JP4089164B2 - Amino acid taste (taste) improvement method by γ-glutamylation - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ酸、特に、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、又はバリン（Ｖａｌ）のγ−グルタミル化による、該アミノ酸の苦味低減化、酸味増加、及び／又は呈味性（嗜好性）改善、並びに、γ−グルタミルアミノ酸の製造方法に関する。尚、本明細書中における「アミノ酸」とは、γ−グルタミル化されていないアミノ酸を意味する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、アミノ酸は栄養成分等として、栄養ドリンク等の健康・栄養食品に添加されている。しかしながら、アミノ酸の中には、苦味等を有することにより、それらの呈味性（嗜好性）が問題となることがあった。
【０００３】
一方、γ−グルタミルアミノ酸はグルタミン分子中のγ位カルボキシル基が他種アミノ酸分子中のアミノ基とペプチド結合した物質の総称である。各種動物組織、微生物及び植物界に広く分布しているγ−グルタミルトランスペプチターゼ（γＧＴＰ）（γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ））の作用により、アミノ酸にグルタチオンが反応して、グルタチン分子中のγ−グルタミル基が受容体となりアミノ酸に転移されて対応するγ−グルタミルアミノ酸が生成される。又、広範囲の動物組織や臓器中に見出されるγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの作用によって、Ｌ−ピログルタミン酸とＬ−アミノ酸に容易に変換される。
又、特開昭５７−１３２８９６号公報には、γ−グルタミルシステインシンターゼを用いて、特定のアミノ酸を用いてγ−グルタミルアミノ酸を製造する方法が開示されており、それらのγ−グルタミルアミノ酸の多くが抗酸化剤として食品に添加され得る旨の記載がある。しかしながら、該公報には、γ−グルタミルアミノ酸の味覚に関しては何等開示されていない。又、メチオニン、ロイシン、又はバリンを使用したγ−グルタミル化によるγ−グルタミルアミノ酸の製造についても記載されていない。
【０００４】
γ−グルタミルアミノ酸の製造についてはこれまでに幾つかの方法が報告されている。例えば、アルカリゲネス、エルビニア、コリネバクテリウムを用いて他のγ−グルタミルアミノ酸からGlu残基を転移させる方法（特公昭５６−５５１９）、セラチア、エルビニア、コリネバクテリウムを用いてグルタミン酸とアミノ酸から生成させる方法（特公昭５６−５５２０）、及びγ−グルタミルシステインシンターゼを用いてグルタミン酸又はαケトグルタール酸とアミノ酸から製造する方法（特公平１−４１３１５）を挙げることが出来る。又、グルタミル基ドナーとしてグルタミンを用いてγ−グルタミルアミノ酸を製造する方法（J. Bacteriol. Vol. 168, p.1325-1331 (1986)、特開平８−８９２６６）が知られている。このグルタミル基ドナーとしてグルタミンを用いる方法は工業的には有用であるが、γ−グルタミルアミノ酸の生成量が低いという問題点があった。
【０００５】
一方、J. Bacteriol. Vol. 160, p.341-346 (1984)にはP.mirabilis のＧＧＴ酵素の精製について、又、J. Bacteriol. Vol. 168, p.1325-1331 (1986)には大腸菌のＧＧＴ酵素の精製について、夫々記載されている。又、BBRC, Vol.150, p.33-38 (1988) には遺伝子クローニングによるＧＧＴ活性増強とその酵素精製について記載されている。更に、特開平３−２３２４８６には、B.subtilis のＧＧＴ遺伝子の増幅について記載されている。しかしながら、いずれの文献にも、ＧＧＴ又は組換えＧＧＴを用いたγ−グルタミルアミノ酸の製造方法については何等開示されていない。又、これらの文献には、γ−グルタミルアミノ酸の味覚に関しても何等開示されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記課題を解決すべく、アミノ酸、特に、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、ロイシン、又はバリンの苦味を低減し、それらの呈味性（嗜好性）を改善することにある。更に本発明の目的は、新規なγ−グルタミルアミノ酸の製造方法を提供することである。
【０００７】
本発明者は、鋭意研究の結果、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、ロイシン、又はバリンをγ−グルタミル化することにより、それらのアミノ酸が有する苦味が有意に低減し、酸味が有意に増加し、及び／又は呈味性（嗜好性）が有意に改善されることを見出し、本発明を完成させた。更に、γＧＴＰ酵素反応により、γ−グルタミルアミノ酸が効率的に製造されることを見出した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、ロイシン、及びバリンから成る群から選択された少なくとも一つのアミノ酸をγ−グルタミル化することから成る、該アミノ酸の苦味低減、酸味増加、及び／又は呈味性（嗜好性）改善方法に係る。
【０００９】
更に、本発明は、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、ロイシン、及びバリンから成る群から選択された少なくとも一つのアミノ酸を含む食品において、該少なくとも一つのアミノ酸の少なくとも一部を、夫々のアミノ酸に対応するγ−グルタミルアミノ酸、即ち、γ−グルタミルフェニルアラニン、γ−グルタミルメチオニン、γ−グルタミルヒスチジン、γ−グルタミルロイシン、及びγ−グルタミルバリンに代えることによる、該食品の改質方法に係る。
更に、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、ロイシン、及びバリンから成る群から選択された少なくとも一つのアミノ酸の少なくとも一部に代えて、夫々のアミノ酸に対応するγ−グルタミルアミノ酸を使用することを特徴とする、食品の製造方法に係る。
【００１０】
更に、本発明は、上記方法で得られる食品、即ち、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、ロイシン、及びバリンから成る群から選択された少なくとも一つのアミノ酸を含む食品において、該少なくとも一つのアミノ酸の少なくとも一部が、夫々のアミノ酸に対応するγ−グルタミルアミノ酸で代えられていることを特徴とする該食品に係る。尚、食品にアミノ酸とそれに対応するγ−グルタミルアミノ酸の両者が含まれている場合には、該アミノ酸の少なくとも一部が対応するγ−グルタミルアミノ酸で代えられているものと見なされ、従って、かかる食品は本発明方法によって改質又は製造された、本発明の食品に含まれる。
【００１１】
又、本発明は、γ−グルタミルフェニルアラニン、γ−グルタミルメチオニン、γ−グルタミルヒスチジン、γ−グルタミルロイシン、及びγ−グルタミルバリンから成る群から選択された少なくとも一つのγ−グルタミルアミノ酸を有効成分として含有する栄養剤、及び該栄養剤を含む食品に係る。
【００１２】
更に、本発明はグルタミル供与体としてのグルタミン、グルタミル受容体としてのアミノ酸、及びγ−グルタミルトランスペプチターゼ（γＧＴＰ）酵素を反応させることから成る、γ−グルタミルアミノ酸の製造方法に係る。
【００１３】
該γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γＧＴＰ）酵素は、当該酵素の遺伝子によって形質転換された大腸菌から調製されたものであることが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
γ−グルタミルアミノ酸自体は公知物質であり、例えば、Bachem 社、Sigma 社等から市販されており入手可能である。又、各アミノ酸はＬ−体である。
【００１５】
或いは、当業者であれば、前述の各文献に記載された方法でγ−グルタミルアミノ酸を調製することが出来る。更に、以下の実施例で具体的に示すように、本発明の製造方法によって、γ−グルタミルアミノ酸を容易に生成することも出来る。γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γＧＴＰ）酵素の由来は特に問わないが、例えば、大腸菌及びP.mirabilis 等の細菌を挙げることが出来、更に、遺伝子組換えによって該酵素の遺伝子が増強された大腸菌から調製された酵素も使用できる。又、使用する該酵素は精製されていることが好ましい。尚、反応条件及び反応生成物の精製条件等は当業者が適宜選択して決めることが出来る。
【００１６】
本明細書において、「苦味低減」、「酸味増加」、及び「呈味性（嗜好性）改善」とは、以下に示す味覚テストにおいて、アミノ酸と比較してそれに対応するγ−グルタミルアミノ酸が有意な程度に、「苦味」が低減し、「酸味」が増加し、及び「呈味性（嗜好性）」が改善されていることを意味する。
【００１７】
味覚テスト
複数人（人数に特に制限はない。例えば、８人）から成る被験者グループ（健常成人、男女問わず）によって、まず予備試験を行い、各アミノ酸について苦味を感じる最低濃度を求める。こうして決められた最低濃度及びその他の所定の濃度においてアミノ酸とそれに対応するγ−グルタミルアミノ酸につき、甘味、塩味、酸味、苦味、旨味の５原味に加え、辛味、及び、呈味性（嗜好性）の幾つかについて、味覚テストを行う。
【００１８】
呈味性（嗜好性）以外の各味覚テストにおいて、各被験者は「感じない」、「かすかに感じる」、「やや感じる」、「感じる」及び「とても感じる」から成る５段階評価を行い、呈味性（嗜好性）の味覚テストにおいては、各被験者は「嫌な味」、「やや嫌な味」、「どちらでもない」、「やや好きな味」及び「好きな味」から成る５段階評価を行い、各味覚テストにおける上記の評価の夫々に１，２，３，４及び５のスコアを付与する。各アミノ酸とそれに対応するγ−グルタミルアミノ酸の夫々につき、これらスコアの合計点及び平均点を計算する。
【００１９】
この味覚テストにおいて、「苦味」が有意な程度に低減しているとは、例えば、上記スコアの平均点が、１.０ポイント以上、好ましくは２.０ポイント以上、低下するような場合を意味する。「酸味」が有意な程度に増加しているとは、例えば、上記スコアの平均点が、２.１ポイント以上、好ましくは３.０ポイント以上、増加するような場合を意味する。更に、「呈味性（嗜好性）」が有意な程度に改善されているとは、例えば、上記スコアの平均点が、０．５ポイント以上、好ましくは１．０ポイント以上、増加するような場合を意味する。
【００２０】
本発明の食品の改質方法又は製造方法は、例えば、食品製造の任意の段階及び／又は製造後に、アミノ酸の少なくとも一部に代えて、対応するγ−グルタミルアミノ酸を使用することで容易に実施できる。このことによって、その他の製造方法及び手段等を特に変更する必要はない。この場合に、アミノ酸とそれに代わるγ−グルタミルアミノ酸は等量である必要はなく、アミノ酸に代えてより少ない又はより多い量のγ−グルタミルアミノ酸を使用することが出来る。更に、食品に含まれるべき各アミノ酸の全てに代えて、夫々に対応するγ−グルタミルアミノ酸を使用することも出来る。
【００２１】
又、本発明の栄養剤又は食品中の各γ−グルタミルアミノ酸の含有量は、その用途（例えば、栄養成分）・種類・形態、並びに、栄養剤又は食品の種類・形態及びそれに含まれるその他の成分の種類等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。又、本発明のγ−グルタミルアミノ酸を含有する栄養剤は、食品の製造過程における当業者に公知の任意の段階・手段で添加することが出来る。尚、該栄養剤にはγ−グルタミルアミノ酸に加えて更にアミノ酸が含まれていても良い。 更に、本発明の栄養剤又は食品は、例えば、ドリンク飲料、固形バー、ガム、粉状組成物等の当該技術分野で公知の任意の形状・形態をとることが可能である。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらにより何等限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】
味覚テスト
以下の味覚テストで使用したγ−グルタミルアミノ酸は全て市販品（Bachem 社製）である。又、平均スコアは小数点以下第２位を四捨五入して求めた。
【００２４】
Phe とγ -Glu-Phe
予備実験の結果、15 mMでPheは苦味が感じられると判断した。そこで、溶液A：15 mM Phe、溶液B：15 mM γ-Glu-Phe、溶液C：15 mM Phe ＋15 mM Glu の３種類の水溶液を作成した。被験者の舌中央部にピペットマンでサンプルを0.7 mLのせ、溶液１種類につき上記のような基準で評価をしてもらった。純水、Ａ、Ｂ及びＣの順に行い、純水の時のみにそれが純水であることを被験者に告げた。スタート時と、溶液と溶液をなめる合間には、必ずミネラルウォーターで口をゆすいでもらった。この溶液をＡ、Ｂ及びＣの順にテストした。被験者は８人であった。
次に、Pheの濃度を15〜45 mM、γ-Glu-Pheの濃度を15〜45 mMに変え、各味覚がどう変化するかをみた。
【００２５】
その結果、Pheは苦味を呈するが、これをγ−グルタミル化したγ-Glu-Pheは、苦味が有意な程度に低減し、且つ、レモンのような爽やかな酸味が有意な程度に増加することが確認された。更に、γ−グルタミル化したγ-Glu-Pheは、Phe に比べて、呈味性（嗜好性）が有意な程度に改善されていることが判明した。以上の結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
【実施例２】
Met とγ -Glu-Met
Metの濃度を15〜45 mM、γ-Glu-Metの濃度を15〜45 mMに変え、実施例１の味覚テストと同様にして、苦味、酸味、嗜好性がどう変化するかを評価した。得られた結果を以下の表２に示す。
【００２８】
【表２】
【実施例３】
その他のアミノ酸とγ - グルタミルアミノ酸
His (70 mM)、Leu (50 mM)、及びVal (50 mM)について、それらのアミノ酸とγ−グルタミルアミノ酸との苦味、酸味、嗜好性を実施例１の味覚テストと同様にして評価した。得られた結果を以下の表３に示す。
【００３０】
【表３】
【実施例４】
γ -Glu-Phe の製造
反応
Glnをγ-グルタミル基供与体及びPheを受容体として、大腸菌K-12株のGGTを用いてγ-Glu-Pheを合成した。
L-GlnとL-Pheの混合水溶液を調製し、NaOH水溶液でpHを10.4に調整した。GGTは遺伝子増強された大腸菌からBBRC 150(1), 33-38 (1988)の方法に従って調製した。L-GlnとL-Pheの混合液にGGTと純水を加え、L-Gln、L-Phe、GGTの濃度がそれぞれ200 mM, 200 mM, 0.5 U/mlとなるようにしたものを３ ml調製し、37℃の恒温槽で1時間半インキュベートし、等量の10％TCA水溶液を加えて反応を停止した。
【００３２】
生成物の定量
生成物量の測定は以下のように行なった。反応液を15000 rpm, 5 min遠心して得た上澄み0.05 ml に0.5 Mのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.2) 0.95 mlを加え、フィルター濾過した。この溶液をShim-pack Amino-Naカラム、蛍光ディテクターを装着した島津のHPLC(model LC-9A)にインジェクトし、o-phthalaldehydeを検出薬として定量した。その結果、上記反応によりγ-Glu-Pheが140 mM (41.2 g/L) 生成した（対Gln収率70％）。
【００３３】
Large scale での反応
500mL 容の三角フラスコに100 mL の反応溶液（上述の至適条件のもの）を調製し、恒温槽につけて、37℃で反応させ、１時間半後に100 mL の10% トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させた。本反応ではγ-Glu-Pheの生成量は77.7 mM（対Gln収率38.9％）であった。
【００３４】
反応生成物の精製
反応液を8,000rpm, 20min, 4℃で遠心を行い、上澄み液よりγ-Glu-Pheの精製を行った。Dowex 1 X 8 カラムにかけ、分取した画分をHPLCにより分析し、γ-Glu-Pheを多く含む画分を回収した。この画分を凍結乾燥して再度Dowex 1 X 8カラムにより精製し、凍結乾燥してγ-Glu-Pheを単離した。
【００３５】
精製標品の確認
精製した標品を6mg/mlとなるように重水に溶かしてBruker社の500 MHzの装置によりNMRスペクトルを取り、同様にして取った市販（Sigma社製）のγ-Glu−PheのNMRスペクトルと比較することにより、本精製標品がγ-Glu-Pheであることを確認した。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、ロイシン、又はバリンをγ−グルタミル化することにより、有意な程度に、それらのアミノ酸が有する苦味を低減し、酸味を増加し、及び／又は呈味性（嗜好性）を改善させることが出来た。
【００３７】
γ−グルタミルアミノ酸は生体内で対応するアミノ酸に容易に代謝されるので、アミノ酸と実質的に同等の機能を維持するものと考えられる。従って、かかるγ−グルタミルアミノ酸は、従来のアミノ酸としての栄養素等としての機能を維持しつつ、その嗜好性が改善された物質であり、栄養剤又は食品の有効成分として有用である。
【００３８】
更に、本発明の食品は、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、ロイシン、及びバリンから成る群から選択された少なくとも一つのアミノ酸の少なくとも一部を、夫々のアミノ酸に対応するγ−グルタミルアミノ酸で置換することにより改質されているか、又は、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、ロイシン、及びバリンから成る群から選択された少なくとも一つのアミノ酸の少なくとも一部に代えて、夫々のアミノ酸に対応するγ−グルタミルアミノ酸を使用することにより製造される。従って、本発明の食品は、アミノ酸のみを含むものと較べて苦味が低減し、酸味が増加し、及び／又は嗜好性が改善されている。更に、従来はアミノ酸が有する苦味を打ち消すために必要とされていた甘味成分等が不要又はより少量で済むことになり、より食し易いものとなった。
【００３９】
又、γＧＴＰ酵素反応により、グルタミル供与体としてのグルタミン及びグルタミル受容体としてのアミノ酸との反応から、γ−グルタミルアミノ酸が効率的に製造されることが判明した。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention reduces the bitterness, increases the acidity of an amino acid, in particular, by γ-glutamylation of phenylalanine (Phe), methionine (Met), histidine (His), leucine (Leu), or valine (Val). And / or a taste (preference) improvement and a method for producing a γ-glutamyl amino acid. In the present specification, “amino acid” means an amino acid that is not γ-glutamylated.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, amino acids have been added as nutritional components and the like to health and nutritional foods such as energy drinks. However, some amino acids have a bitter taste or the like, so that their taste (preference) may be a problem.
[0003]
On the other hand, γ-glutamylamino acid is a general term for substances in which a γ-position carboxyl group in a glutamine molecule is peptide-bonded to an amino group in another amino acid molecule. Glutathione reacts with an amino acid by the action of γ-glutamyltransferase (γGTP) (γ-glutamyltransferase (GGT)) widely distributed in various animal tissues, microorganisms and plant kingdoms. The glutamyl group becomes a receptor and is transferred to an amino acid to produce the corresponding γ-glutamyl amino acid. Further, it is easily converted into L-pyroglutamic acid and L-amino acid by the action of γ-glutamylcyclotransferase found in a wide range of animal tissues and organs.
Japanese Laid-Open Patent Publication No. 57-132896 discloses a method for producing γ-glutamyl amino acid using a specific amino acid using γ-glutamylcysteine synthase, and many of those γ-glutamyl amino acids are disclosed. There is a description that can be added to food as an antioxidant. However, this publication does not disclose anything about the taste of γ-glutamyl amino acid. Also, there is no description about the production of γ-glutamyl amino acid by γ-glutamylation using methionine, leucine or valine.
[0004]
Several methods have been reported so far for the production of γ-glutamylamino acids. For example, a method of transferring Glu residues from other γ-glutamyl amino acids using Alkaligenes, erbinia, corynebacteria (Japanese Patent Publication No. 56-5519), and generation from glutamic acid and amino acids using serratia, erbinia, corynebacteria Examples thereof include a method (Japanese Patent Publication No. 56-5520) and a method for producing glutamic acid or α-ketoglutaric acid and an amino acid using γ-glutamylcysteine synthase (Japanese Patent Publication No. 1-431515). Also known is a method for producing γ-glutamyl amino acid using glutamine as a glutamyl group donor (J. Bacteriol. Vol. 168, p. 1325-1331 (1986), JP-A-8-89266). This method of using glutamine as a glutamyl group donor is industrially useful, but has a problem that the amount of γ-glutamyl amino acid produced is low.
[0005]
On the other hand, J. Bacteriol. Vol. 160, p.341-346 (1984) describes the purification of P. mirabilis GGT enzyme, and J. Bacteriol. Vol. 168, p.1325-1331 (1986). The purification of E. coli GGT enzyme is described respectively. BBRC, Vol.150, p.33-38 (1988) describes the enhancement of GGT activity by gene cloning and its enzyme purification. Further, JP-A-3-232486 describes the amplification of B. subtilis GGT gene. However, none of the documents discloses a method for producing γ-glutamylamino acid using GGT or recombinant GGT. Also, these documents do not disclose anything about the taste of γ-glutamyl amino acid.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to reduce the bitterness of amino acids, particularly phenylalanine, methionine, histidine, leucine, or valine, and to improve the taste (preference) of the amino acids, in order to solve the above-mentioned problems. Furthermore, the objective of this invention is providing the manufacturing method of a novel (gamma) -glutamyl amino acid.
[0007]
As a result of diligent research, the present inventor has significantly reduced the bitterness of these amino acids, significantly increased the sourness, and / or by γ-glutamylating phenylalanine, methionine, histidine, leucine, or valine, and / or Or the taste (taste) was found to be significantly improved, and the present invention was completed. Furthermore, it has been found that γ-glutamylamino acid is efficiently produced by γGTP enzyme reaction.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention is a method for reducing the bitterness, increasing the acidity, and / or presenting an amino acid comprising γ-glutamylation of at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine, methionine, histidine, leucine, and valine. It relates to a taste (preference) improvement method.
[0009]
Furthermore, the present invention relates to a food containing at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine, methionine, histidine, leucine, and valine, wherein at least a part of the at least one amino acid is γ corresponding to each amino acid. -The present invention relates to a method for modifying a food by replacing it with glutamyl amino acids, i.e., γ-glutamylphenylalanine, γ-glutamylmethionine, γ-glutamylhistidine, γ-glutamylleucine, and γ-glutamylvaline.
Furthermore, in place of at least a part of at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine, methionine, histidine, leucine and valine, γ-glutamyl amino acid corresponding to each amino acid is used. Related to food production method.
[0010]
Furthermore, the present invention relates to a food obtained by the above method, that is, a food containing at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine, methionine, histidine, leucine, and valine, at least a part of the at least one amino acid. Are replaced with γ-glutamyl amino acids corresponding to the respective amino acids. In addition, when a food contains both an amino acid and a corresponding γ-glutamyl amino acid, it is considered that at least a part of the amino acid is replaced by the corresponding γ-glutamyl amino acid. The food is included in the food of the present invention that has been modified or manufactured by the method of the present invention.
[0011]
The present invention also contains at least one γ-glutamyl amino acid selected from the group consisting of γ-glutamylphenylalanine, γ-glutamylmethionine, γ-glutamylhistidine, γ-glutamylleucine, and γ-glutamylvaline as an active ingredient. And a food containing the nutrient.
[0012]
Furthermore, the present invention relates to a method for producing γ-glutamyl amino acid, which comprises reacting glutamine as a glutamyl donor, amino acid as a glutamyl acceptor, and γ-glutamyl transpeptidase (γGTP) enzyme.
[0013]
The γ-glutamyl transpeptidase (γGTP) enzyme is preferably prepared from Escherichia coli transformed with the enzyme gene.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
γ-Glutamylamino acid itself is a known substance, and is commercially available from, for example, Bachem and Sigma. Each amino acid is L-form.
[0015]
Alternatively, those skilled in the art can prepare γ-glutamyl amino acids by the methods described in the aforementioned documents. Furthermore, as specifically shown in the following examples, γ-glutamylamino acid can be easily produced by the production method of the present invention. The origin of the γ-glutamyl transpeptidase (γGTP) enzyme is not particularly limited, and examples thereof include bacteria such as E. coli and P. mirabilis, and further from E. coli in which the gene of the enzyme is enhanced by genetic recombination. Prepared enzymes can also be used. The enzyme used is preferably purified. It should be noted that reaction conditions, purification conditions for reaction products, and the like can be appropriately selected and determined by those skilled in the art.
[0016]
In the present specification, “reduction in bitterness”, “increase in sourness”, and “improvement in taste (preference)” are significant in the taste test shown below in which the corresponding γ-glutamyl amino acid is significant compared to the amino acid. It means that “bitterness” is reduced, “acidity” is increased, and “taste (preference)” is improved.
[0017]
Taste test A preliminary test is first conducted by a group of subjects (regardless of the number of healthy adults, men and women) consisting of multiple persons (no limit on the number of persons, for example, 8 persons), and the lowest concentration at which each amino acid feels bitter is determined. Ask. In addition to the five original tastes of sweetness, salty taste, acidity, bitterness, and umami, amino acids and corresponding γ-glutamylamino acids at the minimum concentration thus determined and other predetermined concentrations, pungent taste and taste (preference) A taste test is conducted on some of these.
[0018]
In each taste test other than taste (preference), each subject gave a five-step evaluation consisting of “not feel”, “feel faint”, “slightly feel”, “feel” and “very feel”. In the taste test of taste (taste), each test subject has 5 levels consisting of “disgusting taste”, “slightly unpleasant taste”, “neither”, “slightly favorite taste”, and “favorite taste”. An evaluation is performed and a score of 1, 2, 3, 4 and 5 is assigned to each of the above evaluations in each taste test. For each amino acid and the corresponding γ-glutamyl amino acid, the total and average points of these scores are calculated.
[0019]
In this taste test, “bitterness” has been reduced to a significant degree, for example, when the average score of the scores is reduced by 1.0 point or more, preferably 2.0 points or more. To do. The phrase “acidity” is increasing to a significant degree means that, for example, the average score is increased by 2.1 points or more, preferably 3.0 points or more. Furthermore, “taste (preference)” is improved to a significant degree, for example, the average score of the score is increased by 0.5 points or more, preferably 1.0 points or more. Means the case.
[0020]
The food modification method or production method of the present invention can be easily carried out, for example, by using a corresponding γ-glutamyl amino acid instead of at least a part of the amino acid after any stage of food production and / or after production. it can. Accordingly, there is no need to particularly change other manufacturing methods and means. In this case, the amino acid and the γ-glutamyl amino acid substituted for the amino acid do not have to be equivalent, and a smaller or larger amount of γ-glutamyl amino acid can be used instead of the amino acid. Furthermore, it replaces with all the amino acids which should be contained in a foodstuff, and can also use (gamma) -glutamyl amino acid corresponding to each.
[0021]
In addition, the content of each γ-glutamyl amino acid in the nutrient or food of the present invention is the use (for example, nutrient component), type and form, and the type and form of the nutrient or food and other contained in it. A person skilled in the art can select appropriately according to the type of the component. Further, the nutrient containing the γ-glutamyl amino acid of the present invention can be added at any stage / means known to those skilled in the art in the food production process. In addition, in addition to (gamma) -glutamyl amino acid, this nutrient may contain the amino acid further. Furthermore, the nutrient or food of the present invention can take any shape and form known in the art, such as a drink, a solid bar, a gum, a powdered composition, and the like.
[0022]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, the technical scope of this invention is not limited at all by these.
[0023]
[Example 1]
Taste test All γ-glutamyl amino acids used in the following taste tests are commercially available (Bachem). The average score was calculated by rounding off the second decimal place.
[0024]
Phe and γ- Glu-Phe
As a result of preliminary experiments, it was determined that Phe felt bitter at 15 mM. Therefore, three types of aqueous solutions were prepared: Solution A: 15 mM Phe, Solution B: 15 mM γ-Glu-Phe, Solution C: 15 mM Phe + 15 mM Glu. A 0.7 mL sample was placed on the center of the subject's tongue with a pipetman, and each type of solution was evaluated according to the above criteria. The test was performed in the order of pure water, A, B, and C, and the subject was informed that it was pure water only when pure water was used. I always had my mouth rinsed with mineral water between the start and the time between licking the solution. This solution was tested in the order of A, B and C. There were 8 subjects.
Next, the concentration of Phe was changed to 15 to 45 mM, and the concentration of γ-Glu-Phe was changed to 15 to 45 mM to see how each taste changed.
[0025]
As a result, Phe exhibits a bitter taste, but γ-Glu-Phe, which is γ-glutamylated, reduces the bitterness to a significant degree and increases the refreshing acidity like lemon to a significant degree. Was confirmed. Furthermore, it was found that γ-glutamylated γ-Glu-Phe had a significant improvement in taste (preference) compared to Phe. The results are shown in Table 1.
[0026]
[Table 1]
[Example 2]
Met and γ- Glu-Met
The Met concentration was changed to 15 to 45 mM and the γ-Glu-Met concentration was changed to 15 to 45 mM, and in the same manner as the taste test of Example 1, how the bitterness, sourness and palatability were evaluated was evaluated. The results obtained are shown in Table 2 below.
[0028]
[Table 2]
[Example 3]
Other amino acids and γ - glutamyl amino acids
For His (70 mM), Leu (50 mM), and Val (50 mM), the bitterness, sourness, and palatability of these amino acids and γ-glutamylamino acid were evaluated in the same manner as the taste test of Example 1. The results obtained are shown in Table 3 below.
[0030]
[Table 3]
[Example 4]
Production of γ- Glu-Phe
reaction
Using Gln as a γ-glutamyl group donor and Phe as an acceptor, γ-Glu-Phe was synthesized using GGT of Escherichia coli K-12 strain.
A mixed aqueous solution of L-Gln and L-Phe was prepared, and the pH was adjusted to 10.4 with an aqueous NaOH solution. GGT was prepared from E. coli with enhanced gene according to the method of BBRC 150 (1), 33-38 (1988). 3 ml of L-Gln and L-Phe mixed solution with GGT and pure water so that the concentrations of L-Gln, L-Phe and GGT are 200 mM, 200 mM and 0.5 U / ml, respectively. The mixture was prepared and incubated in a 37 ° C. constant temperature bath for 1.5 hours, and the reaction was stopped by adding an equal volume of 10% aqueous TCA.
[0032]
Determination of product The amount of product was measured as follows. 0.95 ml of 0.5 M sodium citrate buffer (pH 2.2) was added to 0.05 ml of the supernatant obtained by centrifuging the reaction solution at 15000 rpm for 5 min, and filtered through a filter. This solution was injected into Shimadzu HPLC (model LC-9A) equipped with a Shim-pack Amino-Na column and a fluorescence detector, and quantified using o-phthalaldehyde as a detection agent. As a result, 140 mM (41.2 g / L) of γ-Glu-Phe was produced by the above reaction (relative to Gln yield 70%).
[0033]
Large scale reaction
Prepare a 100 mL reaction solution (the above-mentioned optimal conditions) in a 500 mL Erlenmeyer flask, place it in a thermostatic bath, react at 37 ° C, and after 1 hour and a half, add 100 mL of 10% trichloroacetic acid and react. Was stopped. In this reaction, the production amount of γ-Glu-Phe was 77.7 mM (vs. Gln yield 38.9%).
[0034]
Purification of reaction product The reaction solution was centrifuged at 8,000 rpm, 20 min, 4 ° C, and γ-Glu-Phe was purified from the supernatant. The fraction collected on a Dowex 1 X 8 column was analyzed by HPLC, and a fraction rich in γ-Glu-Phe was collected. This fraction was lyophilized, purified again with a Dowex 1 X 8 column, and lyophilized to isolate γ-Glu-Phe.
[0035]
Confirmation of the purified sample The purified sample was dissolved in heavy water at 6 mg / ml, and the NMR spectrum was taken with a Bruker 500 MHz apparatus. By comparing with the NMR spectrum of γ-Glu-Phe, it was confirmed that the purified sample was γ-Glu-Phe.
[0036]
【The invention's effect】
According to the present invention, γ-glutamylation of phenylalanine, methionine, histidine, leucine or valine reduces the bitterness, amino acidity and / or taste of those amino acids to a significant extent. I was able to improve the sex (taste).
[0037]
Since γ-glutamyl amino acid is easily metabolized to the corresponding amino acid in vivo, it is considered that the function substantially equivalent to that of amino acid is maintained. Accordingly, such γ-glutamyl amino acid is a substance having improved palatability while maintaining the function as a nutrient as a conventional amino acid, and is useful as an active ingredient of a nutrient or food.
[0038]
Furthermore, the food of the present invention is obtained by substituting at least a part of at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine, methionine, histidine, leucine, and valine with γ-glutamyl amino acid corresponding to each amino acid. A γ-glutamyl amino acid corresponding to each amino acid is used instead of at least a part of at least one amino acid that has been modified or selected from the group consisting of phenylalanine, methionine, histidine, leucine, and valine It is manufactured by. Therefore, the food of the present invention has a reduced bitterness, increased sourness, and / or improved palatability as compared with those containing only amino acids. Furthermore, the sweetening ingredient etc. which were conventionally required in order to cancel the bitterness which an amino acid has become unnecessary, and it will be enough, and it became easy to eat.
[0039]
It was also found that γ-glutamyl amino acid is efficiently produced from the reaction with glutamine as a glutamyl donor and amino acid as a glutamyl acceptor by γGTP enzyme reaction.
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