JP4088334B2 - 催不整脈モデル動物 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトと類似の発症メカニズムを有する不整脈モデル動物に関する。詳しくは、薬物のＱＴ間隔の延長を評価可能なモデル動物、その作出方法およびそれを用いた評価方法などに関するものである。

臨床の現場で実際に用いられている抗不整脈薬以外の薬物が、時に心電図のＱＴ間隔を延長し、Ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ（ＴｄＰ）といわれる致死性心室性不整脈を誘発することが報告されている。普通の社会生活を送っていた人が突然死することは、家族はもちろん、社会・経済に対しても大きな損失である。
特定の患者にしか起こらない薬物誘発性ＱＴ延長症候群の発生を、正常動物を用いた従来の非臨床試験の結果から予知することは困難であった。その結果、催不整脈作用を有する薬物が臨床の現場で感受性を有する患者に処方されることになり、上述のような不整脈死という最悪の事態が世界中で多発した。このような薬物誘発性ＱＴ延長症候群の発生に伴う心事故を回避するため、ＩＣＨ（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ：日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議）は、Ｓ７Ｂ（ヒト用医薬品の心室再分極遅延（ＱＴ間隔延長）の潜在的可能性に関する非臨床的評価に関するガイドライン）およびＥ１４（非抗不整脈薬におけるＱＴ／ＱＴｃ間隔の延長と催不整脈作用の潜在的可能性に関する臨床的評価に関するガイドライン）を２００５年５月にステップ４（ＩＣＨ調和ガイドライン最終合意）として調印し、非臨床試験の役割を明確に記載した。例えば、ヒトに被験薬を初めて投与する前に、Ｓ７Ｂ試験の実施を考慮すること、Ｔｈｏｒｏｕｇｈ ＱＴ／ＱＴｃ（ＴｈＱＴ）試験が陰性であってもＳ７ＢにおけるｈＥＲＧ（ｈｕｍａｎ ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ）およびｉｎ ｖｉｖｏ試験が強陽性の場合はそのメカニズムを説明しなければならないこと、Ｓ７Ｂ試験および初期臨床試験の成績に基づいてＴｈＱＴ試験が縮小できることなどが盛り込まれた。これらに基づいて、日本国内では非臨床試験データと厳密なプロトコールによるＰｈａｓｅＩデータがＴｈＱＴ試験の代用になりうるという解釈も生まれつつある。今後、非臨床試験から臨床試験までの医薬品開発の全過程において、インテグレイテッドリスクアセスメント（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）が求められることが予想される。その対応には、非臨床試験の各モデルの特徴の理解および得られた試験結果に対する正確な解釈が前提となる。
現在、心疾患モデルとしていくつかのモデル動物が知られている。心房細動モデルとしては、例えば、アコニチンモデル（Ｍｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｈｅａｒｔ．Ｊ．５８：５９−７０（１９５９））があり、これはアコニチンを心耳に局所投与することによって局所起源の心房細動を起こすものであるが、臨床における発作性心房細動とは直接関係がない。また、無菌性心膜炎モデル（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．８：８７２−８７９（１９８６））は、心房筋表面にタルクパウダを無菌的に散布し、心膜炎を起こすことによって心房性不整脈を誘発し易くしたモデルで、Ｋｕｍａｇａｉらはこのモデルで心房細動が誘発されることを明らかにした。このモデルでは心房細動の発生機序を検討するのに用いられている。
また、特開２００２−２９１３７３号公報には、心不全モデル動物の作製方法が開示されており、イヌやラットなどの動物に冠動脈狭窄と冠動脈および腹部大動脈以外の動脈狭窄とを同時期に開始させるものである。一方、特表２００２−５４３８１２号公報には、突然心臓死を生じさせ得るような心室性不整脈を誘導するモデル動物の作製方法が開示されており、イヌの心臓内に房室ブロックおよび心筋梗塞を作製するものである。また、本発明者らは、ハロセン麻酔イヌおよび慢性房室ブロックイヌの２つの実験モデルを併用することにより、薬物による二次性ＱＴ延長症候群の発生を予測できる評価手法を確立させている（杉山篤、日薬理誌（Ｆｏｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．）１２１，３９３−４００（２００３））。しかし、これらのモデル動物は、不整脈や心不全を発症すると、高い確率で死に至るものであった。

本発明の目的は、薬物誘発性ＱＴ延長症候群の発生を再現性良く評価可能な、生理学的にヒトに類似したモデル動物、その作出方法およびそれを用いた評価方法の提供である。
本発明者らは、上記問題点に鑑み、心臓の形状がヒトに類似しており、薬物動態学的に最もヒトに近いサルをモデルとして採用すべく鋭意検討した結果、薬物誘発性ＱＴ延長症候群を評価可能な不整脈モデルを作出することに成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
〔１〕 サルの催不整脈モデル動物であって、房室結節をアブレーション施行してなるモデル動物。
〔２〕 房室結節がブロックされている前記〔１〕に記載のモデル動物。
〔３〕 前記アブレーション施行がカテーテル先端からの電気刺激である、前記〔１〕に記載のモデル動物。
〔４〕 アブレーション施行後１ヶ月未満の急性期モデルである、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のモデル動物。
〔５〕 アブレーション施行後１ヶ月以上の慢性期モデルである、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のモデル動物。
〔６〕 慢性心不全モデルである、前記〔５〕に記載のモデル動物。
〔７〕 正常サルに比べて、血中の心房性ナトリウム利尿ペプチドまたは脳性ナトリウム利尿ペプチドの濃度が上昇している、前記〔６〕に記載のモデル動物。
〔８〕 交感神経の緊張亢進状態のモデルである、前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモデル動物。
〔９〕 正常サルに比べて、血中ノルアドレナリンの濃度が上昇している、前記〔８〕に記載のモデル動物。
〔１０〕 サルがカニクイザルである、前記〔１〕〜〔９〕いずれか１項に記載のモデル動物。
〔１１〕 サルの心臓内に電極カテーテルを挿入し、当該カテーテルで房室結節をアブレーションする工程を含む、催不整脈モデル動物の作出方法。
〔１２〕 前記カテーテルのサイズが５〜６フレンチである前記〔１１〕に記載の作出方法。
〔１３〕 前記サルがカニクイザルである前記〔１１〕または〔１２〕に記載の作出方法。
〔１４〕 前記〔１〕〜〔１０〕いずれか１項に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、薬物のＱＴ間隔の延長を評価する方法。
〔１５〕 前記〔１〕〜〔１０〕いずれか１項に記載のモデル動物に薬物を投与する工程、
投与した動物のＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔を測定し、投与前の同一動物のＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔と比較する工程、および
前記比較工程により得られた結果に基づいて、薬物のＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔延長の潜在的可能性を評価する工程
を含む、薬物のＱＴ間隔の延長を評価する方法。
〔１６〕 前記〔１〕〜〔１０〕いずれか１項に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、抗不整脈作用を有する候補物質のスクリーニング方法。
〔１７〕 前記〔６〕または〔７〕に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、慢性心不全を改善する候補物質のスクリーニング方法。
〔１８〕 前記〔８〕または〔９〕に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、交感神経の緊張亢進状態を改善する候補物質のスクリーニング方法。
〔１９〕 サルの催不整脈モデル動物であって、当該サルは房室ブロックを呈しており、かつ正常サルに比べて血中の心房性ナトリウム利尿ペプチドまたは脳性ナトリウム利尿ペプチドの濃度が上昇しているモデル動物。
〔２０〕 血中の心房性ナトリウム利尿ペプチドまたは脳性ナトリウム利尿ペプチドの濃度が、正常サルと比べて約２〜５０倍上昇している、前記〔１９〕に記載のモデル動物。
〔２１〕 正常サルに比べて、血中ノルアドレナリンの濃度が上昇している、前記〔１９〕または〔２０〕に記載のモデル動物。
〔２２〕 血中ノルアドレナリンの濃度が、正常サルと比べて約１．５〜５倍上昇している、前記〔２１〕に記載のモデル動物。
〔２３〕 交感神経の緊張亢進状態のモデルである、前記〔２１〕または〔２２〕に記載のモデル動物。
〔２４〕 容量負荷に伴う心肥大および心拡大を合併しているモデルである、前記〔１９〕に記載のモデル動物。
〔２５〕 サルがカニクイザルである、前記〔１９〕〜〔２４〕いずれか１項に記載のモデル動物。

図１は、本発明の催不整脈モデルの作出過程で観察された心電図の例を示す。図１Ａは、房室結節アブレーション施行前における、体表面心電図（ＥＣＧ、上段）およびアブレーションカテーテル先端電極から記録した心内心電図（Ｈｉｓ、下段）を示す。図１Ｂは、房室結節アブレーション施行前後における体表面心電図を示す。
図２は、本発明の催不整脈モデルの作出過程での心臓の形状を調べた結果を示す。図２Ａは、房室結節アブレーション施行前後における胸部Ｘ線写真を示す。図２Ｂは、心胸郭比（ＣＴＲ）の変化を示すグラフである。正常サル（Ｎｏｒｍａｌ）と慢性房室ブロックサル（ＣＡＶＢ）との比較である。
図３は、本発明の催不整脈モデルの神経体液性変化をまとめたグラフである。正常サル（Ｎｏｒｍａｌ）と慢性房室ブロックサル（ＣＡＶＢ）との比較である。図中、^＊印は、統計学的な有意差（Ｐ＜０．０５）を示し、^＊＊印は、統計学的な有意差（Ｐ＜０．０１）を示す。
図４は、本発明の催不整脈モデルの急性期と慢性期における電気生理学的な評価を行った結果を示す。図４Ａは、房室結節アブレーション施行直後の急性期と慢性期における体表面心電図（ＥＣＧ）、単相性活動電位（ＭＡＰ）の典型例を示す。図４Ｂは、急性期と慢性期での各刺激周期における単相性活動電位持続時間（ＭＡＰ９０）、有効不応期（ＥＲＰ）および活動電位終末期（ＴＲＰ）をまとめたグラフである。
図５は、本発明の催不整脈モデルにｄｌ−ソタロールを投与した場合の心電図の結果を示す。図５Ａは、ｄｌ−ソタロールによる心電図変化の典型例を示す。図５Ｂは、ソタロールの心電図ＱＴｃに対する作用のまとめを示す。
図６は、本発明の催不整脈モデルにｄｌ−ソタロールを投与した際に発生した不整脈（Ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ（ＴｄＰ））を示す。図６Ａは、ｄｌ−ソタロール投与による不整脈の発生を調べたホルター心電図である。図６Ｂは、不整脈記録部分の拡大図である。図６Ｃは、各用量投与後に不整脈が観察された個体数を示す。

本発明は、サルの催不整脈モデル動物を提供する。本発明のモデル動物は、房室結節をアブレーションすることにより得られるものである。また、本発明のモデル動物は、自然に房室ブロックを発症したサルであってもよい。房室ブロックを呈するサルが本発明のモデル動物として使用できるか否かは、後述する電気生理学的特性、血中ＡＮＰ、ＢＮＰおよび血中ノルアドレナリンの濃度に基づいて選択することができる。
本発明においてサルとは、実験動物として利用可能なサルであれば特に限定されるものではなく、カニクイザル、アカゲザル、ミドリザル、リスザル、マーモセット、タマリン等があげられるが、評価対象の薬物の使用量を減らすことができるという観点から体格の小さいカニクイザルが好ましい。
本発明において催不整脈とは、ヒトで不整脈を誘発することが知られている薬物を、臨床１日最大投与量の１〜１０倍程度投与した場合に発生する多形性心室頻拍のことであり、自然停止することもあるが、自然停止せずに心室細動へ移行して死に至ることもある。
本発明においてアブレーションとは、カテーテル先端から電気刺激を与えること、詳しくは、電極カテーテル先端から高周波電流を流して、当該先端部が接している組織を電気焼灼することをいう。対象とする組織は、房室結節である。このように房室結節を破壊し、完全房室ブロックを作製することによって、洞結節の興奮が心室に伝わらないため、右心室および左心室は以後ヒス束およびプルキンエ線維のリズムによって血液のポンプ機能を果たすことになる。そのため、心臓から血液を送り出すポンプ機能が低下するとともに心拍数も大幅に減少して心臓に負担が掛かり、結果として心臓全体が肥大化していく。
本発明のモデル動物は、容量負荷に伴う心肥大および心拡大を合併しているモデルでもありうる。
本発明のモデル動物は、アブレーション施行後１ヶ月未満の急性期モデルとアブレーション施行後約１ヶ月以上の慢性期モデルとに大別される。急性期モデルは、血行状態の破綻したモデルともいえる。慢性期モデルは、心臓の予備力の低下した状態である。急性期モデルと慢性期モデルとは、体表面心電図（ＥＣＧ）、単相性活動電位（ＭＡＰ）、単相性活動電位持続時間（ＭＡＰ９０）、有効不応期（ＥＲＰ）および活動電位終末期（ＴＲＰ）などの電気生理学的特性には有意差がない。
慢性期モデルは、正常サルまたは急性期モデルと比べて、心拡大が認められ、血中ＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ：心房性ナトリウム利尿ペプチド）またはＢＮＰ（Ｂｒａｉｎ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ：脳性ナトリウム利尿ペプチド）の濃度が有意に高い。このことから、本発明の慢性期モデルは、慢性心不全モデルとしても用いられうる。本発明の慢性期モデルの血中ＡＮＰまたはＢＮＰの濃度は、正常サルと比べて、約２〜５０倍であり、好ましくは約５〜２０倍高い。
本発明のモデル動物は、正常サルと比べて、血中ノルアドレナリンの濃度が有意に上昇している。このことから、本発明のモデル動物は、交感神経の緊張亢進状態のモデルとしても用いられうる。本発明のモデル動物の血中ノルアドレナリンの濃度は、正常サルと比べて、約１．５〜５倍、好ましくは約２〜３倍高い。
本発明の催不整脈モデル動物は、薬物等の投与により不整脈を発症しても、イヌ等の他の種で作製されたモデル動物とは異なり、致死性には至らず回復するモデルである。このことから、本発明のモデル動物は、不整脈からの回復を待って次の薬物を投与することによって、繰り返し利用することができる。回復時間は、投与する薬物の種類および投与量により一概に言えないが、通常、１日〜２週間である。
本発明は、サルの心臓内に電極カテーテルを挿入し、当該カテーテルで房室結節をアブレーションする工程を含む、催不整脈モデル動物の作出方法を提供する。
用いるサルは前記した通りであり、サルの年齢、雌雄の別などは制約を受けないが、モデル動物として長期生存することが可能であるので、特に、１〜１０歳のサル、好ましくはカニクイザルを用いる。
前記アブレーション工程において、電極カテーテルは、当該技術分野で通常用いられるものを限定なく使用することができるが、カニクイザルの場合、そのサイズが５〜６フレンチであるものが好ましい。
電極カテーテルの挿入部位は、大腿静脈、大腿動脈、肘静脈または外頸静脈などがあげられるが、通常、右大腿静脈から挿入することが好ましい。一例として、まず、サルをペントバルビタールやハロセンなどで麻酔し、さらに呼吸を安定させるために挿管して人工呼吸器から一定量（例えば、１０〜２０ｍｌ／ｋｇ）の酸素または大気を供給する。このようにして、サルの呼吸を安定させたのち、電極が先端部に取り付けられた電極カテーテルを大腿静脈から房室結節領域に挿入し、先端電極を所定位置に固定する。次いで、電極カテーテルから房室結節領域に高周波（例えば、５００ｋＨｚ、２０Ｗ）を約１５秒以上（例、３０秒〜１分間）通電して房室結節を焼き切って破壊し、房室ブロックサルを作製する。アブレーションの条件は、前記例示以外に、用いるサルの種類、年齢等により適宜設定することができる。
このようにして得られた催不整脈モデル動物を用いて、薬物のＱＴ間隔の延長を評価することができる。本発明は、かかる方法を提供する。
薬物のＱＴ間隔の延長を評価する方法は、下記工程を含むことが好ましい：
（１）前記モデル動物に薬物を投与する工程、
（２）投与した動物の心電図におけるＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔を測定し、投与前の同一動物の心電図におけるＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔と比較する工程、および
（３）前記比較工程により得られた結果に基づいて、薬物のＱＴ間隔延長の潜在的可能性を評価する工程。
工程（１）
薬物としては、ＱＴ間隔の延長を評価するあらゆる薬物を用いることができる。また、薬物がＱＴ間隔延長作用や催不整脈作用を示さないことを証明する場合は、これに限定されない。薬物の投与量としては、ＱＴ間隔を延長することが知られている薬物を用いて、本発明のモデル動物においてＱＴ間隔の延長を示すことを確認しておき、これを基に評価対象の投与量の範囲を設定することができる。なお、投与量の最大量は、臨床１日最大投与量の１〜３０倍程度が好ましい。投与方法としては、薬物に応じて適宜設定することができるが、臨床でのヒトへの投与方法と同じであることが好ましい。
工程（２）
ＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔の測定は、工程（１）の投与終了後、投与薬物に応じた適当な時間で行うことができるが、通常、１〜２４時間である。また、モデル動物にホルター心電計を装着させることによって、長時間の監視が可能である。
ＱＴ間隔は、心電図のＱ波の開始点からＴ波の終末点までの間隔を時間で示したものであり、通常ｍｓで表わす。ＱＴｃ間隔（ｍｓ）は、ＱＴ間隔の心拍数による変動を数式で補正した値であり、下記式により求めることができる。
ＱＴｃ＝ＱＴ÷^３√（６０÷心室調律）
ここで、心室調律とは、完全房室ブロックの心室が興奮する頻度であり、単位は回／分である。ここではＦｒｉｄｅｒｉｃｉａが報告した補正式を示している（文献：Ｆｒｉｄｅｒｉｃｉａ，Ｌ．Ｓ．，１９２０．Ｄｉｅ ｓｙｓｔｏｌｅｎｄａｕｅｒ ｉｎ ｅｌｅｋｔｒｏｋａｒｄｉｏｇｒａｍｍ ｂｅｉ ｎｏｒｍａｌｅｎ ｍｅｎｓｃｈｅｎ ｕｎｄ ｂｅｉ ｈｅｒｚｋｒａｎｋｅｎ．Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｓｃａｎｄ．５３，４６９−４８６）が、これに限定されるものではない。
次に、投与した動物のＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔と、投与前の同一動物のＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔とを比較する。ＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔の延長は、（投与後の値）−（投与前の値）で求めることができる。
工程（３）
前記比較により、薬物投与後のＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔が有意に延長された場合、投与薬物は、ＱＴ間隔延長症候群を発症させる危険性を有する薬物と判断することができる。このような判断がなされた薬物は、臨床試験への移行を事前に中止することができる。
本発明のモデル動物を用いて、抗不整脈作用を有する候補物質をスクリーニングすることができ、本発明は、かかるスクリーニング方法（スクリーニング方法Ｉ）を提供する。
（スクリーニング方法Ｉ）
候補物質としては、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
候補物質が抗不整脈作用を有するか否かの判断は、以下のように行う。候補物質を当該物質の投与に適した方法で本発明のモデル動物に投与し、不整脈を発症させることが知られている薬物（陽性対照）を、候補物質より前、候補物質と同時、または候補物質より後に、当該モデル動物に投与し、心電図を測定する。不整脈の発生の有無を心電図で確認することによって、発症を抑制する候補物質を選択する。対照として、陽性対照のみを投与した場合に、不整脈の発生する時期および程度を心電図で測定し、把握しておくことが好ましい。
スクリーニング方法Ｉで用いられる陽性対照としては特に限定されるものではないが、例えば、Ｉａ群もしくはＩＩＩ群の抗不整脈薬の一部、ならびに抗生物質、抗真菌薬、抗アレルギー薬、抗高脂血症薬、抗精神病薬、三環系抗うつ薬、抗がん剤、消化管機能促進薬などの一部があげられ、具体的には、ｄｌ−ソタロール、シサプリド、アステミゾール、ハロペリドール、モキシフロキサシン、テルフェナジン（テルフェナジンとケトコナゾールの併用）などがあげられる。
本発明のモデル動物は、慢性期では慢性心不全モデルとしても有用であり、このモデルを用いて、慢性心不全を改善する候補物質をスクリーニングすることができ、本発明は、かかるスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＩ）を提供する。
（スクリーニング方法ＩＩ）
候補物質は、スクリーニング方法Ｉと同様の物質を用いることができる。
候補物質が慢性心不全を改善するか否かの判断は、以下のように行う。候補物質を当該物質の投与に適した方法で本発明のモデル動物に投与する。慢性疾患の治療薬となり得る物質を対象とするため、候補物質の投与は、長期的に行うことが望ましい。慢性心不全の指標となる血中のＡＮＰおよび／またはＢＮＰの濃度を測定し、一定期間経過後に投与前と比較して有意にＡＮＰおよび／またはＢＮＰの濃度を低下させる候補物質を選択する。
本発明のモデル動物は、交感神経の緊張が亢進した状態にあり、このモデルを用いて、交感神経の緊張亢進状態を改善する候補物質をスクリーニングすることができ、本発明は、かかるスクリーニング方法（スクリーニング方法ＩＩＩ）を提供する。
（スクリーニング方法ＩＩＩ）
候補物質は、スクリーニング方法Ｉと同様の物質を用いることができる。
候補物質が交感神経の緊張亢進状態を改善するか否かの判断は、以下のように行う。候補物質を当該物質の投与に適した方法で本発明のモデル動物に投与する。交感神経の緊張亢進状態の指標となる血中のノルアドレナリンの濃度を測定し、投与前と比較して有意にその濃度を低下させる候補物質を選択する。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
以下の実験は、株式会社イナリサーチ（長野県伊那市西箕輪２１４８番地１８８）において、「動物の愛護及び管理に関する法律の一部を改正する法律」（平成１７年６月２２日、法律第６８号）及び「株式会社イナリサーチ動物実験指針」（２００４年１月１日改訂）を遵守し、当施設の動物実験審査委員会（ＩＡＣＵＣ）による審査を受けた試験計画書に従って適正に実施されている。なお、株式会社イナリサーチは、ＡＡＡＬＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより認定されている（認証番号：００１０７）。
実施例１：催不整脈サルモデルの作出
生後約４年の雄または雌のカニクイザル（約３ｋｇ）にペントバルビタールをゆっくり静注し（３０ｍｇ／ｋｇ）、同時に気管に挿管し、人工呼吸器で一定量（１０〜２０ｍｌ／ｋｇ）の酸素または大気を供給して呼吸を管理した。大腿部を剃毛し、アルコール綿で消毒してから、大腿静脈にガイドワイヤを挿入し、さらにペーシング電極が先端部に取り付けられた電極カテーテル（６フレンチのサイズ）を大腿静脈から右心室まで挿入した。ヒス束心電図が最大に記録できる部位を探して先端の電極を固定し、心内心電図（Ｈｉｓ）を測定した（図１Ａ）。また、この時に体表面心電図（ＥＣＧ）も測定した（図１Ａ）。次いで、電極カテーテルの先端電極から房室結節領域に高周波（５００ｋＨｚ ２０Ｗ）を６０秒間通電して房室結節を電気焼灼し、房室をブロックした。アブレーション施行後の体表面心電図を測定し、施行前の心電図と比較した結果を図１Ｂに示す。
実施例２：催不整脈サルモデルの心拡大の評価
雄または雌のカニクイザルの胸部をＸ線撮影し、心胸郭比を計測した。次に、アブレーションを施行して約１２ヶ月経過したカニクイザルの胸部をＸ線撮影し、心胸郭比を比較した。計算式は、最大心臓横径÷最大胸郭横径×１００を用いた。結果を図２に示す。
図２Ａは、完全房室ブロック作成の手術により心臓が拡大した一例を示しており、心胸郭比は４４％から６０％に変化していた。図２Ｂは、同一個体で評価した３例を含む６例の心胸郭比の平均値を示しており、完全房室ブロックにより統計学的に有意に心胸郭比が増大していた。このことから、完全房室ブロックによる心不全に対する代償機構が働いた結果、心臓が拡大したことが明らかとなった。
実施例３：催不整脈サルモデルの生理学的および生化学的検査
正常カニクイザル（Ｎｏｒｍａｌ）と実施例１で得られた慢性房室ブロックサル（ＣＡＶＢ、アブレーション後約２ヶ月経過したサル）から採血し、常法に従って、アルドステロン（Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ）、アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）ＩＩ、ＰＲＡ、アドレナリン（Ａｄｒｅｎａｌｉｎｅ）、ノルアドレナリン（Ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ）、ドパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）、ＡＮＰ、ＢＮＰについて血中濃度を測定した。結果を図３に示す。
図３に示すように、慢性房室ブロックサルは正常サルと比較して、ノルアドレナリン、ＡＮＰおよびＢＮＰの値が有意に高かった。このことから、本発明のサルモデルは、交感神経系が亢進した状態にあり、また、慢性心不全の兆候を有することがわかった。
実施例４：催不整脈サルモデルの電気生理学的評価
実施例１で得られたサルモデルの急性期（アブレーション直後）と慢性期（アブレーション後２ヶ月）における電気生理学的な評価を行った。ペントバルビタール麻酔下で四肢第二誘導心電図を記録した。大腿静脈より単相性活動電位記録およびページング用のカテーテル電極（１６７５Ｐ、ＥＰテクノロジー社製）を右心室内に留置し、単相性活動電位を記録した。心電図は心電図アンプ（ＡＣ−６１１Ｇ、日本光電社製）、単相性活動電位はＤＣプレアンプ（３００、ＥＰテクノロジー社製）で増幅し、モニタ（ＶＣ−６０４Ｇ、日本光電社製）上に信号を記録した。心臓ペーシングはカーディアックスティムレータ（ＳＥＣ−３１０２、日本光電社製）を用い、刺激閾値の約２倍に相当する１〜２Ｖで心室を刺激した。
結果を図４に示す。図４Ａは、房室結節アブレーション施行直後の急性期と慢性期における体表面心電図（ＥＣＧ）および単相性活動電位（ＭＡＰ）の典型例を示す。図４Ｂは、急性期と慢性期での各刺激周期における単相性活動電位持続時間（ＭＡＰ９０）、有効不応期（ＥＲＰ）および活動電位終末期（ＴＲＰ）をまとめたグラフである。これらの結果は、本発明のサルモデルの急性期と慢性期における心室筋の電気生理学的性質に違いが認められないことを示している。
実施例５：ｄｌ−ソタロールによるＱＴ間隔延長の評価
実施例１で得られた慢性房室ブロックサルを用い、ホルター心電計を用いて２４時間心電図を記録した。対照液剤として０．５％メチルセルロース溶液を経口投与して心電図の変化を観察し、後日、同じ動物に５ｍｇ／ｋｇのｄｌ−ソタロール（３群抗不整脈剤）を経口投与して心電図を測定した。結果を図５に示す。
図５に示すように、５ｍｇ／ｋｇのｄｌ−ソタロールの経口投与によりＱＴｃ間隔の延長が認められ、溶媒群に比較して１〜４時間後に統計学的に有意な作用が認められた。このことから、ｄｌ−ソタロールの５ｍｇ／ｋｇはＱＴ間隔を十分に延長させる用量であることがわかった。
実施例６：ｄｌ−ソタロール投与によるＴｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ（ＴｄＰ）の発生の観察
実施例１で得られた慢性房室ブロックサルモデル５例にホルター心電計を装着し、１、３、５または１０ｍｇ／ｋｇのｄｌ−ソタロールをそれぞれ経口投与し、投与後の心電図をモニターした。結果を図６に示す。
図６Ａに、５ｍｇ／ｋｇのｄｌ−ソタロールを経口投与した際の心電図の一例を示す。図６Ｂに拡大して示した心電図がＴｄＰの典型例であり、ここに示した１１分間の間にも数回同様な不整脈が出現している。慢性房室ブロックサルモデルで発生したＴｄＰの特徴は、すべてが自然停止することである。図６Ｃに、５例に各用量のソタロールを投与した際のＴｄＰ発生例数をまとめた。５ｍｇ／ｋｇで５例中４例、１０ｍｇ／ｋｇでは全例にＴｄＰが発生したが、すべてが自然停止し、心室細動に移行して死に至る個体はなかった。このことから、慢性房室ブロックサルモデルはイヌを用いたモデルとは異なり、繰り返して薬物評価に利用することができることがわかった。

本発明のモデル動物は、サルの房室結節のアブレーションにより得られた動物であるので、心臓の形状および薬物動態が最もヒトに近いモデルとなり得る。また、本発明のモデル動物は、房室ブロックを呈しており、不整脈を誘発しやすいモデルである。かかるモデル動物を提供することにより、非臨床的試験の段階で、候補薬物による誘発性ＱＴ延長症候群の発症を的確に評価することが可能となる。また、サル以外の種から作製された他のモデル動物が致死性の不整脈を発症させるのに対して、本発明のモデル動物は、意外にも不整脈を回復させることができる。したがって、貴重なモデル動物を有効に利用することができるとともに、同一のモデル動物を繰り返し評価試験に用いることができ、個体差の変動のない評価結果を得ることができる。この特徴を利用して、多種類の薬物試験または１種類の薬物の多様な試験を同一の基準（同一動物）で比較することができる。モデル動物の供給源としてカニクイザルを用いた場合、体格（体重）や心臓の大きさがイヌ等のモデル動物よりも小さいことから、評価に使用する薬物の量を低減することが可能であり、費用の節約にもつながる。さらに、本発明のモデル動物は、慢性心不全モデルまたは交感神経の緊張亢進状態のモデルとしても利用することができる。
本発明のモデル動物の作出方法によれば、前記したモデル動物を確実に提供することが可能となる。本発明の評価方法によれば、非臨床的試験の段階で、候補薬物による誘発性ＱＴ延長症候群の潜在的可能性を的確に評価することが可能となる。本発明のスクリーニング方法によれば、抗不整脈作用を有する候補物質、慢性心不全を改善する候補物質または交感神経の緊張亢進状態を改善する候補物質を有意に選別することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００５−３１５４３４（出願日：２００５年１０月２８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (25)

1. サルの催不整脈モデル動物であって、房室結節をアブレーション施行してなるモデル動物。
2. 房室結節がブロックされている請求の範囲１に記載のモデル動物。
3. 前記アブレーション施行がカテーテル先端からの電気刺激である、請求の範囲１に記載のモデル動物。
4. アブレーション施行後１ヶ月未満の急性期モデルである、請求の範囲１〜３いずれか１項に記載のモデル動物。
5. アブレーション施行後１ヶ月以上の慢性期モデルである、請求の範囲１〜３いずれか１項に記載のモデル動物。
6. 慢性心不全モデルである、請求の範囲５に記載のモデル動物。
7. 正常サルに比べて、血中の心房性ナトリウム利尿ペプチドまたは脳性ナトリウム利尿ペプチドの濃度が上昇している、請求の範囲６に記載のモデル動物。
8. 交感神経の緊張亢進状態のモデルである、請求の範囲１〜５いずれか１項に記載のモデル動物。
9. 正常サルに比べて、血中ノルアドレナリンの濃度が上昇している、請求の範囲８に記載のモデル動物。
10. サルがカニクイザルである、請求の範囲１〜９いずれか１項に記載のモデル動物。
11. サルの心臓内に電極カテーテルを挿入し、当該カテーテルで房室結節をアブレーションする工程を含む、催不整脈モデル動物の作出方法。
12. 前記カテーテルのサイズが５〜６フレンチである請求の範囲１１に記載の作出方法。
13. 前記サルがカニクイザルである請求の範囲１１または１２に記載の作出方法。
14. 請求の範囲１〜１０いずれか１項に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、薬物のＱＴ間隔の延長を評価する方法。
15. 請求の範囲１〜１０いずれか１項に記載のモデル動物に薬物を投与する工程、
    投与した動物のＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔を測定し、投与前の同一動物のＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔と比較する工程、および
    前記比較工程により得られた結果に基づいて、薬物のＱＴ間隔またはＱＴｃ間隔延長の潜在的可能性を評価する工程
    を含む、薬物のＱＴ間隔の延長を評価する方法。
16. 請求の範囲１〜１０いずれか１項に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、抗不整脈作用を有する候補物質のスクリーニング方法。
17. 請求の範囲６または７に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、慢性心不全を改善する候補物質のスクリーニング方法。
18. 請求の範囲８または９に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、交感神経の緊張亢進状態を改善する候補物質のスクリーニング方法。
19. サルの催不整脈モデル動物であって、当該サルは房室ブロックを呈しており、かつ正常サルに比べて血中の心房性ナトリウム利尿ペプチドまたは脳性ナトリウム利尿ペプチドの濃度が上昇しているモデル動物。
20. 血中の心房性ナトリウム利尿ペプチドまたは脳性ナトリウム利尿ペプチドの濃度が、正常サルと比べて約２〜５０倍上昇している、請求の範囲１９に記載のモデル動物。
21. 正常サルに比べて、血中ノルアドレナリンの濃度が上昇している、請求の範囲１９または２０に記載のモデル動物。
22. 血中ノルアドレナリンの濃度が、正常サルと比べて約１．５〜５倍上昇している、請求の範囲２１に記載のモデル動物。
23. 交感神経の緊張亢進状態のモデルである、請求の範囲２１または２２に記載のモデル動物。
24. 容量負荷に伴う心肥大および心拡大を合併しているモデルである、請求の範囲１９に記載のモデル動物。
25. サルがカニクイザルである、請求の範囲１９〜２４いずれか１項に記載のモデル動物。

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