JP4078778B2

JP4078778B2 - Xylooligosaccharide composition

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Publication number: JP4078778B2
Application number: JP2000033841A
Authority: JP
Inventors: 可也泉; 尚也安住
Original assignee: Oji Holdings Corp; Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd; Oji Holdings Corp
Priority date: 2000-02-10
Filing date: 2000-02-10
Publication date: 2008-04-23
Anticipated expiration: 2020-02-10
Also published as: JP2001226409A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キシロオリゴ糖含有組成物に関する。更に詳しくは、キシロースの２量体から１０量体を主な成分とするキシロオリゴ糖組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キシロオリゴ糖は腸内細菌の選択的な増殖促進効果を通して、おなかの調子を良好に保つ機能を有する特定保健用食品として認定された乳酸菌飲料、チョコレートなどに利用される有用な糖類である。また、ヒトの食品用途だけではなく家畜の飼料としての用途もある。さらに、医薬、サニタリー製品の分野でも乳化剤、皮膚の保湿成分としての用途がある。
【０００３】
一般に、特定保健食品用に用いられるオリゴ糖類はその殆どが整腸作用、即ち腸内悪玉菌である大腸菌や腸内腐敗発酵菌であるクロストリジウム属の菌の数を減らし、相対的に腸内善玉菌といわれるビフィズス菌を増加させる作用を持っている。小麦フスマはキシランを主鎖とするヘミセルロースからなる多糖である。小麦フスマは難分解性の植物繊維であり、従来、整腸作用を持つ食品添加物として使用されてきている。
【０００４】
小麦フスマは、それを摂取した後に現れる排便時の爽快感により漠然とした整腸作用の効果が認識されてきたが、その本来の効果は、小麦フスマが腸内において腸内細菌により分解されて生成されるキシロオリゴ糖に由来するとされている。小麦フスマ由来のキシロオリゴ糖は、腸内善玉菌のビフィズス菌の選択的増殖を促す一方で、腸内悪玉菌である大腸菌の数を相対的に低下させると言われている。大腸菌や腸内腐敗発酵菌は腸内で増殖しながら発ガン性物質を生産することが知られていることから、大腸菌や腸内腐敗発酵菌の数を腸内で減らすことは長期にわたる健康を考えた場合に重要である。
【０００５】
以上のような理由から、整腸作用を有する糖類の研究が鋭意開発されてきているが十分な性能を有したオリゴ糖類の開発には至っていない。その理由の一つは、試験管内（in vitro）でのオリゴ糖類の整腸作用の効果が実際の生体内（in vivo ）での効果に結びつく例が少ないことに起因する。このin vitroとin vivo での効果の差は被試験物質であるオリゴ糖類が腸内に至る過程で胃酸やその他の消化液により変性することに原因があるとされている。
【０００６】
特に胃酸による酸加水分解によるオリゴ糖の重合度の低下が大きな問題である。オリゴ糖は酸加水分解により徐々に低分子化し最終的には大腸菌やクロストリジウム属に属する腐敗性嫌気性菌でも資化することが可能な単糖にまで分解されることが知られている。
しかし、キシロオリゴ糖はオリゴ糖の中でも胃酸に対する抵抗性が他のオリゴ糖に比べて高く、低分子化されることなく腸内に届けられるため、実際に生体内での整腸効果が確認されるオリゴ糖の代表格となっている。
【０００７】
胃酸やその他の消化液での分解を考慮すれば、キシロオリゴ糖を摂取することにより得られる選択的増殖促進効果はキシロオリゴ糖の鎖長が長いほど優れていると言われている。特に３量体以上１０量体程度までのキシロオリゴ糖が選択的増殖性に有効である。１０量体以上の鎖長を持つキシロオリゴ糖でも腸内乳酸菌がキシラナーゼを生産し、分解資化を行うので問題はないと言われている。
【０００８】
現在上市されているキシロオリゴ糖は、小麦フスマやコーンコブといった草本類を原料として作られているが、これらの草本植物中のキシラン主鎖にはグルクロン酸など他の糖が側鎖に分枝している。側鎖が多いキシランからはキシロースのみを構成糖とするオリゴ糖は重合度が比較的小さいものしか生成することができない。それは側鎖を除く作業過程により主鎖であるキシラン鎖も徐々に低分子化していくからである。現状では上市されているキシロオリゴ糖を構成するオリゴ糖は２量体や３量体を主成分とするものがほとんどであり、より重合度の大きなキシロオリゴ糖の開発が望まれている。
【０００９】
天然物に由来するヘミセルロース材料中のキシランを酵素的に分解処理する場合、使用する酵素であるキシラナーゼの違いにより分解生成物に大きな違いが現れる。一般に真菌類であるカビやキノコに由来するキシラナーゼでは酵素であるキシラナーゼの基質特異性が比較的にルーズであり、また糖化力がバクテリア由来のキシラナーゼに比べ非常に高いという特徴がある。このため酵素として真菌類に由来する酵素液を用いてキシロオリゴ糖組成物を生成させた場合、基質であるキシランを一気に分解してしまい、キシロオリゴ糖組成物中のキシロビオースの存在比が７０％以上であるようなキシロオリゴ糖組成物を作ってしまう。
【００１０】
現在上市されているキシロオリゴ糖は、真菌類に由来するキシラナーゼを用いて作製されており、オリゴ糖を構成する構成糖の種類は主に２量体と３量体となっている。一方、バクテリアが生産するようなキシラナーゼを用いてキシロオリゴ糖を生成させた場合、酵素の基質特異性が真菌類のキシラナーゼと大きく異なるため、生成するキシロオリゴマーの組成比が２量体であるキシロビオースから５量体までのきれいな分布でキシロオリゴ糖を生成する（特開平１−２５２２８０号公報）。
【００１１】
本発明者らは、今回、使用する酵素がバチルス属に由来する中性好熱キシラナーゼで、なおかつ原材料が広葉樹化学パルプであるようなリグノセルロース材料を用いた場合、キシロースの２量体から１０量体にわたるキシロオリゴ糖の分布を有するキシロオリゴ糖組成物を得ることができること、このキシロオリゴ糖組成物中では分子量が大きな５量体から１０量体が比較的多く含まれ、さらにはこのキシロオリゴ糖の組成物中でのキシロビオースの存在比はキシロオリゴ糖組成物中の全糖量の約１０％以下であることを見いだした。
キシロビオースが酸加水分解した場合、大腸菌等腸内有害菌が容易に資化し得るキシロースに変換されることを考えると、一般的にキシロオリゴ糖は酸加水分解に対する抵抗力が強いとはいえ、キシロビオースの存在比が低いことは機能性を保持する上で重要である。
【００１２】
このように、化学パルプ由来のリグノセルロースを材料として製造されたキシロオリゴ糖組成物はコーンコブや綿実殻を原料として製造されたキシロオリゴ糖よりも平均重合度が高いという特徴がある。リグノセルロースを材料とした場合、使用する酵素を調整することで平均重合度が２から平均重合度が１０までの任意の比率で新規なキシロオリゴ糖を作ることが可能である。
【００１３】
更に注目すべき点としては、平均重合度が高い新規なキシロオリゴ糖組成物は腸内乳酸菌に対して選択的な増殖性を示すと同時に、食中毒の原因となるビブリオ属の細菌であるVibrio parahaemolyticus IFO 12711 , Vibrio(Listonella) anguillarum IFO 13266といった人に対して有害である細菌に対しても静菌力を発揮する点である。２量体、３量体を主な構成糖とするキシロオリゴ糖組成物では人に対して有害であると思われるこれらの細菌類に対しての静菌作用がほとんどない。しかし鎖長の長いオリゴ糖鎖が静菌力を発揮することは全く新しい知見であり、そのことを見いだすことで、本発明を完成するに至った。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、現状では上市されているキシロオリゴ糖を構成するオリゴ糖は２量体や３量体を主成分とするものがほとんどであり、より重合度の大きなキシロオリゴ糖の開発が望まれている。
それ故、本発明は胃酸やその他の消化液での分解を受けることなく腸内に届けられるため、生体内での整腸効果が高い、分子量の大きな５量体〜１０量体を多く含有するキリロオリゴ糖組成物を提供することを目的とするものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための本発明は、基本的には、キシロオリゴ糖鎖で１０糖鎖までを主な含有成分とするキシロオリゴ糖組成物に関するものであり、次の各発明を基礎として構成される発明である。
【００１６】
(1) キシロースの２〜１０量体の混合物であり、３量体以下のキシロオリゴ糖含有率が４０％以下で、かつ平均重合度が４以上、好ましくは５以上であるキシロオリゴ糖組成物。
(2) 上記キシロオリゴ糖組成物が、キシラン及び／又はヘミセルロースを酵素的又は物理化学的に処理することによって得られたものであることを特徴とする(1) 項記載のキシロオリゴ糖組成物。
(3) 前記キシロオリゴ糖組成物は、リグノセルロース材料をヘミセルラーゼを用いて処理する工程を経て得られたものであることを特徴とする(1) 項又は(2) 項に記載のキシロオリゴ糖組成物。
【００１７】
(4) 前記キシロオリゴ糖組成物は、前記ヘミセルラーゼを用いて処理する工程より得られる糖溶液をさらに酸加水分解処理する工程を経て得られたものであることを特徴とする(3) 項記載のキシロオリゴ糖組成物。
(5) 前記ヘミセルラーゼを用いて処理する工程より得られる糖溶液は、キシロースの２〜１０量体の混合物とキシロオリゴ糖とリグニン様物質の複合体との混合物を含有する糖溶液であることを特徴とする(4) 項記載のキシロオリゴ糖組成物。
(6) 前記酸加水分解処理する工程は、前記ヘミセルラーゼを用いて処理する工程より得られる糖溶液を濃縮する工程を経て得られる糖溶液を酸加水分解処理する工程であることを特徴とする(4) 項又は(5) 項に記載のキシロオリゴ糖組成物。
【００１８】
(7) 酵素処理工程においてキシラン及び／又はヘミセルロースをヘミセルラーゼを用いて処理し、得られる糖溶液を加水分解処理工程において酸加水分解処理し、次いで精製・分離工程において該加水分解処理工程から得られる処理液からキシロオリゴ糖成分を分離・回収することを特徴とする、重合度が３以下のキシロオリゴ糖含有率が４０％以下でありかつ平均重合度が４以上、好ましくは５以上であるキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
【００１９】
(8) 前記加水分解処理工程は、前記酵素処理工程から得られる糖溶液を濃縮した糖溶液について行われる工程であることを特徴とする、(7) 項記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
(9) 前記酵素処理工程は、キシラン及び／又はヘミセルロースを含むリグノセルロース材料をヘミセルラーゼによって処理する工程であることを特徴とする、(7) 項又は(8) 項に記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
【００２０】
(10)前記酵素処理工程は、酵素としてキシラナーゼを使用した酵素処理工程であることを特徴とする、(7) 項〜(9) 項のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
(11)前記酵素処理工程は、ｐＨ３〜１０、好ましくは５〜９の範囲に調整した糖溶液を、１０℃〜９０℃、好ましくは３０℃〜６０℃の温度で酵素処理する工程であることを特徴とする、(7) 項〜(10)項のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
(12)前記加水分解処理工程は、ｐＨを約３．５以下、又はそれ以下の値に調整した糖溶液を、１０５℃〜１５０℃、好ましくは１１０℃〜１２１℃の温度で、１５分以上、好ましくは３０分〜６０分間加熱して酸加水分解処理を行う工程であることを特徴とする、(7) 項〜(11)項のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
【００２１】
(13)前記精製・分離工程は、前記酸加水分解処理工程から得られる糖溶液を、陽イオン交換樹脂カラム−陰イオン交換樹脂カラム−活性炭カラムの順序で通して精製する工程を含むことを特徴とする、(7) 項〜(12)項のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖組成物の製造方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明の新規キシロオリゴ糖組成物は、そのオリゴ糖組成物中の比較的重合度の大きなキシロオリゴ糖の含有率が高いという特徴を持つ。本発明の新規なキシロオリゴ糖組成物の平均重合度を測定した場合、平均重合度は４以上、好ましくは５以上である。もちろん使用する酵素や酸処理の条件を変更することで平均重合度がさらに高い値のキシロオリゴ糖組成物を自由に設計製造することが可能なことは言うまでもない。これに対して、現在上市されているキシロオリゴ糖の平均重合度を測定したとき、その値は平均重合度３以下となり、オリゴ糖中の構成糖が２量体、３量体から主としてなるものである。
【００２３】
本発明の新規キシロオリゴ糖組成物は、リグノセルロース材料をヘミセルラーゼ処理した後に、希酸により酸加水分解することによって重合度の大きなキシロオリゴ糖を含む液体として得ることができる。
リグノセルロースとしてのパルプをヘミセルラーゼ処理する際のパルプ濃度は１〜３０重量％、好ましくは２〜１５重量％の範囲で行われるが、広葉樹クラフトパルプ以外のリグノセルロースを製造原料に用いる場合はこの限りではない。たとえば、リグノセルロースに由来するキシランについて、処理時のパルプ濃度を例示すると、小麦フスマ由来キシランでは０．５〜５％、好ましくは２％前後、コーンコブ由来キシランでは１〜１０％、好ましくは５％前後、綿実殼由来キシランでは１〜１０％、好ましくは５％前後、粉砕コーンパイプでは０．２〜５％、好ましくは１％前後、カラスムギ由来キシランでは０．２〜５％、好ましくは１％前後などである。
【００２４】
本発明のキシロオリゴ糖組成物を得ることができる原料リグノセルロース物質としては針葉樹や広葉樹のような木材が好ましく用いられるが、ケナフ、麻、バガス、イネ等の非木本性の植物であってもよく、特に限定されるものではない。本発明に使用されるパルプは、化学パルプ、機械パルプ、脱墨パルプ等何でもよいが、広葉樹化学パルプが好ましい。化学パルプを得るための蒸解法としては、クラフト蒸解、ポリサルファイド蒸解、ソーダ蒸解、アルカリサルファイト蒸解等の公知の蒸解法を用いることができるが、パルプ品質、エネルギー効率等を考慮するとクラフト蒸解法が好適に用いられる。
【００２５】
リグノセルロース材料として広葉樹クラフトパルプを用いる場合、まずアルカリ酸素漂白工程で漂白したパルプをヘミセルラーゼで処理することが望ましいが、蒸解後のパルプや、機械パルプをそのままヘミセルラーゼ処理原料として用いても良い。
クラフト蒸解で得られたパルプ表面には蒸解工程でパルプ繊維内より溶出されたヘミセルロースが再吸着されていることは周知である。この再吸着したヘミセルロースはその９０％以上がＤ−キシロースがβ１→４結合することによって構成されたキシランである。
【００２６】
広葉樹クラフトパルプではヘミセルロース中の側鎖であるアラビノースやグルクロン酸はそのほとんどが分解除去されている。また側鎖の中の４−Ｏ−メチルグルクロン酸は側鎖として残存するがアルカリ条件下でヘキセンウロン酸へと変換される。このヘキセンウロン酸は酸性条件下で加熱すると容易に分解除去されるのでキシロオリゴ糖の製造にはあまり問題ない。よって化学パルプ表面の再吸着キシランは、通常の植物中の細胞壁内に存在するキシランと違ってパルプの蒸解工程において抽出された際に、その主鎖であるキシランに結合している側鎖の大部分は分解除去されていることになる。そのため再吸着キシランは通常の細胞壁中のキシランと比べて側鎖の保有率が非常に低い。
【００２７】
再吸着分を含めたキシラン含量は広葉樹クラフトパルプ絶乾重量の約２０％を占める。ヘミセルラーゼ処理においては、酵素が広葉樹クラフトパルプに作用し、再吸着分を含むキシラン全般に作用してこれを低分子化する。例えばバチルス・エスピ−Ｓ−２１１３株のキシラナーゼ（特開平８−２２４０８１号公報参照）を利用する場合、処理反応液中に生じるキシロース及びキシロオリゴ糖の構成糖の割合は、３〜５量体が最も多く、単量体が少ない組成比のオリゴ糖を生成する。
【００２８】
本発明者らは、すでに、広葉樹クラフトパルプのヘミセルラーゼ処理工程より得られる排水中にキシロオリゴ糖とリグニン様物質が結合したキシロオリゴ糖複合体が存在することを見いだしている。更にはキシロオリゴ糖複合体は比較的重合度の大きなオリゴ糖にリグニン様の物質が結合していることを見いだしている。このキシロオリゴ糖複合体は希酸処理により容易にキシロオリゴ糖とリグニン様物質を分離除去し得るので重合度の大きなキシロオリゴ糖を大量安価に製造できる。
【００２９】
現在のところ、大規模な酵素処理工程で利用されている酵素はそのほとんどがヘミセルラーゼであるが、市販のヘミセルラーゼのいずれも本発明のキシロオリゴ糖の製造方法における酵素処理工程に用いることができる。例えば商品名カルタザイム（クラリアント社製）、商品名エコパルプ（ローム・エンザイム社製）、商品名スミチーム（新日本化学工業社製）、パルプザイム（ノボノルディクス社製）などの市販の酵素製剤や、トリコデルマ属、テルモミセス属、オウレオバシヂウム属、ストレプトミセス属、アスペルギルス属、クロストリジウム属、バチルス属、テルモトガ属、テルモアスクス属、カルドセラム属、テルモモノスポラ属などの微生物により生産されるキシラナーゼを使用することができる。
【００３０】
酵素処理温度は、１０〜９０℃、好ましくは３０〜６０℃の範囲であるが、酵素の至適温度に近い処理温度がより好ましい。一般的な酵素の場合、処理温度が１０℃未満では反応が不十分となる上、そのような温度を得ること自体に多大のコストを要するので適さない。一方、温度が９０℃を超えて高くなると、処理系を密閉化しないと熱ロスが大きくなる上、一般的な酵素の場合、酵素自体が変性し、不活性になるので適さない。処理時の溶液ｐＨは３〜１０、好ましくは５〜９の範囲であるが、酵素の至適ｐＨに近いｐＨがより好ましい。
広葉樹クラフトパルプをアルカリ酸素漂白して得られるパルプを酵素処理して糖液を得る場合、パルプのｐＨがアルカリ側に傾いているため、酵素の至適ｐＨがアルカリ側に近い酵素の方がｐＨを調整する際のコストも低く優位性がある。もしｐＨの調整が必要な場合は、任意の酸性溶液又はアルカリ性溶液を添加して調整し、酵素処理を行えばよいことは言うまでもない。
【００３１】
酵素処理により得られた糖液中にはキシロオリゴ糖（２〜１０量体）とキシロオリゴ糖複合体が含まれる。酵素処理液中の糖濃度は、バチルス・エスピー２１１３株（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所寄託菌株ＦＥＲＭＢＰ−５２６４）の生産するキシラナーゼを対パルプ絶乾重当たり１ユニット（１ユニットは１分間に１マイクロモルのキシロースを遊離させる酵素力）で使用し、１０％濃度のパルプスラリー中に添加して処理した場合、約３０００μｇ／ｍｌ（キシロース換算）である。
【００３２】
この糖溶液は、後段の製造工程を考慮に入れた場合、荷電ＮＦ膜やその他の限外ろ過膜、逆浸透膜などの膜分離技術を用いて濃縮したり、エバポレーション等の濃縮作業により糖濃度を上昇させる作業を行うことも可能である。実際に糖液のボリュームを減らすことは大量の糖液を後段の精製工程で処理する際のハンドリングを容易にする。加えて言うならば、膜濃縮における作業より得られた透過液は糖濃度が酵素処理液より低く、リグニン等着色性の有機物含量が少ない特徴を持つ。このため、膜濃縮工程より得られる透過液はパルプ製造工程における工業用水として再利用できる。
【００３３】
糖溶液もしくは濃縮処理工程後の糖溶液については、希酸による酸加水分解処理を行ってキシロオリゴ糖複合体をキシロオリゴ糖とリグニン様物質とに分離する。糖液のｐＨの調整方法としては、糖液に対して鉱酸もしくは有機酸を適宜添加して糖液のｐＨを３．５付近に調整することが一般的であるが、アンバーライト２００Ｃ（商品名、ローム・アンド・ハース社製）といったカチオン交換樹脂で糖液を処理してイオン交換によりｐＨを下げることも可能である。
次いでｐＨ調整の終わった糖溶液を１０５℃〜１５０℃、好ましくは１１０℃〜１２１℃の範囲で加熱し、酸加水分解の処理を行う。処理時間は１５分以上であるが好ましくは３０分から６０分である。加熱処理時間を９０分以上に設定するとオリゴ糖の単糖への分解が進み好ましくはない。糖液のｐＨが３．５付近である場合、キシロオリゴ糖複合体とリグニン様物質、キシロオリゴ糖と側鎖の一種であるヘキセンウロン酸は分離除去可能であるが、キシロオリゴ糖自身はほとんど分解することはない。
【００３４】
この処理でキシロオリゴ糖複合体からはリグニン様の有機物が分解除去され、キシロオリゴ糖へと変換される。ｐＨ３．５、１２１℃、６０分の処理条件の時のキシロオリゴ糖複合体からキシロオリゴ糖への変換効率は約９５％である。このとき単糖の一部は加水分解が進みフルフラール様物質となり更に縮合して沈殿する。キシロオリゴ糖複合体から切り離されたリグニン様物質も同様に酸性下で縮合し不溶化して沈殿する。この不溶化した沈殿物は濾紙や珪藻土によるろ過はもちろんのことＵＦ膜やＭＦ膜そしてセラミックフィルター等による分離除去が可能である。
【００３５】
上記のようにしてキシロオリゴ糖複合体から得られたキシロオリゴ糖組成物は、比較的鎖長が長い重合度が５〜８程度のキシロオリゴ糖を高い割合で含んでいる新規なキシロオリゴ糖組成物である。重合度が比較的高いキシロオリゴ糖が得られる理由としては、酵素処理により得られた糖液中のキシロオリゴ糖複合体は５量体から１０量体程度の鎖長のキシロオリゴ糖にリグニン様物質が結合しているためヘミセルラーゼによる必要以上の消化を免れていることに起因している。そのような状態から希酸による酸加水分解でリグニン様物質と分離すると、比較的長い鎖長のキシロオリゴ糖が得られる。
【００３６】
酸加水分解して得られた糖液中には、キシロオリゴ糖の他にキシロース、グルコースといった単糖類やリグニン、フラン化合物、フルフラールといった有機物も含有する。これらの有機物の混合物からキシロオリゴ糖のみを分離、精製する工程としては、イオン交換、分子ふるい、エタノール分画、膜処理などの従来のいかなる精製方法を組み合わせて用いても良い。例えば、陽イオン交換樹脂→陰イオン交換樹脂→活性炭といった順序でカラムを用いる精製方法では出発原料である酸処理糖液を１００％とした場合、精製キシロオリゴ糖の回収率は約７０％である。
【００３７】
精製されたキシロオリゴ糖を含む糖溶液をイオンクロマトグラフィー（ダイオネクス社）を用いて分析したところ２量体ないし１０量体のキシロオリゴ糖を含む糖液であることが判明した。このときの有機分重量を分析したところ絶乾重量中の全糖量は９９％以上であった。また、秤量されたるつぼを用いての灰分の測定では精製糖液中の灰分は事実上認められなかった。
【００３８】
本発明で得られた新規なキシロオリゴ糖組成物を含む糖液は食中毒の原因となるビブリオ属の細菌であるVibrio parahaemolyticus （ IFO 12711） , Vibrio(Listonella) anguillarum（ IFO 13266）といった人に対して有害である細菌に対して静菌力を発揮することが判明している。これらの細菌が増殖する培地に新規キシロオリゴ糖組成物を添加することで細菌類の増殖速度を低下させることができる。一方、新規なキシロオリゴ糖自身は人に対して全く無害である。
【００３９】
前述したように、本発明の新規なキシロオリゴ糖組成物は、リグノセルロース材料を出発原料とし、それをヘミセルラーゼ処理した反応ろ液から分離、精製して得られる重合度の大きなキシロオリゴ糖含有組成物である。この新規なシキロオリゴ糖組成物はヒトに対して有害であるビブリオ属の細菌であるVibrio parahaemolyticus IFO 12711 , Vibrio(Listonella) anguillarum IFO 13266といった細菌に対して静菌力を発揮する。また、この重合度の大きなキシロオリゴ糖組成物は、酵素や爆砕などの物理化学的手法を用いることで従来からあるキシロース、キシロースの２量体を主成分とするキシロオリゴ糖などに容易に変換することもできる。
【００４０】
【実施例】
以下に、実施例、比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、もちろん本発明はこれら実施例に限定されるものではない。以下に示す％は特に断らない限りすべて重量によるものであり、対パルプの添加率はパルプの絶乾重量に対する容量の比率である。なお、各測定法は以下のとおりである。
【００４１】
(1) 全糖量の定量：
全糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法；学会出版センター）にて定量した。
(2) 還元糖量の定量：
還元糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業）を用いて作製、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法；学会出版センター）にて定量した。
(3) 平均重合度の決定法：
サンプル糖液を５０℃に保ち１５０００ｒｐｍにて１５分遠心分離し不溶物を除去し上清液の全糖量を還元糖量（共にキシロース換算）で割って平均重合度を求めた。
(4) 新規キシロオリゴ糖の定量方法：
オリゴ糖の定量方法はイオンクロマトグラフ（ダイオネクス社製）を用い、分析用カラムも同様にダイオネクス社のＣａｒｂｏＰａｃｋＰＡ−１０を用いて分析した。分離溶媒には１００ｍＭＮａＯＨ溶液を用い、溶出溶媒には前述の分離溶媒に酢酸ナトリウムを５００ｎＭとなるように添加し、溶液比で、分離溶媒：溶出溶媒＝４：６となるような直線勾配を組み分離した。
【００４２】
（検量線の作製）
検量線の作成用には、標品としてキシロース（Ｘ）、キシロビオース（Ｘ２）、キシロトリオース（Ｘ３）、キシロテトラオース（Ｘ４）を用いた。これらオリゴ糖類は前述の分析メソッドでは単位重量あたり（今回は１μｇ当たり）のピーク面積がキシロースから順にキシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオースの順に小さくなる。以下標品が存在しない場合のキシロオリゴ糖の定量のために既存の単位重量当たりの面積をもとに検量線を作成したところ、
Ｙ＝４Ｅ＋０７Ｘ^-0.6709
という式を得た。この場合Ｙは１μｇ当たりのオリゴ糖のピーク面積を示し、Ｘはオリゴ糖の重合度である（図１参照）。
この式をもとにオリゴ糖の標品が存在しないキシロペンタオース（Ｘ５）、キシロヘキサオース（Ｘ６）、以下キシロオリゴ糖として１１量体（Ｘ１１）までの１μｇ当たりの面積を計算上求めて表１に示した。
【００４３】
【表１】

【００４４】
以下、キシロオリゴ糖の濃度の定量にはこの計算シートを用いて計算した。キシロオリゴ糖を中性糖としてフェノール硫酸法で定量した時に３４ｍｇ／ｍｌであったサンプルをこの計算シートで計算すると３６．５ｍｇ／ｍｌであった。この計算シートはサンプル中の任意の重合度のオリゴ糖濃度を計算することが可能であり、非常に便利である。
【００４５】
(5) 酵素力価の定義：
酵素として用いたキシラナーゼの活性測定にはバーチウッドキシラン（シグマ社製）を用いた。酵素力価の定義はキシラナーゼがキシランを分解することで得られる還元糖の還元力をＤＮＳ法（還元糖の定量法；学会出版センター）を用いて測定し、１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力を生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００４６】
(6) イオンクロマトグラフによる分析：
キシロオリゴ糖の分析にはイオンクロマトグラフ（ダイオネクス社）を用いた。分析には糖類の分析に適したカラムとしてＣａｒｂｏＰａｃｋＰＡ−１０（ダイオネクス社）を用いた。
【００４７】
実施例１
（酵素処理工程）
国内産広葉樹チップ７０％、ユーカリ材３０％からなる混合広葉樹チップを原料として、クラフト蒸解によりカッパー価２０．１、パルプ粘度４１ｃｐｓの工場製の未晒パルプを得た。次いで、酸素脱リグニンを行い、カッパー価９．６、パルプ粘度２５．１ｃｐｓの酸素脱リグニンパルプを得た。
このパルプを１００メッシュのろ布にてろ別、洗浄後、パルプ濃度を１０％に調整し、希硫酸を加えてｐＨ８に調整し、ついでバチルス・エスピーＳ−２１１３株（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所寄託菌株ＦＥＲＭＢＰ−５２６４）の生産するキシラナーゼを対パルプ１ユニット／ｇとなるように添加し、６０℃で１２０分処理した。処理後、１００メッシュのろ布でろ過してパルプ残渣などを分離し、全糖濃度３７００ｍｇ／ｌを含む１０５０リッター（全糖量として３９００ｇ）の処理液を得た。続いてＮＦ膜（日東電工製：ＮＴＲ−７４５０、膜質：スルホン化ポリエーテルスルホン系、食塩阻止率５０％）を用いて容量比で４０倍に濃縮した。この濃縮液は全糖量で２７００ｇを有しており、全糖回収率は７０％であった。
【００４８】
（酸加水分解処理工程）
酵素処理工程で得られた濃縮糖液１，０００ｍｌに対して硫酸を添加してｐＨを３．５に調製した後、この濃縮糖液を１２１℃にて１時間反応させた。反応生成物をイオンクロマト用カラム（ダイオネクス社：ＰＡ−１０）を用いたイオンクロマトグラフィーで分析した結果、高濃度のキシロオリゴ糖（２量体〜１０量体）を含むことが判明した（図２参照）。
【００４９】
（キシロオリゴ糖の精製・分離工程）
酸加水分解処理工程で調製したキシロオリゴ糖の糖溶液（１１７ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌ、全糖量として１．２ｇを強酸性イオン交換樹脂（ローム・アンド・ハース社製：アンバーライト２００Ｃ）を充填したカラム（内径３６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に負荷した。カラムを通過したキシロオリゴ糖を回収した後に、弱塩基性イオン交換樹脂（ローム・アンド・ハース社製：ＩＲＡ６７）を充填した同様のカラムに負荷した。カラムを通過し得られたキシロオリゴ糖は、濃縮後、８０ｍｇの活性炭（和光純薬製：品番０３７−０２１１５）をキシロオリゴ糖溶液に添加して６０℃にて１時間攪拌し、脱色を行った。攪拌後は０．２２μｍのメンブレンフィルターで活性炭をろ過し、精製したキシロオリゴ糖溶液を得た。精製したキシロオリゴ糖溶液には２８０ｎｍ及び２５０ｎｍの波長の吸収は認められず、酸処理後のキシロオリゴ糖溶液に含まれる紫外吸収物質は除去されていた。灰分の残存率も出発原料である酸処理後のキシロオリゴ糖溶液に対して０．１％以下であった。また、キシロオリゴ糖の回収率は７０．２％であった。
【００５０】
こうして得られた新規キシロオリゴ糖組成物溶液は、前述したイオンクロマトグラフを用いた分析を行うと、糖の重合度が２から１０程度までの分布を示した。更に、その平均重合度を測定するとキシロビオース、キシロトリオース（以上、和光純薬工業社の精製品）、キシロテトラオース（メガザイム社の精製品）は、各々２．２、３．４、４．４であった。また、得られたキシロオリゴ糖の単量体キシロース、二量体、以下１１量体までの含有率を前記した定量方法と検量線を用いて計算した。その結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】

【００５２】
参考例１
実施例１の酵素処理工程と同様の手法で得られた全糖濃度で１５０ｍｇ／ｍｌの新規キシロオリゴ糖組成物を、硫酸を用いてｐＨを１．５に調整した。この糖溶液を温度１２１℃にて６０分処理して酸加水分解を行った。冷却後、イオンクロマトグラフィーにて構成糖を分析したところ、全てがキシロースとして検出され、高重合度キシロオリゴ糖からキシロースへの変換が確認された。
【００５３】
参考例２
実施例１の酵素処理工程と同様の手法で得られた全糖濃度で１５０ｍｇ／ｍｌの新規キシロオリゴ糖組成物に対して、真菌類（Trichoderma.sp）由来のキシラナーゼ（新日本化学工業社製）を酵素力価として１０ユニット添加してｐＨを４．５に調整した後に、温度５０℃にて６時間酵素による消化を行った。反応終了後にイオンクロマトグラフにて構成糖の分析を試みた。その結果構成糖はそのほとんどが２量体であるキシロビオースに変換されていた。
【００５４】
実施例２
実施例１の手法により精製された新規なキシロオリゴ糖組成物（平均重合度＝５．４）を用いて静菌性を調べる以下の実験を行った。
使用菌株としてビブリオ属の細菌はVibrio(Listonella) anguillarum IFO 13266を用いた。Vibrioの場合は、炭素源として各種の糖を０．５％含む培地３．５ｍｌを生菌懸濁液（１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１００μｌ植菌して３７℃にて振とう培養を行い、６６０ｎｍの吸光度を測定することで菌体数の増加を調べた。
なお、上記の試験で用いた資化性検討用の培地は、一般のビブリオ培地を用い、グルコースの代わりにキシロオリゴ糖を加えたものである。
【００５５】
この結果から平均重合度が高い新規なキシロオリゴ糖は、ビブリオ培地中でのVibrio parahaemolyticus IFO 12711の増殖を押さえることが判明した。
（図３参照）
ビブリオ培地中には炭素源としてもともとグルコースを含むにもかかわらず、新規なキシロオリゴ糖を添加することが菌体の増加を抑制することにつながった。このことから、新規なキシロオリゴ糖組成物は静菌作用を有することが明らかになった。
【００５６】
【発明の効果】
本発明により、ビブリオ属に静菌効果がある高平均重合度のキシロオリゴ糖組成物が安価、かつ大量に供給される。この新規キシロオリゴ糖組成物は酸加水分解、酵素消化などの処理により容易にキシロビオース、キシロースに変換できる。またキシロオリゴ糖自体はもともと乳酸菌の選択的増殖性があり機能性食品の材料にも使用されていることからもわかるように、人体への安全性が高い材料であることから、本発明のキシロオリゴ糖組成物も、整腸作用、コレステロール低下作用等が期待される機能性食品用材料としての適用が十分に可能な組成物である。さらに、家畜用や栽培漁業用の餌等への添加剤としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴ糖定量用の検量線を示す図。
【図２】キシロオリゴ糖組成物中の２量体〜１０量体の分布を示す図。
【図３】キシロオリゴ糖組成物の静菌性を示す図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a xylooligosaccharide-containing composition. More specifically, the present invention relates to a xylooligosaccharide composition containing a xylose dimer to a 10-mer as main components.
[0002]
[Prior art]
Xylooligosaccharides are useful saccharides that are used in lactic acid bacteria beverages, chocolates, and the like that have been certified as foods for specified health use, which have a function of maintaining a good tummy tone through the selective growth promoting effect of intestinal bacteria. In addition to human food use, it is also used as livestock feed. Furthermore, in the fields of pharmaceuticals and sanitary products, they have applications as emulsifiers and skin moisturizing ingredients.
[0003]
In general, most of the oligosaccharides used for specified health foods are intestinal regulating, that is, the number of bacteria of the genus Escherichia coli, which is an enteric bad bacteria, and the genus Clostridium, which is an enteric rot fermenter, is relatively good. It has the effect of increasing the number of bifidobacteria called bacteria. Wheat bran is a polysaccharide composed of hemicellulose with xylan as the main chain. Wheat bran is a hardly degradable plant fiber and has been conventionally used as a food additive having an intestinal regulating action.
[0004]
Wheat bran has been recognized to have a vague intestinal regulating effect due to the refreshing feeling that appears after ingestion of wheat bran, but the original effect is produced by decomposition of wheat bran by intestinal bacteria in the intestine Derived from xylooligosaccharides. Xylooligosaccharides derived from wheat bran are said to promote selective growth of Bifidobacteria, which are good enterobacteria, while relatively reducing the number of E. coli that are enterobacteria. Since E. coli and enteric rot fermenting bacteria are known to produce carcinogenic substances while growing in the intestine, reducing the number of E. coli and enteric rot fermenting bacteria in the intestines It is important when thinking.
[0005]
For the reasons described above, saccharides having an intestinal action have been intensively developed, but oligosaccharides having sufficient performance have not yet been developed. One reason for this is that there are few examples where the effect of the intestinal action of oligosaccharides in vitro (in vitro) is linked to the effect in vivo (in vivo). This difference in in vitro and in vivo effects is attributed to the denaturation of the test substance, oligosaccharide, by gastric acid and other digestive fluids in the process of reaching the intestine.
[0006]
In particular, a reduction in the degree of oligosaccharide polymerization due to acid hydrolysis by gastric acid is a major problem. It is known that oligosaccharides are gradually reduced in molecular weight by acid hydrolysis and finally decomposed into monosaccharides that can be assimilated even by spoilage anaerobes belonging to the genus Escherichia coli and Clostridium.
However, xylo-oligosaccharides have higher resistance to gastric acid than other oligosaccharides, and are delivered to the intestine without being reduced in molecular weight. It is a representative of oligosaccharides.
[0007]
Considering degradation in gastric acid and other digestive juices, it is said that the selective growth promoting effect obtained by ingesting xylo-oligosaccharide is more excellent as the chain length of xylo-oligosaccharide is longer. In particular, xylooligosaccharides from trimer to 10-mer are effective for selective growth. Even xylo-oligosaccharides having a chain length of 10-mers or more are said to have no problem because intestinal lactic acid bacteria produce xylanase and utilize it for degradation.
[0008]
The xylo-oligosaccharides currently on the market are made from herbs such as wheat bran and corn cob, but other sugars such as glucuronic acid branch into the side chain in the xylan main chain in these herbaceous plants. Yes. From xylan with many side chains, oligosaccharides having only xylose as a constituent sugar can be produced only with a relatively low degree of polymerization. This is because the xylan chain, which is the main chain, gradually decreases in molecular weight due to the process of removing side chains. Currently, most oligosaccharides constituting xylooligosaccharides on the market are mainly dimers and trimers, and development of xylooligosaccharides having a higher degree of polymerization is desired.
[0009]
When enzymatically decomposing xylan in a hemicellulose material derived from a natural product, a large difference appears in the decomposition product due to the difference in the xylanase that is the enzyme used. In general, xylanases derived from fungi such as fungi and mushrooms are characterized by relatively low substrate specificity of the enzyme xylanase and a very high saccharification ability compared to bacterial xylanases. For this reason, when a xylo-oligosaccharide composition is produced using an enzyme solution derived from fungi as an enzyme, xylan as a substrate is decomposed at a stretch, and the abundance ratio of xylobiose in the xylo-oligosaccharide composition is 70% or more. A certain xylo-oligosaccharide composition is made.
[0010]
The xylo-oligosaccharides currently on the market are produced using xylanases derived from fungi, and the types of constituent sugars constituting the oligosaccharide are mainly dimers and trimers. On the other hand, when xylo-oligosaccharides are produced using a xylanase produced by bacteria, the substrate specificity of the enzyme is greatly different from that of fungal xylanase. Xylooligosaccharides are produced with a clean distribution up to the pentamer (JP-A-1-252280).
[0011]
When the present inventors used a lignocellulosic material in which the enzyme to be used is a neutral thermophilic xylanase derived from the genus Bacillus and the raw material is hardwood chemical pulp, 10 to 10 amounts of a dimer of xylose is used. A xylo-oligosaccharide composition having a distribution of xylo-oligosaccharides throughout the body, a relatively large number of pentamers to 10-mers having a large molecular weight are contained in the xylo-oligosaccharide composition, and the composition of the xylo-oligosaccharide It has been found that the abundance ratio of xylobiose is about 10% or less of the total sugar amount in the xylooligosaccharide composition.
When xylobiose is hydrolyzed, it is converted to xylose that can easily be invaded by enterotoxic bacteria such as Escherichia coli. Although xylobiose is generally resistant to acid hydrolysis, A low abundance ratio is important for maintaining functionality.
[0012]
Thus, the xylooligosaccharide composition produced using chemical pulp-derived lignocellulose as a material is characterized by a higher degree of average polymerization than xylo-oligosaccharide produced using corn cob or cottonseed husk as a raw material. When lignocellulose is used as a material, a novel xylooligosaccharide can be produced at an arbitrary ratio from an average polymerization degree of 2 to an average polymerization degree of 10 by adjusting the enzyme used.
[0013]
Furthermore, it should be noted that the novel xylooligosaccharide composition having a high average degree of polymerization exhibits selective growth against intestinal lactic acid bacteria, and at the same time, Vibrio parahaemolyticus IFO, a bacterium belonging to the genus Vibrio that causes food poisoning. 12711, Vibrio (Listonella) anguillarum IFO 13266 is also a point that exerts bacteriostatic activity against bacteria that are harmful to humans. A xylooligosaccharide composition comprising a dimer or a trimer as a main constituent sugar has little bacteriostatic action against these bacteria which are considered harmful to humans. However, it is a completely new finding that an oligosaccharide chain having a long chain exerts bacteriostatic power, and the present invention has been completed by finding that fact.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, most of the oligosaccharides constituting xylo-oligosaccharides currently on the market are mainly dimers and trimers, and the development of xylo-oligosaccharides with a higher degree of polymerization is desired. Yes.
Therefore, since the present invention is delivered to the intestine without being decomposed by gastric acid or other digestive fluid, it contains a large amount of pentamer to 10-mer having a large molecular weight and high intestinal regulation effect in vivo. An object of the present invention is to provide a chiral oligosaccharide composition.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present invention basically comprises a xylo-oligosaccharide composition comprising xylo-oligosaccharide chains up to 10 sugar chains as a main component.To thingsThe following inventionsInvention based onThe
[0016]
(1) A xylooligosaccharide composition which is a mixture of 2 to 10-mers of xylose, has a xylooligosaccharide content of less than trimer of 40% or less, and an average degree of polymerization of 4 or more, preferably 5 or more.
(2) The xylo-oligosaccharide composition according to item (1), wherein the xylo-oligosaccharide composition is obtained by treating xylan and / or hemicellulose enzymatically or physicochemically.
(3) The xylo-oligosaccharide composition according to (1) or (2), wherein the xylo-oligosaccharide composition is obtained through a step of treating a lignocellulosic material with hemicellulase. object.
[0017]
(4) The xylooligosaccharide composition is obtained by further subjecting a sugar solution obtained from the step of treating with the hemicellulase to an acid hydrolysis treatment. Xylo-oligosaccharide composition.
(5) The sugar solution obtained from the step of treating with hemicellulase is a sugar solution containing a mixture of xylose 2 to 10-mer and a mixture of xylooligosaccharide and lignin-like substance. The xylooligosaccharide composition as described in item (4),
(6) The acid hydrolysis treatment step is a step of acid hydrolysis treatment of the sugar solution obtained through the step of concentrating the sugar solution obtained from the treatment step using the hemicellulase. The xylo-oligosaccharide composition according to (4) or (5).
[0018]
(7) Xylan and / or hemicellulose is treated with hemicellulase in the enzyme treatment step, and the resulting sugar solution is acid hydrolyzed in the hydrolysis treatment step, and then obtained from the hydrolysis treatment step in the purification / separation step. A xylo-oligosaccharide component having a polymerization degree of 3 or less and a xylo-oligosaccharide content of 40% or less and an average polymerization degree of 4 or more, preferably 5 or more, A method for producing the composition.
[0019]
(8) The method for producing a xylooligosaccharide composition according to (7), wherein the hydrolysis treatment step is a step performed on a sugar solution obtained by concentrating the sugar solution obtained from the enzyme treatment step.
(9) The enzyme treatment step is a step of treating a lignocellulosic material containing xylan and / or hemicellulose with hemicellulase, The xylooligosaccharide composition according to item (7) or (8) Manufacturing method.
[0020]
(10) The method for producing a xylooligosaccharide composition according to any one of items (7) to (9), wherein the enzyme treatment step is an enzyme treatment step using xylanase as an enzyme. .
(11) The enzyme treatment step is a step of subjecting a sugar solution adjusted to a pH of 3 to 10, preferably 5 to 9, to an enzyme treatment at a temperature of 10 ° C to 90 ° C, preferably 30 ° C to 60 ° C. The method for producing a xylo-oligosaccharide composition according to any one of items (7) to (10), wherein
(12) In the hydrolysis treatment step, a sugar solution having a pH adjusted to about 3.5 or less, or a value less than or equal to 105 ° C. to 150 ° C., preferably 110 ° C. to 121 ° C., for 15 minutes or more The method for producing a xylooligosaccharide composition according to any one of items (7) to (11), which is preferably a step of performing an acid hydrolysis treatment by heating for 30 to 60 minutes .
[0021]
(13) The purification / separation step includes a step of purifying the sugar solution obtained from the acid hydrolysis treatment step in the order of cation exchange resin column-anion exchange resin column-activated carbon column. The method for producing a xylo-oligosaccharide composition according to any one of items (7) to (12).
[0022]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be specifically described.
The novel xylo-oligosaccharide composition of the present invention is characterized by a high content of xylo-oligosaccharide having a relatively high degree of polymerization in the oligosaccharide composition. When the average degree of polymerization of the novel xylo-oligosaccharide composition of the present invention is measured, the average degree of polymerization is 4 or more, preferably 5 or more. Of course, it is needless to say that a xylooligosaccharide composition having a higher average degree of polymerization can be freely designed and manufactured by changing the enzyme used and the acid treatment conditions. In contrast, when the average degree of polymerization of xylo-oligosaccharides currently on the market is measured, the value is 3 or less, and the constituent sugars in the oligosaccharide are mainly composed of dimers and trimers. is there.
[0023]
The novel xylo-oligosaccharide composition of the present invention can be obtained as a liquid containing a xylo-oligosaccharide having a high degree of polymerization by subjecting the lignocellulose material to hemicellulase treatment and then acid hydrolysis with a dilute acid.
The pulp concentration when lignocellulose is treated with hemicellulase is 1 to 30% by weight, preferably 2 to 15% by weight. However, when lignocellulose other than hardwood kraft pulp is used as the production raw material, Not as long. For example, with regard to xylan derived from lignocellulose, the pulp concentration at the time of treatment is exemplified. For wheat bran derived xylan, 0.5 to 5%, preferably around 2%, for corn cob derived xylan, 1 to 10%, preferably 5% Before and after, 1% to 10%, preferably about 5% for cottonseed xylan, 0.2 to 5%, preferably about 1% for ground corn pipe, 0.2 to 5%, preferably 1 for oat-derived xylan About%.
[0024]
The raw lignocellulosic material from which the xylo-oligosaccharide composition of the present invention can be obtained is preferably wood such as conifers and hardwoods, but may be non-woody plants such as kenaf, hemp, bagasse and rice. There is no particular limitation. The pulp used in the present invention may be any chemical pulp, mechanical pulp, deinked pulp, etc., but hardwood chemical pulp is preferred. As the cooking method for obtaining chemical pulp, known cooking methods such as kraft cooking, polysulfide cooking, soda cooking, alkali sulfite cooking, etc. can be used, but considering the pulp quality, energy efficiency, etc., the kraft cooking method is used. Preferably used.
[0025]
When using hardwood kraft pulp as a lignocellulosic material, it is desirable to first treat the pulp bleached in the alkaline oxygen bleaching step with hemicellulase, but the pulp after digestion or mechanical pulp may be used as the raw material for hemicellulase treatment. .
It is well known that hemicellulose eluted from the pulp fiber in the cooking process is re-adsorbed on the pulp surface obtained by kraft cooking. More than 90% of the re-adsorbed hemicellulose is xylan formed by β1- → 4 bonding of D-xylose.
[0026]
In hardwood kraft pulp, most of arabinose and glucuronic acid which are side chains in hemicellulose are decomposed and removed. Further, 4-O-methylglucuronic acid in the side chain remains as a side chain, but is converted to hexeneuronic acid under alkaline conditions. Since this hexeneuronic acid is easily decomposed and removed when heated under acidic conditions, there is not much problem in the production of xylooligosaccharides. Therefore, the resorbed xylan on the surface of chemical pulp is different from the xylan present in the cell wall of ordinary plants, and when extracted in the pulp cooking process, the side chain bonded to the main chain xylan is large. The part is decomposed and removed. Therefore, resorbed xylan has a very low side chain retention rate compared to normal xylan in the cell wall.
[0027]
The xylan content, including the re-adsorbed content, accounts for about 20% of the hardwood kraft pulp dry weight. In the hemicellulase treatment, the enzyme acts on hardwood kraft pulp and acts on all xylan containing resorbed components to lower the molecular weight. For example, when the xylanase of the Bacillus espi-S-2113 strain (see JP-A-8-224081) is used, the proportion of xylose and xylooligosaccharide constituent sugars produced in the treatment reaction solution is the most in the 3-5 mer. It produces oligosaccharides with a high composition ratio and a small amount of monomers.
[0028]
The present inventors have already found that a xylo-oligosaccharide complex in which xylo-oligosaccharide and lignin-like substance are bound is present in the wastewater obtained from the hemicellulase treatment process of hardwood kraft pulp. Furthermore, the xylo-oligosaccharide complex has found that a lignin-like substance is bound to an oligosaccharide having a relatively high degree of polymerization. Since this xylo-oligosaccharide complex can easily separate and remove xylo-oligosaccharide and lignin-like substance by dilute acid treatment, a large amount of xylo-oligosaccharide having a high degree of polymerization can be produced at a low cost.
[0029]
At present, most of the enzymes used in large-scale enzyme treatment steps are hemicellulases, but any commercially available hemicellulase can be used in the enzyme treatment step in the method for producing xylooligosaccharides of the present invention. . For example, commercially available enzyme preparations such as trade name Cartazame (Clariant), trade name Eco Pulp (Rohm Enzyme), trade name Sumiteam (Shin Nippon Chemical Co., Ltd.), Pulpzyme (Novo Nordix), Trichoderma Use xylanases produced by microorganisms such as Genus, Thermomyces, Oreobasidium, Streptomyces, Aspergillus, Clostridium, Bacillus, Thermotoga, Termamoscus, Cardoseram, Thermomonospora Can do.
[0030]
The enzyme treatment temperature is in the range of 10 to 90 ° C., preferably 30 to 60 ° C., but a treatment temperature close to the optimum temperature of the enzyme is more preferred. In the case of a general enzyme, if the treatment temperature is less than 10 ° C., the reaction becomes insufficient, and obtaining such a temperature itself is not suitable because it requires a great deal of cost. On the other hand, if the temperature exceeds 90 ° C., heat loss increases unless the treatment system is sealed, and in the case of a general enzyme, the enzyme itself is denatured and becomes inactive, which is not suitable. The solution pH during the treatment is in the range of 3 to 10, preferably 5 to 9, but a pH close to the optimum pH of the enzyme is more preferable.
When a sugar solution is obtained by enzymatic treatment of pulp obtained by bleaching hardwood kraft pulp with alkaline oxygen, the pH of the pulp is inclined to the alkali side, so the enzyme whose pH is closer to the alkali side is the pH. The cost for adjusting the is low and has an advantage. If the pH needs to be adjusted, it goes without saying that any acidic solution or alkaline solution may be added to adjust the enzyme treatment.
[0031]
The sugar solution obtained by the enzyme treatment contains xylooligosaccharide (2 to 10-mer) and xylooligosaccharide complex. The sugar concentration in the enzyme-treated solution is 1 unit (1 unit) of xylanase produced by Bacillus sp. 2113 strain (Deposited strain FERM BP-5264, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry, Industrial Technology Institute) Is an enzyme force that releases 1 micromole of xylose per minute), and when added to a 10% strength pulp slurry and processed, it is about 3000 μg / ml (in terms of xylose).
[0032]
This sugar solution can be used when the subsequent manufacturing process is taken into account.PackingIt is also possible to concentrate using a membrane separation technique such as an electro-NF membrane, other ultrafiltration membranes or reverse osmosis membranes, or to increase the sugar concentration by a concentration operation such as evaporation. Actually reducing the volume of the sugar solution means that a large amount of sugar solution is used in the subsequent purification process.Process withEasy handling. In addition, the permeate obtained from the work in membrane concentration has the characteristics that the sugar concentration is lower than that of the enzyme treatment solution and the content of colored organic substances such as lignin is low. For this reason, the permeate obtained from the membrane concentration step can be reused as industrial water in the pulp production step.
[0033]
The sugar solution or the sugar solution after the concentration treatment step is subjected to an acid hydrolysis treatment with a dilute acid to separate the xylooligosaccharide complex into the xylooligosaccharide and the lignin-like substance. As a method for adjusting the pH of the sugar solution, it is common to adjust the pH of the sugar solution to around 3.5 by appropriately adding a mineral acid or an organic acid to the sugar solution. It is also possible to treat the sugar solution with a cation exchange resin such as “Rohm & Haas” and lower the pH by ion exchange.
Next, the pH-adjusted sugar solution is heated in the range of 105 ° C. to 150 ° C., preferably 110 ° C. to 121 ° C., to perform acid hydrolysis. The treatment time is 15 minutes or more, preferably 30 to 60 minutes. If the heat treatment time is set to 90 minutes or more, decomposition of oligosaccharides into monosaccharides proceeds, which is not preferable. When the pH of the sugar solution is around 3.5, the xylooligosaccharide complex and lignin-like substance, xylooligosaccharide and hexeneuronic acid, which is one of the side chains, can be separated and removed, but xylooligosaccharide itself is hardly decomposed. Absent.
[0034]
By this treatment, lignin-like organic substances are decomposed and removed from the xylooligosaccharide complex and converted to xylooligosaccharide. The conversion efficiency from xylooligosaccharide complex to xylooligosaccharide at pH 3.5, 121 ° C. and 60 minutes is about 95%. At this time, a part of the monosaccharide is hydrolyzed and becomes a furfural-like substance, which is further condensed and precipitated. Similarly, the lignin-like substance cleaved from the xylooligosaccharide complex is condensed, insolubilized and precipitated under acidic conditions. This insolubilized precipitate can be separated and removed by UF membrane, MF membrane, ceramic filter, etc. as well as filtration by filter paper or diatomaceous earth.
[0035]
The xylo-oligosaccharide composition obtained from the xylo-oligosaccharide complex as described above is a novel xylo-oligosaccharide composition containing a high proportion of xylo-oligosaccharide having a relatively long chain length and a polymerization degree of about 5-8. . The reason why a xylo-oligosaccharide having a relatively high degree of polymerization is obtained is that a lignin-like substance is bonded to a xylo-oligosaccharide having a chain length of about 5 to 10 mer in the xylo-oligosaccharide complex in a sugar solution obtained by enzyme treatment. This is due to the fact that hemicellulase avoids unnecessary digestion. When the lignin-like substance is separated from such a state by acid hydrolysis with a dilute acid, a xylo-oligosaccharide having a relatively long chain length is obtained.
[0036]
In addition to the xylooligosaccharide, the sugar solution obtained by acid hydrolysis contains monosaccharides such as xylose and glucose, and organic substances such as lignin, furan compounds, and furfural. As a step of separating and purifying only xylooligosaccharide from a mixture of these organic substances, any conventional purification method such as ion exchange, molecular sieving, ethanol fractionation, membrane treatment, etc. may be used in combination. For example, in a purification method using a column in the order of cation exchange resin → anion exchange resin → active carbon, the recovery rate of purified xylooligosaccharide is about 70% when the acid-treated sugar solution as a starting material is 100%.
[0037]
When the sugar solution containing the purified xylo-oligosaccharide was analyzed using ion chromatography (Dionex), it was found to be a saccharide solution containing a dimer or a 10-mer xylo-oligosaccharide. When the organic content weight at this time was analyzed, the total amount of sugar in the absolute dry weight was 99% or more. Moreover, in the measurement of the ash content using the weighed crucible, the ash content in the refined sugar solution was practically not recognized.
[0038]
The sugar solution containing the novel xylooligosaccharide composition obtained in the present invention is harmful to humans such as Vibrio parahaemolyticus (IFO 12711) and Vibrio (Listonella) anguillarum (IFO 13266), which are bacteria of the genus Vibrio causing food poisoning. It has been found that it exhibits bacteriostatic activity against bacteria. The growth rate of bacteria can be reduced by adding a novel xylooligosaccharide composition to a medium in which these bacteria grow. On the other hand, the novel xylooligosaccharide itself is completely harmless to humans.
[0039]
As described above, the novel xylo-oligosaccharide composition of the present invention is a composition containing xylo-oligosaccharide having a high degree of polymerization, which is obtained by separating and purifying a lignocellulosic material from a reaction filtrate treated with hemicellulase. It is. This novel silico-oligosaccharide composition exerts bacteriostatic activity against bacteria such as Vibrio parahaemolyticus IFO 12711 and Vibrio (Listonella) anguillarum IFO 13266, which are bacteria of the genus Vibrio that are harmful to humans. In addition, this xylooligosaccharide composition having a large degree of polymerization can be easily converted into xylooligosaccharides mainly composed of xylose or a dimer of xylose by using a physicochemical method such as enzyme or explosion. You can also.
[0040]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples and comparative examples, but the present invention is not limited to these examples. Unless otherwise specified, the percentages shown below are by weight, and the addition ratio of pulp is the ratio of the capacity to the absolute dry weight of the pulp. In addition, each measuring method is as follows.
[0041]
(1) Quantification of total sugar content:
The total sugar amount was prepared by using a calibration curve using D-xylose (Wako Pure Chemical Industries) and quantified by the phenol-sulfuric acid method (reducing sugar quantification method; Academic Publishing Center).
(2) Quantification of reducing sugar content:
The amount of reducing sugar was prepared by using a calibration curve using D-xylose (Wako Pure Chemical Industries) and quantified by the Sommoji-Nelson method (reducing sugar quantification method; Academic Publishing Center).
(3) Determination of average degree of polymerization:
The sample sugar solution was kept at 50 ° C. and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes to remove insoluble matter, and the total sugar amount in the supernatant was divided by the reducing sugar amount (both converted to xylose) to determine the average degree of polymerization.
(4) Quantification method of new xylooligosaccharides:
The oligosaccharide was quantified using an ion chromatograph (Dionex), and the analytical column was similarly analyzed using a Dionex Carbo PackPA-10. A 100 mM NaOH solution is used as a separation solvent, and sodium acetate is added to the above-mentioned separation solvent so as to have a concentration of 500 nM as an elution solvent. Separated.
[0042]
(Preparation of calibration curve)
For preparing a calibration curve, xylose (X), xylobiose (X2), xylotriose (X3), and xylotetraose (X4) were used as preparations. In these analytical methods, these oligosaccharides have a peak area per unit weight (per 1 μg in this case) in the order of xylose, xylobiose, xylotriose, and xylotetraose. A calibration curve was created based on the existing area per unit weight for the quantification of xylooligosaccharides in the absence of a standard.
Y = 4E + 07X^-0.6709
The following formula was obtained. In this case, Y represents the peak area of oligosaccharide per 1 μg, and X is the degree of polymerization of oligosaccharide (see FIG. 1).
Based on this formula, the area per microgram of xylopentaose (X5), xylohexaose (X6), and xylo-oligosaccharide below 11-mer (X11) in which no oligosaccharide preparation exists is calculated and displayed. It was shown in 1.
[0043]
[Table 1]

[0044]
Hereinafter, the concentration of xylooligosaccharide was calculated using this calculation sheet. A sample which was 34 mg / ml when quantified by the phenol-sulfuric acid method using xylo-oligosaccharide as a neutral sugar was calculated to be 36.5 mg / ml on this calculation sheet. This calculation sheet can calculate the oligosaccharide concentration of an arbitrary degree of polymerization in a sample, and is very convenient.
[0045]
(5) Definition of enzyme titer:
Birchwood xylan (manufactured by Sigma) was used to measure the activity of the xylanase used as the enzyme. Enzyme titer is defined by measuring the reducing power of reducing sugar obtained by decomposing xylan by xylanase using the DNS method (quantitative method for reducing sugar; Academic Publishing Center). The amount of enzyme that generates the corresponding reducing power was defined as 1 unit.
[0046]
(6) Analysis by ion chromatography:
An ion chromatograph (Dionex) was used for analysis of xylooligosaccharides. For the analysis, Carbo Pack PA-10 (Dionex) was used as a column suitable for the analysis of saccharides.
[0047]
Example 1
(Enzyme treatment process)
Using a mixed hardwood chip consisting of 70% domestic hardwood chips and 30% eucalyptus wood as a raw material, unbleached pulp manufactured by a factory with a kappa value of 20.1 and a pulp viscosity of 41 cps was obtained by kraft cooking. Subsequently, oxygen delignification was performed to obtain an oxygen delignified pulp having a copper number of 9.6 and a pulp viscosity of 25.1 cps.
This pulp is filtered and washed with a 100-mesh filter cloth, the pulp concentration is adjusted to 10%, diluted sulfuric acid is added to adjust the pH to 8, and then Bacillus sp. S-2113 strain (Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Technology) The xylanase produced by the Engineering and Industrial Technology Research Institute (deposited strain FERM BP-5264) was added to 1 unit / g of pulp and treated at 60 ° C. for 120 minutes. After the treatment, it was filtered through a 100 mesh filter cloth to separate pulp residues and the like to obtain a 1050 liter treatment solution (3900 g as the total sugar amount) containing a total sugar concentration of 3700 mg / l. Subsequently, it was concentrated 40 times by volume using an NF membrane (Nitto Denko: NTR-7450, membrane quality: sulfonated polyethersulfone, salt rejection 50%). This concentrated solution had a total sugar amount of 2700 g, and the total sugar recovery rate was 70%.
[0048]
(Acid hydrolysis treatment process)
Sulfuric acid was added to 1,000 ml of the concentrated sugar solution obtained in the enzyme treatment step to adjust the pH to 3.5, and then this concentrated sugar solution was reacted at 121 ° C. for 1 hour. As a result of analyzing the reaction product by ion chromatography using a column for ion chromatography (Dionex: PA-10), it was found to contain a high concentration of xylooligosaccharide (dimer to 10mer) (FIG. 2). reference).
[0049]
(Xylooligosaccharide purification / separation process)
Column filled with 10 ml of xylo-oligosaccharide sugar solution (117 mg / ml) prepared in the acid hydrolysis treatment step and 1.2 g as the total sugar amount with a strongly acidic ion exchange resin (Rohm and Haas: Amberlite 200C) (Inner diameter 36 mm, length 150 mm). After collecting the xylo-oligosaccharide that passed through the column, it was loaded onto a similar column packed with a weakly basic ion exchange resin (Rohm and Haas: IRA67). After concentration, the xylo-oligosaccharide obtained through the column was decolorized by adding 80 mg of activated carbon (manufactured by Wako Pure Chemicals: product number 037-02115) to the xylo-oligosaccharide solution and stirring at 60 ° C. for 1 hour. After stirring, the activated carbon was filtered through a 0.22 μm membrane filter to obtain a purified xylooligosaccharide solution. Absorption at wavelengths of 280 nm and 250 nm was not observed in the purified xylo-oligosaccharide solution, and the ultraviolet absorbing substance contained in the xylo-oligosaccharide solution after acid treatment was removed. The residual rate of ash was 0.1% or less with respect to the acid-treated xylo-oligosaccharide solution as a starting material. The recovery rate of xylo-oligosaccharide was 70.2%.
[0050]
The novel xylo-oligosaccharide composition solution thus obtained showed a distribution in which the degree of polymerization of sugars was about 2 to 10 when analyzed using the ion chromatograph described above. Further, when the average degree of polymerization is measured, xylobiose, xylotriose (hereinafter, a purified product of Wako Pure Chemical Industries) and xylotetraose (a purified product of Megazyme) are 2.2, 3.4, 4. 4. In addition, the content of the obtained xylooligosaccharide in monomer xylose, dimer, and the following 11-mer was calculated using the above-described quantification method and calibration curve. The results are shown in Table 2.
[0051]
[Table 2]

[0052]
Reference example 1
A novel xylo-oligosaccharide composition having a total sugar concentration of 150 mg / ml obtained in the same manner as in the enzyme treatment step of Example 1 was adjusted to pH 1.5 using sulfuric acid. This sugar solution was treated at a temperature of 121 ° C. for 60 minutes for acid hydrolysis. When the constituent sugars were analyzed by ion chromatography after cooling, all were detected as xylose, confirming the conversion from a high polymerization degree xylooligosaccharide to xylose.
[0053]
Reference example 2
A xylanase derived from a fungus (Trichoderma.sp) (manufactured by Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd.) with respect to a novel xylo-oligosaccharide composition having a total sugar concentration of 150 mg / ml obtained in the same manner as in the enzyme treatment step of Example 1 After adding 10 units as an enzyme titer to adjust the pH to 4.5, digestion with an enzyme was performed at a temperature of 50 ° C. for 6 hours. After completion of the reaction, analysis of the constituent sugars was attempted by ion chromatography. As a result, most of the constituent sugars were converted to xylobiose, which is a dimer.
[0054]
Example 2
The following experiment was conducted to examine bacteriostatic properties using a novel xylo-oligosaccharide composition (average degree of polymerization = 5.4) purified by the method of Example 1.
Vibrio (Listonella) anguillarum IFO 13266 was used as the bacterium belonging to the genus Vibrio. In the case of Vibrio, 3.5 μl of a medium containing 0.5% of various sugars as a carbon source is inoculated with 100 μl of a viable cell suspension (103 cells / ml), and cultured at 37 ° C. with shaking. The increase in the number of cells was examined by measuring the absorbance.
In addition, the medium for examination of assimilation used in the above test is a general vibrio medium in which xylooligosaccharide is added instead of glucose.
[0055]
From this result, it was found that a novel xylooligosaccharide having a high average degree of polymerization suppresses the growth of Vibrio parahaemolyticus IFO 12711 in a vibrio medium.
(See Figure 3)
Although the vibrio medium originally contained glucose as a carbon source, the addition of a novel xylo-oligosaccharide led to the suppression of the increase in bacterial cells. This revealed that the novel xylo-oligosaccharide composition has a bacteriostatic action.
[0056]
【The invention's effect】
According to the present invention, a high average degree of polymerization xylo-oligosaccharide composition having a bacteriostatic effect on Vibrio is supplied at low cost and in large quantities. This novel xylo-oligosaccharide composition can be easily converted into xylobiose and xylose by treatments such as acid hydrolysis and enzymatic digestion. Further, as can be seen from the fact that xylo-oligosaccharide itself has a selective growth ability of lactic acid bacteria and is also used as a functional food material, it is a material that is highly safe to human body. The composition is also a composition that can be sufficiently applied as a functional food material that is expected to have an intestinal regulating action, a cholesterol lowering action, and the like. Furthermore, it is also useful as an additive to feed for livestock or cultivated fishery.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a calibration curve for oligosaccharide quantification.
FIG. 2 is a graph showing the distribution of dimers to 10-mers in a xylooligosaccharide composition.
FIG. 3 is a graph showing bacteriostatic properties of a xylooligosaccharide composition.

Claims

A treatment liquid containing a xylo-oligosaccharide-lignin complex obtained by xylanase treatment of hardwood chemical pulp is subjected to an acid hydrolysis treatment, and the acid hydrolysis treatment liquid is treated with a strongly acidic ion exchange resin treatment-a weakly basic ion exchange resin. process - a Kiriroorigo sugar composition have been purified adsorption treatment in the order of the activated carbon treatment, with xylo sugar chain from 2 to 10 carbohydrate state, and are an average polymerization degree of 4 or more and a polymerization degree of 3 or less der xylooligosaccharide content is 40% or less Ru xylooligosaccharide composition.