JP4076351B2

JP4076351B2 - Highly surviving Lactobacillus bacteria and their utilization

Info

Publication number: JP4076351B2
Application number: JP2002016602A
Authority: JP
Inventors: 耕一郎園池; 薫栃谷
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2022-01-25
Also published as: JP2003219861A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養終期における菌の死滅が少ない高生残性ラクトバチルス属細菌、当該細菌を利用した発酵乳の製造方法、当該方法で製造した発酵乳を含有する発酵乳製品および当該細菌の取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌の発酵により得られる発酵乳等の発酵乳製品は、整腸作用と様々な生理効果を有する食品である。これらは、乳酸菌で発酵させた乳を適宜シロップや水で希釈するなどして製造されるものであり、乳酸による爽やかさ、バランスのとれた甘さ等がおいしさの主要因となる。また、その両者の濃度を高めることでコクのある良好な風味が付与される。このため、乳酸菌の培養は乳酸酸度が可能な限り高まるまで行うことが望ましいが、一方、乳酸菌の長時間の培養は生菌数の低下を招くため、生菌数を重視する発酵乳等の製造において、この二律背反の問題を解決することが求められている。
【０００３】
このため、乳酸菌の培養の際にクロレラエキス、酵母エキス等の増殖促進物質を培地に添加して、短時間に酸度を上昇させる試みがなされているが、このような場合には、培養初期の増殖性は良好となるものの、培養終期には、自ら産生した酸の影響により菌の死滅が却って促進されてしまい、結果的に生菌数の低下が生じてしまうことも多い。
【０００４】
また、長時間培養によって得られた発酵乳に、各種糖質などの添加物を加え製品化した場合、製品保存後の菌の生残性が悪く、製品規格の維持や生理作用の発現のためには問題がある。
【０００５】
このため、乳酸菌に変異処理を施すなどして酸耐性の高い乳酸菌等のスクリーニングが行われているが、従来の方法では、十分に生菌数を維持し、製品化後の生残性を高めることは困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、培養終期における高酸度状態でも高い生菌数を有し、製品化後の生残性の高い乳酸菌を得ること、すなわち、培養終期の低ｐＨ域での生残性が高く、長時間培養に適した高生残性乳酸菌を得ることをその課題とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を行ったところ、培養終期における死滅速度の低いラクトバチルス属細菌は長時間培養において、高い酸産生能および生菌数を維持できることを見出した。そして、このような性質を有するラクトバチルス属細菌は、至適培養温度より高い温度で培養することにより得られる耐性株から、死滅速度の低い変異株をスクリーニングすることにより得られることを見出した。
【０００８】
また、このような培養後期における菌の死滅が少ない高生残性乳酸菌を用いて、乳を発酵させることにより得られる発酵乳は、高い生菌数を有するとともに、製品保存時の生残性の高いことを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は異性化糖を３質量％以上含み、無脂乳固形分濃度が１６質量％である乳培地において培養したときに、酸度２２.５における生菌数が１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上であることを特徴とする高生残性ラクトバチルス属細菌を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は上記の高生残性ラクトバチルス属細菌により乳を発酵することを特徴とする発酵乳の製造方法を提供するものである。
【００１１】
更に、本発明は上記の方法により得られた発酵乳を含有することを特徴とする発酵乳製品を提供するものである。
【００１２】
また更に、本発明はラクトバチルス属細菌を生育可能な温度範囲の限界に近い高温で継代培養して得られた菌株から、異性化糖を３質量％以上含み、無脂乳固形分濃度が１６質量％である乳培地において培養した時に、酸度２２.５における生菌数が１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上であり、酸度２１における死滅速度が０.０１以下である菌株を選抜することを特徴とする高生残性ラクトバチルス属細菌の取得方法を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本明細書中において、死滅速度とは、乳酸菌をブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖等の異性化糖を固形分換算で３質量％（以下、単に「％」ともいう）以上含み、無脂乳固形分濃度が１６質量％である乳培地で培養した際に、培養時間、酸度および生菌数を経時的に測定し、この測定値より、横軸に培養時間および縦軸に酸度とする回帰式１を作成し、更に横軸に培養時間および縦軸に生菌数の対数とする回帰式２を作成し、この回帰式２の導関数に、回帰式１より算出された所望の酸度の培養時間を代入して得られる数値の絶対値を意味する。この死滅速度の数値が小さいとき、その酸度における菌の死滅する割合が少ないことを示す。
【００１４】
また、本明細書中において酸度とは、培養液（被験サンプル）９ｇを中和する０.１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液の量（ｍｌ）のことである。上記無脂乳固形分１６％の乳培地において酸度２２.５は、ほぼｐＨ３.６５に対応し、酸度２１はほぼｐＨ３.７に対応する。
【００１５】
更に、酸度２２.５におけるラクトバチルス属の生菌数（酸度２１における死滅速度）を測定する条件等を具体的に示すと、ブドウ糖果糖液糖（ブリックス７５°）１０％、無脂乳固形分濃度１６％、遊離オレイン酸０.００２３％、マンガン０.０８ｐｐｍを含む乳培地に菌を接種し、接種した菌の至適温度近辺で培養を行い、菌数、酸度変化を経時的に測定し、酸度２２.５に達した時点の生菌数を測定し、死滅速度を算出する。
【００１６】
本発明の高生残性ラクトバチルス属細菌は、異性化糖を３質量％以上含み、無脂乳固形分濃度が１６質量％以上である乳培地において培養したときに、酸度２２.５における生菌数が１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上となる菌であるが、中でも培地中のオレイン酸含量が０.００２％〜０.００２５％、特に０.００２％〜０.００２３％であり、マンガン含量が０.０５ｐｐｍ〜０.４ｐｐｍ、特に０.０５ｐｐｍ〜０.１ｐｐｍである場合の酸度２２.５における生菌数が１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上となる菌が優れたものとして挙げられる。酸産生能、生残性等のラクトバチルス属の生育特性は、培地中の微量成分量、具体的にはオレイン酸およびマンガン含量に影響を受ける。すなわち、一般にオレイン酸含量が低いと菌の生残性は低下し、マンガン含量が低いと菌の増殖能は低下するが、前記条件下において高い生菌数および遅い死滅速度を有する株は、オレイン酸含量が低い等の比較的劣悪な培地条件で長時間培養した場合であっても優れた生菌数を有し、製品化後も高い生残性を維持するものとなる。このため、本発明の高生残性ラクトバチルス属細菌は、オレイン酸含量の低い培地において発酵される飲食品等への適用が好ましい。具体的には、オレイン酸含量の低い脱脂乳培地に対して本菌株を用いた場合に、特に優れた効果が発揮される。
【００１７】
本発明の高生残性ラクトバチルス属細菌は、例えば、次のような方法によって得ることができる。まず、親株となるラクトバチルス属細菌をＩＬＳ培地等の培地に接種し、これを菌の生育が可能な温度範囲の限界に近い高温で培養する。次いで、得られたコロニーを継代して同様の操作を繰り返し、高温培養に強い菌株を選択する。
【００１８】
次いで、このようにして選択された菌株を、異性化糖を３質量％以上含み、無脂乳固形分濃度が１６質量％である乳培地にて培養し、酸度２２.５における生菌数が１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上であり、酸度２１における死滅速度が０.０１以下である菌株を選抜することにより、培養終期に菌の死滅が少ない菌株、すなわち高生残性ラクトバチルス属細菌が得られる。
【００１９】
この取得方法において、親株となるラクトバチルス属細菌は特に限定されず、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ガセリ（L.gasseri）、ラクトバチルス・プランタラム（L.plantarum）、ラクトバチルス・ブヒネリ（L.buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（L.casei）、ラクトバチルス・ジョンソニー（L.johnsonii）、ラクトバチルス・ガリナラム（L.gallinarum）、ラクトバチルス・アミロボラス（L.amylovorus）、ラクトバチルス・ブレビス（L.brevis）、ラクトバチルス・ラムノーザス（L.rhamnosus）、ラクトバチルス・ケフィア（L.kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L.paracasei）、ラクトバチルス・クリスパタス（L.crispatus）、ラクトバチルス・ブルガリクス（L.bulgaricus）等が用いられるが、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノーザス、ラクトバチルス・パラカゼイ等酸耐性の高いものは、長時間培養された場合でも高い生菌数を維持できるため好ましく、特にラクトバチルス・カゼイは製品化後の菌の生残性改善の効果が高いため好ましい。
【００２０】
また、この方法において使用されるＩＬＳ培地等での培養温度は、ラクトバチルス属細菌の生育が可能な温度範囲の限界に近い高温、すなわち、至適温度よりも３℃〜６℃高い温度に設定すればよく、具体的にラクトバチルス・カゼイであれば４０℃〜４３℃、好ましくは４２℃の培養温度であり、ラクトバチルス・アシドフィルスであれば４４℃〜４６℃、ラクトバチルス・ブルガリクスであれば４６℃〜４９℃である。
【００２１】
更に、この方法において使用される乳培地は、異性化糖を３質量％以上、好ましくは３％〜７.５％含み、無脂乳固形分濃度が１６質量％であるものが好ましい。また、本発明の高生残性ラクトバチルス属細菌を取得するに当たっては、この乳培地のオレイン酸濃度をオレイン酸及びその誘導体（以下、「オレイン酸等」という）で調整することが好ましい。オレイン酸等としては、特に限定されるものではなく、遊離のオレイン酸やオレイン酸の無機塩の他、一般的に乳化剤として用いられているシュガーエステル、グリセリド、ソルビタンエステル、プロピレングリコールエステル等において、その脂肪酸部分がオレイン酸であるものを挙げることができる。具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、グリセリンオレイルエステル、ポリグリセリンオレイルエステル、ソルビタンオレイルエステル、プロピレングリコールオレイルエステルおよびショ糖オレイルエステル等が挙げられる。中でも、オレイン酸モノグリセリドや、ポリグリセリンモノオレイルエステルは、培養終了時菌数の増加効果、生残性改善効果が高いため好ましく、また、溶解性等の物性の面からはショ糖オレイルエステル等が好ましい。これらは１種または２種以上組み合わせて使用することができる。これらのオレイン酸等の添加量は特に限定されないが、菌の生残性を高めるためには、オレイン酸の終濃度として０.０１％〜０.０４％、特に０.０１５％〜０.０２５％が好ましい。
【００２２】
更にまた、この乳培地のマンガン濃度をマンガンを含む塩類や各種植物等のエキス類、具体的には硫酸マンガン等のマンガン塩の１種以上や生姜エキス、茶類エキスまたはネギエキスから選ばれた１種以上（以下、「エキス類」という）により調整することもできる。茶類エキスとしては、例えば緑茶、紅茶、ウーロン茶、ジャスミン茶、グアバ茶等を水、酸性水等の水性溶媒もしくはエタノール、酢酸エチル、グリセリン、プロピレングリコールエステル等の有機溶媒またはこれらの混合溶媒で抽出した抽出物等が挙げられ、中でも水抽出物を用いれば、ラクトバチルス属細菌の増殖性が高まり、オレイン酸と組合わせて用いた場合の培養終期における死滅速度が低下するため好ましく、特にｐＨ５.０以下の酸性水抽出物を用いることが好ましい。また、ネギエキスとしては、ネギをそのままあるいは細断あるいは破砕等の処理を施して、上記茶類エキスと同様の溶媒で抽出したものが、生姜エキスとしては、生姜をそのままあるいは脱皮、破砕等の処理を施して同様の溶媒で抽出したものが挙げられ、両者とも茶類エキスと同様に水性溶媒、特に酸性水を溶媒とした抽出物を用いることが好ましい。これらマンガン塩あるいはエキスの添加量は特に限定されないが、菌の増殖性を高めるためには、マンガンの終濃度として０.０５ｐｐｍ〜１ｐｐｍ、特に０.０８ｐｐｍとすることが好ましい。
【００２３】
次に、本発明の方法を用い、親株としてラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭＢＰ−１３６６：以下、「ＹＩＴ９０２９」という）から高生残性ラクトバチルス属細菌を取得する方法の具体例を示す。まず、親株であるＹＩＴ９０２９を下記組成のＩＬＳ培地に１０％接種し、４２℃で７時間培養する。これを２０代継代を繰り返し、最終段階で生じたコロニーからシングルコロニーを拾い、高温培養に強い菌株を選択する。次いでこれらを異性化糖を３質量％以上含み、無脂乳固形分濃度が１６質量％である乳培地にて培養し、酸度２２.５における生菌数が１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上であり、酸度２１における死滅速度が０.０１以下である菌株を選抜し、高生残性ラクトバチルス属細菌を得た。
【００２４】
＜ＩＬＳ培地＞
（成分）（％）
Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ１
Ｙｅａｓｔ抽出物０.５
Ｔｒｙｐｔｏｓｅ０.３
リン酸（Ｉ）カリウム０.３
リン酸（ＩＩ）カリウム０.３
クエン酸（ＩＩＩ）アンモニウム０.２
酢酸ナトリウム・３Ｈ_２Ｏ０.１７
Ｌ−システイン塩酸塩０.２
Ｔｗｅｅｎ８００.１
塩類溶液（下記塩類を１００ｍｌの水に溶解したもの）０.５
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１１.５ｇ
ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０.６８ｇ
ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２.４ｇ
【００２５】
このようにして得られた高生残性ラクトバチルス属細菌の菌株の一つをラクトバチルス・カゼイＹＩＴ１０００３（以下、「ＹＩＴ１０００３」という）と命名し、ＦＥＲＭＢＰ−７７０７として、平成１３年８月１４日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した。
【００２６】
上記ＹＩＴ１０００３の菌学的性質を下記表１に示す。なお、本発明のＹＩＴ１０００３は親株であるＹＩＴ９０２９と菌学的性質においてほぼ一致するが、上記したように、異性化糖を３質量％以上含み、無脂乳固形分濃度が１６質量％である乳培地において培養したときに、酸度２２.５における生菌数が１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上であり、更に、酸度２１における死滅速度が０.０１以下であるという特徴を有する。
【００２７】
【表１】

【００２８】
上記のようにして得られた高生残性ラクトバチルス属細菌により乳を発酵させて得られる発酵乳は、菌の生残性が高いものであり、例えば特段の工夫をしなくても従来以上の生菌数を保証できるものである。なお、ここで、乳とは、牛乳（全脂乳）およびその加工品である脱脂乳、その他の山羊乳、羊乳等の獣乳等、更には植物性の豆乳等であり、発酵乳とは、前記乳を上記ラクトバチルス属細菌を用いて発酵して得られる発酵物のことである。
【００２９】
本発明の発酵乳の製造にあたっては、本発明の高生残性ラクトバチルス属細菌以外の微生物を併用することも可能である。このような微生物としては、例えば上記列挙したラクトバチルス属細菌のうち培養終期における死滅速度があまり低くないものやラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ.ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ.クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ.ダイアセチラクチス（Lactococcus lactis subsp. diacetilactis）等のラクトコッカス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptcoccus thermophilus）等のストレプトコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium.breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium.longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium.infantis）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Bifidobacterium.catenulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマーリス（Bifidobacterium.animaris）ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（Bifidobacterium. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium.adolescentis）等のビフィドバクテリウム属細菌、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyses cerevisiae）、トルラスポラ・デルブルエッキー（Torulaspora delbrueckii）、キャンジダ・ケフィア等のサッカロマイセス属、トルラスポラ属、キャンジダ属等に属する酵母等が好ましいものとして挙げられる。中でも上記ラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびラクトコッカス属細菌から選ばれる乳酸菌のうち１種以上を併用して発酵乳製品を製造すれば、高い嗜好性を得られるため継続的な飲用が容易であり好ましい。
【００３０】
この発酵乳の製造において、前記した高生残性ラクトバチルス属細菌の取得方法で用いられる乳培地と同様に、発酵時の発酵基質中のオレイン酸量を、オレイン酸等で調整することが好ましい。これらのオレイン酸等の添加量は特に限定されないが、菌の生残性をより高めるためには、オレイン酸の終濃度として０.０１％〜０.０４％、特に０.０１５％〜０.０２５％が好ましい。また、この発酵乳の製造において、前記したスクリーニングで用いられる乳培地と同様に、発酵基質中のマンガン量をエキス類等で調整することもできる。これらエキス等の添加量は特に限定されないが、菌の増殖性を高めるためには、マンガンの終濃度として０.０５ｐｐｍ〜０.４ｐｐｍ、特に０.０５ｐｐｍ〜０.３ｐｐｍとすることが好ましい。
【００３１】
また、上記発酵乳を使用し、発酵乳製品を製造することができる。この発酵乳製品とは、前記発酵乳をそのままあるいは適宜加工した後、容器に充填するなどした所謂市販製品を指す。その形態としては、プレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプや、ハードタイプ等の固形状、ドリンクタイプの液状等いずれの形態であっても良く、豆乳を原料とする発酵豆乳であっても良い。の製品とすることも可能である。中でも、発酵乳製品であれば、菌の生残性が高いため好ましい。
【００３２】
この発酵乳製品の製造に際しては、発酵乳以外の各種の食品素材、すなわち各種糖質や乳化剤、増粘剤、増粘剤、甘味料、酸味料、果汁等を適宜添加することができる。具体的には、蔗糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール類、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、カラギーナン、キサンタンガム、グァーガム、ペクチン、ローカストビーンガム等の増粘（安定）剤、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等の酸味料、レモン果汁、オレンジ果汁、ベリー系果汁等の果汁類等が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等のビタミン類やカルシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類等を添加することが可能である。
【００３３】
また、発酵乳製品の製造は常法に従えばよく、例えば、殺菌した乳培地に本発明のラクトバチルス属細菌を接種培養し、これを均質化処理して発酵乳を得、次いで、別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら制約されるものではない。
【００３５】
実施例１
ラクトバチルス属細菌のスクリーニング：
ＩＬＳ培地に、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭＢＰ−１３６６）を１０％接種し、４２℃で７時間培養した。これを更にＩＬＳ培地で２０代継代を繰り返し、最終段階で生じたコロニーからシングルコロニー２０個（Ａ〜Ｔ）を選抜した。これら２０株および親株であるＹＩＴ９０２９株をそれぞれ単独で１０％還元脱脂乳培地で３代継代し、スターターとした。これをそれぞれ１０％ブドウ糖果糖液糖（ブリックス７５°）を含み、無脂乳固形分濃度が１６％である乳培地（遊離オレイン酸濃度０.００２３％、マンガン濃度０.０８ｐｐｍ）で培養した。この培養中に酸度および生菌数を経時的に測定し、酸度２２.５に達するまでの時間およびそのときの生菌数ならびに酸度２１における死滅速度を算出した。その結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】

【００３７】
表２に示す菌株のうち、酸度２２．５における生菌数が１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上であり、酸度２１における死滅速度が０.０１以下である菌株が１０株得られた。これらのうちＬ株をラクトバチルス・カゼイＹＩＴ１０００３とした（以下、「ＹＩＴ１０００３」という）。
【００３８】
実施例２
発酵乳の製造：
下記に示す３種類の組成の乳培地を９８℃で９０分間殺菌し、ＹＩＴ９０２９およびＹＩＴ１０００３をそれぞれ単独で０.５％接種し、３７℃で酸度２２.５まで培養して経時的に酸度および生菌数を測定した。その結果を表３に示した。
【００３９】
＜培地＞
Ａ培地：１０％ブドウ糖果糖液糖を含む無脂乳固形分濃度１６％の脱脂粉乳
（オレイン酸終濃度０.００２３％、マンガン濃度０.０８ｐｐｍ）
マンガン（Ｍｎ）添加Ａ培地：ウーロン茶エキスでＡ培地のマンガン濃度を調整
（オレイン酸終濃度０.００２３％、マンガン濃度０.１８ｐｐｍ）
Ｂ培地：１０％ブドウ糖果糖液糖を含む無脂乳固形分濃度１６％の脱脂粉乳
（オレイン酸終濃度０.００４％、マンガン濃度０.０３ｐｐｍ）
【００４０】
【表３】

【００４１】
表３からＹＩＴ１０００３を用いて酸度を２２.５まで培養するのに要した時間は、親株であるＹＩＴ９０２９と比べて何れの培地でも短いことが示された。また、酸度２２.５での生菌数も、親株より多いことが分かった。特に、マンガン添加Ａ培地（オレイン酸含量が低く、マンガン含量が高い培地）を用いた場合の結果は良好であった。
【００４２】
実施例３
発酵乳の保存試験：
実施例２と同様のＡ培地を９８℃で９０分間殺菌し、ＹＩＴ１０００３を０.５％接種し、３７℃で６日間培養して発酵乳（生菌数２.６×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ）を製造した。得られた発酵乳をブドウ糖果糖液糖（ブリックス７５°）溶液で５倍希釈し（糖の終濃度１５％）、ポリスチレン容器に充填、密封し、１５℃で１４日間静置保存した。この発酵乳（乳製品乳酸菌飲料）の製造直後および保存１４日目に生菌数を測定したところ、１４日間ほぼ一定の生菌数が維持された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明のラクトバチルス属細菌は、培養終期における生菌数が多く、死滅速度が低い生残性の高いものである。
【００４４】
従って本発明の高生残性ラクトバチルス属細菌で乳を発酵させた発酵乳およびその発酵乳を含有する発酵乳製品は、保存中の生菌数の低下や死滅速度の増加が抑制され、製品規格の維持や生理作用の発現に優れたものとなる。
【００４５】
また、オレイン酸類等の特別の増殖因子を加えなくても高い生残性が保証できるので、発酵乳の製造面においても有利である。
以上[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a high-survival Lactobacillus genus bacterium with less bacterial death at the end of culture, a method for producing fermented milk using the bacterium, a fermented milk product containing fermented milk produced by the method, and a method for obtaining the bacterium About.
[0002]
[Prior art]
Fermented milk products such as fermented milk obtained by fermentation of lactic acid bacteria are foods that have an intestinal regulating action and various physiological effects. These are produced by appropriately diluting milk fermented with lactic acid bacteria with syrup or water, and the main factors of deliciousness are freshness and balanced sweetness due to lactic acid. Moreover, the rich and favorable flavor is provided by raising the density | concentration of both. For this reason, it is desirable to culture the lactic acid bacteria until the lactic acid acidity is increased as much as possible. On the other hand, since long-term culture of the lactic acid bacteria leads to a decrease in the number of viable bacteria, production of fermented milk and the like that places an emphasis on the number of viable bacteria Therefore, it is required to solve this contradictory problem.
[0003]
For this reason, attempts have been made to increase the acidity in a short time by adding a growth promoting substance such as chlorella extract or yeast extract to the medium during culturing of lactic acid bacteria. Although the growth is good, at the end of the culture, the killing of the bacteria is accelerated by the influence of the acid produced by itself, and as a result, the number of viable bacteria is often lowered.
[0004]
In addition, when fermented milk obtained by culturing for a long time and adding various carbohydrates and other products to produce a product, the survival of the bacteria after product storage is poor and product standards are maintained and physiological effects are manifested. Has a problem.
[0005]
For this reason, lactic acid bacteria are screened for lactic acid bacteria with high acid resistance by, for example, mutation treatment, but the conventional method maintains the number of viable cells sufficiently and improves the survival after commercialization. It was difficult.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present invention provides a lactic acid bacterium having a high viable cell count even in a high acidity state at the end of the culture and having a high survival rate after commercialization, that is, having a high survivability in the low pH range at the end of the culture. An object of the present invention is to obtain a high survival lactic acid bacterium suitable for long-term culture.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors conducted extensive research and found that Lactobacillus bacteria having a low kill rate at the end of the culture can maintain high acid-producing ability and viable cell counts during long-term culture. . And it discovered that the Lactobacillus genus bacteria which have such a property were obtained by screening the mutant strain with a low death rate from the resistant strain obtained by culture | cultivating at temperature higher than optimal culture | cultivation temperature.
[0008]
In addition, fermented milk obtained by fermenting milk using such a high-survival lactic acid bacterium that causes less mortality of bacteria in the later stage of culture has a high viable count and high survival when storing the product. As a result, the present invention has been completed.
[0009]
That is, in the present invention, when cultured in a milk medium containing 3% by mass or more of isomerized sugar and having a nonfat milk solid content concentration of 16% by mass, the viable cell count at acidity of 22.5 is 1 × 10 ⁹ cfu / The present invention provides a high survival Lactobacillus genus bacterium characterized in that it is ml or more.
[0010]
Moreover, this invention provides the manufacturing method of fermented milk characterized by fermenting milk with said high-survival Lactobacillus genus bacteria.
[0011]
Furthermore, this invention provides the fermented milk product characterized by including the fermented milk obtained by said method.
[0012]
Furthermore, the present invention includes 3% by mass or more of isomerized sugar from a strain obtained by subculturing at a high temperature close to the limit of the temperature range in which Lactobacillus bacteria can grow, and has a nonfat milk solid content concentration of Selecting a strain having a viable count of 1 × 10 ⁹ cfu / ml or more at an acidity of 22.5 and a kill rate of 0.01 or less at an acidity of 21 when cultured in a milk medium having a mass of 16% by mass. It is an object of the present invention to provide a method for obtaining a characteristic high survival Lactobacillus genus bacterium.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present specification, the term “death rate” means that lactic acid bacteria contain 3% by mass (hereinafter also simply referred to as “%”) or more of isomerized sugars such as glucose fructose liquid sugar and fructose glucose liquid sugar, in terms of solid content. When culturing in a milk medium having a milk solid content concentration of 16% by mass, the culture time, acidity, and viable cell count are measured over time. From this measured value, the horizontal axis indicates the culture time and the vertical axis indicates the acidity. Regression equation 1 is created, and further, regression equation 2 is created with the culture time on the horizontal axis and the logarithm of the number of viable cells on the vertical axis. The desired acidity calculated from regression equation 1 is used as the derivative of this regression equation 2. It means the absolute value of the numerical value obtained by substituting the incubation time. When this numerical value of the killing rate is small, it indicates that the rate of killing the bacteria at that acidity is small.
[0014]
Moreover, in this specification, acidity is the quantity (ml) of 0.1 mol / l sodium hydroxide solution which neutralizes 9g of culture solutions (test sample). In the milk medium having a non-fat milk solid content of 16%, an acidity of 22.5 corresponds to about pH 3.65, and an acidity of 21 corresponds to about pH 3.7.
[0015]
Furthermore, specific conditions for measuring the number of viable bacteria of Lactobacillus genus at acidity 22.5 (killing rate at acidity 21) are as follows: glucose fructose liquid sugar (Brix 75 °) 10%, non-fat milk solids Inoculate a milk medium containing 16% concentration, free oleic acid 0.0027% and manganese 0.08ppm, incubate near the optimal temperature of the inoculated bacteria, and measure changes in the number of bacteria and acidity over time. The number of viable bacteria when the acidity reaches 22.5 is measured, and the killing rate is calculated.
[0016]
The high survival Lactobacillus genus bacterium of the present invention contains 3% by mass or more of isomerized sugar, and when cultured in a milk medium having a nonfat milk solid content concentration of 16% by mass or more, it is a viable bacterium having an acidity of 22.5. The number of bacteria is 1 × 10 ⁹ cfu / ml or more, but the oleic acid content in the medium is 0.002% to 0.0025%, especially 0.002% to 0.0027%, and the manganese content In the case where the number of viable cells is 0.05 ppm to 0.4 ppm, particularly 0.05 ppm to 0.1 ppm, the number of viable bacteria at an acidity of 22.5 is 1 × 10 ⁹ cfu / ml or more. The growth characteristics of the genus Lactobacillus such as acid production ability and survival are affected by the amount of trace components in the medium, specifically the oleic acid and manganese contents. That is, in general, when the oleic acid content is low, the viability of the fungus decreases, and when the manganese content is low, the proliferative ability of the fungus decreases, but under the above conditions, a strain having a high viable cell count and a slow killing rate Even when cultured for a long time under relatively poor medium conditions such as low acid content, it has an excellent viable cell count and maintains high survival even after commercialization. For this reason, the high survival Lactobacillus genus bacteria of this invention are preferable to apply to the food-drinks etc. which are fermented in the culture medium with a low oleic acid content. Specifically, when this strain is used on a skim milk medium having a low oleic acid content, a particularly excellent effect is exhibited.
[0017]
The high survival Lactobacillus genus bacterium of the present invention can be obtained, for example, by the following method. First, a Lactobacillus bacterium as a parent strain is inoculated into a medium such as an ILS medium, and this is cultured at a high temperature close to the limit of the temperature range in which the fungus can grow. Subsequently, the obtained colony is subcultured and the same operation is repeated, and a strain resistant to high-temperature culture is selected.
[0018]
Subsequently, the strain thus selected is cultured in a milk medium containing 3% by mass or more of isomerized sugar and having a nonfat milk solid content concentration of 16% by mass, and the viable cell count at an acidity of 22.5 is By selecting a strain having a kill rate of 1 × 10 ⁹ cfu / ml or more and a kill rate at acidity of 21 or less of 0.01, a strain with few killed bacteria at the end of the culture, that is, a highly viable Lactobacillus bacterium is obtained. It is done.
[0019]
In this acquisition method, the bacterium belonging to the genus Lactobacillus as a parent strain is not particularly limited, and Lactobacillus acidophilus, L. gasseri, L. plantarum, L. plantarum, Lactobacillus -L. buchneri, L. casei, L. johnsonii, L. gallinarum, L. amylovorus, Lactobacillus Bacillus brevis (L.brevis), Lactobacillus rhamnosus (L.rhamnosus), Lactobacillus kefir (L.kefir), Lactobacillus paracasei (L.paracasei), Lactobacillus crispatus (L.crispatus), lact Bacillus bulgaricus (L. bulgaricus) is used, but Lactobacillus casei, la Those having high acid resistance such as Cactobacillus rhamnosus and Lactobacillus paracasei are preferable because they can maintain a high viable count even when cultured for a long time.Lactobacillus casei is particularly effective for improving the survival of bacteria after commercialization. It is preferable because of its high effect.
[0020]
The culture temperature in the ILS medium used in this method is set to a high temperature close to the limit of the temperature range in which Lactobacillus bacteria can grow, that is, a temperature 3 to 6 ° C. higher than the optimum temperature. Specifically, if it is Lactobacillus casei, it is a culture temperature of 40 ° C. to 43 ° C., preferably 42 ° C., and if it is Lactobacillus acidophilus, it may be 44 ° C. to 46 ° C., Lactobacillus bulgaricus. If it is 46 to 49 degreeC.
[0021]
Further, the milk medium used in this method preferably contains 3% by mass or more, preferably 3% to 7.5% of isomerized sugar, and has a nonfat milk solid content concentration of 16% by mass. In obtaining the highly viable Lactobacillus bacteria of the present invention, it is preferable to adjust the oleic acid concentration of the milk medium with oleic acid and its derivatives (hereinafter referred to as “oleic acid etc.”). The oleic acid is not particularly limited, and in addition to free oleic acid and inorganic salts of oleic acid, sugar esters, glycerides, sorbitan esters, propylene glycol esters, etc. that are generally used as emulsifiers, Mention may be made of those whose fatty acid part is oleic acid. Specific examples include sodium salts, potassium salts, glycerin oleyl esters, polyglycerin oleyl esters, sorbitan oleyl esters, propylene glycol oleyl esters, and sucrose oleyl esters. Among them, oleic acid monoglyceride and polyglycerin monooleyl ester are preferable because of the high effect of increasing the number of bacteria at the end of culture and the effect of improving survival, and sucrose oleyl ester is preferred from the viewpoint of physical properties such as solubility. preferable. These can be used alone or in combination of two or more. The addition amount of these oleic acids and the like is not particularly limited, but in order to increase the survival of the bacteria, the final concentration of oleic acid is 0.01% to 0.04%, particularly 0.015% to 0.025. % Is preferred.
[0022]
Furthermore, the manganese concentration of the milk medium is selected from manganese-containing salts and various plant extracts, specifically one or more manganese salts such as manganese sulfate, ginger extract, tea extract or leek extract. It can also be adjusted by more than seeds (hereinafter referred to as “extracts”). As tea extracts, for example, green tea, black tea, oolong tea, jasmine tea, guava tea, etc. are extracted with water, an aqueous solvent such as acidic water, or an organic solvent such as ethanol, ethyl acetate, glycerin, propylene glycol ester, or a mixed solvent thereof. Among them, the use of a water extract is preferable because the growth of Lactobacillus bacteria is enhanced and the killing rate at the end of the culture when used in combination with oleic acid is decreased, and pH 5. It is preferable to use an acid water extract of 0 or less. In addition, as the leek extract, the leek is processed as it is or after being shredded or crushed and extracted with the same solvent as the tea extract, but as the ginger extract, the ginger is left as it is or is processed such as molting or crushing. In both cases, it is preferable to use an extract obtained by using an aqueous solvent, particularly acidic water, as the tea extract. The addition amount of these manganese salts or extracts is not particularly limited, but in order to increase the growth of bacteria, the final manganese concentration is preferably 0.05 ppm to 1 ppm, particularly preferably 0.08 ppm.
[0023]
Next, a specific example of a method for obtaining a high survival Lactobacillus genus bacterium from Lactobacillus casei YIT9029 (FERM BP-1366: hereinafter referred to as “YIT9029”) as a parent strain using the method of the present invention is shown. First, 10% of the parent strain YIT9029 is inoculated into an ILS medium having the following composition and cultured at 42 ° C. for 7 hours. This is repeated for 20 generations, a single colony is picked up from the colonies generated in the final stage, and a strain resistant to high-temperature culture is selected. Next, these were cultured in a milk medium containing 3% by mass or more of isomerized sugar and having a non-fat milk solid content concentration of 16% by mass, and the viable cell count at an acidity of 22.5 was 1 × 10 ⁹ cfu / ml or more. Yes, a strain having a death rate of 0.01 or less at an acidity of 21 was selected to obtain a high survival Lactobacillus genus bacterium.
[0024]
<ILS medium>
(Component) (%)
Trypticase 1
Yeast extract 0.5
Tryptose 0.3
Potassium phosphate (I) 0.3
Potassium phosphate (II) 0.3
Ammonium citrate (III) 0.2
Sodium acetate 3H ₂ O 0.17
L-cysteine hydrochloride 0.2
Tween80 0.1
Salt solution (dissolved in 100 ml of water) 0.5
11.5 g of MgSO ₄ · 7H ₂ O
FeSO ₄ · _7H 2 O 0.68g
MnSO ₄ · _7H 2 O 2.4g
[0025]
One of the strains of the high-survival Lactobacillus bacterium thus obtained was named Lactobacillus casei YIT10003 (hereinafter referred to as “YIT10003”), and was named FERM BP-7707 on August 14, 2001. In the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (postal code 305-8565, 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan).
[0026]
The bacteriological properties of YIT10003 are shown in Table 1 below. The YIT10003 of the present invention is almost identical in bacteriological properties with the parent strain YIT9029, but as described above, milk containing 3% by mass or more of isomerized sugar and having a nonfat milk solid content concentration of 16% by mass. When cultured in a medium, the number of viable cells at an acidity of 22.5 is 1 × 10 ⁹ cfu / ml or more, and the killing rate at an acidity of 21 is 0.01 or less.
[0027]
[Table 1]

[0028]
Fermented milk obtained by fermenting milk with the high survival Lactobacillus genus bacteria obtained as described above has high survival of bacteria, for example, more than conventional without special measures. The number of viable bacteria can be guaranteed. Here, the milk is cow's milk (whole milk) and skim milk which is a processed product thereof, other goat's milk such as goat's milk, sheep milk, etc., and also plant soy milk, etc. Is a fermented product obtained by fermenting the milk with the Lactobacillus bacteria.
[0029]
In the production of the fermented milk of the present invention, microorganisms other than the high survival Lactobacillus genus bacteria of the present invention can be used in combination. Examples of such microorganisms include, for example, those listed above that do not have a very low kill rate at the end of the culture, Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus lactis subsp. .Lactococcus lactis subsp. Cremoris, Lactococcus lactis subsp. Diacetilactis, Lactococcus bacteria, Streptococcus thermophilus, Streptococcus bacteria, Bifidobacterium.breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis Bifidobacterium.infantis), Bifidobacterium.catenulatum, Bifidobacterium.animaris Bifidobacterium.pseudocatenulatum, Bifidobacterium addresscentis (Bifidobacterium.adolescentis) and other Bifidobacterium bacteria, Saccharomyses cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces genus such as Candida kefir, Torlaspora genus, Candida genus etc. Is preferable. Above all, if fermented dairy products are produced by using one or more of lactic acid bacteria selected from the above-mentioned Lactobacillus bacteria, Streptococcus bacteria and Lactococcus bacteria, a high palatability can be obtained and continuous drinking is easy. It is preferable.
[0030]
In the production of this fermented milk, it is preferable to adjust the amount of oleic acid in the fermentation substrate at the time of fermentation with oleic acid or the like, as in the milk medium used in the method for obtaining the high survival Lactobacillus sp. The addition amount of these oleic acids and the like is not particularly limited, but in order to further improve the survival of the bacteria, the final concentration of oleic acid is 0.01% to 0.04%, particularly 0.015% to 0.05%. 025% is preferable. In addition, in the production of this fermented milk, the amount of manganese in the fermentation substrate can be adjusted with extracts or the like, as in the milk medium used in the above-described screening. The addition amount of these extracts and the like is not particularly limited, but in order to increase the growth of bacteria, the final manganese concentration is preferably 0.05 ppm to 0.4 ppm, particularly 0.05 ppm to 0.3 ppm.
[0031]
Moreover, fermented milk products can be produced using the fermented milk. The fermented milk product refers to a so-called commercial product in which the fermented milk is processed as it is or appropriately, and then filled into a container. The form may be any form such as a plain type, a soft type, a fruit flavor type, a solid type such as a hard type, and a liquid type such as a drink type, and may be fermented soymilk made from soymilk. It is also possible to make this product. Of these, fermented milk products are preferred because of the high survival of bacteria.
[0032]
In producing this fermented milk product, various food materials other than fermented milk, that is, various sugars, emulsifiers, thickeners, thickeners, sweeteners, acidulants, fruit juices, and the like can be appropriately added. Specifically, sugars such as sucrose, isomerized sugar, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose, xylose, sugar alcohols such as sorbitol, xylitol, erythritol, lactitol, paratinit, reduced starch syrup, reduced maltose starch syrup, sucrose fatty acid Emulsifiers such as esters, glycerin fatty acid esters, lecithin, thickeners (stabilizers) such as carrageenan, xanthan gum, guar gum, pectin, locust bean gum, acidulants such as citric acid, lactic acid, malic acid, lemon juice, orange juice, berries Examples include fruit juices such as system fruit juices. In addition, vitamins such as vitamin A, vitamin B, vitamin C, vitamin D, and vitamin E, and minerals such as calcium, iron, manganese, and zinc can be added.
[0033]
In addition, the production of fermented dairy products may be in accordance with conventional methods, for example, inoculating and culturing the bacterium belonging to the genus Lactobacillus of the present invention in a sterilized milk medium, homogenizing it to obtain fermented milk, and then separately preparing The syrup solution is added and mixed, homogenized with a homogenizer or the like, and then added with flavor to finish the final product.
[0034]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated still in detail, this invention is not restrict | limited at all by these.
[0035]
Example 1
Screening for Lactobacillus bacteria:
ILS medium was inoculated with 10% of Lactobacillus casei YIT9029 (FERM BP-1366) and cultured at 42 ° C. for 7 hours. This was further repeated for 20 passages in ILS medium, and 20 single colonies (A to T) were selected from the colonies generated in the final stage. These 20 strains and the parent strain, YIT9029 strain, were each subcultured for 3 passages in 10% reduced skim milk medium, and used as starters. Each of these was cultured in a milk medium (free oleic acid concentration 0.0023%, manganese concentration 0.08 ppm) containing 10% glucose fructose liquid sugar (Brix 75 °) and having a nonfat milk solid content concentration of 16%. During this cultivation, the acidity and the viable cell count were measured over time, and the time until the acidity reached 22.5, the viable cell count at that time, and the death rate at an acidity of 21 were calculated. The results are shown in Table 2.
[0036]
[Table 2]

[0037]
Among the strains shown in Table 2, 10 strains having a viable count of 1 × 10 ⁹ cfu / ml or more at an acidity of 22.5 and a death rate of 0.01 or less at an acidity of 21 were obtained. Among these, the L strain was designated Lactobacillus casei YIT10003 (hereinafter referred to as “YIT10003”).
[0038]
Example 2
Production of fermented milk:
The milk medium having the following three compositions is sterilized at 98 ° C. for 90 minutes, inoculated with 0.5% each of YIT9029 and YIT10003, cultured at 37 ° C. to an acidity of 22.5, and the acidity and liveness over time. The number of bacteria was measured. The results are shown in Table 3.
[0039]
<Culture area>
A medium: nonfat milk solid content concentration 16% containing 10% glucose fructose liquid sugar (final oleic acid concentration 0.0023%, manganese concentration 0.08ppm)
Manganese (Mn) -added A medium: Adjust the manganese concentration of A medium with oolong tea extract (final oleic acid concentration 0.0023%, manganese concentration 0.18ppm)
B medium: skim milk powder containing 16% glucose fructose liquid sugar and having a non-fat milk solid concentration of 16% (final oleic acid concentration of 0.004%, manganese concentration of 0.03 ppm)
[0040]
[Table 3]

[0041]
Table 3 shows that the time required for culturing the acidity to 22.5 using YIT10003 is shorter in any medium compared to YIT9029 which is the parent strain. It was also found that the number of viable bacteria at acidity 22.5 was higher than that of the parent strain. In particular, the results were good when using a manganese-added A medium (a medium with a low oleic acid content and a high manganese content).
[0042]
Example 3
Fermented milk preservation test:
A medium similar to Example 2 was sterilized at 98 ° C. for 90 minutes, inoculated with 0.5% of YIT10003, cultured at 37 ° C. for 6 days, and fermented milk (viable cell count 2.6 × 10 ⁹ cfu / ml) Manufactured. The obtained fermented milk was diluted 5-fold with a glucose fructose liquid sugar (Brix 75 °) solution (final sugar concentration 15%), filled in a polystyrene container, sealed, and stored still at 15 ° C. for 14 days. When the number of viable bacteria was measured immediately after production of this fermented milk (dairy lactic acid bacteria beverage) and on the 14th day of storage, a substantially constant viable cell count was maintained for 14 days.
[0043]
【The invention's effect】
The bacterium belonging to the genus Lactobacillus of the present invention has a high number of viable bacteria at the end of the culture and has a low survival rate and a high survival rate.
[0044]
Therefore, fermented milk obtained by fermenting milk with the highly surviving Lactobacillus genus bacteria of the present invention and fermented milk products containing the fermented milk are capable of suppressing a decrease in the number of viable bacteria during storage and an increase in the killing rate. It will be excellent in maintaining and maintaining physiological effects.
[0045]
Further, high survival can be ensured without adding special growth factors such as oleic acids, which is advantageous in terms of producing fermented milk.
more than

Claims

Has the following mycological properties:

In addition, the number of viable cells at an acidity of 22.5 when cultured near the optimum temperature of Lactobacillus casei in a milk medium containing 3% by mass or more of isomerized sugar and having a solid content of nonfat milk of 16% by mass. Is 1 × 10 ⁹ cfu / ml or more, characterized in that Lactobacillus casei YIT10003 (FERM BP-7707) .

Milk medium is glucose fructose liquid sugar (Brix 75 °) 10%, nonfat milk solid content concentration 16%, free oleic acid 0 . 0023%, manganese 0 . The Lactobacillus casei YIT10003 (FERM) according to claim 1, which contains 08 ppm. BP-7707).

Lactobacillus casei YIT10003 (FERM ) according to claim 1 or 2 Method for producing a fermented milk, which comprises fermenting milk with BP-7707).

A fermented milk product comprising fermented milk obtained by the method according to claim 3 .

Lactobacillus casei YIT9029 (FERM BP-1366) in the following steps (a) to (c),
(A): Lactobacillus casei YIT9029 (FERM BP-1366) to IL S medium is inoculated 10% and cultured at 42 ° C. for 7 hours.
(B): This was repeated for 20 generations, and from the colonies produced in the final stage, single colonies Pick a strain and select a strain that is resistant to high-temperature culture.
(C): Next, these contain 3% by mass or more of isomerized sugar, and the nonfat milk solid content concentration is 16% by mass. Is cultured in the vicinity of the optimum temperature of Lactobacillus casei in a milk medium, and the acidity is 22 . The number of viable bacteria in 5 is 1 × 10 ^９9 A strain having a concentration of cfu / ml or more is selected.
LITobacillus casei YIT10003 (FERM BP-7707) acquisition method.

The milk medium of step (c) is glucose fructose liquid sugar (Brix 75 °) 10%, non-fat milk solid content concentration 16%, free oleic acid 0 . 0023%, manganese 0 . Lactobacillus casei YIT10003 (FERM) according to claim 5, which contains 08 ppm. BP-7707) acquisition method.