorganism detection represented by the following formula.
一般式:5'−dNa−Nb−dNc−3' The general formula: 5'-dNa-Nb-dNc-3 '
(a:11以上の整数、b:1以上の整数、c:0または1以上の整数、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよい) (A: 11 or more integer, b: an integer of 1 or more, c: 0 or an integer of 1 or more, dN: deoxyribonucleotide and / or nucleotide analogs, N: unmodified ribonucleotide and / or modified ribonucleotide, Incidentally, dNa some sites dN may be substituted by N)
本発明の第9の発明において、cが0であるものが好適に使用でき、当該ヌクレオチドアナログがデオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが(α−S)リボヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレオチドプライマーが好適である。 In a ninth aspect of the present invention, c can be a a is suitably used 0, the nucleotide analogue is a deoxyribonucleotide inosine nucleotides, deoxyribonucleotides uracil nucleotide, a modified ribonucleotide (alpha-S) ribonucleotide chimeric oligo nucleotide primer is preferred. とくに限定はされないが、例えば配列表の配列番号13〜16、23〜26、28〜31でそれぞれ表される病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーが好適である。 Not particularly limited are. For example, a chimeric oligonucleotide primer for pathogenic microorganism detection respectively represented by SEQ ID NO: 13~16,23~26,28~31 sequence table are preferred.
本発明の第10の発明は、配列表の配列番号36、37にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有する、結核菌由来のIS6110遺伝子および/またはその断片を増幅するためのプライマー、配列表の配列番号27に示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有する、リン菌由来のcppB遺伝子および/またはその断片を増幅するためのプライマー、配列表の配列番号22に示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有する、クラミジア由来のpLGV440および/またはその断片を増幅するためのプライマー、配列表の配列番号41〜43にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有する、HCV由来の5'非翻訳領域および/またはその断片を増 A tenth invention of the present invention, with overlapping sequences portion to the base sequence, or the sequence shown in SEQ ID NO: 36 and 37 in the sequence listing, amplifies the IS6110 gene and / or fragment thereof from Mycobacterium tuberculosis primers for, SEQ ID NO: 27 nucleotide sequence shown in the sequence listing, or with overlapping sequences partially sequence, primers for amplifying the cppB gene and / or fragment thereof from phosphorus bacteria, the sequence of sequence listing nucleotide sequence shown in ID NO: 22, or with overlapping sequences partially sequence, primers for amplifying the pLGV440 and / or fragment thereof from Chlamydia, base sequence shown in SEQ ID NO: 41-43 in the sequence Listing or with overlapping sequences partially sequence, increasing the 5 'untranslated region and / or fragment thereof from HCV 幅するためのプライマーに関する。 Regarding a primer for width.
本発明の第10の発明において、上記プライマーは塩基配列の一部がリボヌクレオチドに置換されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。 In a tenth aspect of the present invention, the primer is a part of the nucleotide sequence may be a chimeric oligonucleotide primer which is substituted ribonucleotides. また、本発明の第9及び第10の発明において、標識を付加されていてもよい。 Further, in the invention of the ninth and tenth of the invention, it may be added a label. 当該標識としては、蛍光物質、色素、酵素、ビオチン、および金コロイドが例示される。 As the labeling, a fluorescent substance, dye, enzyme, biotin, and colloidal gold are exemplified.
本発明の第11の発明は、本発明の第1〜第5の発明のプローブを含有することを特徴とする標的核酸検出用組成物に関する。 Eleventh aspect of the invention relates first to a target nucleic acid detection composition characterized in that it contains a probe of the fifth aspect of the present invention.
本発明の第12の発明は、本発明の第9〜第10の発明のプライマーを含有することを特徴とする標的核酸検出用組成物に関する。 A twelfth aspect of the present invention relates to ninth 10 target nucleic acid detection composition characterized by containing the primer of the invention of the present invention.
本発明の第11ならびに第12の発明は、病原微生物の検出に使用できる。 An eleventh invention as well as the 12 of the present invention can be used for the detection of pathogenic microorganisms.
本発明の第13の発明は、本発明の第6〜第8の病原微生物の検出方法に使用するための組成物であって、標的核酸の増幅もしくはハイブリダイゼーションを行うための少なくとも1種の試薬を包含する病原微生物検出用組成物に関する。 Thirteenth aspect of the present invention is a composition for use in the sixth to the detection method of the pathogenic microorganisms of the eighth of the present invention, at least one reagent for performing an amplification or hybridization of the target nucleic acid about pathogenic microorganism detection composition comprising a.
本発明の第13の発明において、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseH、及びデオキシリボヌクレオチド3リン酸から選択される試薬を含有してもよい。 In a thirteenth aspect of the present invention, DNA polymerase having strand displacement activity, RNase H, and reagents may be contained, which is selected from the deoxyribonucleotide triphosphates. 当該DNAポリメラーゼがバチルス カルドテナックス(Bacillus caldotenax)由来の5'→3'エキソヌクレアーゼ欠損BcaDNAポリメラーゼであってもよく、当該RNaseHがピロコッカス(Pyrococcus)属細菌由来及び/又はアルカエオグロバス(Archaeoglobus)属細菌由来のII型RNaseHであってもよい。 The DNA polymerase may be a Bacillus stearothermophilus (Bacillus caldotenax) derived 5 '→ 3' exonuclease-deficient BcaDNA polymerase, derived the RNaseH is Pyrococcus (Pyrococcus) bacterium and / or alk eosin Glo bus (Archaeoglobus) genus a type II RNaseH from bacteria may be.
本発明の第14の発明は、本発明の第1〜第5の発明のプローブを含有することを特徴とする病原微生物検出用キットに関する。 Fourteenth aspect of the invention relates first to fifth kits pathogenic microorganism detection, characterized in that it contains a probe of the invention of the present invention.
本発明の第14の発明において、本発明の第9〜第10のプライマーを含有してもよい。 In the fourteenth aspect of the present invention may contain a ninth 10 primer of the present invention. 当該キットは、結核菌群、リン菌、クラミジア、HCVの検出に使用することができる。 The kit can be used Mycobacterium tuberculosis, phosphorus bacteria, chlamydia, the detection of HCV. また、当該キットは、本発明の第6〜第8の病原微生物の検出方法に使用するためのキットであって、標的核酸の増幅もしくはハイブリダイゼーションを行うための少なくとも1種の試薬を包含してもよい。 Moreover, the kit is a kit for use in the sixth to the detection method of the pathogenic microorganisms of the eighth of the present invention, include at least one reagent for performing an amplification or hybridization of the target nucleic acid it may be. また、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseH、及びデオキシリボヌクレオチド3リン酸から選択される試薬を含有してもよい。 Furthermore, DNA polymerase having strand displacement activity, RNase H, and reagents may be contained, which is selected from the deoxyribonucleotide triphosphates. 当該DNAポリメラーゼがバチルス カルドテナックス由来の5'→3'エキソヌクレアーゼ欠損BcaDNAポリメラーゼが好適であり、RNaseHがピロコッカス属細菌由来及び/又はアルカエオグロバス属細菌由来のII型RNaseHであってもよい。 The DNA polymerase derived from Bacillus stearothermophilus, 5 '→ 3' exonuclease-deficient BcaDNA polymerase are preferred, RNaseH may be a type II RNaseH from Pyrococcus sp bacterial and / or alk eosin Glo bus bacterium. さらに、増幅産物を捕捉するための担体を含有してもよく、該担体がマイクロタイタープレート、ビーズ、マグネチックビーズ、メンブラン、およびガラスから選択される担体であるものが好適に使用できる。 Further, may also contain a carrier for capturing the amplified product, the carrier is a microtiter plate, beads, magnetic beads, membranes, and those which are carrier selected from a glass can be suitably used.
本発明の第15の発明は、結核菌群の検出方法において、結核菌含有検体をムラミダーゼで処理し、核酸を抽出する工程を包含することを特徴とする結核菌群の検出方法に関する。 A fifteenth invention of the present invention is a method for detecting Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis-containing sample is treated with muramidase, a method for detecting Mycobacterium tuberculosis characterized by comprising the step of extracting the nucleic acids.
発明の詳細な説明本明細書においてデオキシリボヌクレオチド(本明細書中ではdNとも記載する)とは、糖部分がD−2−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。 And DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION deoxyribonucleotides (herein also referred to as dN) refers to a nucleotide which the sugar moiety is composed of D-2-deoxyribose, for example, adenine base moiety , cytosine, guanine, include those having a thymine. さらに、7−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。 Furthermore, deoxyribonucleotide analogs, such as deoxyribonucleotides or deoxyinosine nucleotide with a modified base such as 7-deazaguanosine encompassed in the above deoxyribonucleotides.
本明細書においてリボヌクレオチド(本明細書中ではNとも記載する)とは、糖部分がD−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。 The ribonucleotide herein (also referred to as N in this specification) refers to a nucleotide sugar moiety is composed of D- ribose, adenine base moiety, cytosine, guanine, those having a uracil and the like. さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド[(α−S)リボヌクレオチド、(α−S)Nとも記載する]やこの他の誘導体等も含まれる。 The ribonucleotides also include modified ribonucleotides such modified ribonucleotide obtained by replacing the oxygen atom of the alpha-position of the phosphate group to a sulfur atom [(α-S) ribonucleotide, also described as (α-S) N to] and this other derivatives are also included.
本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドプライマーとは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するプライマーのことを言う。 The chimeric oligonucleotide primers herein, refers to a primer containing deoxyribonucleotides and ribonucleotides. 該プライマーはヌクレオチドアナログおよび/または修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。 The primer may contain nucleotide analogs and / or modified nucleotides.
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーの3'末端又は3'末端側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において核酸鎖が伸長でき、エンドヌクレアーゼで切断でき、鎖置換反応を行うことができるものであれば、いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包含される。 Chimeric oligonucleotide primer to be used in the present invention, the ribonucleotides located on 3 'end or 3' end of the primer, in the method of the present invention can stretch nucleic acid strand can be digested with endonuclease, a strand displacement reaction as long as it can be done, both are included in the chimeric oligonucleotide primers of the present invention.
本明細書において3'末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいてその中央より3'末端にかけての部分を指す。 3 herein 'terminated side, nucleic acid, e.g., 3 from the center in a primer' refers to a portion of the over the end. 同様に5'末端側とは、核酸においてその中央より5'末端にかけての部分を指す。 Similarly 'The distal, 5 from the center in a nucleic acid 5' refers to the portion extending end.
本明細書においてエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーよりDNAの伸長を行って生成した二本鎖DNAに作用して、該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するものであればよい。 In the present specification and endonucleases, which acts on double-stranded DNA from the chimeric oligonucleotide primer annealed to template nucleic acid was generated by performing elongation DNA, specifically cleaves ribonucleotides portion of the primer it is sufficient.
本明細書においてDNAポリメラーゼとは、DNA鎖を鋳型として新たなDNA鎖を合成する酵素のことを言い、天然型のDNAポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。 The DNA polymerase used herein, refers to an enzyme that synthesizes a new DNA strand DNA strand as a template, other natural type DNA polymerase, mutant enzymes having the above-mentioned activity. 当該酵素としては、例えば鎖置換(Strand displacement)活性を有するDNAポリメラーゼ、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有していないDNAポリメラーゼ、逆転写酵素活性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つDNAポリメラーゼが挙げられる。 As the enzyme, for example, strand displacement (Strand displacement) DNA polymerase having activity, 5 '→ 3' DNA polymerase having no exonuclease activity include a DNA polymerase having both reverse transcriptase activity and endonuclease activity.
本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってDNA複製を行う際、DNA鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換(strand displacement)することができる活性のことをいう。 The term "strand displacement activity" herein, when performing DNA replication in accordance with a nucleic acid sequence serving as a template, proceeds while replacing the DNA strand to release the complementary strand that is annealed to the template strand, i.e. a strand displacement (strand It refers to an activity that can displacement) to. また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したDNA鎖のことを「置換鎖」と称する。 In the present specification, that of free DNA strands from a nucleic acid sequence as a template by strand displacement is referred to as a "displaced strand".
本明細書においてアルカリ領域とは、pHが7を越える領域のことをいう。 The alkaline region herein refers to a region where the pH exceeds 7.
本明細書において、病原微生物とは、病原性の細菌ならびにウイルスのことをいう。 In the present specification, the pathogenic microorganisms refers to a pathogenic bacteria and viruses.
本明細書において標的核酸とは、核酸増幅あるいは検出の対象となる病原微生物由来の遺伝子の任意の領域のことをいい、DNAあるいはRNAのいずれもが含まれる。 The target nucleic acid in the present specification, refers to any region of the gene from a pathogenic microorganism of interest nucleic acid amplification or detection, include any of the DNA or RNA is.
以下、本発明を詳細に説明する。 The present invention will be described in detail.
(1)本発明のプローブ本発明のプローブは、病原微生物、例えば結核菌群、リン菌、クラミジアあるいはHCVを検出しうることを特徴とする。 (1) probe of the probe of the Invention The present invention pathogenic microorganisms, such as Mycobacterium tuberculosis, characterized in that the phosphorus bacteria may detect chlamydia or HCV. 本発明のプローブの好適な態様としては、アルカリ領域において標的核酸に安定してハイブリダイズできるものが例示される。 As a preferred embodiment of the probe of the present invention, it can stably hybridize to a target nucleic acid in the alkaline region is illustrated. すなわち本発明のアルカリ領域でハイブリダイズ可能なプローブとしては、特に限定はないが、例えばpH7.0を超えるアルカリ領域、好ましくはpH8〜14の範囲、特に好ましくはpH8〜pH10の範囲のアルカリ条件下においてその塩基配列に相補的な配列を有する標的核酸とハイブリダイズすることが可能なプローブ挙げられる。 That is, as the hybridizable probe alkaline range of the present invention is not particularly limited, for example, alkali range exceeding pH 7.0, preferably in the range of PH8~14, particularly preferably under alkaline conditions ranging pH8~pH10 like probe capable of hybridizing with a target nucleic acid having a sequence complementary to the nucleotide sequence in the. 特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号11、20、21、34、35記載の塩基配列を含有するものが挙げられる。 It is not particularly limited and examples thereof include those containing SEQ ID NO: 11,20,21,34,35 nucleotide sequence described in the sequence listing. なお、本発明のプローブは従来の中性領域でのハイブリダイゼーションに用いることができる。 Incidentally, the probe of the present invention can be used for hybridization under conventional neutral region.
本発明のプローブを使用する場合、二本鎖核酸をアルカリ処理によって一本鎖に変性した後、中和することなくハイブリダイゼーション工程に使用することが可能である。 When using the probe of the present invention, after denaturation to single strands by alkaline treatment a double-stranded nucleic acid, it can be used in the hybridization step without neutralization. これによって工程も簡略化され、感度も従来の方法の10倍以上向上する。 This process is also simplified, the sensitivity is improved more than 10 times that of the conventional methods. また、アルカリ領域でハイブリダイズさせることにより、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させることができる。 Further, by hybridizing with an alkali region, it is possible to improve the specificity of hybridization.
検体由来の核酸とハイブリダイズしたプローブの検出法には特に限定はなく、公知の検出方法のいずれもが本発明に適用できる。 There is no particular limitation on the method for detecting analyte nucleic acid from the hybridized probe, none of the known detection methods can be applied to the present invention.
上記の本発明のプローブを適切な方法で標識して使用することにより、試料中に存在する標的核酸を効率よくおよび/または高感度に検出することができる。 By using labeled probes of the invention described above in an appropriate way, it is possible to detect the target nucleic acid present in a sample to efficiently and / or high sensitivity.
プローブの標識方法には限定はなく、例えば放射性同位体( 32 P等)、色素、蛍光物質、発光物質、種々のリガンド(ビオチン、ジゴキシゲニン等)、酵素等が使用できる。 There is no limitation on the method for labeling a probe, such as a radioactive isotope (32 P, etc.), dyes, fluorescent materials, luminescent materials, various ligands (biotin, digoxigenin, etc.), enzymes and the like can be used. 標識されたプローブは当該標識に応じた検出方法でその存在を確認することができる。 The labeled probe can confirm the presence detection method in accordance with the label. 直接検出できないリガンドの場合には、検出可能な標識を付されたリガンド結合性の物質と組み合わせればよい。 If that can not be detected directly ligands may be combined with a detectable label attached ligand binding agent. 例えば、リガンド標識したプローブと酵素標識した抗リガンド抗体とを組み合せ、シグナルを増幅することによって標的核酸を高感度に検出することが可能である。 For example, combining the anti-ligand antibody probe and an enzyme-labeled that ligand labeled, it is possible to detect the target nucleic acid with high sensitivity by amplifying the signal.
さらに上記プローブは、検出のための標識物質を有していてもよい。 Furthermore the probe may have a labeling substance for detection. 標識物質は、特に限定はされないが例えばリガンドあるいはレセプター物質、放射性同位元素、蛍光、発光、発色のいずれもが好適に使用できる。 Labeling substance, particularly limited by not but for example a ligand or receptor substance, a radioisotope, a fluorescent, luminescent, none of the color can be preferably used.
本発明の方法においては、標識物質を有したプローブと目的の領域を増幅した核酸とをハイブリダイズし、フリーのプローブを洗浄後に検出する方法やあるいは該洗浄工程を省いた、いわゆるホモジニアス検出法のいずれもが好適に使用できる。 In the method of the present invention, a nucleic acid obtained by amplifying the region of the probe and the target having a labeling substance hybridized, omitting the methods and or the cleaning step of detecting free probe after washing, the so-called homogeneous detection method both can be preferably used. 蛍光を利用した該ホモジニアス検出法としては、例えば、Proc. As the homogeneous detection methods using fluorescence, for example, Proc. ,Natl. , Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA、vol. USA, vol. 85、p8790〜8794(1988)に記載の蛍光共鳴エネルギー転移(FRET;Fluoresence resonance energy transfer)法、Nature Biotechnology、vol. 85, fluorescence resonance energy transfer according to p8790~8794 (1988) (FRET; Fluoresence resonance energy transfer) method, Nature Biotechnology, vol. 14、p303〜308(1996)に記載の分子ビーコン(Molecular Beacons)法、Anal. 14, molecular beacons (Molecular Beacons) method described in p303~308 (1996), Anal. Chem. Chem. 、vol. , Vol. 72、p3717〜3724(2000)に記載のスマートブローブ(Smart probe)法等が好適に使用できる。 72, smart Burobu (Smart probe) method, or the like can be used suitably according to p3717~3724 (2000).
本発明の態様の一つとして、当該プローブの5'末端がローダミン系またはオキサジン系色素で標識され、3'末端がクエンチングを起こす塩基配列であるオリゴヌクレオチドやレポーター色素で標識され、さらに該プローブの5'末端側と3'末端側がセルフアニーリングしている、分子ビーコン法あるいはスマートプローブ法の場合が例示される。 In one embodiment of the present invention, 5 of the probe 'end is labeled with a rhodamine or oxazine dyes, 3' end labeled oligonucleotide and the reporter dye is a nucleotide sequence that causes the quenching, further the probe 5 'end and 3' end is self-annealed, when the molecular beacon method or smart probe method is illustrated.
上記のプローブを用いた場合、本発明の増幅方法によって増幅された核酸が存在すると、該増幅核酸にプローブがハイブリダイズして、プローブのセルフアニーリング構造が解消され、その結果として蛍光強度が抑制されずに蛍光シグナルを発するようになる。 When using the above probe, the nucleic acid amplified by the amplification method of the present invention is present, the probe hybridizes to the amplified nucleic acid, self-annealing structure of the probe is eliminated, the fluorescent intensity is suppressed as a result so that emit a fluorescent signal without. 一方、増幅核酸が存在しない場合は、プローブはセルフアニーリング構造を保持し、蛍光強度が抑制されるため蛍光シグナルは検出されない。 On the other hand, if the amplified nucleic acid is not present, the probe retains the self-annealing structure, the fluorescent signal is not detected for fluorescence intensity is suppressed.
すなわち、スマートプローブ法の場合、前記蛍光色素はローダミン系色素またはオキサジン系色素が好ましく、該色素は上記プローブの5'末端に結合され、3'末端の塩基配列と協調して標的核酸に該蛍光プローブが結合していないときは蛍光強度が抑制され、標的核酸に該蛍光プローブが結合した場合には蛍光強度が抑制されない性質を持つものであればよい。 That is, in the case of the smart probe method, the fluorescent dye is preferably a rhodamine dye or an oxazine dye, dye is 'coupled to the end, 3' 5 of the probe in cooperation with the ends of the base sequence fluorescence in a target nucleic acid when the probe is not bound is fluorescence intensity suppressed, if the fluorescent probe to the target nucleic acid bound may be any one which has the property of fluorescence intensity is not suppressed.
一方、分子ビーコン法の場合は、標的核酸に該蛍光プローブが結合していない場合には蛍光共鳴エネルギー転移によってその蛍光強度が抑制され、結合した場合には蛍光強度が抑制されないような組み合わせになればよい。 On the other hand, in the case of molecular beacon method, when the fluorescent probe to the target nucleic acid not bound is the fluorescence intensity suppressed by fluorescence resonance energy transfer, come combinations such as fluorescence intensity is not suppressed when bound Bayoi.
これら蛍光色素としては、FAM(6−カルボキシーフルオレッセイン)やTAMRA(6−カルボキシーテトラメチルーローダミン)やJA242(オキサジン)やDABCYL(4−ジメチルアミノアゾベンゼン−4'−スルホニルクロライド)が好ましい。 These fluorescent dyes, FAM (6- Cal Bokishi fluorescein) and TAMRA (6- Cal Bokishi tetramethyl over rhodamine) and JA242 (oxazine) and DABCYL (4-dimethylamino-azobenzene-4'-sulfonyl chloride) is preferred . これらの蛍光色素は公知であり、市販されている。 These fluorescent dyes are known and are commercially available.
なお、オリゴヌクレオチドに蛍光標識する方法は、例えば、Nuc. A method for the fluorescent labeled oligonucleotide can be, for example, Nuc. Acids Res. Acids Res. 、vol. , Vol. 12、p3387〜3403(1984)、J. 12, p3387~3403 (1984), J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 、vol. , Vol. 112、p1253〜1254(1990)あるいは、Anal. 112, p1253~1254 (1990) or, Anal. Chem. Chem. 、vol. , Vol. 70、p4771〜4779(1998)に記載の方法が利用できる。 70, can be utilized the method described in p4771~4779 (1998).
本発明のプローブの鎖長は、特に限定はされないが例えば、12mer以上、好ましくは20mer以上、特に好ましくは40mer以上である。 The chain length of the probe of the present invention, although not particularly limited are for example, 12mer or more, preferably at least 20mer, particularly preferably 40mer or more.
本発明の結核菌群検出用プローブは、Mycobacteium tuberculosis、Mycobacterium bovisBCG、Mycobacterium africanum、Mycobacterium microti及び/又はMycobacterium canettiを検出することができる。 Mycobacterium tuberculosis detection probe of the present invention can detect the Mycobacteium tuberculosis, Mycobacterium bovisBCG, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti and / or Mycobacterium Canetti. 当該プローブは、標的核酸は検出しようとする核酸、もしくは生物に応じて適切なものを選択すればよく、特に限定するものではないが、例えば結核菌群の検出においてはIS6110遺伝子を標的核酸とするプローブが使用でき、配列表の配列番号12に示される結核菌由来IS6110遺伝子の塩基配列から適切な領域を選択することにより設計することができる。 The probe is a nucleic acid to be detected the target nucleic acid, or may be selected as appropriate depending on the organism, is not particularly limited, and the target nucleic acid IS6110 gene in for example the detection of Mycobacterium tuberculosis probes can be used, it can be designed by selecting the appropriate region from the nucleotide sequence of Mycobacterium tuberculosis from IS6110 gene represented in SEQ ID NO: 12. 特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号39に記載の塩基配列を含む領域から、好ましくは配列表の配列番号40を含む領域から、さらに好ましくは配列表の配列番号38を含む領域から選択することができる。 Selected from the region comprising SEQ ID NO: 38 in the sequence listing is not intended to limit the present invention, a region containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 in the sequence listing, the region preferably comprising SEQ ID NO: 40 in the Sequence Listing, more preferably can do. 特に配列表の配列番号11記載の塩基配列を含む領域から選択することができる。 In particular it may be selected from the region comprising SEQ ID NO: 11 nucleotide sequence described in the sequence listing. 上記のプローブは、結核菌群由来のIS6110遺伝子、もしくはその断片と安定に、かつ高い特異性をもってハイブリダイズすることから、当該遺伝子の検出、さらには結核菌群の検出に特に有用である。 The above probe, IS6110 gene from Mycobacterium tuberculosis or from hybridizing with fragments and stable, and high specificity thereof, the detection of the gene, more particularly useful for the detection of Mycobacterium tuberculosis.
本発明のリン菌検出用プローブは、Neisseria gonorrhoeaeを検出することができる。 Phosphorus bacteria detection probe of the present invention, it is possible to detect Neisseria gonorrhoeae. 当該プローブは、標的核酸は検出しようとする核酸、もしくは生物に応じて適切なものを選択すればよく、特に限定するものではないが、例えばリン菌の検出においてはcryptic plasmid proteinB(cppB)遺伝子を標的核酸とするプローブが使用でき、配列表の配列番号27に示されるリン菌由来cppB遺伝子の塩基配列から適切な領域を選択することにより設計することができる。 The probe is a nucleic acid to be detected the target nucleic acid, or may be selected as appropriate depending on the organism, is not particularly limited, for example, a cryptic plasmid proteinB (cppB) gene in the detection of phosphorus bacteria probe to the target nucleic acid can be used, can be designed by selecting the appropriate region from the nucleotide sequence of phosphorus subtilis -derived cppB gene represented in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing. 特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号27に記載の塩基配列を含む領域から、好ましくは配列表の配列番号21を含む領域から選択することができる。 It is not particularly limited for example, from the region comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 in the Sequence Listing, preferably can be selected from a region containing SEQ ID NO: 21. 上記のプローブは、リン菌由来のcppB遺伝子、もしくはその断片と安定に、かつ高い特異性をもってハイブリダイズすることから、当該遺伝子の検出、さらにはリン菌の検出に特に有用である。 The above probe, cppB gene derived from phosphorus bacteria or from hybridizing with fragments and stable, and high specificity thereof, the detection of the gene, more particularly useful for detection of phosphorus bacteria.
本発明のクラミジア検出用プローブは、Chlamydia trachomatisを検出することができる。 Chlamydia detection probe of the present invention, it is possible to detect Chlamydia trachomatis. 当該プローブは、標的核酸は検出しようとする核酸、もしくは生物に応じて適切なものを選択すればよく、特に限定するものではないが、例えばクラミジアの検出においてはクリプティック・プラスミド(cryptic plasmid)pLGV440を標的核酸とするプローブが使用でき、配列表の配列番号22に示されるクラミジア由来pLGV440の塩基配列から適切な領域を選択することにより設計することができる。 The probe is a nucleic acid to be detected the target nucleic acid, or may be selected as appropriate depending on the organism, is not particularly limited, for example in the detection of Chlamydia cryptic plasmid (cryptic plasmid) pLGV440 a probe to target nucleic acid can be used, it can be designed by selecting the appropriate region from the nucleotide sequence of Chlamydia from pLGV440 shown in SEQ ID NO: 22 of sequence Listing. 特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号22に記載の塩基配列を含む領域から、好ましくは配列表の配列番号44を含む領域から、さらに好ましくは配列表の配列番号20を含む領域から選択することができる。 Selected from the region comprising SEQ ID NO: 20 in the sequence listing is not intended to limit the present invention, a region containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 22, from the region preferably comprising SEQ ID NO: 44 of the Sequence Listing, more preferably can do. 上記のプローブは、クラミジア由来のpLGV440、もしくはその断片と安定に、かつ高い特異性をもってハイブリダイズすることから、当該遺伝子の検出、さらにはクラミジアの検出に特に有用である。 The above probes are from Chlamydia pLGV440 or stably and fragments thereof, and a high from hybridizing with specificity, the detection of the gene, more particularly useful for the detection of Chlamydia.
また、本発明のHCV検出用プローブは、標的核酸増幅時に使用するフォワード側プライマー及びリバース側プライマーで挟まれた領域の塩基配列にハイブリダイズ可能なプローブであれば特に限定はされない。 Further, HCV detection probe of the present invention is not particularly limited as long as it is capable of hybridizing probes to the nucleotide sequence of the sandwiched region forward primer and the reverse primer used during the target nucleic acid amplification. また、該プローブの長さは、特に限定はされないが、好ましくは8塩基〜53塩基の範囲、特に好ましくは8塩基〜36塩基の範囲で選択すればよい。 The length of the probe is not particularly limited, preferably 8 bases to 53 bases, especially in the range preferably may be selected in the range of 8 bases to 36 bases. 例えば、配列表の配列番号43に示される塩基配列から上記範囲で連続する8塩基以上の塩基配列を有するプローブを選択すればよく、特に限定はされないが、配列表の配列番号34あるいは35に示される塩基配列の中の連続する8塩基以上を有するプローブが挙げられる。 For example, may be selected probe having the SEQ ID NO: 43 nucleotide sequence of the base sequence of 8 bases or more consecutive above range indicated in the sequence listing, it is not particularly limited, shown in SEQ ID NO: 34 or 35 in the Sequence Listing probes having consecutive 8 or more bases in the nucleotide sequence are exemplified.
(2)本発明の検出方法本発明の標的核酸の検出方法は、上記(1)記載のプローブを用いることにより、標的核酸の2本鎖から1本鎖への変性工程に続く中和工程を省略できる。 (2) method for detecting a target nucleic acid detection method of the present invention of the present invention, by using the probe of above (1) wherein, the neutralization step following the denaturation step in the single-stranded from double-stranded target nucleic acid It can be omitted. すなわち、本発明の標的核酸の検出方法においてpHが7を越えるアルカリ条件、特に好ましくはpH8〜14の範囲のアルカリ条件下においてその塩基配列に相補的な配列を有する核酸とハイブリダイズすることが可能である。 That is, the alkaline conditions in excess of pH 7 in the method for detecting a target nucleic acid of the present invention, particularly preferably can be a nucleic acid which hybridizes with a sequence complementary to the nucleotide sequence under alkaline conditions ranging pH8~14 it is. 当該ハイブリダイゼーションの条件としては、特に限定するものではないが、「厳密な条件」として当業者に知られている条件を挙げることができる。 The conditions of the hybridization is not particularly limited, mention may be made of conditions known to those skilled in the art as "stringent conditions". このような条件は、1989年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、T. Such conditions, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory issued, T. マニアティス(T.Maniatis)ら編集、モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル第2版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.)に記載のものや、本願実施例に記載されたものが使用できる。 Maniatis (T. Maniatis) et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2nd ed), or anything described, those described herein Example can be used .
代表的なハイブリダイゼーション溶液の組成としては次のものが挙げられる:0.5%SDS、5×デンハルツ[Denhardt's;0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%フィコール400]及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム)。 The composition of a typical hybridisation solution include the following: 0.5% SDS, 5 × Denhardt's [Denhardt's; 0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0 6 × SSC containing .1% Ficoll 400] and 100 [mu] g / ml salmon sperm DNA (1 × SSC is 0.15 M NaCl, 0.015M sodium citrate). なお、本発明においてはハイブリダイゼーション溶液のpHは8〜14の範囲に調整して実施してもよい。 Incidentally, pH of the hybridization solution in the present invention may be implemented by adjusting the range of 8 to 14.
ハイブリダイゼーションの温度は、特に限定されるものではないが、例えばプローブのTm値より5℃以上低い温度で実施される。 The hybridization temperature is not particularly limited, for example, carried out at 5 ° C. or more below the Tm value of the probe.
ここで、プローブのTm値は、例えば下記式: Here, Tm value of the probe, for example the following formula:
Tm=81.5−16.6(log 10 [Na+])+0.41(%G+C)−(600/N) Tm = 81.5-16.6 (log 10 [Na +]) + 0.41 (% G + C) - (600 / N)
(式中、Nはプローブの鎖長、%G+Cはプローブ中のグアニンおよびシトシン残基の含量である) (Wherein, N is the chain length of the probe,% G + C is the content of guanine and cytosine residues in the probe)
により求められる。 The sought.
また、プローブの鎖長が18塩基よりも短い場合には、Tm値は下記式: Further, when the chain length of the probe 18 is shorter than the base, Tm values ​​following formula:
Tm=(%A+T)×2+(%G+C)×4] Tm = (% A + T) × 2 + (% G + C) × 4]
(式中、(%A+T)はプローブ中のアデニンおよびチミン残基の含量、(%G+C)はプローブ中のグアニンおよびシトシン残基の含量である) (Wherein, (% A + T) the content of adenine and thymine residues in the probe, (% G + C) is the content of guanine and cytosine residues in the probe)
として推定することができる。 It can be estimated as.
上記のハイブリダイゼーション条件でプローブと標的核酸のハイブリダイズを確認することにより、標的核酸の検出に適したプローブを選定することができる。 By confirming the hybridized probe and target nucleic acid under hybridization conditions described above, it is possible to select a probe suitable for detection of a target nucleic acid.
本発明の検出方法におけるハイブリダイゼーション条件には特に限定はなく、公知のハイブリダイゼーション条件、好ましくは厳密なハイブリダイゼーション条件が使用される。 It is not particularly limited to hybridization conditions in the detection method of the present invention, a known hybridization conditions, preferably stringent hybridization conditions used. また、ハイブリダイゼーション溶液のpHは8〜14の範囲に調整してもよい。 Further, pH of the hybridization solution may be adjusted to a range of 8 to 14.
本発明の標的核酸の検出方法の一態様としては、例えば結核菌群の検出方法においては、結核菌群由来のIS6110遺伝子の検出に適したプローブが好適に使用でき、特に限定するものではないが、例えば、配列表の配列番号39記載の塩基配列もしくはその一部、好ましくは配列表の配列番号40記載の塩基配列もしくはその一部、さらに好ましくは配列表の配列番号38記載の塩基配列もしくはその一部、特に好ましくは配列表の配列番号11を含有するプローブが本発明に好適に使用できる。 As an embodiment of the method for detecting a target nucleic acid of the present invention, for example, in the detection method of Mycobacterium tuberculosis, it probes suitable for the detection of IS6110 gene from Mycobacterium tuberculosis can be suitably used is not particularly limited , for example, SEQ ID NO: 39 nucleotide sequence or a part thereof according the sequence listing, preferably SEQ ID NO: 40 nucleotide sequence or a part thereof according to the sequence Listing, more preferably or a base sequence of SEQ ID NO: 38 in the sequence table that some, especially preferably probes containing SEQ ID NO: 11 in the sequence listing can be preferably used in the present invention. また、例えばリン菌の検出方法においては、リン菌由来のcppB遺伝子の検出に適したプローブが好適に使用でき、特に限定するものではないが、例えば、配列表の配列番号27記載の塩基配列もしくはその一部、好ましくは配列表の配列番号21記載の塩基配列もしくはその一部を含有するプローブが本発明に好適に使用できる。 Further, for example, in the detection method of the phosphorus bacteria can probes preferably used which is suitable for the detection of cppB gene from phosphorus bacteria is not particularly limited, for example, of SEQ ID NO: 27 in the Sequence Table nucleotide sequences or part, preferably probes containing nucleotide sequence or a part thereof of SEQ ID NO: 21, wherein the sequence list can be suitably used for the present invention. また、クラミジアの検出方法においては、クラミジア由来のpLGV440の検出に適したプローブが好適に使用でき、特に限定するものではないが、例えば、配列表の配列番号22記載の塩基配列もしくはその一部、好ましくは配列表の配列番号44記載の塩基配列もしくはその一部、さらに好ましくは配列表の配列番号20記載の塩基配列もしくはその一部を含有するプローブが本発明に好適に使用できる。 Further, in the method for detecting chlamydia, probes suitable for the detection of pLGV440 from Chlamydia can be suitably used is not particularly limited, for example, SEQ ID NO: 22 nucleotide sequence or a part thereof according the sequence listing, preferably SEQ ID NO: 44 nucleotide sequence or a part thereof according to the sequence Listing, more preferably a probe containing the base sequence or a part thereof of SEQ ID NO: 20, wherein the sequence list can be suitably used for the present invention. さらに、HCVの検出方法においては、特に限定するものではないが、5'非翻訳領域が好適であり、例えば、配列表の配列番号43記載の塩基配列もしくはその一部、好ましくは配列表の配列番号34記載の塩基配列もしくはその一部、又は配列番号35記載の塩基配列もしくはその一部を含有するプローブが本発明に好適に使用できる。 Further, in the method for detecting HCV, but not limited to, 5 'are preferably untranslated region, e.g., SEQ ID NO: 43 nucleotide sequence or a part thereof according to Sequence Listing, preferably the sequence of sequence listing nucleotide sequence or a part thereof of number 34 wherein, or probes containing nucleotide sequence or a part thereof of SEQ ID NO: 35 described can be suitably used for the present invention.
本発明の病原微生物の検出方法は、上記(1)記載のプローブを用いることにより個々の病原微生物を特異的に検出することができる。 Detection methods of pathogenic microorganisms of the present invention can specifically detect individual pathogenic microorganisms by using a probe as described in (1) above. すなわち、上記のプローブは各病原微生物由来の遺伝子、もしくはその断片と安定に、かつ高い特異性をもってハイブリダイズすることから、当該遺伝子の検出、さらには各病原微生物の検出に特に有用である。 That is, the probe genes from each pathogenic microorganism or from hybridizing with fragments and stable, and high specificity thereof, the detection of the gene, more particularly useful for detection of each pathogenic microorganisms.
さらに本発明の検出方法においては、上記(1)記載のプローブを使用することにより当該プローブと核酸を含有する試料との間で、pH7を越えるアルカリ条件下、好ましくはpH8〜14、特に好ましくはpH8〜10の条件下でハイブリダイゼーションを実施することができる。 In still detection method of the present invention, with the sample containing the probe and a nucleic acid by using the probe of above (1), wherein, under alkaline conditions in excess of pH 7, preferably PH8~14, particularly preferably it is possible to carry out the hybridization under the conditions of pH8~10. すなわち、当該方法により標的核酸の変性工程に続く中和工程を経ることなく、病原微生物由来の遺伝子、もしくはその断片を検出する方法が提供され、該方法によって検体中に含まれる結核菌等を検出することができる。 That is, without a neutralization step following the denaturation step of the target nucleic acid by the method, a gene derived from pathogenic microorganisms, or is provided a method of detecting a fragment thereof, detecting Mycobacterium tuberculosis or the like contained in the sample by the method can do.
本発明の方法は、試料中に存在する特定の遺伝子の検出、定量に利用することができる。 The method of the present invention, detection of a particular gene present in a sample, can be used for quantification. すなわちDNAまたはRNA等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。 That detecting a specific gene from any sample that may contain nucleic acids such as DNA or RNA, can be quantified. 前述の試料としては、特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織(例えば、癌組織、リンパ節等)、細胞培養物(例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等)のような生体由来試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料(食品、生物学的製剤等)、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。 The sample described above is not particularly limited, for example, whole blood, serum, buffy coat, urine, faeces, cerebrospinal fluid, semen, saliva, tissue (e.g., cancerous tissue, lymph nodes, etc.), cell culture ( for example, a sample which may microorganisms such as biological samples, viruses or bacteria, such as mammalian cell cultures and bacterial cultures, etc.) are mixed or infection (food, biologicals, etc.), or soil, detecting a specific gene from a sample that may contain organisms such as waste water, can be quantified. さらに例えば、標的核酸の存在の有無によって上記の病原微生物の存在の検出、定量等に利用することができる。 Furthermore, for example, detection of the presence of the pathogenic microorganisms by presence or absence of the target nucleic acid, can be used to quantify the like. 特に、病原性の微生物の検出方法は衛生、環境分野で有用である。 In particular, detection methods of pathogenic microorganisms are useful hygiene, in the environmental field. 上記検出法のための鋳型として使用される核酸は、RNAあるいはDNAのいずれもが好適に使用できる。 Nucleic acids used as a template for the detection method, either the RNA or DNA can be suitably used.
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。 Particularly limited to the preparation of nucleic acid-containing preparation from these materials are not, for example, dissolving treatment with a surfactant, ultrasonication, shaking agitation using glass beads, it can be carried out by using such a French press. 幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である(例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき)。 In some instances, it is advantageous to purify the nucleic acids further added to the operation (e.g., in case where an endogenous nuclease exists). これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。 In such cases, the nucleic acid is purified phenol extraction, chromatography, ion exchange is carried out by known methods of gel electrophoresis or density gradient centrifugation.
RNA由来の配列を有する核酸を標的とする場合には、当該RNAを鋳型とした逆転写反応によって合成されたcDNAを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。 When a nucleic acid having a sequence derived from RNA targeting, a cDNA synthesized by a reverse transcription reaction the RNA as a template may be conducted with the method of the present invention as a template.
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される反応条件において鋳型RNAにアニールするものであれば特に限定されるものではない。 Primers used for reverse transcription reaction described above is not limited in particular as long as it anneals to the template RNA under reaction conditions used. 該プライマーは、特定の鋳型RNAに相補的な塩基配列を有するプライマー(特異的プライマー)の他、オリゴdT(デオキシチミン)プライマーやランダムな配列を有するプライマー(ランダムプライマー)であっても良い。 The primers, other primers having a nucleotide sequence complementary to a specific template RNA (specific primer), may be a primer (random primer) having oligo dT (deoxythymine) primer and random sequences. 逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは6ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは9ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは100ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは30ヌクレオチド以下である。 The length of the primer for reverse transcription, from the viewpoint of performing the specific annealing, is preferably 6 nucleotides or more, still more preferably 9 nucleotides or more, from the viewpoint of the synthesis of oligonucleotides, preferably be 100 nucleotides or less , more preferably 30 nucleotides or less. さらに、逆転写用プライマーとして、逆転写後のcDNAを鋳型とした本発明の核酸増幅法を行う際に鎖置換反応のためのプライマーとして使用可能なキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。 Further, as a reverse transcription primer, the cDNA after reverse transcription may be used a chimeric oligonucleotide primer that can be used as a primer for strand displacement reaction when performing nucleic acid amplification method of the present invention as a template. このようなプライマーは、下記(3)に記載された性質を有し、かつRNAからの逆転写反応に使用できるものであれば特に限定はないが、例えば、配列表の配列番号32及び33に記載の塩基配列を有するプライマーが好適に使用できる。 Such primers have the properties described in the following (3), and is not particularly limited as long as it can be used for the reverse transcription reaction from RNA, eg, in SEQ ID NO: 32 and 33 in the Sequence Listing primer having the nucleotide sequence set forth can be preferably used.
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、RNAを鋳型としたcDNA合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素(AMV RTase)、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素(MMLV RTase)、ラウス関連ウイルス2逆転写酵素(RAV−2 RTase)等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。 The enzyme used in the reverse transcription reaction mentioned above is not particularly limited as long as it has an activity of synthesizing a cDNA using an RNA as a template, for example, avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV RTase), Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase (MMLV RTase), Rous-associated virus 2 reverse transcriptase (RAV-2 RTase), etc., and reverse transcriptase of various origins. このほか、逆転写活性を併せ持つDNAポリメラーゼを使用することもできる。 In addition, it is also possible to use a DNA polymerase having both reverse transcriptase activity. また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来DNAポリメラーゼ(Tth DNAポリメラーゼ等)、好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼ等を使用できる。 Further, for the purposes of the present invention is suitably enzyme having reverse transcription activity at a high temperature, for example, genus Thermus bacterial DNA polymerase (Tth DNA polymerase, etc.), can be used thermophilic Bacillus bacteria-derived DNA polymerase and the like . 特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼが好ましく、B. Is not particularly limited but, for example, preferably thermophilic Bacillus bacteria-derived DNA polymerase, B. st由来DNAポリメラーゼ(Bst DNAポリメラーゼ)、さらにBca DNAポリメラーゼが好ましい。 st-derived DNA polymerase (Bst DNA polymerase) and Bca DNA polymerase are preferable. 例えば、Bca DNAポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型RNAの二次構造形成を抑制しながらcDNAを合成することができる。 For example, Bca DNA polymerase does not require a manganese ion for a reverse transcription reaction, also can synthesize a cDNA while suppressing secondary structure formation of a template RNA under high-temperature conditions. 上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。 Enzyme having reverse transcriptase activity of the above are also natural body to the extent that has the activity, none of the mutants can be used.
上記方法により単離したゲノムDNAやPCRフラグメントのような二本鎖DNA、および全RNA若しくはmRNAから逆転写反応で調製されたcDNAのような一本鎖DNAのいずれもが本発明に使用される核酸増幅法において鋳型DNAとして好適に使用できる。 Double-stranded DNA, and none of the single-stranded DNA such as a cDNA prepared by reverse transcription reaction from whole RNA or mRNA can be used in the present invention, such as genomic DNA isolated and PCR fragments by the method It can be suitably used as a template DNA in the nucleic acid amplification method. 上記二本鎖DNAの場合は、一本鎖DNAに変性する工程(デネーチャー)を施したものが好適に使用できる。 For the double-stranded DNA, can be preferably used those having been subjected to the step of denatured into single-stranded DNA (de Nature).
上記のように、本発明のプローブとハイブリダイズする標的核酸上の領域を適切な核酸増幅方法によって増幅し、これをハイブリダイゼーションに使用することができる。 As described above, it can be a region on the target nucleic acid hybridize to the probe of the present invention was amplified by a suitable nucleic acid amplification method, which is used in the hybridization. 使用される核酸増幅方法には特に限定はなく、標的核酸上の領域を増幅可能なものであればよい。 It is not particularly limited to nucleic acid amplification method used, as long as it can amplify a region on the target nucleic acid. 例えばポリメラーゼ連鎖反応法(PCR;polymerase chain reaction、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号)、リガーゼ連鎖反応(LCR;ligase chain reaction)、鎖置換型増幅法(SDA;strand displacement amplification、特公平7−114718号)、自立複製法(3SR;self−sustained sequence replication)、核酸配列増幅法(NASBA法;nucleic acid sequence based amplification、特許第2650159号)、TMA法(transcription−mediated amplification For example the polymerase chain reaction (PCR; polymerase chain reaction, U.S. Pat. Nos. 4,683,195, No. 4,683,202 and 4,800,159), ligase chain reaction (LCR; ligase chain reaction), strand displacement amplification (SDA; strand displacement amplification, Kokoku No. 7-114718), self-replication method (3SR; self-sustained sequence replication), nucleic acid sequence amplification method (NASBA method; nucleic acid sequence based amplification, No. 2,650,159 No.), TMA method (transcription-mediated amplification )、Qβレプリカーゼ法(特許番号第2710159号)、ICAN法(Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids、国際公開第00/56877号パンフレット)等を使用することができる。 ), Qβ replicase method (Patent No. 2710159), ICAN method (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids, the WO 00/56877 pamphlet), and the like can be used.
ICAN法は、キメラヌクレオチドプライマーとエンドヌクレアーゼ、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを使用して、等温条件下に鋳型核酸上の特定の塩基配列を有するDNAを連続的に増幅する方法である。 ICAN method is a chimeric oligonucleotide primer and an endonuclease, using a DNA polymerase having strand displacement activity, a method for continuously amplify DNA having a specific nucleotide sequence on the template nucleic acid under isothermal conditions.
ここで、「連続的に」とは、反応温度、反応液組成の変更を伴わずに反応が進行していることを意味する。 Here, "continuously" it is meant that the reaction temperature, the reaction without changing the reaction solution composition is in progress. また、本明細書において「等温」とは、酵素および核酸鎖が上記各工程において機能する、実質的に一定の温度条件のことを意味する。 Further, in the present specification, the term "isothermal" is an enzyme and a nucleic acid strand function in each step, which means that a substantially constant temperature conditions.
通常、キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドから構成され、リボヌクレオチドがその3'末端又は3'末端側に配置されたものが使用される。 Usually, the chimeric oligonucleotide primer is composed of deoxyribonucleotides and ribonucleotides, which ribonucleotide is positioned at its 3 'terminus or 3' terminus is used. 例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドがICAN法のプライマーとして使用することができる。 For example, it is possible oligonucleotides having a structure represented by the following general formula are used as primers ICAN method.
一般式:5'−dNa−Nb−dNc−3' The general formula: 5'-dNa-Nb-dNc-3 '
(a:11以上の整数、b:1以上の整数、c:0または1以上の整数、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよい) (A: 11 or more integer, b: an integer of 1 or more, c: 0 or an integer of 1 or more, dN: deoxyribonucleotide and / or nucleotide analogs, N: unmodified ribonucleotide and / or modified ribonucleotide, Incidentally, dNa some sites dN may be substituted by N)
なお、上記のヌクレオチドアナログとしては、例えば、デオキシリボイノシンヌクレオチドを、また修飾リボヌクレオチドとしては、例えば、(α−S)リボヌクレオチドを、それぞれ使用することができる。 As the nucleotide analogs of the above, for example, the deoxyribonucleotide inosine nucleotides, also as a modified ribonucleotide, for example, the (alpha-S) ribonucleotide can be used respectively. 当該ヌクレオチドアナログは、プライマーとしての機能を実質的に失わない範囲で含有させることができる。 The nucleotide analogs can be incorporated within a range not substantially losing a function as a primer.
当該プライマーは、鋳型上の増幅が望まれる領域の5'側、3'側の塩基配列をもとに、5'側の塩基配列に相同な配列を有するもの、3'側の塩基配列に相補的なものの2種を作成し、増幅に使用される。 The primer is 5 ', 3' of the region amplified on the template is desired based on the nucleotide sequence of the side, 'having a sequence homologous to the base sequence of the side 3' 5 complementary to the nucleotide sequence of the side specific but creates the two, are used for amplification.
本発明に使用されるエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりDNAの伸長を行って生成した二本鎖DNAに作用して、鎖置換反応が起こるように伸長鎖を切断しうるものであればよい。 The endonuclease used in the present invention, by acting on double-stranded DNA generated by performing a decompression of the chimeric oligonucleotide primer than DNA described above was annealed to the template nucleic acid, as strand displacement reaction occurs extension chain may be those capable of cleavage. 即ち、上記の二本鎖DNAのうちのキメラオリゴヌクレオチドプライマー部分にニックを生成しうる酵素である。 That is, an enzyme capable of generating a nick in the chimeric oligonucleotide primer portion of said double-stranded DNA. 特に限定されるものではないが、例えば、本発明にはリボヌクレアーゼが使用でき、特にDNAとRNAとから形成された二本鎖核酸のRNA部分に作用するエンドリボヌクレアーゼH(RNaseH)が好適に使用できる。 Although not particularly limited, for example, the present invention is a ribonuclease can be used, endoribonuclease H (RNase H) can be preferably used which act on particular RNA portion of double-stranded nucleic acid formed from DNA and RNA . また、該リボヌクレアーゼには、上記作用を有するものであれば、常温性から耐熱性のリボヌクレアーゼのいずれもが好適に本発明に使用できる。 In addition, the said ribonuclease, as long as it has the above-described action, both mesophilic and heat-resistant ones ribonuclease can be used to suitably present invention. 例えば、下記実施例に示すように、約50℃〜約70℃での反応では大腸菌(E.coli)由来のRNaseHが本発明の方法に使用することができる。 For example, as shown in the following examples, RNase H from E. coli (E. coli) can be used in the methods of the present invention is a reaction at about 50 ° C. ~ about 70 ° C.. また、本発明の方法においては、耐熱性のリボヌクレアーゼも好適に使用できる。 Further, in the method of the present invention, the heat resistance of ribonuclease can be suitably used. 該耐熱性リボヌクレアーゼとしては、特に限定はされないが、例えば市販のHybridase TM Thermostable RNaseH(エピセンターテクノロジーズ社製)の他、好熱性バチルス属細菌、サーマス属細菌、ピロコッカス属細菌、サーモトガ属細菌、アルカエオグロバス属細菌、メタノコッカス属細菌等由来のRNaseH等も好適に使用できる。 The heat-resistant RNase is not particularly limited, for example, other commercially available Hybridase TM Thermostable RNase H (Epicenter Technologies), thermophilic Bacillus bacteria, Thermus bacteria, Pyrococcus bacteria, Thermotoga bacterium, Arukae Ogurobasu bacteria, RNase H or the like from Methanococcus bacteria or the like can be preferably used. さらに、該リボヌクレアーゼは、天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。 Furthermore, the ribonuclease, both natural and variants can be preferably used. なお、本願明細書に記載されているRNaseHの酵素単位は、実施例中の参考例に示した酵素単位測定方法に基づいて表示された数値である。 Note that enzyme units of RNaseH, which is described herein is a numerical value displayed on the basis of enzyme units measuring method shown in Reference Example in Example.
また、上記RNaseHは、本発明の方法に使用できるものであれば特に限定はなく、例えば、種々のウイルス、ファージ、原核、真核生物由来のいずれであってもよい。 Further, the RNaseH is as long as it can be used in the method of the present invention is not particularly limited, for example, various viral, phage, prokaryotic, may be any of eukaryotic origin. さらに、細胞性RNaseHあるいはウイルス性RNaseHのいずれであってもよい。 Furthermore, it may be any of cellular RNaseH or viral RNaseH. 例えば、上記細胞性RNaseHとしては大腸菌RNaseHIが、ウイルス性RNaseHとしてはHIV−1由来RNaseHが例示される。 For example, the cellular RNaseH coli RNaseHI is Viral RNaseH is exemplified HIV-1-derived RNaseH. 本発明の方法においてRNaseHは、I型、II型、III型のいずれもが使用できる。 RNaseH in the method of the invention, I-type, II type, either type III can be used. 特に限定はされないが、例えば大腸菌由来RNaseHI、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来RNaseHIIが好適に使用できる。 Particularly but not limited to, for example, E. coli-derived RNaseHI, Pyrococcus bacterium-derived or alk eosin Glo bus bacterium derived RNaseHII can be suitably used.
また、本発明の方法に使用するエンドヌクレアーゼ、例えば、RNaseHの切断反応の効率は上記プライマーの3'末端近傍の塩基配列に左右され、所望のDNAの増幅効率に影響することが考えられるので、使用するRNaseHに最適なプライマーをデザインすることは当然のことである。 Furthermore, the endonuclease used in the method of the present invention, for example, the efficiency of cleavage reactions of RNaseH is dependent on the nucleotide sequence of the 3 'end near the primer, since it is considered to affect the amplification efficiency of the desired DNA, it is of course possible to design the optimal primer to RNaseH to be used.
ICAN法には、DNAの鎖置換(strand displacement)を行う活性を有するDNAポリメラーゼが使用される。 The ICAN method, DNA polymerase having activity to perform DNA strand replacing (strand displacement) are used. また、実質的に5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有しないものが特に好適に使用される。 Further, those having substantially no 5 '→ 3' exonuclease activity are particularly preferably used.
ICAN法に使用されるDNAポリメラーゼは、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、バチルス カルドテナックス(Bacillus caldotenax、以下、B.caと称す)やバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus、以下B.stと称す)等の好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌由来DNAポリメラーゼIのラージ フラグメント(クレノウ断片)等が挙げられる。 DNA polymerase used in the ICAN method is not particularly limited as long as it has the above-described strand displacement activity, e.g., Bacillus stearothermophilus (Bacillus caldotenax, hereinafter referred to as B.Ca) and Bacillus stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus, hereinafter referred to as B.St) thermophilic Bacillus bacteria 5 '→ 3' mutant or lacking exonuclease activity from DNA polymerase large fragment of E. coli DNA polymerase I, such as (Klenow fragment) etc. the. また、本発明に使用できるDNAポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。 Also, DNA polymerases that can be used in the present invention can be suitably used in any of mesophilic and heat resistance. 上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタンパク質の何れであっても良い。 The above enzymes may purified from its original source ones is obtained, or be any genetic engineering-produced recombinant protein. また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、このような酵素の例として、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたBca DNAポリメラーゼであるBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)等が挙げられる。 Further, the enzyme, substituted by genetic engineering or other techniques, well deletions, additions, even those with modifications such as insertion, as an example of such an enzyme, 5 '→ 3' exonuclease BcaBEST DNA polymerase activity is Bca DNA polymerase lacking (Takara Shuzo Co., Ltd.). 該酵素は50℃〜70℃で活性を示し、当該方法に好適に使用することができる。 The enzyme can exhibit activity at 50 ° C. to 70 ° C., suitably used for the method.
なお、DNAポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、RNaseH活性を有するものが知られている。 Incidentally, in the DNA polymerase, endonuclease activity under specific conditions, for example, are known to have an RNaseH activity. このようなDNAポリメラーゼを本発明の方法に用いることができる。 Such DNA polymerases can be used in the method of the present invention. すなわち、該DNAポリメラーゼをRNaseH活性が発現されるような条件下、例えばMn 2+の存在下で使用する態様が挙げられる。 That is, under conditions such that the DNA polymerase is RNaseH activity is expressed, embodiments employing the like, for example, in the presence of Mn 2+. 該態様においては、上記RNaseHを添加することなく本発明の方法を実施することができる。 In said embodiment, it is possible to implement the method of the present invention without the addition of the RNase H. すなわち、Mn 2+を含有する緩衝液中で上記のBca DNAポリメラーゼは、RNaseH活性を示すことができる、上記の態様はBca DNAポリメラーゼに限定されるものではなく、RNaseH活性を併せ持つことが知られている公知のDNAポリメラーゼ、例えばサーマス サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のTth DNAポリメラーゼも本発明に使用することができる。 That is, the above Bca DNA polymerase in a buffer containing Mn 2+ can exhibit RNaseH activity, the above embodiments are not intended to be limited to the Bca DNA polymerase, is known to both the RNaseH activity known DNA polymerases are, for example, Thermus thermophilus (Thermus thermophilus) derived Tth DNA polymerase can also be used in the present invention.
ICAN法は、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型となる核酸を含有する試料、エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド3リン酸(dNTP)等を前記酵素が活性を示しうる組成の緩衝液中で混合し、当該反応液を適切な温度で反応産物が生成するのに十分な時間保温することにより実施される。 ICAN method, mixed chimeric oligonucleotide primer, a sample containing nucleic acid as a template, endonuclease, a DNA polymerase, buffer composition of the enzyme deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) such as may exhibit activity, It is carried out by incubation for a time sufficient to produce a reaction product the reaction mixture at a suitable temperature.
なお、反応に先立ってキメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型となる核酸を混合し、2本鎖核酸が変性する温度、例えば、90℃以上で保持した後、本発明の方法に使用される反応温度以下まで冷却してアニーリングを実施してもよいが、これは増幅反応に必須の操作ではない。 Note that the nucleic acid as a chimeric oligonucleotide primer and the template prior to the reaction mixture, the temperature at which double-stranded nucleic acid is denatured, for example, until after maintaining at 90 ° C. or higher, the reaction temperature used in the method of the present invention will cooling to be carried out annealing, but this is not an essential operation in the amplification reaction.
また本発明の検出方法において、RNAを鋳型とする場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を1段階で行ってもよい。 Also in the detection method of the present invention, when the RNA as a template, a reverse transcription reaction and the nucleic acid amplification reaction may be carried out in one step. 特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換型DNAポリメラーゼの組み合わせとして例えば、AMV RTase、MMLV RTaseあるいはRAV−2 RTaseとBca DNAポリメラーゼの組み合わせが好適に使用できる。 Particularly but not limited to, for example, as a combination of reverse transcriptase and strand displacement DNA polymerase, AMV RTase, combinations of MMLV RTase or RAV-2 RTase and Bca DNA polymerase can be preferably used. さらに、逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有する1種のDNAポリメラーゼを用いてもよい。 Further, one type may be used for DNA polymerases having reverse transcriptase activity and strand displacement activity.
本発明の標的核酸の検出方法は、核酸を含有する試料より直接、標的核酸を増幅することにより実施することができる。 Method for detecting a target nucleic acid of the invention, directly from a sample containing nucleic acid, can be carried out by amplifying the target nucleic acid. この場合、増幅される標的核酸の鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的核酸を検出する観点からは、例えば200bp以下、さらに好ましくは150bp以下の領域が有効である。 In this case, the chain length of the target nucleic acid to be amplified is not particularly limited, from the viewpoint of detecting with high sensitivity a target nucleic acid, e.g. 200bp or less, more preferably is effective following areas 150 bp. 該増幅鎖長となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、高感度に試料中の標的核酸を検出することができる。 By setting the chimeric oligonucleotide primers of the present invention so that the amplified chain length, it is possible to detect the target nucleic acid in the sample with high sensitivity.
さらに、本発明の検出方法では、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。 Further, in the detection method of the present invention, bicine, tricine, Hepes, reaction buffer containing phosphate or Tris buffer components, and by the use of annealing solution containing spermidine or propylenediamine, even higher from traces of nucleic acid sample it is possible to detect the target nucleic acid sensitivity. この場合、使用するエンドヌクレアーゼとDNAポリメラーゼは特に限定はされないが、例えば大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来RNaseH及びBcaBEST DNAポリメラーゼの組み合わせが好ましい。 In this case, the endonuclease and the DNA polymerase to be used is not particularly limited, for example E. coli, a combination of Pyrococcus bacterium-derived or alk eosin Glo bus bacterium derived RNaseH and BcaBEST DNA polymerase is preferable. 特に、上記エンドヌクレアーゼ及びDNAポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。 In particular, the endonuclease and DNA polymerase are both the number of units that can be suitably used depending on the kind are expected vary, and the increase or increase the amount of amplification product detection sensitivity when its index of the buffer composition and may be adjusted the amount of the enzyme.
また、二本鎖の鋳型DNAと2種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する核酸増幅方法の態様においては、反応の条件等にもよるが、各プライマーから伸長反応中のそれぞれの鋳型−伸長鎖中間体の間で鋳型の交換が起こり、合成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸を生成することがある。 In the embodiment of the nucleic acid amplification method using the template DNA and two chimeric oligonucleotide primer double-stranded, depending on the conditions of the reaction, each template in the extension reaction from the primer - extension strand intermediate replacement of the mold occurs between the body, synthesized primer extension strand each other resulting in the formation of double-stranded nucleic acid annealed. この二本鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを有しており、次いでその両端から再び鎖置換による相補鎖伸長反応を開始することができる。 The double-stranded nucleic acid has a chimeric oligonucleotide primer at both ends, then it is possible to start the complementary strand extension reaction by again strand displacement from both ends. この反応の結果、一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。 The result of this reaction, the amplification product is generated with primer sequences at one end. さらに、この反応中に鋳型の交換が起こった場合には前記と同様な二本鎖核酸が再度生成される。 Furthermore, the double-stranded nucleic acid similar to the is generated again when the replacement of the mold occurs during the reaction.
本発明では、上記のような鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを使用し、鋳型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法を利用することができる。 In the present invention, using a DNA polymerase having strand displacement activity, such as described above, can be utilized nucleic acid amplification method comprising the step of performing template switching reaction.
鎖置換反応中に上記の鋳型交換反応を行う能力を有するDNAポリメラーゼとしては、例えば、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠失したBca DNAポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。 The DNA polymerase having the capability of performing the above-described template switching reaction in the strand displacement reaction, for example, 5 '→ 3' mutant enzyme of Bca DNA polymerase lacking exonuclease activity is particularly preferably used. 当該酵素はBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)として市販されており、また、該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、Escherichia coli HB101/pUI205(FERM BP−3720、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305−8566)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成3年5月10日(原寄託日)に寄託)より日本特許第2978001号に記載の方法によって調製することもできる。 The enzyme is commercially available as BcaBEST DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and E. coli containing the gene of the enzyme, Escherichia coli HB101 / pUI205 (FERM BP-3720, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Higashi 1-Chome prepared by the method described in the Japanese Patent No. 2978001 from the central sixth deposited with the (postal code 305-8566) National Institute of Advanced industrial Science and technology Patent organism Depositary Center in 1991 May 10 (original deposit date)) it is also possible to.
本発明の検出方法においては、標的核酸の増幅の際に、dUTPを基質として取り込ませることができる。 In the detection method of the present invention, during amplification of a target nucleic acid, dUTP may be incorporated as a substrate. したがって、dUTPを基質に用いた場合には、ウラシル N−グリコシダーゼ(uracil N−glycosidase:UNG)を利用して増幅産物を分解し、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができる。 Therefore, if dUTP is used as a substrate, uracil N- glycosidase (uracil N-glycosidase: UNG) by degrading amplification products utilizing, it is possible to prevent false positives due to carryover contamination of amplification products .
本発明の検出方法において上記の核酸増幅方法によって増幅された標的核酸を検出するには公知の核酸検出方法、例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等を使用することができる。 Known nucleic acid detection method to detect the target nucleic acid amplified by the method of nucleic acid amplification in the detection method of the present invention, a method of detecting the reaction product of a certain size, for example, by electrophoresis, by hybridization with a probe it can be used such as detection. さらに、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用できる。 Further, detection methods that combine magnetic beads or the like can be suitably used. 上記電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。 The detection by the electrophoresis is usually a fluorescent substance such as ethidium bromide is used, it may be combined hybridization with the probe. また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。 The probe may be labeled with radioisotopes, which were subjected to non-radioactive labels such as biotin or a fluorescent substance. この他、上記(b)工程において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも可能である。 In addition, by using a labeled nucleotide in the step (b), the amplification product by incorporating labeled nucleotides can perform enhancement of the detection signal using that or the label to facilitate detection, the further fluorescence polarization, it is possible to perform detection using fluorescence energy transfer, or the like. さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。 Further, by constructing an appropriate detection system, it is possible to perform it automatically detecting a target nucleic acid and, or the quantification of the target nucleic acid. また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。 Further, the naked eye detection method by hybrid chromatography method can be preferably used.
消光状態になるような距離で配置された2種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド(RNA)プローブあるいはリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発明の検出方法に使用することができる。 Detection method of any of the configured chimeric oligonucleotide probe in two or more fluorescent substances labeled ribonucleotides (RNA) probe or ribonucleotides and deoxyribonucleotides arranged at a distance such that the quenching state present invention it can be used for. 当該プローブは蛍光を発することはないが、これに相補的な標的核酸由来の増幅DNAにアニーリングした場合、RNaseHは該プローブを分解する。 The probe does not fluoresce, when annealed to amplify DNA from a target nucleic acid that is complementary to, RNase H degrades the probe. この結果、プローブ上の蛍光物質間の距離が増大して蛍光が発せられるようになり、標的核酸の存在を知ることができる。 This results in the fluorescence is emitted distance between the fluorescent substances on the probe then increases, it is possible to know the presence of the target nucleic acid. RNaseHを使用して本発明の核酸の増幅方法が実施された場合には、その反応液中に上記のプローブを添加するだけで標的核酸を検出することができる。 If the method for amplifying a nucleic acid of the present invention using RNaseH is performed, it is possible to detect the target nucleic acid by that by adding the probe to the reaction solution. 当該プローブの標識に使用される蛍光物質としては、例えば、6−FAM(6−carboxyfluorescein)とTAMRA(N,N,N',N'−tetramethyl−6−carboxyrhodamine)との組み合わせが好適に使用できる。 As the fluorescent substance used for labeling the probe, for example, 6-FAM (6-carboxyfluorescein) and TAMRA (N, N, N ', N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine) a combination of a can be preferably used .
本発明の検出方法において等温下における増幅方法を用いる場合には、サーマルサイクラーのような装置を必要としない。 When using an amplification method in the isothermal under in the detection method of the present invention does not require a device such as a thermal cycler. また本発明の増幅方法では、使用するプライマーを1種類もしくは2種類と従来法よりも少なくすることができる。 In the amplification method of the present invention can be less than one or two kinds of the conventional method primers used. dNTPのような試薬もPCR等で用いられるものを流用できるため、ランニングコストを従来法よりも低くすることができる。 Because they use those reagents such as dNTP used for PCR and the like can be made lower than the conventional method the running cost. そのため、ルーチンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。 Therefore, it can be suitably used in the field of genetic testing in which the detection is routinely conducted. さらに、本発明の方法はPCR法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用することができる。 Furthermore, the method of the present invention since the resulting numerous amplification product in a shorter time than the PCR method, simple, quick, can be utilized as a highly sensitive gene detection method.
本発明の検出方法を用いる場合には、大量の検体を解析するために反応系を微量化し、さらに集積度を高める手段を組み合わせてもよい。 When using the detection method of the present invention, the reaction system was trace of to analyze a large number of analytes may be combined with means for enhancing further integration. その手段の一つとして、最先端の超微細加工技術を駆使して、本発明の検出方法の基本プロセス、例えば、DNAの細胞からの抽出、核酸増幅反応、目的DNAの検出等のプロセスを数cm角〜指先大のマイクロチップ上に集積化したものを組み合わせてもよい。 As one of the means, by making full use of state-of-the-art microfabrication techniques, the basic process of the detection method of the present invention, for example, the number extracted from DNA of cell, the nucleic acid amplification reaction, the process of detection of target DNA to cm square to a fingertip-sized microchip on may be combined those integrated. さらに、必要に応じてゲル或いはキャピラリー電気泳動、検出用プローブとのハイブリダイゼーションのプロセスを組み合わせてもよい。 Further, gel or capillary electrophoresis may be optionally combined hybridization process between the detection probe. 該システムは、マイクロチップ、マイクロCE(capillary electophoresis)チップあるいはナノチップとも呼ばれている。 The system, microchip, also called micro-CE (capillary electophoresis) chip or nanotip.
このようなシステムにおける核酸増幅反応としては目的のDNA断片が増幅されるものであればいずれの核酸増幅反応も利用することができる。 Such as the nucleic acid amplification reaction in a system can be utilized any of the nucleic acid amplification reaction as long as the DNA fragment of interest is amplified. 特に限定はされないが例えば、ICAN法のような等温条件下で核酸を増幅できる方法が好適に使用できる。 Is not particularly limited for example, a method capable of amplifying the nucleic acids under isothermal conditions such as ICAN method can be preferably used. 該方法を組み合わせることにより、当該システムの単純化が可能となり、上記のような集積化されたシステムでの利用に非常に好適である。 By combining the method enables simplification of the system is very suitable for use in the above-described integrated systems. さらに、本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。 Furthermore, it is possible to construct a system of a higher integration density by utilizing the technique of the present invention.
本発明の検出方法においては、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号13〜16でそれぞれ表される塩基配列を有する結核菌群検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、配列表の配列番号28〜29でそれぞれ表される塩基配列を有するリン菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、配列表の配列番号23〜26でそれぞれ表される塩基配列を有するクラミジア検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、配列表の配列番号30〜31でそれぞれ表される核酸配列を有するHCV検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーが好適に使用できる。 In the detection method of the present invention is not particularly limited example, chimeric oligonucleotide primers for Mycobacterium tuberculosis detection having the nucleotide sequence represented in SEQ ID NOs: 13-16 in the Sequence Listing, of the sequence listing SEQ ID NO: 28-29 in phosphorus bacteria detection chimeric oligonucleotide primer, a chimeric oligonucleotide primer for Chlamydia detection having the nucleotide sequence represented in SEQ ID NOs: 23-26 in the sequence listing, SEQ ID NO: 30 in the sequence listing having the nucleotide sequence represented respectively chimeric oligonucleotide primer for HCV detection with nucleic acid sequence represented respectively 31 can be suitably used. 上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いて試料中の標的核酸を増幅し、電気泳動あるいはリアルタイム検出により目的の増幅産物を確認することができる。 Using the chimeric oligonucleotide primer to amplify a target nucleic acid in a sample, it is possible to confirm amplification product of interest by electrophoresis or real-time detection.
さらに本発明の検出方法においては、配列表の配列番号11、12、38〜40でそれぞれ表される塩基配列を含有する領域から選択される結核菌群検出用プローブ、配列表の配列番号27で表される塩基配列を含有する領域から選択されるリン菌検出用プローブ、配列表の配列番号22、44でそれぞれ表される塩基配列を含有する領域から選択されるクラミジア検出用プローブ、配列表の配列番号43〜45でそれぞれ表される塩基配列を含有する領域から選択されるHCV検出用プローブを用いて標的核酸を検出することができる。 In still detection method of the present invention, the sequence listing SEQ ID NO 11,12,38~40 in Mycobacterium tuberculosis detection probes selected from region containing the base sequence represented respectively by SEQ ID NO: 27 in the Sequence Listing phosphorus bacteria detection probes selected from region containing the base sequence represented, Chlamydia detection probes selected from region containing the base sequence represented in SEQ ID NOs: 22 and 44 in the sequence Listing, of the sequence listing it is possible to detect the target nucleic acid with HCV detection probes selected from region containing the base sequence represented in SEQ ID NOs: 43-45.
本発明の方法において等温核酸増幅方法を用いる場合、必要な反応装置としては恒温層があればよく、サーマルサイクラーのような厳密な装置は必要ない。 If in the process of the present invention using an isothermal nucleic acid amplification method, as required reactor may be any thermostat, exact device is not required, such as a thermal cycler. また、標識シグナルを測定する装置としては、市販の分光光度計、蛍光検出器、プレートリーダー等を使用することができる。 Further, as an apparatus for measuring the label signal, it can be used commercially available spectrophotometer, fluorescence detector, a plate reader, and the like. 従って、通常の検査業務を行っている所で、大量迅速検体測定が可能である。 Therefore, where is doing a regular inspection business, it is possible to mass-rapid analyte measurement. さらに、本発明の方法に必要な試薬も市販されている。 Furthermore, reagents are also commercially available necessary for the method of the present invention.
本発明の方法を用いてHCVの検出を行う場合、検体から常法によって抽出されたHCVのRNA、逆転写反応用プライマー、逆転写酵素(逆転写活性を有するDNAポリメラーゼを使用する場合は逆転写酵素は必要ない)、dATP、dGTP、dCTP、dTTPを含むdNTP混合溶液を調製し、一定温度でHCV−RNAから生成したcDNAを鋳型として、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマー及びICAN用DNAポリメラーゼで標的核酸を増幅させ、これに上記蛍光標識プローブとホモジニアス系でハイブリダイゼーションさせその蛍光強度を測定する。 If using the method of the present invention to detect the HCV, when using RNA of HCV extracted by a conventional method from a specimen, a primer for reverse transcription reaction, a DNA polymerase having a reverse transcriptase (reverse transcriptase activity Reverse transcription enzyme is not required), dATP, dGTP, dCTP, and dNTP mix solution was prepared containing dTTP, cDNA as a template generated from HCV-RNA at a constant temperature, the target nucleic acid in the chimeric oligonucleotide primer and ICAN for DNA polymerase amplified, this is hybridized with the fluorescent-labeled probe and homogeneous system for measuring the fluorescence intensity. 反応の具体的な条件は下記実施例に詳述されている。 Specific conditions for the reaction are described in detail in the following examples.
反応では、まず、HCV−RNAを鋳型としてcDNAが合成され、ついで、このcDNAを鋳型としてICAN法によりDNAの増幅がおこる。 In the reaction, first, cDNA is synthesized HCV-RNA as a template and then amplification of the DNA takes place by ICAN method of this cDNA as a template. 増幅DNAは、上記蛍光プローブと相補的な領域を含んでいるので、蛍光プローブは一本鎖状態の増幅DNAにハイブリダイズする。 Amplified DNA is because it contains a region complementary with the fluorescent probe, fluorescence probe hybridizes to the amplified DNA single-stranded state. 蛍光プローブがハイブリダイズすることによって、蛍光強度の抑制が解除され蛍光強度が増加する。 By fluorescence probe hybridizes, suppression of fluorescence intensity is released fluorescence intensity increases. 一方、試料中にHCVのRNAが存在しない場合はハイブリダイゼーションがおこらず、蛍光強度は抑制されたままで蛍光強度は弱い。 On the other hand, hybridization not occur if the HCV RNA is not present in the sample, the fluorescence intensity is the fluorescence intensity is weak while suppressed. このため、蛍光強度を測定することにより簡便・迅速・高感度に試料中のHCVのRNAを検出することができる。 Therefore, it is possible to detect the HCV of RNA in a sample conveniently, rapidly and high sensitivity by measuring the fluorescence intensity.
本発明の方法では、ホモジニアス系で洗浄工程無しにHCVのRNAを蛍光強度として測定する。 In the method of the present invention, to measure the HCV of RNA as a fluorescence intensity without washing with homogeneous system process. 本発明は蛍光色素を変え、測定波長を変化させることで多項目同時測定にも対応可能な点でも有利である。 The present invention changes the fluorescent dye, in multi-item simultaneous measurement by changing the measurement wavelength is also advantageous adaptable. すなわち、血液センターではHCVのみでなくHBV、HIV、HTLVも重要な検査項目であり、各々に特異的なICAN用のプライマーとプローブを用意し各プローブを測定波長の異なる蛍光色素で標識することで上記項目を同時に測定することが可能である。 That is, in the blood centers is HBV, HIV, HTLV also important test items not only HCV, by labeling with fluorescent dyes having different measurement wavelengths each probe prepared primers and probes for specific ICAN each it is possible to measure the items simultaneously. また、反応のエンドポイントでの蛍光強度を測定することで定性測定として血液センターなど多量検体の高感度測定が可能となり、一方、反応をキネティックに蛍光測定することで定量測定として治療のモニタリング用としての定量測定も可能である。 Further, it is possible to highly sensitive measurement of a large amount specimen such as blood centers as qualitative measurement by measuring the fluorescence intensity at the endpoint of the reaction, whereas, for the treatment of monitoring as a quantitative measurement by reacting fluorescence measurement Kinetic the quantitative measurement of it is also possible. 従って、本発明の方法によれば、従来のRT−PCR法のように温度を上げ下げする複雑で特殊な機器が不要であり、限られた時間、設備内で大量に検体を測定できない不便さも改良され、洗浄工程が不要であり、非常に便利である。 Therefore, according to the method of the present invention, a complex and specialized equipment for raising and lowering the temperature as in the conventional RT-PCR method is not required, limited time, even inconvenience can not be mass-measuring an analyte in capital improvements is, the cleaning process is not required, it is very convenient.
(3)本発明のプライマー本発明の検出方法に用いられるプライマーとしては、キメラオリゴヌクレオチドプライマーが例示される。 (3) A primer used in the detection method of the primers present invention of the present invention, the chimeric oligonucleotide primer can be exemplified. 該プライマーは、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、非修飾あるいは修飾リボヌクレオチドから構成され、リボヌクレオチドがその3'末端又は3'末端側に配置されたものが使用される。 The primers, deoxyribonucleotides, nucleotide analogs, consists unmodified or modified ribonucleotides, which ribonucleotide is positioned at its 3 'terminus or 3' terminus is used. 例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドがICAN法のプライマーとして使用することができる。 For example, it is possible oligonucleotides having a structure represented by the following general formula are used as primers ICAN method.
一般式:5'−dNa−Nb−dNc−3' The general formula: 5'-dNa-Nb-dNc-3 '
(a:11以上の整数、b:1以上の整数、c:0または1以上の整数、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよい) (A: 11 or more integer, b: an integer of 1 or more, c: 0 or an integer of 1 or more, dN: deoxyribonucleotide and / or nucleotide analogs, N: unmodified ribonucleotide and / or modified ribonucleotide, Incidentally, dNa some sites dN may be substituted by N)
なお、上記のヌクレオチドアナログとしては、例えば、デオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチドあるいは修飾されたデオキシリボヌクレオチド等、また修飾リボヌクレオチドとしては、例えば、(α−S)リボヌクレオチドを、それぞれ使用することができる。 As the nucleotide analogs of the above, for example, deoxyribonucleotides inosine nucleotides, deoxyribonucleotides uracil nucleotide or a modified deoxyribonucleotide or the like, and as modified ribonucleotide, for example, can be used respectively (alpha-S) ribonucleotide, .
当該プライマーは、鋳型上の増幅が望まれる領域の5'側、3'側の塩基配列をもとに、5'側の塩基配列に相同な配列を有するもの、3'側の塩基配列に相補的なものの2種を作成し、増幅に使用される。 The primer is 5 ', 3' of the region amplified on the template is desired based on the nucleotide sequence of the side, 'having a sequence homologous to the base sequence of the side 3' 5 complementary to the nucleotide sequence of the side specific but creates the two, are used for amplification.
本発明においては、例えば、結核菌群を検出しようとする試料について上記方法による核酸増幅反応を実施したうえ、増幅物と本発明のプローブとの間でのハイブリダイゼーションを実施して結核菌群を検出することができる。 In the present invention, for example, after carrying out the nucleic acid amplification reaction on a sample to be detected with Mycobacterium tuberculosis according to the above method, the amplification product and hybridized implemented Mycobacterium tuberculosis between the probe of the present invention it is possible to detect. 核酸増幅のためのプライマーは、配列表の配列番号12に示した結核菌群IS6110遺伝子の塩基配列を参考に、各種の核酸増幅方法での使用に適したものを設計し、作製することができる。 Primers for nucleic acid amplification, in reference to the nucleotide sequence of the Mycobacterium tuberculosis IS6110 gene shown in SEQ ID NO: 12, was designed to be suitable for use in a variety of nucleic acid amplification method, it can be produced . 特に限定はされないが、例えばIS6110遺伝子中の配列表の配列番号39に示される塩基配列あるいはその一部を含む領域、好ましくは配列表の配列番号40に示される塩基配列あるいはその一部を含む領域、さらに好ましくは配列表の配列番号38に示される塩基配列あるいはその一部を含む領域を増幅できるものが本発明に好適である。 It is not particularly limited, for example, a region containing a nucleotide sequence or a portion thereof shown in SEQ ID NO: 39 in the sequence listing in the IS6110 gene, region preferably comprising the nucleotide sequence or a portion thereof shown in SEQ ID NO: 40 in the Sequence Listing , even more preferably suitable for the present invention which can amplify a region comprising the nucleotide sequence or a portion thereof shown in SEQ ID NO: 38 in the sequence listing. さらに、配列表の配列番号11記載の塩基配列を含む領域を増幅できるものが好ましい。 Furthermore, it can amplify a region comprising SEQ ID NO: 11 nucleotide sequence described in the Sequence Listing are preferred.
さらに本発明のプライマーにおいては、従来報告されている結核菌群IS6110塩基配列の多型をGenBank遺伝子データベースから解析し、結核菌群のIS6110と相同性を有する類縁配列も精査することにより、特に好ましくは、配列表の配列番号36、37でそれぞれ示される塩基配列を有する核酸増幅用プライマーを使用した場合に、高感度かつ定量性の核酸増幅を実施することができる。 In yet primers of the present invention, by analyzing the polymorphism of a conventional a reported tuberculosis IS6110 nucleotide sequence from GenBank gene database, reviewing also analogous sequences with IS6110 and homology tuberculosis, particularly preferably , when using the nucleic acid amplification primer having a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 36 and 37 in the sequence listing can be performed nucleic acid amplification of sensitive and quantitative properties. 従って、当該プライマーは各種の核酸増幅法による結核菌群IS6110遺伝子もしくはその断片の増幅に有用である。 Therefore, the primers are useful for amplifying Mycobacterium tuberculosis IS6110 gene or fragment thereof according to various nucleic acid amplification methods.
本発明においては、上記結核菌群の検出と同様に、リン菌、クラミジア、HCVを検出するためのプローブ、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより好適に検出することができる。 In the present invention, similarly to the detection of the Mycobacterium tuberculosis, it can be suitably detected by using probes for detecting phosphorus bacteria, chlamydia, an HCV, the chimeric oligonucleotide primer.
当該プライマーは上記の塩基配列に限定されるものではなく、当該塩基配列周辺、すなわち当該配列にその一部が重複した配列を有するものが本発明に好適に使用できる。 The primer is not limited to the above nucleotide sequence, the nucleotide sequence surrounding, i.e. those having a sequence portion thereof to the sequence is duplicated can be suitably used for the present invention. すなわち、使用する核酸増幅方法の特徴に応じて当該配列に重複する適切な塩基配列を選択し、プライマーを作成することができる。 In other words, select the appropriate nucleotide sequence overlapping the sequence according to the characteristics of the nucleic acid amplification method used can create primer.
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社(ABI社、Applied Biosystems Inc.)のDNAシンセサイザー394型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。 These chimeric oligonucleotide primer, to have any nucleic acid sequence, for example, Applied Biosystems (ABI, Inc., Applied Biosystems Inc.) using a DNA synthesizer 394 type can be synthesized by phosphoamidite method. また、別法としてリン酸トリエステル法、H−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。 Further, phosphoric acid triester method Alternatively, H- phosphonate method, a thiophosphonate method, or may be synthesized by any method.
ICAN法により核酸増幅を行うためのプライマーとしては、当該方法に使用できるようにプライマーの3'末端部分のデオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに置換すればよい。 The primers for performing nucleic acid amplification by ICAN method, a deoxyribonucleotide at the 3 'terminal portion of the primer may be substituted ribonucleotides for use in the method. このようなプライマーの一例として、配列表の配列番号13〜16、23〜26、28〜31にそれぞれ塩基配列を示すキメラオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。 An example of such a primer, like chimeric oligonucleotide primer indicating each nucleotide sequence in SEQ ID NO: 13~16,23~26,28~31 in the sequence list.
さらに、これらのプライマーは適切な物質、例えば蛍光物質、色素、リガンド類(ビオチン、ジゴキシゲニン等)、または金コロイド等で標識されていてもよく、例えば、リガンド類で標識したプライマーを使用することにより、増幅された標的核酸を担体に捕捉させるなど、高感度で簡便な定量性をもった測定方法が提供される。 Additionally, these primers suitable material, such as a fluorescent substance, dye, ligands (biotin, digoxigenin, etc.), or colloidal gold, etc. may be labeled, for example, by using a labeled primer ligands the amplified target nucleic acid such as by capturing the carrier, the measuring method having a simple quantitative sensitive and is provided. この場合、固相としてはマイクロタイタープレート、ビーズ、マグネチックビーズ、メンブラン、またはガラス等が例示される。 In this case, microtiter plates, beads, magnetic beads, membranes or glass or the like, is exemplified as the solid phase.
喀痰検体からの抽出DNA試料中には、ヒトDNAのみならず気道常在細菌ならびにウイルス由来のDNAが含まれる。 The extraction DNA samples from sputum specimens include DNA derived from airway indigenous bacteria and viruses not only human DNA. 従って、本発明で開発されたプライマーの特異性を調べるため、結核菌の感染病歴のないボランティアからの喀痰を検体として結核菌群遺伝子の増幅を試みた。 Therefore, in order to examine the specificity of primers developed in the present invention, attempted amplification of Mycobacterium tuberculosis gene sputum from volunteers with no infection history of tuberculosis as a specimen. このような試験で陽性結果がでないことが本プライマーの特異性の証明となりうる。 Such positive results in the test that does not appear can be a proof of the specificity of the primer. 38名のボランティアから採取された喀痰からの抽出DNAに対し、上記のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いたICAN法によるIS6110遺伝子断片の増幅を行った。 To extract DNA from a sputum collected from 38 volunteers, it was amplified IS6110 gene fragment by ICAN method using the chimeric oligonucleotide primer. その結果、腸性結果は1例も認められず上記のプライマーの結核菌への特異性の高さが実証され、非IS6110標的DNAを偽陽性にしないことが示された。 As a result, the intestine of the results demonstrated that the specificity of the high as to Mycobacterium tuberculosis of the primers was not observed one case, a non-IS6110 target DNA was shown not to false positives.
(4)本発明の組成物本発明は、前述(2)の本発明の検出方法に使用される組成物を提供する。 (4) Compositions of the Invention The present invention provides a composition for use in the detection method of the present invention described above (2). 該組成物としては、例えば、上記(1)に記載のプローブならびに上記(3)に記載のプライマーを含有するものが挙げられる。 As the composition, for example, those containing a primer according to the probe and the above (3) according to the above (1). あるいは、上記プローブを含む検出用組成物及び上記プライマーを含む増幅用組成物の形態であってもよい。 Alternatively, it may be in the form of amplification composition comprising a sensing composition and the primer containing the probe. さらに、酢酸マグネシウムを含む組成物及びプライマーを含む組成物の形態であってもよい。 Furthermore, it may be in the form of a composition comprising a composition and a primer containing magnesium acetate. さらに、緩衝成分やdNTP等を含んでいてもよい。 May further include a buffer component and dNTP like. さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド3リン酸のアナログを含有していてもよい。 Furthermore, it may contain an analog of a modified deoxyribonucleotide or deoxynucleotide triphosphates. さらに、本発明の組成物中の試薬の分解・失活等による非増幅状況(偽陰性)確認のための内部標準(IC;internal control)を含有していてもよい。 Further, non-amplification conditions by decomposition and deactivation, etc. reagents in the composition of the present invention (false negative) internal standard for confirmation; may contain (IC internal Control). 当該内部標準は、本発明のプライマーにより増幅することができる。 The internal standard can be amplified by the primers of the present invention.
また別の態様としては、本発明の検出方法に適した組成で上記の各種成分が含有された組成物を挙げることができ、該組成物は適切な鋳型とキメラオリゴヌクレオチドプライマーを添加するのみで増幅反応を実施することができる。 As another embodiment, the various components in the composition suitable for the detection method of the present invention can be exemplified composition contained, the composition only by addition of an appropriate mold and chimeric oligonucleotide primer it can be carried out amplification reactions. さらに、増幅対象があらかじめ明らかである場合には、当該増幅対象の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する組成物が好適である。 Further, when the amplification target is a previously clear, compositions containing a chimeric oligonucleotide primer suitable for amplification of the amplified are preferred.
特に好適な態様としては、本発明の核酸増幅方法に適した組成で上記の各種成分が含有された組成物を挙げることができ、該組成物は適切な鋳型を添加するのみで増幅反応を実施することができる。 Particularly suitable embodiment, the various components in the composition that is suitable for nucleic acid amplification method of the present invention can be exemplified composition contained, carried out only in the amplification reaction composition is added a suitable mold can do. さらに、検出用プローブを含んでいる場合には、リアルタイムで病原微生物由来の標的核酸を検出することができる。 Furthermore, if it contains a detection probe can detect the target nucleic acid from a pathogenic microorganism in real time.
特に限定されないが例えば、HCVの検出において本発明の方法、該方法のための組成物あるいはキットを用いることにより、従来のアンプリコアHCVキットが2オーダーの測定範囲にあったのに比較して3オーダーまで測定範囲を広げることができる。 But are not limited to for example, the method of the present invention in the detection of HCV, by using the composition or kit for the method, three orders compared to conventional Amplicor HCV kit was in the measurement range of two orders it can be expanded measurement range up. また、従来のアンプリコアHCVキットでは、所用時間が約5時間であったのに比較して、本発明では約45分間と大幅に所用時間を短縮することができる。 Further, in the conventional Amplicor HCV kit, as compared to that required time was about 5 hours, the present invention can be shortened for about 45 minutes and considerably time required. 従って、これまでよりも1日に処理できる検体数を増大させることが可能である。 Therefore, it is possible to increase the number of samples that can be processed in a day than ever before.
(5)本発明のキット本発明のキットは、病原微生物由来の標的核酸の検出のためのキットであり、特に限定はされないが、pH7を越えるアルカリ条件下で標的核酸とハイブリダイズ可能なプローブ、特に限定はされないが例えば、上記(1)記載のプローブを含有することを特徴とする。 (5) Kit Kit invention of the present invention is a kit for the detection of target nucleic acid from a pathogenic microorganism is not particularly limited, a target nucleic acid capable of hybridizing probe under alkaline conditions exceeding pH 7, is not particularly limited for example, characterized in that it contains a probe as described in (1) above.
また、本発明のキットの一態様としては、結核菌群の検出のためのキットが挙げられる。 Further, as an embodiment of the kit of the present invention include a kit for the detection of Mycobacterium tuberculosis. 該キットは、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacteium bovisBCG、Mycobacterium africanum、Mycobacterium microti及び/又はMycobacterium canettiを特異的に検出可能なプローブを含有することを特徴とする。 The kit, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacteium bovisBCG, Mycobacterium africanum, characterized by containing a specific detectable probe Mycobacterium microti and / or Mycobacterium Canetti. 当該キットは、pH7を越えるアルカリ条件下で結核菌群の検出に用いることもできる。 The kit can also be used to detect Mycobacterium tuberculosis in alkaline conditions in excess of pH 7.
また、本発明のキットの一態様としては、リン菌の検出のためのキットが挙げられる。 Further, as an embodiment of the kit of the present invention include a kit for the detection of phosphorus bacteria. 該キットは、Neisseria gonorrhoeaeを特異的に検出可能なプローブを含有することを特徴とする。 The kit is characterized by containing a specific detectable probe Neisseria gonorrhoeae. 当該キットは、pH7を越えるアルカリ条件下でリン菌の検出に用いることもできる。 The kit can also be used to detect phosphorus bacteria under alkaline conditions in excess of pH 7.
また、本発明のキットの一態様としては、クラミジアの検出のためのキットが挙げられる。 Further, as an embodiment of the kit of the present invention include a kit for the detection of Chlamydia. 該キットは、Chlamydia trachomatisを特異的に検出可能なプローブを含有することを特徴とする。 The kit is characterized by containing a specific detectable probe Chlamydia trachomatis. 当該キットは、pH7を越えるアルカリ条件下でクラミジアの検出に用いることもできる。 The kit can also be used to detect chlamydia under alkaline conditions in excess of pH 7.
また、本発明のキットの一態様としては、HCVの検出のためのキットが挙げられる。 Further, as an embodiment of the kit of the present invention include a kit for the detection of HCV. 該キットは、HCVを特異的に検出可能なプローブを含有することを特徴とする。 The kit is characterized by containing a specific detectable probe HCV. 当該キットは、pH7を越えるアルカリ条件下でHCVの検出に用いることもできる。 The kit can also be used to detect HCV in alkaline conditions in excess of pH 7.
さらに上記キットにおいては、別の実施態様としてプライマーを含有してもよい。 In addition the kit may contain a primer as a separate embodiment. さらに、標的遺伝子を増幅する核酸増幅法のための試薬(DNAポリメラーゼ等)、プローブの検出反応に使用される試薬、検体からの核酸の抽出に使用される試薬等を含むキットであってもよい。 Further, reagents for nucleic acid amplification method for amplifying a target gene (DNA polymerase, etc.), reagents used in the detection reaction of the probe, may be a kit containing reagents, etc. used for extraction of nucleic acids from the sample . 該キットは、本発明の結核菌群等の検出方法を簡便、かつ迅速に実施するうえで好適である。 The kit is suitable method for detecting Mycobacterium tuberculosis or the like of the present invention conveniently, and in order to quickly implement. 当該キットは、特に多数の試料について結核菌群等の存在を調べる際に、高い再現性、信頼性で検査結果を与えることができる。 The kit when determining the presence of Mycobacterium tuberculosis or the like in particular a large number of samples, high reproducibility, can give test results in reliability. さらに、偽陰性確認のための内部標準(IC;internal control)、該内部標準検出用のプローブを含有していてもよい。 Furthermore, an internal standard for false negative confirmation (IC; internal control), may contain probes for internal standard detection. 当該内部標準は、本発明のプライマーにより増幅することができる。 The internal standard can be amplified by the primers of the present invention.
さらに1つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、本発明のプローブ、プライマー、DNAポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼの使用のための指示書を含むことを特徴とする。 In yet one embodiment, the kit in packaged form, the probe of the present invention, a primer, characterized in that it comprises instructions for use of a DNA polymerase and endonuclease. さらに、市販のDNAポリメラーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼを指示書に従って選択し、使用してもよい。 Furthermore, selected according to the instructions of the commercially available DNA polymerases and / or endonucleases, it may be used. さらに、RNAを鋳型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。 May further include a reverse transcription reaction reagent in the case of an RNA as a template. DNAポリメラーゼは、上記のDNAポリメラーゼから選択することができる。 DNA polymerase can be selected from the above DNA polymerase. また、エンドヌクレアーゼは、Pfu由来RNaseHIIあるいはAfu由来RNaseHIIのいずれかから選択することができる。 Furthermore, the endonuclease may be selected from any of the Pfu-derived RNase HII or Afu-derived RNase HII.
上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば鎖置換反応用試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。 The above "instruction", the use of the kit, e.g., method of preparing a strand displacement reaction reagent solution, a printed matter that describes the reaction conditions and the like recommended, other brochure or leaflet form of manual, kit including those described in the package such that the attached label, the kit is paid to. さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。 Furthermore, through the electronic media such as the Internet, disclosure, also includes information provided.
また、本発明のキットにおいては、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びアニーリング溶液が含まれていてもよい。 In the kit of the present invention, bicine, tricine, Hepes, reaction buffer containing phosphate or Tris buffer components, and it may include an annealing solution. また、DNAポリメラーゼやRNaseHが含まれていてもよい。 In addition, it may be included DNA polymerase and RNaseH. さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド3リン酸のアナログを含有していてもよい。 Furthermore, it may contain an analog of a modified deoxyribonucleotide or deoxynucleotide triphosphates.
本発明のキットにおいて、検出用プローブを適宜選択することにより、リアルタイムで病原微生物由来の標的核酸を検出することができるキットが提供される。 In the kit of the present invention, by selecting a detection probe appropriately, kits that can detect a target nucleic acid from a pathogenic microorganism in real time it is provided.
(6)本発明の核酸抽出方法本発明は、高感度に結核菌等を検出するための核酸抽出方法を提供する。 (6) a nucleic acid extraction method of the Invention The present invention provides a nucleic acid extraction method for detecting Mycobacterium tuberculosis or the like with high sensitivity. すなわち、臨床標本からの核酸抽出は、デリケートで困難な工程であり、尿、胸水、髄液、血液などの液体検体から、膿、喀痰などのような濃厚粘性検体、さらには細胞、組織といったものまでその対象は幅広い。 That is, nucleic acid extraction from clinical specimen is a delicate and difficult process, as urine, pleural fluid, cerebrospinal fluid, from fluid sample such as blood, pus, thick viscous specimen such as sputum, more cells, tissue such as its subject is a wide range of up to. 現在、これら検体から結核菌等の遺伝子を抽出するスタンダードな方法は存在せず、従って現在まで報告された結核菌等の遺伝子検査における報告では、様々な核酸抽出方法が用いられている。 Currently, standard methods for extracting genes such as Mycobacterium tuberculosis from these specimens are not present, therefore the report in genetic testing of Mycobacterium tuberculosis such as reported to date, have been used a variety of nucleic acid extraction methods. これら従来法では各種界面活性剤、アルカリ、有機溶媒、またはカオトロピック試薬を含む試薬中で混合したり、ガラスビーズ存在下で超音波処理をすることで実施されていた。 Various surfactants in these conventional methods, an alkali, or mixed with a reagent containing an organic solvent or chaotropic reagents, were carried out by sonication in the presence of glass beads.
本発明者らは上記の各種の従来法と、これまでListeria属、Lactobacillus属ならびにStreptococcus属からの核酸抽出に用いられていたムラミダーゼ(muramidase、放線菌Streptomyces globisporus由来のものが、ムタノリシン(mutanolysin)としてシグマ社より発売)を結核菌に使用する方法を比較し、結核菌をムラミダーゼ消化する方法が最も優れていることを発見した。 The present inventors and the prior art method described above in various, Listeria spp far, muramidase that has been used for nucleic acid extraction from Lactobacillus genus and the genus Streptococcus (Muramidase, those derived from actinomycetes Streptomyces globisporus, as mutanolysin (mutanolysin) released from sigma) comparing the method used in Mycobacterium tuberculosis, and found that the method of muramidase digested M. tuberculosis is most excellent. また、該酵素で消化した菌体を5分間煮沸処理することでさらに優れた結果が得られることを発見した。 Also discovered that superior results by boiling treatment the cells were digested by the enzyme for 5 minutes to obtain.
結核菌を含有する試料をムラミダーゼで30分処理し、次いで96℃、5分間の処理を行った後にICAN法で遺伝子を増幅し結核菌の検出を試みた。 Samples containing M. tuberculosis for 30 minutes at muramidase, then 96 ° C., to amplify the gene in ICAN method after the treatment of 5 minutes was attempted detection of Mycobacterium tuberculosis. この結果、驚くべきことに、従来の界面活性剤などの試薬を用いた場合に比べ10倍高い感度で結核菌DNAを検出することができ、これは結核菌5ゲノムコピーに相当する検出感度であることが解った。 As a result, surprisingly, in 10-fold higher sensitivity compared with the case of using a reagent such as conventional surfactants can detect M. tuberculosis DNA, which is a detection sensitivity corresponding to the M. tuberculosis 5 genomic copies it was found that there is.
上記の一連の検出操作は、従来の界面活性剤やカオトロピック試薬を用いた方法において核酸抽出液中に混入する成分の核酸増幅反応への阻害効果を排除することができる。 Series of detection operation described above can be eliminated the inhibitory effect of the method using a conventional surfactant or chaotropic agents into the nucleic acid amplification reaction of components to be mixed in the nucleic acid extracts. さらに、加熱処理を加えることで結核菌等に対する殺菌効果も生まれ、従来検査員を悩ませていた検査室での結核菌等の感染を予防できる効果も生まれるというメリットを持つ。 Further, sterilization effect born against Mycobacterium tuberculosis such as by adding a heat treatment, also has the advantage that born infection the possible preventive effect of Mycobacterium tuberculosis or the like in the conventional inspector laboratory which had plagued. 従って、本プロトコールの発明は、迅速に、安全に、かつ高感度に結核菌等のDNAを抽出することができる。 Accordingly, the invention of this protocol, quickly, can be safely and to extract the DNA, such as Mycobacterium tuberculosis in a high sensitivity.
例えば試料として、喀痰を使用する場合には、まず公知の喀痰処理方法であるNALC(N−acetyl−L−cysteine)−NaOH法で喀痰を処理した後、上記の本発明の核酸抽出方法を実施することが好適である。 As example a sample, when using sputum, first after processing the sputum with a known sputum processing methods NALC (N-acetyl-L-cysteine) -NaOH method, performing nucleic acid extraction method of the present invention it is preferable to. すなわち、本発明の検出方法において、結核菌等を含有する検体をムラミダーゼで処理し、核酸を抽出する工程を包含していてもよい。 That is, in the detection method of the present invention, a specimen containing the Mycobacterium tuberculosis or the like treated with muramidase, may include the step of extracting the nucleic acids.
上記の本発明の検出方法に使用される全てのプロトコール、すなわちプローブ、プライマー、核酸の抽出法、核酸増幅法は、極めて迅速で信頼性があり、かつ高感度な結核菌等の検出を可能とする。 All protocols, i.e. probe used in the detection method of the present invention, a primer, extraction of nucleic acids, nucleic acid amplification methods, it is very fast and reliable, and allows the detection of such highly sensitive Mycobacterium tuberculosis and to. 該方法を用いれば、検体の採取から結果報告までを3時間以内に完了することができ、6時間を要した従来のキット(例えばロシュ社製キット)に比べ、検査時間が1/2に短縮された。 Using the method, it is possible to complete up to report results from specimens taken within 3 hours, compared to the conventional kit took 6 hours (e.g. Roche kit), shortening the inspection time to a half It has been. つまり本発明の方法は同日中に検査結果を提供でき、感染患者の一刻も早い隔離を可能とし、公衆衛生上、結核の伝播を早期に予防できるという多大な社会的貢献をもたらす。 That the process of the present invention can provide test results on the same day, to allow the earliest isolation moment of infected patients, public health, resulting in a significant contribution to society that the spread of tuberculosis can be prevented at an early stage.
以下に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。 A more detailed description of the examples the invention are shown below, but the invention is not limited to the scope of the examples. また、本発明に基づき、キャリーオーバーによる増幅産物のコンタミネーションを防ぐ改良や、内部標準物質や他の結核菌等の遺伝子を同時増幅、検出する改良は、いずれも当業者に容易に類推される改良である。 Further, based on the present invention, improvements and to prevent contamination of the amplified product carryover, the internal standard and other genes co-amplification of Mycobacterium tuberculosis such, improvements to be detected, both of which are easily inferred by those skilled in the art it is an improvement.
実施例以下に本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は、下記実施例によって限定されるものではない。 Although specifically described with reference to Examples present invention to following examples, the present invention is not intended to be below embodiment thereof.
参考例1 ピロコッカス フリオサスのRNaseHII遺伝子のクローニング(1)ピロコッカス フリオサス ゲノムDNAの調製トリプトン(ディフコラボラトリーズ社製)1%、酵母エキス(ディフコラボラトリーズ社製)0.5%、可溶性でんぷん(ナカライテスク社製)1%、ジャマリンS・ソリッド(ジャマリンラボラトリー社製)3.5%、ジャマリンS・リキッド(ジャマリンラボラトリー社製)0.5%、MgSO 0.003%、NaCl 0.001%、FeSO ・7H O 0.0001%、CoSO 0.0001%、CaCl ・7H O 0.0001%、ZnSO 0.0001%、CuSO ・5H O 0.1ppm、KAl(SO 0.1ppm、H BO 0.1ppm、Na Reference Example 1 Pyrococcus Cloning of RNaseHII gene furiosus (1) Pyrococcus furiosus genomic DNA prepared tryptone (manufactured by Difco Laboratories) 1% (manufactured by Difco Laboratories) yeast extract 0.5%, soluble starch (Nacalai Tesque Ltd.) 1% Jamarin S · solid (manufactured by Jamarin Laboratory) 3.5% Jamarin S · Liquid (manufactured by Jamarin Laboratory) 0.5%, MgSO 4 0.003% , 0.001% NaCl, FeSO 4 · 7H 2 O 0.0001% , CoSO 4 0.0001%, CaCl 2 · 7H 2 O 0.0001%, ZnSO 4 0.0001%, CuSO 4 · 5H 2 O 0.1ppm, KAl (SO 4 ) 2 0.1ppm, H 3 BO 4 0.1ppm, Na 2 M ・2H O 0.1ppm、NiCl ・6H O 0.25ppmの組成の培地2リットルを2リットル容のメジュウムボトルにいれ、120℃、20分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furiosus、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメンより購入:DSM3638)を接種して、95℃、16時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。 O 4 · 2H 2 O 0.1ppm, put Medium 2 liters of the composition of NiCl 2 · 6H 2 O 0.25ppm to Mejuumubotoru 2 liter, 120 ° C., was sterilized for 20 minutes, bubbled with nitrogen gas, the dissolved oxygen was removed, this Pyrococcus furiosus (Pyrococcus furiosus, purchased from Deutsche Zamurunku von Mikroorganismen: DSM3638) was inoculated, 95 ° C., after 16 hours static culture to obtain bacterial cells by centrifugation .
次に、得られた菌体を4mlの25%ショ糖、50mM Tris−HCl(pH8.0)に懸濁し、0.4mlの10mg/ml塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、20℃で1時間反応させた。 Then, 25% sucrose the obtained cells 4 ml, were suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), was added to 10mg / ml lysozyme chloride (Nacalai Tesque) solution of 0.4 ml, 20 It was allowed to react for 1 hour at ° C.. 反応終了後、この反応液に24mlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mM Tris−HCl(pH8.0)、0.2mlの20mg/mlプロテイナーゼK(宝酒造社製)及び2mlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。 After completion of the reaction, 150 mM NaCl in 24ml to the reaction solution, 1mM EDTA, 20mM Tris-HCl (pH8.0), the 20 mg / ml proteinase K (Takara Shuzo) and 10% aqueous solution of sodium lauryl sulfate 2ml of 0.2ml It was added and incubated for 1 hour at 37 ° C..
反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約1mgのゲノムDNAを調製した。 After completion of the reaction, phenol - chloroform extraction, performed followed by ethanol precipitation, genomic DNA was prepared from about 1 mg.
(2)RNaseHII遺伝子のクローニングピロコッカス ホリコシ(Pyrococcus horikoshii)の全ゲノム配列が公開されており〔DNA リサーチ(DNA Research)、第5巻、第55−76頁(1998)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(PH1650)が1つ存在することが明らかになっている(配列番号1、日本国 独立行政法人製品評価技術基盤機構 ホームページ:http://www.nite.go.jp/)。 (2) whole genome sequence of RNaseHII gene cloning Pyrococcus horikoshii (Pyrococcus horikoshii) have been published [DNA Research (DNA Research), Vol. 5, pp. 55-76 (1998)], encoding the homologue of RNaseHII gene (PH1650) has revealed that there is one (SEQ ID NO: 1, the Japanese National Institute of technology and evaluation website: http: //www.nite.go.jp/).
そこで、このPH1650遺伝子(配列番号1)と一部公開されているピロコッカス フリオサスのゲノム配列(University of Utah,Utah Genome Centerホームページ:http://www.genome.utah.edu/sequence.html)でホモロジー検索をおこなった。 So, this PH1650 gene (SEQ ID NO: 1) and the genomic sequence of Pyrococcus furiosus, which is part of the public (University of Utah, Utah Genome Center home page: http: //www.genome.utah.edu/sequence.html) homology in search was carried out. その結果、非常にホモロジーの高い配列が見つかった。 As a result, it was found very high homology array.
得られた配列もとにプライマー1650Nde(配列番号2)及び1650Bam(配列番号3)を合成した。 Sequences based on the obtained primer 1650Nde (SEQ ID NO: 2) and were synthesized 1650Bam (SEQ ID NO: 3).
上記(1)で得たピロコッカス フリオサス ゲノムDNA 200ngを鋳型にして、20pmolの1650Nde及び20pmolの1650Bamをプライマーに用い、100μlの容量でPCRを行った。 And the Pyrococcus furiosus genomic DNA 200 ng obtained in the above (1) as a template, using 1650Bam of 1650Nde and 20pmol of 20pmol primer, PCR was performed in a volume of 100 [mu] l. PCRでのDNAポリメラーゼはタカラExタック(宝酒造社製)を添付のプロトコールに従って用い、PCRは94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとし、30サイクル行った。 Used as a DNA polymerase for the PCR TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) according to the attached protocol, PCR is 30 seconds at 94 ° C., 30 sec at 55 ° C., and the 1 minute as one cycle at 72 ° C., was carried out 30 cycles. 増幅した約0.7kbのDNA断片をNdeI及びBamHI(ともに宝酒造社製)で消化し、得られたDNA断片をプラスミドベクターpET3a(ノバジェン社製)のNdeI及びBamHI間に組込んだプラスミドpPFU220を作製した。 The amplified DNA fragment of about 0.7kb was digested with NdeI and BamHI (both Takara Shuzo Co., Ltd.), prepare a plasmid pPFU220 incorporating the resulting DNA fragment between NdeI and BamHI of the plasmid vector pET3a (Novagen) did.
(3)RNaseHII遺伝子を含むDNA断片の塩基配列の決定上記(2)で得られたpPFU220の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。 (3) the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment pPFU220 obtained in the said determined base sequence of the DNA fragment (2) including a RNaseHII gene were determined by dideoxy method.
得られた塩基配列の結果を解析したところ、RNaseHIIをコードすると考えられるオープンリーディングフレーム(ORF、open reading frame)が見出された。 Were Analysis of the determined nucleotide sequence, an open reading frame (ORF, open reading frame) presumably encoding RNaseHII were found. このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号4に示す。 The nucleotide sequence of the open reading frame in SEQ ID NO: 4. また、該塩基配列から推定されるRNaseHIIのアミノ酸配列を配列表の配列番号5に示す。 The amino acid sequence of RNaseHII deduced from the nucleotide sequence in SEQ ID NO: 5.
なお、プラスミドpPFU220で形質転換された大腸菌JM109は、Escherichia coli JM109/pPFU220と命名、表示され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター[日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305−8566)]に平成12年9月5日(原寄託日)より受託番号FERM P−18020として寄託され、ブタペスト条約のもと前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成13年7月9日(国際移管日)よりFERM BP−7654として移管されている。 In addition, E. coli JM109 transformed with plasmid pPFU220 is named Escherichia coli JM109 / pPFU220, is displayed, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center [Japan Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Higashi 1-Chome, Central 6 is deposited as accession number FERM P-18020 from (zip code 305-8566)] in 2000 September 5 (original date of deposit), based on the National Institute of Advanced industrial Science and technology, International Patent organism Depositary of the Budapest Treaty It has been transferred to the center, 2001 July 9, from (international transfer date) as FERM BP-7654.
(4)精製RNaseHII標品の調製上記(2)で得られたpPFU220を大腸菌HMS174(DE3)(ノバジェン社製)に形質転換し、得られたpPFU220を含む大腸菌HMS174(DE3)を100μg/mlのアンピシリンを含む2リットルのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。 (4) Purification RNase HII PPFU220 obtained in preparation Preparation (2) was transformed into E. coli HMS174 (DE3) (Novagen), E. coli containing the resulting PPFU220 HMS174 the (DE3) of 100 [mu] g / ml It was inoculated into a 2 liter LB medium containing ampicillin, and 16 hours by shaking culture at 37 ° C.. 培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を66.0mlのソニケーションバッファー〔50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。 After cultivation, sonication buffer 66.0ml the cells collected by centrifugation [50mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA, 2mM phenyl methanesulfonyl fluoride] was suspended in, and subjected to ultrasonic crushing machine . この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を60℃、15分間の熱処理にかけた。 The homogenate was centrifuged for 10 minutes at 12000rpm, and the resulting supernatant 60 ° C., was subjected to a 15 minute heat treatment. その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、61.5mlの熱処理上清液を得た。 It was then centrifuged for 10 minutes again 12000 rpm, the supernatant was collected to obtain a heated supernatant of 61.5 mL.
この熱処理上清液をバッファーA〔50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTA〕で平衡化したRESOURSE Qカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。 The heated supernatant buffer A [50mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA] was subjected to RESOURSE Q column equilibrated with (Amersham Pharmacia Biotech), using FPLC system (Amersham Pharmacia Biotech) It was subjected to chromatography Te. その結果、RNaseHIIはRESOURSE Qカラムを素通りした。 As a result, RNaseHII was passed through the RESOURSE Q column.
素通りしたRNaseHII画分60.0mlをバッファーAで平衡化したRESOURSE Sカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステムを用いて0〜500mM NaCl直線濃度勾配により溶出し、約150mM NaClのところに溶出されたRNaseHII画分を得た。 Subjected to RESOURSE S column equilibrated with RNaseHII fraction 60.0ml that passed through with buffer A (Amersham Pharmacia Biotech), and eluted with a 0-500 mM NaCl linear concentration gradient using FPLC system, at approximately 150 mM NaCl to give eluted with RNaseHII fraction.
このRNaseHII画分2.0mlをセントリコン−10(アミコン社製)を用いた限外ろ過により濃縮し、250μlの濃縮液を100mM NaCl、0.1mM EDTAを含む50mM Tris−HCl(pH8.0)で平衡化したSuperdex200ゲルろ過カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、RNaseHIIは、17キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。 The RNaseHII fraction 2.0ml concentrated by ultrafiltration using Centricon-10 (the Amicon), 100 mM NaCl concentrate in 250 [mu] l, in 50 mM Tris-HCl containing 0.1 mM EDTA (pH 8.0) subjected to Superdex200 gel filtration column equilibrated (Amersham Pharmacia Biotech) results were eluted with the same buffer, RNase HII was eluted at a position corresponding to a molecular weight 17 kilodaltons. この分子量は、RNaseHIIが1量体として存在する場合に相当する。 This molecular weight corresponds to that of RNaseHII is present as a dimer.
こうして溶出されたRNaseHIIをPfuRNaseHII標品とした。 The thus eluted RNaseHII was PfuRNaseHII preparation. 上記で得られたPfuRNaseHII標品を用いて下記の方法によりRNaseH活性を測定した。 It was measured RNaseH activity by the following methods using PfuRNaseHII preparation obtained above.
10mM Tris−HCl(pH8.0)、1mMジチオスレイトール(ナカライテスク社製)、0.003%ウシ血清アルブミン(フラクションV、シグマ社製)、4%グリセロール、20μg/mlポリ(dT)(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)、30μg/mlポリ(rA)(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を混合し、37℃で10分間保温した。 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM dithiothreitol (manufactured by Nacalai Tesque), 0.003% bovine serum albumin (Fraction V, Sigma), 4% glycerol, 20 [mu] g / ml poly (dT) (Amersham manufactured by Pharmacia Biotech) was mixed with 30 [mu] g / ml poly (rA) (Amersham Pharmacia Biotech), and incubated at 37 ° C. 10 min. これをRNaseH活性を測定するための基質液として使用した。 This was used as a substrate solution for measuring the RNaseH activity.
100μlの基質液に1μlの1M MnCl を加えて40℃で保温し、これに上記のPfu RNaseHII標品を適当に希釈したものを加えて反応を開始した。 Adding 1μl of 1M MnCl 2 to the substrate solution 100μl was incubated at 40 ° C., the reaction was initiated by addition of this to those appropriate dilution of the above Pfu RNase HII preparation. 40℃で30分間反応を行った後、10μlの0.5M EDTAを加えて反応を停止し、260nmにおける吸光度を測定した。 After 30 minutes of reaction at 40 ° C., the reaction was stopped by addition of 0.5M EDTA in 10 [mu] l, the absorbance was measured at 260 nm.
その結果、上記のPfu RNaseHII標品を添加した反応液では、先に10μlの0.5M EDTAを加えた後にこれを添加したものに比べて260nmにおける吸光度の値が高かった。 As a result, the reaction solution was added the above Pfu RNase HII preparation, as compared to that which was added to after adding 0.5M EDTA in 10μl above the value of absorbance at 260nm was high. よって、当該標品がRNaseH活性を有することが明らかになった。 Therefore, the preparation was found to have RNaseH activity.
参考例2 Afu RNaseHIIの調製アルカエオグロバス フルギダスのRNaseHII遺伝子のクローニング(1)アルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNAの調製アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンGmbHより購入:DSM4139)8ml相当分の菌体を集め、100μlの25%ショ糖、50mMトリス−HCl(pH8.0)に懸濁し、20μlの0.5M EDTA、10μlの10mg/ml塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、20℃で1時間反応させた。 Reference Example 2 Afu Cloning of RNase HII gene preparation alk eosin Gros bus fulgidus of RNase HII (1) alk eosin Gros bus fulgidus preparation of genomic DNA alk eosin Glo bus fulgidus (Archaeoglobus fulgidus, Deutsche Zamurunku von Mikroorganismen und Zell Kurtz Ren GmbH more purchase: DSM4139) collected 8ml equivalent cells of 25% sucrose 100 [mu] l, were suspended in 50mM tris-HCl (pH 8.0), 20 [mu] l of 0.5M EDTA, 10 [mu] l of 10mg / ml lysozyme chloride (Nacalai added Tesque) solution was reacted at 20 ° C.. 反応終了後、この反応液に800μlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mMトリス−HCl(pH8.0)、10μlの20mg/mlプロテイナーゼK(宝酒造社製)及び50μlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。 After completion of the reaction, 150 mM NaCl in 800μl to the reaction solution, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 [mu] l of 20 mg / ml proteinase K (Takara Shuzo) and 10% aqueous solution of sodium lauryl sulfate 50μl added, It was incubated for 1 hour at 37 ℃. 反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に50μlのTEに溶解してゲノムDNA溶液を得た。 After completion of the reaction, phenol - chloroform extraction, ethanol precipitation and dissolved in TE of 50μl after air-dried to obtain a genomic DNA solution.
(2)RNaseHII遺伝子のクローニングアルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)は全ゲノム配列が公開されており〔Klenk,HPら、ネイチャー(Nature)、第390巻、第364−370頁(1997)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(AF0621)が1つ存在することが明らかになっている(配列番号6、http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)。 (2) Cloning Arca eosin Glo bus fulgidus (Archaeoglobus fulgidus) of RNaseHII genes are whole genome sequence published [Klenk, HP et al., Nature (Nature), 390, pp. 364-370 (1997)], genes encoding homologs of RNaseHII (AF0621) that is present one has been revealed (SEQ ID NO: 6, http: //www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html).
そこで、このAFO621遺伝子(配列番号6)の配列をもとにプライマーAfuNde(配列番号7)及びAfuBam(配列番号8)を合成した。 Therefore, primers were synthesized AfuNde the sequence under this AFO621 gene (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 7) and AfuBam (SEQ ID NO: 8).
上記(1)で得たアルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNA 30ngを鋳型にして、20pmolのAfuNde及び20pmolのAfuBamをプライマーに用い、100μlの容量でPCRを行なった。 By the Arca eosin Glo bus fulgidus genomic DNA 30 ng, obtained in the above (1) as a template, using AfuBam of AfuNde and 20pmol of 20pmol primer, PCR was carried out in a volume of 100 [mu] l. PCRでのDNAポリメラーゼはパイロベストDNAポリメラーゼ(宝酒造社製)を添付のプロトコールに従って用い、PCRは94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとし、40サイクル行った。 Used as a DNA polymerase for the PCR Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) according to the attached protocol, PCR is 30 seconds at 94 ° C., 30 sec at 55 ° C., and the 1 minute as one cycle at 72 ° C., it was carried out 40 cycles . 増幅した約0.6kbのDNA断片をNdeI及びBamHI(ともに宝酒造社製)で消化し、得られたDNA断片をプラスミドベクターpTV119Nd(pTV119NのNcoIサイトをNdeIサイトに変換したもの)のNdeI及びBamHI間に組込んだプラスミドpAFU204を作製した。 The amplified DNA fragment of about 0.6kb was digested with NdeI and BamHI (both Takara Shuzo Co., Ltd.), between NdeI and BamHI of the resulting DNA fragment Plasmid vector PTV119Nd (the NcoI site of pTV119N obtained by converting the NdeI site) the plasmid pAFU204 incorporating in was fabricated.
(3)RNaseHII遺伝子を含むDNA断片の塩基配列の決定上記(2)で得られたpAFU204の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。 (3) the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment pAFU204 obtained in the said determined base sequence of the DNA fragment (2) including a RNaseHII gene were determined by dideoxy method.
得られた塩基配列の結果を解析したところ、RNaseHIIをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。 Were Analysis of the determined nucleotide sequence was found an open reading frame presumably encoding RNase HII. このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号9に示す。 The nucleotide sequence of the open reading frame in SEQ ID NO: 9. また、該塩基配列から推定されるRNaseHIIのアミノ酸配列を配列表の配列番号10に示す。 The amino acid sequence of RNaseHII deduced from the nucleotide sequence in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
なお、プラスミドpAFU204で形質転換された大腸菌JM109は、Escherichia coli JM109/pAFU204と命名、表示され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター[日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305−8566)]に平成13年2月22日(原寄託日)より受託番号FERM P−18221として寄託され、ブタペスト条約のもと前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成13年8月2日(国際移管日)よりFERM BP−7691として移管されている。 In addition, E. coli JM109 transformed with plasmid pAFU204 is named Escherichia coli JM109 / pAFU204, is displayed, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center [Japan Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Higashi 1-Chome, Central 6 is deposited as accession number FERM P-18221 from (zip code 305-8566)] in 2001 February 22 (original date of deposit), based on the National Institute of Advanced industrial Science and technology, International Patent organism Depositary of the Budapest Treaty has been transferred to the center, 2001 August 2 from (international transfer date) as FERM BP-7691.
(4)精製RNaseHII標品の調製上記(2)で得られたpAFU204で大腸菌JM109を形質転換し、得られたpAFU204を含む大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む2リットルのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。 (4) E. coli JM109 with pAFU204 obtained in purified RNaseHII preparation Preparation (2) was transformed inoculated E. coli JM109 containing the obtained pAFU204 to 2 liters of LB medium containing 100 [mu] g / ml of ampicillin and, for 16 hours by shaking culture at 37 ° C.. 培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を37.1mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。 After cultivation, sonication buffer 37.1ml the cells collected by centrifugation [50mM Tris -HCl (pH8.0), 1mM EDTA, 2mM phenyl methanesulfonyl fluoride] was suspended in, and subjected to ultrasonic crushing machine . この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、15分間の熱処理にかけた。 The homogenate was centrifuged for 10 minutes at 12000 rpm, the resulting supernatant 70 ° C. and subjected to a 15 minute heat treatment. その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、40.3mlの熱処理上清液を得た。 It was then centrifuged for 10 minutes again 12000 rpm, the supernatant was collected to obtain a heated supernatant of 40.3Ml.
この熱処理上清液をバッファーA〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA〕で平衡化したRESOURSE Qカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。 The heated supernatant buffer A [50mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA] was subjected to RESOURSE Q column equilibrated with (Amersham Pharmacia Biotech), using FPLC system (Amersham Pharmacia Biotech) It was subjected to chromatography Te. その結果、RNaseHIIはRESOURSE Qカラムを素通りした。 As a result, RNaseHII was passed through the RESOURSE Q column.
バッファーAで平衡化したRESOURSE Sカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。 Subjected to RESOURSE S column equilibrated in buffer A (Amersham Pharmacia Biotech), and chromatographed using FPLC system (Amersham Pharmacia Biotech). その結果、RNaseHIIはRESOURSE Sカラムを素通りした。 As a result, RNaseHII was passed through the RESOURSE S column.
素通りしたRNaseHII画分40.0mlを50mM NaClを含むバッファーB〔50mMトリス−HCl(pH7.0)、1mM EDTA〕21を外液として、2時間の透析を3回行なった。 Buffer B containing RNaseHII fraction 40.0ml that passed through the 50mM NaCl [50mM Tris -HCl (pH7.0), 1mM EDTA] to 21 as an external solution was performed three times dialyzed for 2 hours. 透析後の酵素液40.2mlを50mM NaClを含むバッファーBで平衡化したHiTrap−heparinカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステムを用いて50〜550mM NaCl直線濃度勾配により溶出した。 Subjected to HiTrap-heparin column equilibrated enzyme solution 40.2ml after dialysis in Buffer B containing 50 mM NaCl (Amersham Pharmacia Biotech), and eluted with 50~550MM NaCl linear concentration gradient using FPLC system. その結果、約240mM NaClのところに溶出されたRNaseHII画分を得た。 As a result, to obtain a RNaseHII fraction eluted with about 240 mM NaCl.
このRNaseHII画分7.8mlをセントリコン−10(アミコン社製)を用いた限外ろ過により濃縮し、約600μlの濃縮液を4回に分けて100mM NaCl、0.1mM EDTAを含む50mMトリス−HCl(pH7.0)で平衡化したSuperose6ゲルろ過カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、RNaseHIIは、30.0キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。 The RNaseHII fraction 7.8ml concentrated by ultrafiltration using Centricon-10 (the Amicon), 100 mM NaCl divided concentrate of approximately 600μl to 4 times, 50 mM Tris -HCl containing 0.1 mM EDTA (pH 7.0) in subjected to equilibrated Superose6 gel filtration column (Amersham Pharmacia Biotech), as a result of elution with the same buffer, RNase HII was eluted at a position corresponding to a molecular weight 30.0 kilodaltons . この分子量は、RNaseHIIが1量体として存在する場合に相当する。 This molecular weight corresponds to that of RNaseHII is present as a dimer. こうして溶出されたRNaseHIIをAfu RNaseHII標品とした。 The thus eluted RNaseHII was Afu RNaseHII preparation.
上記で得られたAfu RNaseHII標品を用いて、参考例1−(4)に記載の方法により酵素活性を測定した結果、Afu RNaseHII標品にRNaseH活性が認められた。 With Afu RNase HII preparation obtained in Reference Example 1- (4) Results of the measurement of the enzymatic activity by the method described in, RNase H activity was observed in the Afu RNase HII preparation.
本発明の方法に使用される耐熱性RNaseHのユニット数は、次の方法により算出した。 Units of thermostable RNaseH used in the method of the present invention was calculated by the following method.
ポリ(rA)及びポリ(dT)(ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製)1mgをそれぞれ1mM EDTAを含む40mM トリス−HCl(pH7.7)1mlに溶解し、ポリ(rA)溶液及びポリ(dT)溶液を調製した。 Poly (rA) and poly (dT) (both from Amersham Pharmacia Biotech) 1 mg respectively was dissolved in 40mM Tris-HCl (pH 7.7) 1 ml containing 1 mM EDTA, prepared poly (rA) solution and a poly (dT) solution did.
次に、4mM MgCl 、1mM DTT、0.003%BSA、4%グリセロールを含む40mM トリス−HCl(pH7.7)に、終濃度20μg/mlとなるポリ(rA)溶液、終濃度30μg/mlとなるポリ(dT)溶液を加え、37℃で10分間反応後、4℃に冷却し、ポリ(rA)−ポリ(dT)溶液を調製した。 Next, 4mM MgCl 2, 1mM DTT, 0.003% BSA, to 4% 40 mM Tris -HCl containing glycerol (pH 7.7), a final concentration of 20 [mu] g / ml poly (rA) solution, final concentration of 30 [mu] g / ml become poly (dT) solution was added. after 10 min reaction at 37 ° C., cooled to 4 ° C., poly (rA) - was prepared poly (dT) solution. このポリ(rA)−ポリ(dT)溶液100μlに任意に希釈した酵素液1μlを加え、40℃で10分間反応させ、0.5M EDTA 10μlを加えて反応を停止させた後、260nmの吸光度を測定した。 The poly (rA) - poly (dT) solution 100μl enzyme solution 1μl diluted arbitrarily added, allowed to react for 10 minutes at 40 ° C., after stopping the reaction by adding 0.5M EDTA 10 [mu] l, the absorbance at 260nm It was measured. 対照として、上記反応液に0.5M EDTA 10μlを加えた後、40℃で10分間反応させ、吸光度を測定した。 As a control, after adding 0.5M EDTA 10 [mu] l in the reaction solution, reacted 10 minutes at 40 ° C., the absorbance was measured. その後、EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値(吸光度差)を求めた。 Then, to determine the value obtained by subtracting the absorbance of the control from the absorbance obtained by reacting in the absence of EDTA (absorbance difference). すなわち、酵素反応によってポリ(rA)−ポリ(dT)ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。 That is, poly (rA) by enzymatic reaction - was determined the concentration of free nucleotide poly (dT) hybrid by the absorbance difference. RNaseHの1単位は、1nmolのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するA 260を10分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。 1 unit of RNaseH is an enzyme amount that increases the A 260 of 1nmol ribonucleotides correspond to liberated in 10 minutes, was calculated according to the following formula.
単位(unit)=〔吸光度差×反応液量(ml)〕/0.0152×(110/100)×希釈率参考例3 Unit (Unit) = [absorbance difference × the reaction volume (ml)] / 0.0152 × (110/100) × dilution Reference Example 3
本発明の方法に使用される常温性RNaseHのユニット数は、以下の方法で測定した。 The number of units of mesophilic RNaseH used in the method of the present invention was measured by the following method.
(1)使用する試薬液の調製力価測定用反応液:最終濃度がそれぞれ40mM トリス−塩酸(pH7.7、37℃)、4mM 塩化マグネシウム、1mM DTT、0.003% BSA、4%グリセロール、24μM ポリ(dT)になるように滅菌水で調製した。 (1) Used reagent solution of Preparation titer measurement reaction solution: the final concentration respectively 40mM Tris - HCl (pH7.7,37 ℃), 4mM magnesium chloride, 1mM DTT, 0.003% BSA, 4% glycerol, It was prepared in sterile water to a 24μM poly (dT).
ポリ[8− H]アデニル酸溶液:370kBqのポリ[8− H]アデニル酸溶液を200μlの滅菌水に溶解した。 Poly [8- 3 H] adenylic acid solution: 370KBq poly [8- 3 H] adenylic acid solution of was dissolved in sterile water 200 [mu] l.
ポリアデニル酸溶液:ポリアデニル酸を3mMになるように滅菌超純水で希釈した。 Polyadenylic acid solution: diluted with sterile ultrapure water to be polyadenylated on 3 mM.
酵素希釈液:最終濃度がそれぞれ25mM トリス−塩酸(pH7.5、37℃)、5mM 2−メルカプトエタノール、0.5mM EDTA(pH7.5、37℃)、30mM 塩化ナトリウム、50%グリセロールになるように滅菌水で調製した。 Enzyme diluent: final concentrations respectively 25mM Tris - HCl (pH 7.5, 37 ° C.), 5 mM 2-mercaptoethanol, 0.5mM EDTA (pH7.5,37 ℃), 30mM sodium chloride, so as to be 50% glycerol It was prepared with sterile water.
熱変性子牛胸腺DNAの調製:子牛胸腺DNA200mgをTEバッファー100mlに懸濁し、膨潤させた。 Preparation of heat Henseiko calf thymus DNA: calf thymus DNA200mg suspended in TE buffer 100 ml, was allowed to swell. 該溶液のUV260nmの吸光度を測定し、1mg/mlの濃度に滅菌超純水で希釈した。 The absorbance of UV260nm of the solution was measured and diluted with sterile ultrapure water to a concentration of 1 mg / ml. 次に、該溶液を100℃で10分間加熱後、氷浴中で急冷した。 Then, after heating 10 minutes the solution at 100 ° C., and quenched in an ice bath.
(2)活性測定方法上記(1)で調製した力価測定用反応液985μlにポリ[8− H]アデニル酸溶液7μlを加え37℃で10分間保持した。 (2) and held activity measurement method described above (1) poly [8- 3 H] Preparation titers measurement reaction solution 985μl in 10 minutes at 37 ° C. was added adenylate solution 7 [mu] l. 次にポリアデニル酸を最終濃度が24μMになるように8μl加え、さらに37℃で5分間保持した。 Then polyadenylated final concentration added 8μl to be 24 [mu] M, and held an additional 5 minutes at 37 ° C.. このようにしてポリ[8− H]rA−ポリdT反応液1000μlを調製した。 The thus prepared poly [8- 3 H] rA- poly dT reaction 1000μl with. 次に、該反応液200μlを分取し、30℃で5分間保持した後、任意の希釈系列で希釈した酵素液1μlを加え、これらの反応液を経時的に50μlずつサンプリングして、後の測定に用いた。 Then, a sample was collected the reaction was 200 [mu] l, was held 5 minutes at 30 ° C., was added an enzyme solution 1μl diluted with any dilution series, with time sampled by 50μl of these reaction solution after It was used for the measurement. 酵素添加からサンプリングまでの間の時間をY分とした。 The time between the enzyme addition to the sampling and the Y component. また、全CPM用反応液50μlおよびブランク用反応液50μlは、酵素液の代わりに酵素希釈液を1μl加えて調製した。 The total CPM for reaction 50μl and the reaction mixture 50μl blank was prepared by adding 1μl of enzyme diluent instead of the enzyme solution. 該サンプリング溶液に100mMピロリン酸ナトリウム100μl、熱変性子牛胸腺DNA溶液50μlおよび10%トリクロロ酢酸300μl(全CPM測定の場合は、超純水300μl)を加え、0℃で5分間保持後、10000rpmで10分間遠心した。 100mM sodium pyrophosphate in the sampling solution 100 [mu] l, (in the case of total CPM measurement, ultra-pure water 300 [mu] l) heat Henseiko calf thymus DNA solution 50μl and 10% trichloroacetic acid 300 [mu] l was added, after 5 minute hold at 0 ° C., at 10000rpm and centrifuged for 10 minutes. 遠心後、得られた上清250μlをバイアルに入れ、アクアゾル−2(NENライフサイエンスプロダクツ社製)10mlを加え、液体シンチレーションカウンターでCPMを測定した。 After centrifugation, put the resulting supernatant 250μl vial, aquasol -2 (NEN Life Science Products, Inc.) 10 ml was added, was measured CPM in a liquid scintillation counter.
(3)ユニット計算各酵素のユニット(Unit)数は、以下の計算式で算出した。 (3) Unit calculation of each enzyme units (Unit) number was calculated by the following equation.
Unit/ml={(測定したCPM−ブランクCPM)×1.2 ×20×1000×希釈率}×200(μl)/(全CPM×Y分×50(μl)×9 ** Unit / ml = {(measured CPM- blank CPM) × 1.2 * × 20 × 1000 × dilution factor} × 200 (μl) / (total CPM × Y min × 50 (μl) × 9 ** )
1.2 :全CPM中に含まれるポリ[8− H]rA−ポリdTの50μl当たりのnmol数9 ** :補正係数実施例1 1.2 *: All CPM poly contained in [8- 3 H] rA- poly dT of nmol number 9 ** per 50 [mu] l: Correction coefficient Example 1
(1)喀痰からのDNA抽出米国CDC(Centers for Diseases Control and Prevention)が推奨するNALC法により喀痰を処理した。 (1) was treated sputum by NALC method DNA extraction U.S. CDC (Centers for Diseases Control and Prevention) recommended from sputum. すなわち、喀痰を50ml容のスクリューキャップ付チューブに入れ、等量のNALC液(0.1Mクエン酸ナトリウム 50mlと4%水酸化ナトリウム 50mlの混合液に0.5gのN−アセチル−L−システインを加えたもの)を加え、試験管ミキサーで20秒間良くかき混ぜ検体を液状にした。 That is, sputum was placed in 50ml ml screw tube capped, NALC solution an equal volume (in a mixture of 0.1M sodium citrate 50ml 4% sodium hydroxide 50ml of 0.5 g N-acetyl -L- cysteine added ones) was added and the sample stirred well vitro mixer for 20 seconds and a liquid. 室温で15分間放置した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で全量を50mlとし、次いで3000g以上で20分遠心し沈殿を採取した。 After standing at room temperature for 15 minutes, a total volume of 50ml with phosphate buffered saline (PBS), and then were taken 20 minutes centrifuged precipitate above 3000 g. この沈殿に50μlの溶解緩衝液[lysis buffer;1単位のムタノリシン(mutanolysin、シグマ社製)を含有する10mM HEPES緩衝液(pH7.8)]を加えよく混和する。 Lysis buffer 50μl to precipitate [lysis buffer; 1 unit of mutanolysin (mutanolysin, Sigma) 10 mM HEPES buffer (pH 7.8) containing] mix well added. 37℃で30分反応し、ついで5分間水浴中煮沸または96℃のヒートブロック中で加熱処理した。 30 minutes of reaction at 37 ° C., then heated in a heat block for 5 minutes water bath boiling or 96 ° C.. 必要な場合は微量高速遠心器により遠心し、その上清を分取した。 If necessary centrifuged by trace fast centrifuge, it was collected the supernatant. 以上の操作により調製された上清を喀痰からのDNA抽出液として以降の操作に用いた。 The supernatant prepared by the above procedure was used in the subsequent operation as DNA extract from sputum. さらに、Genとるくん酵母用(宝酒造社製)も使用取扱説明書に従い、核酸抽出に使用した。 In addition, Gen take-kun for yeast (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) is also in accordance with Instructions for use, was used in the nucleic acid extraction.
(2)プローブ、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの作製結核菌群由来のIS6110遺伝子を検出するための特異的オリゴヌクレオチドプローブをGenBank Accession No. (2) probe, GenBank Accession specific oligonucleotide probes prepared for detecting the IS6110 gene from Mycobacterium tuberculosis of the chimeric oligonucleotide primer No. X52471記載の塩基配列をもとに作製した。 X52471 was prepared based on the nucleotide sequence described. すなわち、配列表の配列番号11に示す塩基配列からなり、5'末端にFITC(フルオレセインイソチオシアネート)が付されたオリゴヌクレオチドプローブMTIS−2BFをDNA合成機により合成した。 That is, the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 of the Sequence Listing, oligonucleotide probes MTIS-2BF to FITC (fluorescein isothiocyanate) is attached to the 5 'end was synthesized by a DNA synthesizer.
結核菌群IS6110遺伝子由来のDNA断片をICAN法で合成するためのキメラオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。 The DNA fragment from Mycobacterium tuberculosis IS6110 gene to generate chimeric oligonucleotide primer for synthesizing by ICAN method. すなわち配列表の配列番号12に示された結核菌群IS6110遺伝子の塩基配列をもとに、配列表の配列番号13に示された塩基配列からなるフォワードプライマーMTIS−2F、配列表の配列番号14に示された塩基配列からなり、5'末端にビオチンが付加されたリバースプライマーMTIS2−RBioをそれぞれDNA合成機により合成した。 That based on the nucleotide sequence of the Mycobacterium tuberculosis IS6110 gene shown in SEQ ID NO: 12, the forward primer MTIS-2F having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 of the Sequence Listing, the sequence of Sequence Listing ID No. 14 made from the indicated nucleotide sequence, 5 'end is added biotin was reverse primer MTIS2-RBio were synthesized by the respective DNA synthesizer. 同様に配列表の配列番号15に示された塩基配列からなるフォワードプライマーK−F1033−2、配列表の配列番号16に塩基配列からなり、5'末端にビオチンが付加されたリバースプライマーK−R1133−2BioをそれぞれDNA合成機により合成した。 Forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 similarly Sequence Listing K-F1033-2, the base sequence in SEQ ID NO: 16, 5 'reverse primer K-R1133 which biotin terminally added -2Bio were synthesized by the respective DNA synthesizer.
(3)ICAN法による増幅表1に示すICAN反応のための反応液を調製し、60℃で30分インキュベートした。 (3) The reaction solution was prepared for the ICAN reaction shown in amplification Table 1 by ICAN method, and incubated for 30 minutes at 60 ° C..
また、同様にK−F1033−2/K−R1133−2プライマーの組み合わせでもICAN増幅反応を行った。 Moreover, it was performed in the same manner as in ICAN amplification reactions by a combination of K-F1033-2 / K-R1133-2 primer. 反応終了後、上記反応液の一部を電気泳動に供して、目的の増幅断片を確認した。 After completion of the reaction, subjected to electrophoresis a portion of the reaction solution was confirmed amplified fragment of interest.
(4)固層プレート発光法による検出ストレプトアビジン(ナカライ社製)をPBSに2μg/mlの濃度に溶解し、この溶液を白色発光検出用96ウェルマイクロタイタープレートに150μl/ウェルとなるように添加し、4℃で一晩放置し、固定化した。 (4) the solid layer plate light emission method by detecting streptavidin (Nacalai Inc.) was dissolved in a concentration of 2 [mu] g / ml into PBS, added to this solution to a 150 [mu] l / well in 96-well microtiter plates for white emission detection and allowed to stand overnight at 4 ° C., it was immobilized. ストレプトアビジン溶液を捨てた後、1%BSA−PBS溶液を200μl/ウェルとなるように分注して4℃で一晩放置し、ブロッキングを行った。 After discarding the streptavidin solution is dispensed 1% BSA-PBS solution to a 200 [mu] l / well and left overnight at 4 ° C., to perform blocking. この溶液を捨てたものをストレプトアビジンコートプレートとして以下の実験に使用した。 Those discarded this solution was used in the following experiments as a streptavidin-coated plate.
上記のストレプトアビジンコートプレートにハイブリダイゼーション緩衝液[1%TritonX−100、1%BSAを含む5×SSC]50μl/ウェルを加え、実施例1−(3)でMTIS−2F/MTIS2−RBioプライマーの組み合わせで得られた増幅断片を含むICAN反応液を10μl/ウェルずつ添加して良く混合し、室温で15分間反応させ、プレート表面に捕捉させた。 Additional streptavidin-coated plates in hybridization buffer 50 [mu] l / well [5 × SSC containing 1% TritonX-100,1% BSA] was added, in Example 1- (3) MTIS-2F / MTIS2-RBio primer the ICAN reaction solution containing the amplified fragment obtained with the combination was added at 10 [mu] l / well was mixed well, allowed to react for 15 minutes at room temperature, was captured on the plate surface. 次にDNA変性液(0.1N NaOH溶液)を5μl/ウェルずつ添加し、良く混和して3分間のDNA変性を行い、プレート表面に捕捉された二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性した。 Then added DNA denaturing solution (0.1 N NaOH solution) by 5 [mu] l / well, subjected to DNA denaturing well mixed to yield 3 minutes to denature the double-stranded DNA captured on the plate surface to single-stranded DNA . 引き続き上記のプローブMTIS2BFを5pmol/mlとなるようにハイブリダイゼーションバッファーに希釈し、これを100μl/ウェルずつ添加してよく混合し、室温で40分反応させた。 Subsequently diluted in the hybridization buffer to the probe MTIS2BF the 5 pmol, which was mixed well added in 100 [mu] l / well and reacted at room temperature for 40 minutes. この時、各ウェルのpHは13〜14であった。 At this time, pH of each well was 13-14. 反応後、ウェル内の溶液を捨て、200μl/ウェルの洗浄バッファー[25mM Tris−塩酸(pH7.5)、150mM NaCl、1%BSA、0.05%Tween20]で2回ウェルを洗浄する。 After the reaction, discarded solution in the wells, washing buffer [25 mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween20] of 200 [mu] l / well wash twice wells with. その後、パーオキシダーゼ標識抗FITCウサギ抗体(ケミコン社製)をハイブリダイゼーションバッファーに2μg/mlに溶解したものを100μl/ウェルずつ添加し室温で20分反応させた。 Thereafter, a material obtained by dissolving peroxidase-labeled anti-FITC rabbit antibody (Chemicon) in hybridization buffer in 2 [mu] g / ml and reacted at room temperature for 20 minutes was added in 100 [mu] l / well. 反応後、液を捨て、200μl/ウェルの洗浄バッファーで4回ウェルを洗浄した後、発光基質[SuperSignal ELISA Pico Substrate(ピアス社製)]を100μl/ウェルずつ添加し、直ちに発光プレートリーダー(ラボシステムズ社製)で相対発光強度を測定した。 After the reaction, removing the solution, after washing 4 times wells with wash buffer 200 [mu] l / well, luminescent substrate [SuperSignal ELISA Pico Substrate (Pierce) was added at 100 [mu] l / well, immediately luminescence plate reader (Labsystems the relative luminescence intensity was measured by company Ltd.).
(5)検出感度の検討0、5および10コピー相当の結核菌群ゲノムを含む喀痰由来DNA試料につき、上記のとおり結核菌群DNAの検出を実施した。 (5) per sputum DNA from samples containing consideration 0,5 and 10 copies equivalent Mycobacterium tuberculosis genome detection sensitivity was performed to detect the above as Mycobacterium tuberculosis DNA. その結果、表2に示すように5コピーにおいてもS/N比で約300倍という強い発光が検出できた。 As a result, also detected a strong emission of about 300 times in the S / N ratio in 5 copies, as shown in Table 2.
以上のように、本発明により、迅速かつ高感度な結核菌の検査が可能であることが示された。 As described above, the present invention has been shown to be capable of rapid and inspection sensitive Mycobacterium tuberculosis. また、本発明の結核菌の検出方法において、本発明の核酸抽出方法及びGenとるくん酵母用試薬を用いた方法のいずれの方法においても好適に利用できることを確認した。 Further, in the detection method of Mycobacterium tuberculosis of the present invention, it was confirmed that can be suitably used in any of the methods of nucleic acid extraction methods and Gen GenTLE method using yeast reagent of the present invention. 従って、操作法の簡便さから見て、本発明の核酸抽出方法の有用性が確認できた。 Thus, viewed from the simplicity of the procedure, the usefulness of the nucleic acid extraction process of the present invention was confirmed.
実施例2 Example 2
結核菌感染の疑いを持たれた患者26例から喀痰を採取し、実施例1記載の操作に従って結核菌DNAの検出を行った。 Sputum collected from 26 patients that were unsuspecting of M. tuberculosis infection, were detected M. tuberculosis DNA following the procedure of Example 1, wherein. また、同一検体を用いて、既存の16S rRNAをコードするDNAをターゲットとしたPCR法に基づくキットであるアンプリコア マイコバクテリウムツベルクロシス(ロシュ社製)を用いた検出、小川培地による培養法による結核菌検査を実施した。 Further, using the same sample, detection using the DNA encoding the existing 16S rRNA is a kit based on PCR method targeting Amplicor Mycobacterium tuberculosis (Roche), according to the culture method using Ogawa medium It was carried out tuberculosis examination. その結果を表3に示す。 The results are shown in Table 3.
表3に示したように、本発明法は培養検査の結果と良く一致したが、PCR法では培養法で陰性であった2例が偽陽性として検出され、また、培養法陽性の1例が偽陰性として検出された。 As shown in Table 3, the present invention method is in good agreement with the results of the culture test, the PCR method is detected as two cases were negative by the culture method is a false positive, also one example of the culture method positive It is detected as a false negative.
すなわち従来の方法に比べ本発明の方法は正確な検査結果を超迅速に簡便に得られることが確認できた。 That the process of the present invention compared with the conventional method was confirmed to be obtained an accurate test results ultra rapid conveniently.
実施例3 Example 3
本発明の検出方法の結核菌群に対する特異性について検討した。 It was examined for its specificity for Mycobacterium tuberculosis detection method of the present invention. ゲノムDNAは、表4に示す37株を使用した。 Genomic DNA was used 37 strains shown in Table 4.
各ゲノムDNAは、OD値からコピー数を計算し、2×10 コピーになるように希釈した。 Each genomic DNA, the copy number was calculated from the OD values were diluted to 2 × 10 7 copies. 上記鋳型となるゲノムDNAを用いて、以下の表5に示す反応液組成で検出を行った。 Using genomic DNA as a the template, it was detected in the reaction mixture composition shown in Table 5 below.
上記反応液を60℃で1時間保持した。 The reaction mixture was held for 1 hour at 60 ° C.. 検出は、実施例1(4)記載の方法で行った。 Detection was in Example 1 (4), wherein the method. その結果、Mycobacterium tuberculosis株及びMycobacterium bovis BCG株のみ特異的に検出することができた。 As a result, it was possible to specifically detect only Mycobacterium tuberculosis strains and Mycobacterium bovis BCG strain. このことから、本発明の方法が非常に特異性の高い検出方法であることを確認した。 Therefore, it was confirmed that the method of the present invention are highly specific detection method.
実施例4 Example 4
(1)磁気ビーズを用いた結核菌群の検出について検討した。 (1) it was examined for the detection of Mycobacterium tuberculosis using magnetic beads. プライマーは、MTIS−2Fプライマー及びMTIS−2RBioプライマーを用いた。 Primers were used MTIS-2F primer and MTIS-2RBio primer. 次に、鋳型として実施例2での陽性検体由来の抽出ゲノムを滅菌水にて30倍、300倍、3000倍となるように希釈調製した。 Next, 30-fold with sterilized water extraction genomes from positive specimens in Example 2 as a template, 300-fold, diluted prepared so that 3000 times. 反応は以下のようにして行った。 The reaction was carried out in the following manner. 即ち、最終濃度32mM ヘペス−水酸化カリウムバッファー(pH7.8)、100mM 酢酸カリウム、1%DMSO、0.01%BSA、4mM 酢酸マグネシウム、各500μM dNTPs、各50pmolのMTIS−2F及びMTIS−2Rプライマー、8.75UのAfu由来RNaseH、8UのBcaBEST DNAポリメラーゼ、各鋳型量1μlを添加し滅菌水で最終容量を50μlにした。 That is, the final concentration 32mM HEPES - potassium hydroxide buffer (pH 7.8), potassium 100mM acetate, 1% DMSO, 0.01% BSA, magnesium 4mM acetate, each 500 [mu] M dNTPs, MTIS-2F and MTIS-2R primer of each 50pmol , Afu-derived RNaseH of 8.75U, BcaBEST DNA polymerase 8U, the final volume with sterile water was added to the amount of template 1μl was 50 [mu] l. 該反応液はあらかじめ60℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、60分間保持した。 The reaction solution was set in Thermal Cycler Personal set in advance 60 ° C., and held for 60 minutes. 得られた増幅断片を自動検出装置、ルミパルス(富士レビオ社製)にセットし、ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ(ピアス社製)による検出を行った。 The resulting apparatus for automatically detecting the amplified fragment was, set in Lumipulse (manufactured by Fujirebio Inc.), was detected by the magnetic beads streptavidin-coated (Pierce). ビオチン結合能100pmol相当のストレプトアビジン固層化磁気ビーズをキュベット第1層でビオチン化増幅断片と5分間反応させ、次いで0.1N NaOHを加えてFITC標識プローブMTISBFと5分間ハイブリダイズさせ、洗浄後POD標識抗FITC抗体を加え、5分間反応後洗浄し発光基質を加えた。 Biotin binding Noh 100pmol considerable streptavidin solid phase magnetic beads reacted biotinylated amplified fragment and 5 minutes in the first layer cuvette, and then FITC-labeled probe MTISBF and hybridized 5 minutes by addition of 0.1 N NaOH, washed added POD-labeled anti-FITC antibody, washed after 5 minutes the reaction was added luminescent substrate. この結果、既存の自動化検出装置において磁気ビーズを用いて20分間という短時間で半定量可能であることが示された。 The results show that at short time of 20 minutes using a magnetic beads in existing automated detector can be semi-quantitative. なお、試薬は実施例1と同様のものを用いた。 Incidentally, the reagents used were the same as in Example 1. 検出は、発光量をフォトカウンティングすることで測定した。 Detection was measured by photo counts the amount of light emission. その結果を表6に示す。 The results are shown in Table 6.
表6に示した結果から、従来のプレート発光法と同等の感度で検出できることを確認した。 From the results shown in Table 6, it was confirmed that can be detected by conventional plate luminescence method equivalent sensitivity.
(2)内部標準(IC;internal control)を組み合わせた場合の検出系について検討した。 Was examined detection system when combining; (internal control IC) (2) internal standard. 内部標準は以下のようにして調製した。 Internal standard was prepared as follows. すなわち、ヒトゲノムDNAを鋳型とし、配列表の配列番号17及び18記載のプライマーを用いてPCR増幅した。 That is, the human genomic DNA as a template was PCR amplified using primers SEQ ID NO: 17 and 18 in Sequence Listing. 得られた増幅断片を常法により精製し、pT7 Blue T−vector(Novagen社製)に挿入した。 The resulting amplified fragment was purified by a conventional method, was inserted into pT7 Blue T-vector (Novagen Co.). 該プラスミドを内部標準として用いた。 Using said plasmid as an internal standard. 反応は、実施例3記載の条件と同様にして、上記プラスミドを1、3、10pgを添加した。 The reaction, as in the conditions described in Example 3, and the above plasmid was added 1,3,10Pg. 鋳型の結核菌ゲノムは、0、2及び20コピーを用いた。 M. tuberculosis genome of template was used 0,2 and 20 copies. 検出は、配列表の配列番号19記載の塩基配列を有し、5'末端にFITC標識を有するIC用プローブ(ICFプローブ)及びFITC標識プローブMTISBFを用いた。 Detection has the SEQ ID NO: 19 nucleotide sequence described in the sequence listing, probe IC with FITC-labeled at the 5 'end (ICF probe) and with FITC-labeled probe MTISBF. その結果、いずれのICプラスミド濃度でも結核菌ゲノムを検出できた。 As a result, able to detect M. tuberculosis genome at any IC plasmid concentration. 特にICプラスミドの濃度が3pgの場合に好適であることが確認できた。 In particular the concentration of IC plasmid was confirmed to be suitable in the case of 3 pg.
(3)上記増幅断片の検出方法として、ハイブリッド・クロマト法を検討した。 (3) as a method of detecting the amplified fragment was examined hybrid chromatography. 即ち、ニトロセルロース膜にストレプトアビジン(ナカライテスク社製)を固定化し、吸水パッドを連結し、ハイブリ・クロマト・ストリップを作製した。 That was immobilized streptavidin to a nitrocellulose membrane (manufactured by Nacalai Tesque), the water absorption pad was ligated to prepare a hybrid-chromatographic strip. これを用いて、実施例1で得られた増幅断片のハイブリ・クロマト法による検出を行った。 Using this was detected by hybridization-chromatography of the resulting amplified fragment in Example 1. 検出は、1−step TMB−Blotting(ピアス社製)を用いた発色で行った。 The detection was carried out with a color using the 1-step TMB-Blotting (Pierce). すなわち、ニトロセルロース膜上に増幅断片を含有する反応液を展開し、その後順に0.1N NaOH溶液、FITC標識プローブ、洗浄液、発色液を展開した。 That is, to expand the reaction solution containing amplified fragments on a nitrocellulose membrane, 0.1 N NaOH solution in order then, FITC-labeled probe, washing solution, the coloring solution to expand. その結果、結核菌陽性の増幅断片では、ブルーのバンドが検出された。 As a result, the amplified fragment of M. tuberculosis-positive, blue bands were detected. また、この方法を用いる事により、本発明の方法実施後、5〜10分で結果が肉眼で判明することから、迅速な遺伝子検査方法として有用であることが確認できた。 Further, by using this method, after the method embodiment of the present invention, since the results in 5-10 minutes is found with the naked eye, it was confirmed to be useful as a rapid genetic testing methods.
実施例5 Example 5
実施例1〜4の結果を踏まえ、結核菌群のキットを構築した。 Based on the results of Examples 1 to 4 was constructed kits Mycobacterium tuberculosis. 各コンポーネントについて以下に示す。 For each of the components are shown below.
(1)ICAN増幅用試薬;50回分 (1) ICAN amplification reagent; 50 times
(2)検出用試薬(50回分) (2) Detection reagent (50 times)
上記試薬を用いてMycobacterium tuberculosis株及びMycobacterium bovis BCG株を検出したところ、迅速、高感度、高特異的に検出できることを確認した。 It was detected with Mycobacterium tuberculosis strains and Mycobacterium bovis BCG strain using the above reagents, rapid, highly sensitive, it was confirmed that can highly specifically detected.
実施例6 Example 6
(1)スワブ検体からのDNA抽出男子尿道ならびに女子子宮頚部を綿棒で拭い取ったスワブ検体に界面活性剤を含む抽出バッファー(アンプリコアSTD用検体処理試薬(ロシュ社))を加え95℃〜100℃で10分間加熱処理した。 (1) DNA extraction male urethra and women cervix extraction buffer (Amplicor STD for sample processing reagent (Roche)) containing a surfactant swab specimens wiped with a cotton swab from swabs was added 95 ° C. to 100 ° C. in was heated for 10 minutes.
(2)プローブ、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの作製クラミジアのクリプティック・プラスミドを検出するための特異的オリゴヌクレオチドプローブを作製した。 (2) probes were prepared specific oligonucleotide probes for detecting a cryptic plasmid Preparation Chlamydia chimeric oligonucleotide primer. すなわち、配列表の配列番号20に示す塩基配列からなり、5'末端にFITC(フルオレセインイソチオシアネート)が付されたオリゴヌクレオチドプローブCT1234をDNA合成機により合成した。 That is, the base sequence shown in SEQ ID NO: 20, an oligonucleotide probe CT1234 to FITC (fluorescein isothiocyanate) is attached to the 5 'end was synthesized by a DNA synthesizer. また、リン菌のcppB遺伝子を検出するための特異的オリゴヌクレオチドプローブを作製した。 Further, to prepare a specific oligonucleotide probe for detecting the cppB gene phosphorus bacteria. すなわち、配列表の配列番号21に示す塩基配列からなり、5'末端にFITC(フルオレセインイソチオシアネート)が付されたオリゴヌクレオチドプローブCppB3をDNA合成機により合成した。 That is, the base sequence shown in SEQ ID NO: 21, an oligonucleotide probe CppB3 to FITC (fluorescein isothiocyanate) is attached to the 5 'end was synthesized by a DNA synthesizer.
クラミジアのクリプティック・プラスミド由来のDNA断片をICAN法で合成するためのキメラオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。 The DNA fragment from cryptic plasmid of Chlamydia to generate chimeric oligonucleotide primer for synthesizing by ICAN method. すなわち配列表の配列番号22に示されたクラミジアのクリプティック・プラスミドの塩基配列をもとに、配列表の配列番号23及び24に示された塩基配列からなるフォワードプライマーF1212−22、F1162−22、配列表の配列番号25及び26に示された塩基配列からなり、5'末端にビオチンが付加されたリバースプライマーR1272−22Bio、R1379−22BioをそれぞれDNA合成機により合成した。 That based on the nucleotide sequence of the cryptic plasmid of Chlamydia shown in SEQ ID NO: 22, a forward primer F1212-22 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23 and 24 of the Sequence Listing, F1162-22 consists SEQ ID NO: 25 and 26 in the indicated nucleotide sequence of sequence Listing, 5 'reverse primer R1272-22Bio biotin at the terminal is added, the R1379-22Bio were synthesized by the respective DNA synthesizer.
リン菌cppB遺伝子由来のDNA断片をICAN法で合成するためのキメラオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。 The DNA fragment from phosphorus bacteria cppB gene to generate chimeric oligonucleotide primer for synthesizing by ICAN method. すなわち配列表の配列番号27に示されたクラミジアのクリプティック・プラスミドの塩基配列をもとに、配列表の配列番号28に示された塩基配列からなるフォワードプライマーpJDBF−1、配列表の配列番号29に示された塩基配列からなり、5'末端にビオチンが付加されたリバースプライマーpJDBR−3BioをそれぞれDNA合成機により合成した。 That based on the nucleotide sequence of the cryptic plasmid of Chlamydia shown in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing, the forward primer pJDBF-1 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing, SEQ ID NO: of the Sequence Listing It consists 29 to the indicated nucleotide sequence, 5 'end biotin appended reverse primer pJDBR-3Bio were synthesized by the respective DNA synthesizer.
(3)ICAN法による増幅表7に示すICAN反応のための反応液を調製し、55℃で60分インキュベートした。 (3) The reaction solution was prepared for the ICAN reaction shown in amplification Table 7 by ICAN method, and incubated for 60 minutes at 55 ° C..
反応終了後、上記反応液の一部を電気泳動に供して、目的の増幅断片を確認した。 After completion of the reaction, subjected to electrophoresis a portion of the reaction solution was confirmed amplified fragment of interest.
(4)固層プレート発光法による検出ストレプトアビジン(ナカライ社製)をPBSに2μg/mlの濃度に溶解し、この溶液を白色発光検出用96ウェルマイクロタイタープレートに150μl/ウェルとなるように添加し、4℃で一晩放置し、固定化した。 (4) the solid layer plate light emission method by detecting streptavidin (Nacalai Inc.) was dissolved in a concentration of 2 [mu] g / ml into PBS, added to this solution to a 150 [mu] l / well in 96-well microtiter plates for white emission detection and allowed to stand overnight at 4 ° C., it was immobilized. ストレプトアビジン溶液を捨てた後、1%BSA−PBS溶液を200μl/ウェルとなるように分注して4℃で一晩放置し、ブロッキングを行った。 After discarding the streptavidin solution is dispensed 1% BSA-PBS solution to a 200 [mu] l / well and left overnight at 4 ° C., to perform blocking. この溶液を捨てたものをストレプトアビジンコートプレートとして以下の実験に使用した。 Those discarded this solution was used in the following experiments as a streptavidin-coated plate.
上記のストレプトアビジンコートプレートにハイブリダイゼーション緩衝液[1%TritonX−100、1%BSAを含む5×SSC]50μl/ウェルを加え、実施例1−(3)でF1212−22/R1272−22BioならびにpJDBF−1/pJDBR−3Bioプライマーの組み合わせで得られた増幅断片を含むICAN反応液を10μl/ウェルずつ1検体につき2ウェルに添加して良く混合し、室温で15分間反応させ、プレート表面に捕捉させた。 50 [mu] l / well was added [5 × SSC containing 1% TritonX-100,1% BSA] above streptavidin-coated plates in hybridization buffer, in Example 1- (3) F1212-22 / R1272-22Bio and pJDBF -1 / pJDBR-3Bio the ICAN reaction solution containing the amplified fragment obtained with the combination of primer was added to 2 wells per 10 [mu] l / well, one sample was mixed well, reacted at room temperature for 15 minutes, then captured on the plate surface It was. 次にDNA変性液(0.1N NaOH溶液)を5μl/ウェルずつ添加し、良く混和して3分間のDNA変性を行い、プレート表面に捕捉された二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性した。 Then added DNA denaturing solution (0.1 N NaOH solution) by 5 [mu] l / well, subjected to DNA denaturing well mixed to yield 3 minutes to denature the double-stranded DNA captured on the plate surface to single-stranded DNA . 引き続き上記のプローブCT1234またはCppB3を5pmol/mlとなるようにハイブリダイゼーションバッファーに希釈し、これを100μl/ウェルずつ添加してよく混合し、室温で40分反応させた。 Subsequently diluted in the hybridization buffer to the probe CT1234 or CppB3 a 5 pmol, which was mixed well added in 100 [mu] l / well and reacted at room temperature for 40 minutes. この時、各ウェルのpHは13〜14であった。 At this time, pH of each well was 13-14. 反応後、ウェル内の溶液を捨て、200μl/ウェルの洗浄バッファー[25mM Tris−塩酸(pH7.5)、150mM NaCl、1%BSA、0.05%Tween20]で2回ウェルを洗浄する。 After the reaction, discarded solution in the wells, washing buffer [25 mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween20] of 200 [mu] l / well wash twice wells with. その後、パーオキシダーゼ標識抗FITCウサギ抗体(ケミコン社製)をハイブリダイゼーションバッファーに2μg/mlに溶解したものを100μl/ウェルずつ添加し室温で20分反応させた。 Thereafter, a material obtained by dissolving peroxidase-labeled anti-FITC rabbit antibody (Chemicon) in hybridization buffer in 2 [mu] g / ml and reacted at room temperature for 20 minutes was added in 100 [mu] l / well. 反応後、液を捨て、200μl/ウェルの洗浄バッファーで4回ウェルを洗浄した後、発光基質[SuperSignal ELISA Pico Substrate(ピアス社製)]を100μl/ウェルずつ添加し、直ちに発光プレートリーダー(ラボシステムズ社製)で相対発光強度を測定した。 After the reaction, removing the solution, after washing 4 times wells with wash buffer 200 [mu] l / well, luminescent substrate [SuperSignal ELISA Pico Substrate (Pierce) was added at 100 [mu] l / well, immediately luminescence plate reader (Labsystems the relative luminescence intensity was measured by company Ltd.).
(5)検出感度の検討0、10および100コピー相当のクラミジアゲノムを含むDNA試料につき、上記のとおりクラミジアDNAの検出を実施した。 (5) per DNA sample comprising study 0,10 and 100 copies corresponding Chlamydia genome detection sensitivity was performed to detect the above as Chlamydia DNA. その結果、表8に示すように10コピーにおいてもS/N比で約30倍という強い発光が検出できた。 As a result, also detected a strong emission of about 30 fold in the S / N ratio in 10 copies as shown in Table 8. また、0、10および100コピー相当のリン菌ゲノムを含むDNA試料につき、上記のとおりリン菌DNAの検出を実施した。 Further, per DNA sample containing 0, 10 and 100 copies corresponding phosphorus subtilis genome was performed to detect the phosphorus bacteria DNA as described above. その結果、表9に示すように10コピーにおいてもS/N比で約300倍という強い発光が検出できた。 As a result, also detected a strong emission of about 300 times in the S / N ratio in 10 copies as shown in Table 9.
以上のように、本発明により、迅速かつ高感度なクラミジアならびにリン菌の検査が可能であることが示された。 As described above, the present invention has been shown to be capable of rapid and inspection sensitive Chlamydia and phosphorus bacteria.
実施例7 Example 7
クラミジアとリン菌の混合感染の疑いを持たれた検体12例から実施例1記載の操作に従ってクラミジアならびにリン菌DNAの同時増幅検出を行った。 The co-amplification detection of Chlamydia and phosphorus tuberculosis DNA was carried out according to the procedure described in Example 1 from the specimen 12 cases mixing was no suspicious Chlamydia and phosphorus bacteria.
その結果、クラミジアのみ陽性が5例、リン菌のみ陽性が1例、クラミジアとリン菌共に陽性が3例、共に陰性が3例であった。 As a result, 5 cases positive only chlamydia, one case only positive phosphorus bacteria, 3 cases positive chlamydia and phosphorus bacteria both were both 3 cases negative. この結果は、既存のPCR法キット(アンプリコアSTD(ロシュ社))の結果と一致した。 This result was consistent with the results of the existing PCR method kit (Amplicor STD (Roche)).
実施例8 Example 8
プライマー及びプローブの調製HCVゲノムの塩基配列に従って、配列表の配列番号30及び31に記載の塩基配列を有するHCV−F及びHCV−R1キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び配列表の配列番号32及び33に記載の塩基配列を有する逆転写反応用オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。 According primer and nucleotide sequence of the prepared HCV genome probe, according to HCV-F and HCV-R1 chimeric oligonucleotide primer and SEQ ID NO: 32 and 33 in the sequence listing having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 30 and 31 of the Sequence Listing oligonucleotide primers for reverse transcription reaction comprising the nucleotide sequence were synthesized. さらに、配列表の配列番号34及び35に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを合成した。 Furthermore, to synthesize an oligonucleotide probe having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 and 35 in the Sequence Listing. さらに、上記オリゴヌクレオチドプローブの5'末端にTAMRA(N,N,N',N'−tetramethyl−6−carboxy−rhodamine、ABI社製)を自動DNA合成機によって作製し、蛍光標識プローブとした。 Furthermore, 5 'end TAMRA (N, N, N' of the oligonucleotide probes, N'-tetramethyl-6-carboxy-rhodamine, ABI Co., Ltd.) was prepared by an automated DNA synthesizer and the fluorescent-labeled probe.
(2)合成RNAの調製インフォームド コンセントの得られたHCV−RNA陽性血清をアンプリコアHCVモニターキット(ロッシュ社製)でコピー数を算出し、これをキットに付属の検体希釈液で、1×10 コピーから1コピー/μlまで10倍希釈系列を作製し、HCV−RNAとした。 (2) a HCV-RNA-positive sera obtained a preparation consent of synthetic RNA to calculate the number of copies in Amplicor HCV Monitor kit (Roche), which in sample diluent attached to the kit, 1 × 10 7 copies to 1 copy / [mu] l to prepare a 10-fold dilution series was HCV-RNA.
(3)逆転写反応上記(1)で作製した逆転写反応用プライマーならびにFirst−strand cDNA Synthesis Kit(宝酒造社製)を用いて上記(2)で調製したHCV−RNAからcDNAを合成した。 (3) cDNA was synthesized from HCV-RNA prepared in the above (2) using reverse transcriptase reaction primers and First-strand cDNA Synthesis Kit manufactured (Takara Shuzo Co., Ltd.) in the reverse transcription reaction (1) above.
(4)ICAN反応液の調製上記cDNA溶液を用いてICAN反応を行った。 (4) it was subjected to ICAN reaction using preparative above cDNA solution ICAN reaction. 1チューブあたりの反応液組成を表10に示す。 The reaction solution composition per tube shown in Table 10.
(5)ホモジニアス検出反応チューブ1本あたり、上記反応液47μlを加え、そこに(4)で作製したcDNA溶液3μlを添加し、56℃で30分間保持した。 (5) per one homogeneous detection reaction tube, the reaction mixture 47μl was added, the addition of cDNA solution 3μl prepared there in (4), and held for 30 minutes at 56 ° C.. 反応終了後、この反応液に上記(1)で調製した蛍光標識プローブを終濃度が300nMとなるように添加し、98℃で2分間処理後、氷冷却により25℃にし、保持した。 After completion of the reaction, the fluorescent-labeled probe prepared in the above (1) to the reaction solution final concentration was added in an amount of 300 nM, after 2-minute treatment at 98 ° C., to 25 ° C. with ice cooling, and held. 該反応液を、蛍光検出器、フルオロスキャン(ラバオシステムズ社製)にて蛍光強度を測定した。 The reaction, fluorescence detector, and fluorescence intensity was measured at fluoroscan (Rabao Systems Inc.). さらに、対照として、市販のPCR法によるアンプリコアHCVキット(ロシュ社製)でも同一の検体を用いて測定した。 Further, as a control, it was measured using the same specimen even Amplicor HCV kit with a commercial PCR method (Roche). その結果を図1に示す。 The results are shown in Figure 1. 図1は、各種HCV−RNA濃度を測定した場合の蛍光強度の変化及び従来法との測定範囲の比較を示すグラフであり、左縦軸はOD450値、右縦軸は蛍光強度(SN比)、横軸は、HCV−RNA量を示す。 Figure 1 is a graph showing a comparison of the measurement range of the change in fluorescence intensity and the conventional method in the case of measuring the various HCV-RNA concentration, left vertical axis OD450 value, the right vertical axis the fluorescence intensity (SN ratio) the horizontal axis represents the HCV-RNA quantity. また、図1の黒四角は、本発明の方法による結果を示し、黒丸は、アンプリコアHCVキットによる結果を示す。 Also, the black squares in Figure 1 shows the results of the method of the present invention, a black circle indicates a result of the Amplicor HCV kit.
図1に示したように本発明の方法では、蛍光強度(SN比)はHCV−RNAコピー数が多いほど増加することが確認できた。 In the method of the present invention, as shown in FIG. 1, the fluorescence intensity (SN ratio) it was confirmed that the increase the more HCV-RNA copy number. また、本発明のHCV検出方法の所用時間は45分であった。 Further, time required for HCV detection method of the present invention was 45 minutes. 一方、対照となるアンプリコアHCVキットにおいては、所用時間は約5時間であった。 On the other hand, in the Amplicor HCV kit as a control, required time was about 5 hours. さらに、HCV−RNAの検出範囲については、図1に示したように吸光度で示すアンプリコアHCVキットでは、HCV−RNAのコピー数の増加にしたがって増大はするものの、測定範囲は2オーダーであり、10 コピー以上では、定量性がないことが確認できた。 Further, for the detection range of HCV-RNA, the Amplicor HCV kit showing absorbance as shown in FIG. 1, although the increases with increase in the number of copies of HCV-RNA, the measurement range is 2 orders, 10 in 5 or more copies, it was confirmed that there is no quantitative properties. 一方、本発明の方法は、3オーダーの広い検出範囲であることが確認できた。 On the other hand, the method of the present invention was confirmed to be a wide detection range of three orders. さらに、簡便性・迅速性においても本発明の方法は優れており、多検体を処理するのに適した方法であることが確認できた。 Furthermore, a method of the present invention is excellent, confirmed that the method is suitable for processing multiple samples in convenience, rapidity.
実施例9 Example 9
(1)患者血清からのHCV−RNAの調製臨床検体からのHCVの検出について検討した。 (1) it was examined for the detection of HCV from preparation clinical specimens HCV-RNA from patient sera. インフォームドコンセントの得られたHCV患者の血清28検体各100μlからアンプリコアHCVキット附属のHCV−RNA抽出試薬(ロシュ社製)を用いてRNAを調製した。 RNA was prepared using the HCV-RNA extraction reagent Amplicor HCV kit supplementary serum 28 specimens each 100μl of HCV patients obtained a informed consent (Roche).
(2)患者血清中のHCV−RNA検出実施例1(3)及び(4)記載の方法と同じ方法でHCV−RNAを増幅し、本発明の検出方法に供した。 (2) HCV-RNA detection embodiment of patient serum 1 (3) and (4) to amplify the HCV-RNA by the method described, and subjected to the detection method of the present invention. 本実施例においては、対照のHCV−RNAを含まない試料について行ったネガティブコントロール10本の蛍光強度の平均値+3SD(標準偏差値の3倍)をカットオフ値とし、このカットオフ値を超えた蛍光強度を示す検体を陽性とした。 In the present embodiment, the average value of the fluorescence intensity of the negative control 10 present conducted on samples without control of HCV-RNA + 3SD the (3 times the standard deviation) as the cut-off value, exceeds the cutoff value the specimens showing fluorescence intensity as a positive. 一方、同一の検体を市販のアンプリコアHCVキットにより測定し、キットの取扱説明書に従って陽性・陰性を判定した。 On the other hand, the same sample was measured by a commercially available Amplicor HCV kit were determined positive or negative according to the instructions of the kit. 本発明の検出方法と従来法のアンプリコアHCVキットの結果の比較を表11に示す。 The comparison of the results of the detection method and the conventional method Amplicor HCV kit of the present invention shown in Table 11.
表11に示したように、本発明の方法による測定結果は、従来法で得られた成績と良く相関していることが確認できた。 As shown in Table 11, the measurement results by the method of the present invention, it was confirmed to correlate well with results obtained by the conventional method. また、本発明の方法が従来法に比較して、高感度で迅速・簡便に測定できることが確認できた。 The method of the present invention as compared to the conventional method, it was confirmed that it was possible rapidly and conveniently measured with high sensitivity.
産業上の利用の可能性本発明により、病原性微生物を高感度、高特異的・迅速・簡便に測定できることが可能となり、特殊な機器を使用することなく多検体を限られた時間で処理することが可能な方法、プライマー及びプローブ、キットが提供される。 The possibility invention INDUSTRIAL APPLICABILITY high sensitivity pathogenic microorganisms, it is possible to be highly specific, rapid, simple measurement, treatment with a limited time multiple samples without the use of specialized equipment method capable, primers and probes, kits are provided.
【配列表】 [Sequence Listing]

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
図1 本発明の方法により、各種HCV−RNA濃度を測定した場合、HCV−RNA濃度と蛍光強度の変化の関係、ならびに従来法との測定範囲の差を比較した図である。 The method of Figure 1 the present invention, when measuring various HCV-RNA concentration, the relationship changes in HCV-RNA concentration and fluorescence intensity, and is a graph comparing the difference in the measuring range of the conventional method.

Claims (4)

  1. 結核菌含有検体をムラミダーゼで処理し、核酸を抽出する工程; Step of Mycobacterium tuberculosis-containing sample is treated with muramidase, to extract the nucleic acids;
    配列表の配列番号13及び14でそれぞれ表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、前記の核酸を含有する試料、RNaseH、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド3リン酸(dNTP)を含む反応液を適切な温度で反応産物が生成するのに十分な時間保温することによって結核菌IS6110遺伝子の断片を増幅する工程;および Chimeric oligonucleotide primer represented in SEQ ID NOs: 13 and 14 in Sequence Listing, a sample containing the nucleic acid, RNase H, DNA polymerase having strand displacement activity, deoxyribonucleotide triphosphates a reaction solution containing (dNTPs) appropriate step to amplify a fragment of the M. tuberculosis IS6110 gene by such temperature the reaction product is incubated for a time sufficient to generate; and
    増幅物と配列表の配列番号11記載の塩基配列で示されるプローブとの間でアルカリ領域でのハイブリダイゼーションにより結核菌IS6110遺伝子の断片を検出する工程を包含する結核菌群の検出方法。 Detection method of the amplified product with sequence listing SEQ ID NO: 11 including Mycobacterium tuberculosis the step of detecting a fragment of Mycobacterium tuberculosis IS6110 gene by hybridization with alkaline region between the probe represented by the nucleotide sequences set forth.
  2. 請求項1記載の結核菌群の検出方法に使用するための組成物であって、 配列表の配列番号13及び14でそれぞれ表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseH及びデオキシリボヌクレオチド3リン酸を含有することを特徴とする結核菌群検出用組成物。 A composition for use in the detection method of claim 1 Mycobacterium tuberculosis according chimeric oligonucleotide primer represented in SEQ ID NOs: 13 and 14 in Sequence Listing, DNA polymerase having strand displacement activity, RNase H and deoxyribonucleotide triphosphates of Mycobacterium tuberculosis detection composition characterized by containing.
  3. 請求項1記載の結核菌群の検出方法に使用するためのキットであって、 配列表の配列番号11記載の塩基配列で示されるプローブ、配列表の配列番号13及び14でそれぞれ表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseH、デオキシリボヌクレオチド3リン酸及びムラミダーゼを含有することを特徴とする結核菌群検出用キット。 A kit for use in the detection method of claim 1 Mycobacterium tuberculosis according probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 in the Sequence Table, chimeric respectively represented by SEQ ID NO: 13 and 14 in the Sequence Listing oligonucleotide primers, DNA polymerase having strand displacement activity, RNase H, deoxyribonucleotide triphosphates and Mycobacterium tuberculosis detection kit, characterized in that it contains the muramidase.
  4. さらに、マイクロタイタープレート、ビーズ、マグネチックビーズ、メンブラン、およびガラスから選択される、増幅産物を捕捉するための担体を含有する請求項3記載のキット。 Furthermore, a microtiter plate, beads, magnetic beads, membranes, and are selected from glass, claim 3 kit according containing carrier for capturing the amplified product.
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