JP4071907B2 - Automated nucleic acid testing device - Google Patents

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【0001】 [0001]
本発明は、自動核酸検査装置に関する。 The present invention relates to an automatic nucleic acid testing device. より具体的には、サンプルから核酸成分を抽出する工程、抽出した核酸成分を増幅する工程、及び増幅した核酸を検出する工程が全て自動化された自動核酸検査装置に関する。 More specifically, the step of extracting a nucleic acid component from a sample, the step of amplifying the extracted nucleic acid component, and an automatic nucleic acid testing apparatus amplified detecting the nucleic acid is all automated.
【0002】 [0002]
核酸同士の相補的な結合は、抗原抗体反応と比べても高度に特異的であるため、所望の核酸を特異的に増幅、検出する技術は、遺伝的疾患の検査や法医学的な鑑定などに極めて有用である。 Complementary binding between nucleic acids, since even compared to antigen-antibody reaction is highly specific, specifically amplify the desired nucleic acid, detection technology, such as the inspection and forensic appraisal of genetic diseases it is extremely useful.
【0003】 [0003]
このような検査の主な工程は、(i)サンプルからの核酸成分の抽出、(ii)核酸の増幅、(iii)増幅した核酸の検出であり、これらの工程を全て自動的に行い得る自動核酸検査装置が既に市販されている。 Automatic Such main steps of the inspection, the extraction of nucleic acid components from (i) a sample, (ii) amplifying the nucleic acid is a detection of the amplified nucleic acid (iii), which can perform all of these steps automatically nucleic acid testing devices have already been marketed.
【0004】 [0004]
しかしながら、現在の自動核酸検査装置は、上記各工程に以下のような問題点を有している。 However, current automatic nucleic acid testing device has the following problems in the above steps.
【0005】 [0005]
まず、核酸抽出操作としては、手動の場合、エタノール等の有機溶媒による抽出後に遠心分離を行うのが最も一般的であり、特開平6-327476に開示されている自動遺伝子解析装置は、かかる操作を採用している。 First, as the nucleic acid extraction procedure, the case of the manual is the most common to carry out the centrifugal separation after extraction with an organic solvent such as ethanol, automatic genetic analyzer disclosed in JP-A-6-327476, such operations It is adopted.
【0006】 [0006]
しかし、このような操作によってサンプルから核酸を抽出するには、試料混合手段、遠心分離手段の他、サンプル容器の蓋を開閉する機構も設置しなければならないため、装置が大型化し、構成の複雑化も避けられない。 However, to extract the nucleic acids from a sample by such operation, the sample mixing means, other centrifugal separation means, for mechanism for opening and closing the lid of the sample container must also be installed, device becomes large, complex structure of not also be avoided. また、遠心処理に伴いサンプル容器の交換などを要するので、連続的な処理を行い難い。 Also, it takes a like replacement of the sample container with the centrifugation, difficult to perform continuous processing.
【0007】 [0007]
一方、特開平9-19292、特開平8-62224は、自動核酸検査装置用に適した新たな核酸抽出工程として、ガラス表面への核酸の非特異的吸着を利用した分離、抽出方法を開示している。 On the other hand, JP-A 9-19292, JP-A-8-62224, as a new nucleic acid extraction process suitable for automated nucleic acid testing apparatus, separated utilizing a non-specific adsorption of nucleic acids to glass surfaces, extraction method disclosed ing.
【0008】 [0008]
該方法では、タンパク質を分解する物質を予めサンプルに加えた後、ガラスコートされたフェライト磁石ビーズを添加する。 In this method, after adding to the pre-sample decomposing substance protein, adding ferrite magnet beads glass coating. 核酸成分は、該ビーズのガラス部分に吸着するので、ビーズを磁石に吸い付ければ、核酸成分のみを抽出することができる。 The nucleic acid component, since adsorbed on the glass portion of the beads, if Suitsukere beads to the magnet, it is possible to extract only the nucleic acid component.
【0009】 [0009]
しかしながら、該方法も洗浄操作と抽出操作とを要するため、そのための手段を要し、抽出・分離の工程は10〜12分かかる。 However, since the method also requires a cleaning operation and the extraction operation requires a means for them, the extraction and separation process takes 10 to 12 minutes. また、該方法では、mLレベルの検体から核酸を抽出することは困難である。 Further, in the method, it is difficult to extract nucleic acids from samples mL level. それ故、多数の検体を短時間で検査し得る装置に適用するには、該方法も完全とはいえない。 Therefore, to apply the device may be tested in a short time a large number of specimens can not be said method also completely. また、検体毎に別々の容器を必要とするので、連続的な処理を行い難い。 Moreover, because it requires separate containers for each specimen, difficult to perform continuous processing.
【0010】 [0010]
次に、増幅工程において改良すべき点としては、PCRを行うときの液温の調整が挙げられる。 Then, as the points to be improved in the amplification step include the liquid temperature adjustments when performing PCR. 該工程においてGC含量の多い核酸を用いた場合、93℃では核酸の変性が起こらないが、94℃では核酸の変性が起こることもあるので、自動化においても、とりわけ液温の厳密な制御が課題となる。 When using more nucleic GC content in the process, but does not occur for nucleic acid denaturation at 93 ° C., since sometimes occur denaturation of 94 ° C. in the nucleic acid, even in an automated, challenges especially liquid strict control of temperature to become.
【0011】 [0011]
この点、従来のPCR反応装置では、加熱したヒートブロックの中に、PCR反応液及びサンプルを加えた縦長のカップ状容器を挿脱させるように収容することによって、PCR反応液及びサンプルを間接的に加熱するので、加熱にタイムラグが生じ、正確な温度制御が困難であるという欠点を有している。 In this respect, in a conventional PCR reaction apparatus, in a heated heat block, by accommodating the cup-shaped container of elongated plus PCR reaction solution and the sample so as to insertion and removal, indirectly PCR reaction solution and the sample since heating to lag the heating occurs, it has the disadvantage that accurate temperature control is difficult.
【0012】 [0012]
最後に、PCR増幅産物の検出工程においても、操作時間、染色溶液が環境に与える問題等が残っている。 Finally, in the detection step of the PCR amplification products, operating time, staining solutions are still problems such as on the environment.
【0013】 [0013]
例えば、上記特開平6-327476は、PCR産物を分離、検出するために簡易なゲル電気泳動装置を組み込んだ自動遺伝子解析装置を開示している。 For example, the JP-A 6-327476, the separation of PCR products, discloses an automatic genetic analyzer incorporating a simple gel electrophoresis apparatus in order to detect. しかしながら、電気泳動を用いた検出は、少なくとも60分程度の時間を要するのみならず、一度の操作で扱い得る検体数は限られている。 However, detection is not only takes at least 60 minutes to time, have limited number of samples can be handled in a single operation using the electrophoresis. 従って、ゲル電気泳動を用いた自動核酸検査装置は、多数の検体を短時間で分析しなければならない臨床検査に用いるには全く適していない。 Thus, automated nucleic acid inspection apparatus using the gel electrophoresis is not at all suitable for use in clinical tests that must be analyzed in a short time a large number of specimens. また、染色やラベリングに用いる種々の色素、例えば蛍光色素は、遺伝的毒性も有しているので、廃棄物としての取り扱いに注意しなければならない。 Further, various dyes used in the dyeing or labeling, such as fluorescent dyes, so also have genetic toxicity, care must be taken in handling as waste.
【0014】 [0014]
【発明が解決しようとする課題】 [Problems that the Invention is to Solve
本発明は、従来技術に存する上記課題を解決するためになされたものであり、(i)サンプルからの核酸成分の抽出、(ii)抽出した核酸の増幅、(iii)増幅した核酸の検出工程のうちの少なくとも一つが自動操作に適するように改良された自動核酸検査装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve the above problems existing in the prior art, (i) Extraction of nucleic acid components from the sample, (ii) extracted nucleic acid amplification, (iii) step of detecting the amplified nucleic acid and an object thereof is to provide an automatic nucleic acid testing apparatus in which at least one is improved to be suitable for automatic operation of the.
【0015】 [0015]
【課題を解決するための手段】 In order to solve the problems]
上記課題を解決するために、本発明は、 In order to solve the above problems, the present invention is,
核酸を含有する複数のサンプルから核酸成分を連続的に抽出可能な核酸抽出手段と、 And continuously extracted nucleic acid extraction means a nucleic acid component from a plurality of samples containing nucleic acids,
該核酸抽出手段によって抽出された前記核酸成分中に含まれ得る所望の核酸を特異的に増幅するための核酸増幅手段と、 A nucleic acid amplification means for specifically amplifying a desired nucleic acid that may be included in the nucleic acid component extracted by the nucleic acid extraction unit,
該核酸増幅手段によって増幅された前記所望の核酸を検出するための核酸検出手段とを備えた自動核酸検査装置を提供する。 To provide an automatic nucleic acid testing device that includes a nucleic acid detection means for detecting the desired nucleic acid amplified by the nucleic acid amplification means.
【0016】 [0016]
本発明は、(i)サンプルからの核酸成分の抽出、(ii)抽出した核酸の増幅、(iii)増幅した核酸の検出からなる工程のうち少なくとも一つが自動操作に適するように改良された自動核酸検査装置を提供する。 Automatic invention, the extraction of nucleic acid components from (i) samples, which is modified as appropriate in (ii) extracted nucleic acid amplification, at least one of automatic operation of the process consisting of the detection of the amplified nucleic acid (iii) to provide a nucleic acid testing equipment.
【0017】 [0017]
従って、本発明の装置によれば、従来の同種の装置に比べて、多数のサンプルを短時間に検査することができる。 Therefore, the apparatus according to the present invention, as compared with the conventional apparatus for the same kind, it is possible to inspect a large number of samples in a short time. より具体的には、96個のサンプルを5〜6時間で検査することが可能であり、これは従来の装置に比べて、およそ3分の1の所要時間である。 More specifically, it is possible to inspect the 96 samples in 5-6 hours, which is compared with the conventional apparatus, it is one of the required time of approximately 3 minutes.
【0018】 [0018]
かかる効果を達成するために、本発明の装置においては、核酸抽出手段としてフリーフロー電気泳動又はキャピラリー電気泳動、PCR増幅容器として加熱体一体型核酸増幅容器、及び核酸検出手段として楕円偏光解析を使用する。 To achieve such effects, in the apparatus of the present invention, free-flow electrophoresis or capillary electrophoresis as nucleic acid extraction unit, the heating body integrated nucleic acid amplification container as PCR amplification vessel, and using ellipsometry as a nucleic acid detecting means to. 本発明の装置では、多数の検体を自動検査するのに適したこれらの核酸抽出手段、PCR増幅容器、及び核酸検出手段を一以上組み合わせて使用し得るが、最大の効果を得るためには、これらの核酸抽出手段、PCR増幅容器、及び核酸検出手段を同時に使用することが好ましい。 In the apparatus of the present invention, for these nucleic acid extraction means suitable for automatic inspection many samples, PCR amplification container, and a nucleic acid detection means may be used in combination one or more, to obtain the maximum effect, these nucleic acid extraction unit, it is preferable to use PCR amplification container, and a nucleic acid detection means at the same time.
【0019】 [0019]
以下、実施例によって、本発明をさらに詳細に記載するが、いかなる意味においても、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定することを意図するものではない。 Hereinafter, examples will be described in further detail the present invention, in any way, not intended to limit the scope of the invention as set forth in the appended claims.
【0020】 [0020]
[実施例1] [Example 1]
図1は、本実施例の自動核酸検査装置内部の上面図である。 Figure 1 is a top view of an internal automated nucleic acid testing apparatus of the present embodiment. 以下、図1を参照しながら、本発明の自動核酸検査装置を詳細に説明する。 Hereinafter, with reference to FIG. 1, illustrating the automatic nucleic acid testing apparatus of the present invention in detail.
【0021】 [0021]
自動核酸検査装置101は、核酸の抽出・増幅・検出工程を全て自動的に行うことができ、前記各工程は、それぞれ自動核酸検査装置101の内部に配置された核酸抽出手段111、PCR反応装置119、及び核酸検出手段132によって、この順序で実施される。 Automated nucleic acid testing device 101, all extraction and amplification and detection steps of a nucleic acid can be performed automatically, each step, the nucleic acid extraction unit 111, PCR reactor placed inside the automatic nucleic acid testing device 101, respectively 119, and the nucleic acid detection unit 132 is implemented in this order.
【0022】 [0022]
従って、自動核酸検査装置101によれば、検査者は、試料を添加したサンプル管をサンプル立て(図示せず)にセットした後、自動核酸検査装置101を始動させるだけで核酸検査を行うことができる。 Therefore, according to the automatic nucleic acid testing apparatus 101, the examiner, after setting the sample tube supplemented with a sample sample stand (not shown), be performed nucleic acid testing simply by starting the automatic nucleic acid testing device 101 it can.
【0023】 [0023]
自動核酸検査装置101を始動させると、前記サンプルは、吸入装置(図示せず)によって吸入された後、核酸抽出手段111に移送される。 When starting the automatic nucleic acid testing apparatus 101, the sample, after being sucked by the suction device (not shown), is transferred to the nucleic acid extraction unit 111.
【0024】 [0024]
核酸抽出手段11は、特開平6-327476、特開平9-19292、及び特開平8-62224に開示された抽出手段を含む任意の抽出手段であり得るが、処理の迅速性、構成の簡易さ故に、フリーフロー電気泳動又はキャピラリー電気泳動を用いるのが極めて好ましい。 Nucleic acid extraction unit 11, Hei 6-327476, Hei 9-19292, and may be any extraction means comprising the disclosed extraction means in JP-A 8-62224, rapidity of processing, simplicity of construction therefore, to use a free-flow electrophoresis or capillary electrophoresis highly preferred.
【0025】 [0025]
一般的に、サンプルが少量の場合にはキャピラリー電気泳動が適しており、検体中に目的核酸数が少ない場合(1000個未満)にはフリーフロー電気泳動が適しているであろう。 Generally, the sample is suitable capillary electrophoresis in the case of small quantities, if a small object number nucleic acid (less than 1000) in the specimen will have suitable free-flow electrophoresis.
【0026】 [0026]
フリーフロー電気泳動は、典型的には、図2に示された構造を有しており、それ自体公知である(特開平10―318982参照)。 Free-flow electrophoresis, typically has the structure shown in FIG. 2, known per se (see JP-A 10-318982). フリーフロー電気泳動のための素子は、厚さ0.1〜5mm、好ましくは0.5〜2mmの二枚のガラス板201a及び201bと、両ガラス板の間に挟持されたシリコン板202a及び202b、一対の延在する電極206a(陽極)と206b(陰極)から構成されている。 Elements for free-flow electrophoresis, a thickness of 0.1 to 5 mm, preferably a two glass plates 201a and 201b of 0.5 to 2 mm, the silicon plate 202a and 202b sandwiched two glass plates, a pair of extending and a electrode 206a (anode) and 206 b (cathode). ガラス板201a、201bとシリコン板202a、202bによって偏平な中空状の間隙が形成されているので、サンプル注入口205からサンプル溶液を注入すると、サンプルは緩衝液流入口203から緩衝液流出口204へ(図中矢印の方向)流れる。 Glass plates 201a, 201b and the silicon plate 202a, so flat hollow space is formed by 202b, from the sample inlet 205 when injecting the sample solution, the sample to buffer outlet 204 from the buffer solution inlet 203 (the arrow direction in the drawing) flows.
【0027】 [0027]
電極206aと206bは電界を形成しているので、核酸のように負の電荷を有する物質は、陽極206aの方向に移動しながら泳動される。 Since electrodes 206a and 206b forms an electric field, substances having a negative charge as the nucleic acid is electrophoresed while moving in the direction of the anode 206a. 従って、図中、緩衝液流出口204の右側で流出液を収集すれば、核酸成分を抽出することができる。 Thus, in the figure, when collecting effluent in the right buffer outlet 204 can extract the nucleic acid component.
【0028】 [0028]
2枚のガラス板201a、201bの間隔は、サンプルと緩衝液が互いに拡散して混じり合わないように、5μm〜150μmとするのが好ましい。 Two glass plates 201a, 201b interval, as the sample and the buffer solution is not mixed diffuse each other, preferably with 5Myuemu~150myuemu. 電極には、腐食されにくい白金、金を使用することが好ましい。 The electrode corrosion is not easily platinum, it is preferable to use gold. ガラス板201aと201bの間隔が狭い場合には、印加電圧は数kVまで上げることができるが、適宜設定できる。 And the gap of the glass plate 201a and 201b is narrow, the applied voltage can be increased up to several kV, but may be set appropriately.
【0029】 [0029]
フリーフロー電気泳動に使用し得る緩衝液としては、種々の緩衝液が知られており、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。 The buffers that may be used in free flow electrophoresis are known various buffers, phosphate buffer, acetate buffer, glycine - tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, tris (hydroxymethyl) amino including but methane buffers, and the like.
【0030】 [0030]
フリーフロー電気泳動素子のサイズは、縦(流速方向)1〜30cm、横1〜30cm、好ましくは縦2〜10cm、横2〜10cm、最も好ましくは縦3〜5cm、横3〜5cmであり得る。 The size of the free-flow electrophoresis device, the vertical (the direction of the flow velocity) 1 to 30 cm, transverse 1 to 30 cm, preferably vertical 2 to 10 cm, horizontal 2 to 10 cm, and most preferably may be a vertical 3 to 5 cm, lateral 3 to 5 cm . フリーフロー電気泳動のサイズは、分離能、サンプルの容量、分離時間等に応じて適切なサイズを選択すればよい。 The size of the free-flow electrophoresis separation capability, sample volume may be selected appropriate size depending on the separation time and the like. フリーフロー電気泳動を用いて、1mL程度のサンプルから核酸成分を抽出する場合の標準的な分離時間は、概ね1分以内であり、良好な条件を選択することで30秒以内にもなり得、極めて短時間且つ連続的に核酸成分を抽出することができる。 Using free-flow electrophoresis, standard separation time in the case of extracting nucleic acid components from a sample of approximately 1 mL, generally is within 1 minute, also can become within 30 seconds by selecting a good condition, it can be extracted in a very short time and continuously nucleic acid component.
【0031】 [0031]
さらに、フリーフロー電気泳動には大量のサンプルを負荷することが可能である。 Further, the free-flow electrophoresis is possible to load a large sample. これは、サンプル中に所望の核酸が微量(ある場合には一分子)しか含まれておらず、大量のサンプルを全て核酸抽出手段に供する必要がある場合には、特に有用な特徴である。 This is the desired nucleic acid in the sample is only not Including (one molecule in some cases) trace, when it is necessary to provide all the nucleic acid extraction means a large number of samples, a particularly useful feature.
【0032】 [0032]
キャピラリー電気泳動には、極微量のサンプルを負荷することが可能であり、極微量サンプルの検査を行うのに有効である。 Capillary electrophoresis, it is possible to load a sample of very small amount, is effective in inspecting a very small samples. キャピラリー電気泳動用の素子は、毛管力を生じるような中空の細長い円筒管路と、この管路のサンプル流入側とサンプル流出側とに一対の電極(陽極と陰極)を接続し、電荷を与えることによって、注入側から流出側へと核酸成分を移動させるものであり、概ね2分以内、好適な条件、特にキャピラリー長を短くすることで1分以内の分離が可能となる(特開平9−89840等参照)。 Element for capillary electrophoresis, connects the hollow elongated cylindrical conduit that produce capillary force, a pair of electrodes on the sample inlet side and the sample outlet side of the conduit (anode and cathode), giving an electric charge by, which causes the injection side to the outlet side is moved to a nucleic acid component, generally within 2 minutes, suitable conditions, in particular the separation of less than 1 minute by shortening the capillary length is possible (JP-9- see, for example, 89,840). 従って、好ましくは、核酸抽出手段11にフリーフロー電気泳動とキャピラリー電気泳動装置の両方を設けて、選択的にサンプルの注入と電圧の印加を行うように構成することによって、サンプル量に応じた抽出を行わせることができる。 Therefore, preferably, provided with both the free-flow electrophoresis and capillary electrophoresis apparatus to nucleic acid extraction unit 11, by configuring to perform the application of injection and voltage selectively samples, corresponding to sample extraction it can be carried out. このような選択的な核酸抽出の指示は、ユーザーインターフェース136に設けた入力手段によってオペレーターが指定するか、あるいはサンプル量やIDをコード化したバーコードをサンプルカップの外壁に設けて適宜の読取り手段によって自動的に入力指示するようにすればよい。 Indication of such selective nucleic acid extraction, or the operator specifies the input means provided in the user interface 136, or the sample volume and ID coded barcode samples appropriate reading means is provided on the outer wall of the cup it may be input indicated automatically by.
【0033】 [0033]
核酸抽出手段111によって抽出された核酸含有画分は、上記素子の流出口から落下させるか適宜の吸引手段で吸引させて検体毎にサンプルカップ中に回収するようにする。 Nucleic acid-containing fraction extracted by the nucleic acid extraction unit 111, so as to recover in the sample cup is sucked in for each specimen by an appropriate suction means or to fall from the outlet of the device. サンプルカップには、サンプルカップストッカー115に収納されているものが使用される。 The sample cup, which is housed in the sample cup stocker 115 is used. 従って、核酸抽出手段111で抽出された核酸含有画分を抽出するために、遅くとも核酸含有画分抽出時点までに、サンプルカップを所定の位置に搬送する操作が自動的に行われる。 Therefore, in order to extract the nucleic acid-containing fraction extracted with nucleic acid extraction unit 111, by the time the latest nucleic acid-containing fraction extracted operation of transporting the sample cups into position it is automatically performed. 核酸は全体として負の電荷を帯びているので、核酸抽出手段111としてフリーフロー電気泳動を用いる場合には、サンプルカップは、緩衝液流出口204の右側(陽極206aが存在している側)の適切な位置に配置される。 Since nucleic acids are negatively charged as a whole, when using a free-flow electrophoresis as a nucleic acid extraction unit 111, the sample cup, buffers outlet 204 right (side where the anode 206a is present) It is properly positioned.
【0034】 [0034]
サンプルカップの搬送は、カップ搬送ハンド106によって行われる。 Conveying the sample cup is carried out by the cup transport hand 106. カップ搬送ハンド106は、ロボットアーム102に沿って図中X軸方向に移動し得るロボットアーム103に係合されたロボットアーム104に取り付けられている。 Cup transport hand 106 is attached to the robot arm 104 engaged with the robotic arm 103 which can move in the X-axis direction in the drawing along the robot arm 102. さらに、カップ搬送ハンド106は、Z軸方向(紙面垂直方向)に延出するロボットアーム105上を自由に移動し得る。 Further, the cup conveying hand 106 may freely move on the robot arm 105 extending in the Z-axis direction (direction perpendicular to the paper surface). 従って、カップ搬送ハンド106は、ロボットアーム103とロボットアーム104の存在位置によって決定される図中XY平面上の任意の位置に移動させることができる。 Thus, the cup conveying hand 106 may be moved to any position on the drawing XY plane determined by the location of the robot arm 103 and the robot arm 104. その後ロボットアーム104に沿ってZ軸方向に下降させれば、ロボットアーム102〜104の垂直位置の下方に配置されているサンプルカップを握持することが可能となる。 If ask then along the robot arm 104 is lowered in the Z axis direction, it is possible to grip the sample cup is located below the vertical position of the robot arm 102 to 104.
【0035】 [0035]
なお、ロボットアーム103及び104には、カップ搬送ハンド106の他に、PCRモジュール搬送ハンド108、及び反応トレー搬送ハンド109が取り付けられており、以下で詳述する備品や試薬等をある地点から別の地点に移動させる各種の操作は、全てこれらのハンドで行われる。 Incidentally, another to the robot arm 103 and 104, in addition to the cup transport hand 106, PCR module transport hand 108, and is attached is a reaction tray transfer hand 109, a point in the equipment and reagents and the like to be described below various operation of moving to a point, all carried out in these hands. 但し、各種のロボットアームがベルトコンベア上との同じ容器、モジュール、トレー等の移し換えのみを行って、ベルトコンベアが長距離ないし長時間の搬送を行うように変更してもよい。 However, various same vessel, the module of the robot arm and the belt conveyor, by performing only was transferred to trays and the like, the belt conveyor may be modified to perform a long-distance or long transport.
【0036】 [0036]
前記サンプルカップ中に核酸含有画分を抽出した後、サンプルカップは再びカップ搬送ハンド106によって握持され、サンプル濃縮用ヒートブロック112の上面に形成されているサンプル収納孔に収納される。 Wherein after the sample cup was extracted nucleic acids containing fractions, the sample cup is gripped by the cup transport hand 106 again, it is accommodated in the sample accommodating hole formed in the upper surface of the sample concentration for the heat block 112.
【0037】 [0037]
通常は、全てのサンプル収納孔にサンプルカップが収納されるまで、前述した核酸抽出操作と、サンプル濃縮用ヒートブロック112へのサンプルカップの収納からなる上記操作を繰り返す(図1では8回繰り返されることになる)。 Normally, until sample cup to all samples housing hole is accommodated, is repeated and the nucleic acid extraction procedure described above, consisting of storage of the sample cup into the sample concentrating the heat block 112 to repeat the above operation (in FIG. 1 eight times It will be).
【0038】 [0038]
サンプル濃縮用ヒートブロック112は、例えば、サンプルカップ中の核酸含有画分を加熱して液体成分を蒸発せしめるといった適宜の濃縮技術を採用することによって核酸含有画分を濃縮し得る。 Sample concentration for the heat block 112 may, for example, concentrated nucleic acid-containing fraction by employing an appropriate concentration techniques such as by heating a nucleic acid-containing fraction in the sample cup is evaporated liquid components. サンプル濃縮用ヒートブロック112は、熱伝導性の良好な材質、例えば金属からなることが好ましく、この種の目的で使用される一般的なヒートブロックである。 Sample concentration for the heat block 112, a material having good thermal conductivity, preferably made of for example metal, a general heat block for use in this type of purpose. 加熱温度は、任意の温度に設定し得るが、60〜100℃の温度範囲が好ましい。 The heating temperature is can be set to any temperature, preferably a temperature range of 60 to 100 [° C..
【0039】 [0039]
サンプルの濃縮は、続いて行われるPCR増幅ステップに使用するために、サンプル容量を減少せしめたい場合だけ行えばよいので、該工程は省略することもできる。 Concentration of the sample, for use in subsequently PCR amplification steps are performed, since it is sufficient only if you want allowed reduce sample volume, the process may be omitted. しかしながら、核酸抽出手段111として、フリーフロー電気泳動を使用する場合には、濃縮操作が必要となることが多いであろう。 However, as a nucleic acid extraction unit 111, when using a free-flow electrophoresis, will often concentration operation is required.
【0040】 [0040]
前記核酸含有画分、好ましくは濃縮された核酸含有画分は、ポンプ107の作用によって、ピペット手段(図示せず)に吸引される。 The nucleic acid-containing fraction, preferably the nucleic acid-containing fraction which is enriched by the action of the pump 107, is sucked into the pipette means (not shown). 該ピペット手段には、ピペットチップ容器123に収納されているピペットチップが自動的に取り付けられる。 The said pipette means pipette tip housed in the pipette tip container 123 is automatically attached. ピペットチップは通常使用されているものであり得る。 The pipette tip may be those that are normally used.
【0041】 [0041]
前記核酸含有画分が吸引除去された後、ヒートブロック112に収納されているサンプルカップは、カップ搬送ハンド106で握持され廃棄箱113に廃棄される。 After the nucleic acid-containing fraction is aspirated, the sample cup is housed in the heat block 112 is gripped by the cup transport hand 106 is discarded in the disposal box 113.
【0042】 [0042]
前記ピペット手段は、前記ロボットアーム102〜104によって、PCR試薬カップストッカー116に並立された容器まで移動され、該容器中に前記核酸含有画分、好ましくは濃縮された核酸含有画分を吐出する。 The pipette means, by the robotic arm 102 to 104, is moved to the container which is coexistent in PCR reagent cup stocker 116, the in container nucleic acid-containing fraction, preferably ejects the nucleic acid-containing fraction is concentrated.
【0043】 [0043]
該容器には、核酸含有画分を吐出した後又は吐出する前に、PCR増幅試薬114が分注される。 The container prior to or discharged after discharging the nucleic acid-containing fraction is dispensed PCR amplification reagents 114 min. 核酸含有画分を吐出する前に、予めPCR増幅試薬114を分注しておけば検査時間の短縮を図り得るであろう。 Before discharging the nucleic acid-containing fraction, it will get work to shorten the inspection time if aliquoted PCR amplification reagents 114 in advance min. なお、PCR増幅試薬114は、ポンプ110の作用によって、前記ピペット手段から吸引され、PCR試薬カップストッカー116に並立された容器に吐出される。 Incidentally, PCR amplification reagents 114, by the action of the pump 110, the aspirated from the pipette means is discharged into collateral containers in PCR reagent cup stocker 116. また、ピペットチップは、各操作毎及び各検体毎に交換され、使用済みのピペットチップは廃棄箱113に廃棄される。 Also, the pipette tip is exchanged for every operation for each and each sample, used pipette tip is discarded in the disposal box 113.
【0044】 [0044]
PCR増幅試薬114は、所定の配列を有するプライマー、Taqポリメラーゼ等の耐熱性ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸(dTTP、dATP、dCTP、dGTP)、緩衝液等のPCRに必要な物質を含有している。 PCR amplification reagents 114, contains a primer having the predetermined sequence, a thermostable polymerase such as Taq polymerase, deoxynucleotide triphosphate (dTTP, dATP, dCTP, dGTP), a substance needed for PCR buffer solution . PCRには、極めて多くの変法が開発されているので、PCR増幅試薬114は、適用するPCR手法に応じた様々な試薬を2種類以上含有し得る。 The PCR, since so many variations have been developed, PCR amplification reagents 114 may contain various reagents in accordance with the PCR technique for applying two or more types.
【0045】 [0045]
PCR増幅試薬114と混合された前記核酸含有画分(以下PCR混合液という)は、PCR反応装置119の上に予め載置されたPCRモジュール120上の試料注入口に注入される。 The nucleic acid-containing fraction is mixed with PCR amplification reagents 114 (hereinafter referred to as PCR mixture) is injected into the pre-placed on the PCR module 120 on the sample inlet on the PCR reactor 119. PCRモジュール120への注入も、ポンプ110及び前記ピペット手段によって行われる。 Injection into PCR module 120 is also performed by the pump 110 and the pipette unit.
【0046】 [0046]
以下、図3〜7を参照しながら、PCRモジュール120の好ましい構造及びPCRモジュール120への試料の注入操作を説明する。 Hereinafter, with reference to FIGS. 3-7, illustrating the injection operation of the sample into a preferred structure and PCR module 120 of PCR module 120.
【0047】 [0047]
好ましいPCRモジュール120は、図3(上面図)、図4(断面図)、図5(図4の拡大図)に示された構造の第一の基板と図6(上面図)に示された構造の第二の基板を有する。 Preferred PCR module 120, FIG. 3 (top view), Fig. 4 (sectional view), as shown in FIG. 5 the first substrate and FIG. 6 (top view) of the structure shown in (enlarged view of FIG. 4) having a second substrate structure.
【0048】 [0048]
図4に示されているように、第一の基板は、PCR混合液を注入するための反応セル302が少なくとも一つ形成された平滑な基板301と、前記反応セル302が形成された表面と対向する表面に接着されている樹脂膜303を具備する。 As shown in FIG. 4, the first substrate includes a smooth substrate 301 of the reaction cell 302 is at least one formation for injecting the PCR mixture, and the reaction cell 302 is formed a surface comprising a resin film 303 is bonded to the opposing surfaces.
【0049】 [0049]
基板301の材料としては、半導体工学で成形方法が確立されているシリコンウェハを使用し得る。 As the material of the substrate 301 may use a silicon wafer forming method is established in the semiconductor engineering.
【0050】 [0050]
基板301の材料としてシリコンウェハを使用するときには、反応セル302はエッチングによって平滑な底面を有するように成形し得る。 When using a silicon wafer as a material of the substrate 301, the reaction cell 302 may be shaped to have a smooth bottom surface by etching. エッチングの精度を向上させて各反応セルの深さを均一に揃え、各反応セル中のPCR混合液の温度にばらつきが生じないようにするためには、シリコンウェハの両表面のうち反応セルを成形しない表面にホウ素原子をドープすることが好ましい。 To improve the accuracy of etching uniformly align the depth of each reaction cell, in order to variation does not occur in the temperature of the PCR mixture in each reaction cell, the reaction cell of the both surfaces of the silicon wafer it is preferred to dope the boron atoms on the surface which is not formed.
【0051】 [0051]
反応セル302の形状及び大きさは、上述した構成に則って、任意のものであり得るが、底面が平坦で略偏平な空間を有しているのが好ましい。 The shape and size of the reaction cell 302, in accordance with the configuration described above, but can be any of those, preferably the bottom has a substantially flat space flat. また、PCR混合液の容量は通常100μL以下であるため、例えば、図のように形状が矩形の場合には、1辺が2〜50mm、深さが0.1〜1.0mmであることが好ましい。 Further, since the capacity of the PCR mixture is usually 100μL less, for example, if the shape as shown in FIG rectangle is preferably one side is 2 to 50 mm, a depth of 0.1 to 1.0 mm.
【0052】 [0052]
図3及び図4には、反応セル302の個数が8個の基板が示されているが、反応セルの個数は、1以上の任意の個数であり得る。 In FIGS. 3 and 4, although the number of the reaction cell 302 is shown eight substrate, the number of the reaction cell may be one or more arbitrary number. 反応セルの個数を多くすれば、多数の検体を同時に測定できるので好ましいであろう。 If increasing the number of the reaction cell may be preferred because it measures the number of analytes simultaneously.
【0053】 [0053]
図5に図示されているように、樹脂膜303には、加熱体304と温度検出部5が埋設されている。 As shown in Figure 5, the resin film 303, the heating element 304 and the temperature detecting section 5 is embedded. このような構造のPCRモジュールを用いれば、反応セルの底部が平坦なので伝熱効率が良好である。 Using the PCR module of this structure, heat transfer efficiency is good because the bottom of the reaction cell is flat. また、加熱体と温度検出部が反応セルの底部に一体的に配置されており、反応セル302の中のPCR混合液が直接、加熱されるので、PCR混合液の温度を厳格に調節できる。 The heating element and the temperature detecting portion are integrally disposed at the bottom of the reaction cell, PCR mix directly in the reaction cell 302, since it is heated it can be adjusted strictly to the temperature of the PCR mixture. PCRの成否は、反応温度によって大きな影響を受け得るので、ヒートブロックを介してPCRモジュールを間接的に加熱する態様に比べて、加熱体が埋設されたPCRモジュールによる加熱は、良好な結果をもたらす。 The success of the PCR, because it can greatly influenced by the reaction temperature, as compared with the embodiment of indirectly heating the PCR module via the heat block, the heating by the PCR module heating body is embedded, gives good results . このように、加熱効率を向上させた反応セルを用いることで、核酸増幅を短時間で実施し得る。 Thus, by using a reaction cell with improved heating efficiency can be carried out nucleic acid amplification in a short time. また、別個の反応セル302を複数個形成したことで、同一又は異なるサンプルを同時に処理できる。 Furthermore, a separate reaction cell 302 by the plural number, can simultaneously process the same or different samples.
【0054】 [0054]
反応セル302が形成された凹部において、基板301の強度は著しく減弱するので、樹脂膜303は基板1の凹部に強度を与えるという極めて重要な役割も果たしている。 In the recess of the reaction cell 302 is formed, the strength of the substrate 301 is significantly attenuated, the resin film 303 also plays a very important role of providing strength to the recess of the substrate 1. 従って、樹脂膜303の材質は、強い強度を有し、非水溶性であり、少なくとも0〜100℃の温度範囲で耐熱性がある材質でなければならない。 Thus, the material of the resin film 303 has a high strength, a water-insoluble, should be a material having heat resistance at a temperature range of at least 0 to 100 ° C.. 具体的には、テフロン等のフッ素樹脂、ポリイミド樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン樹脂、塩化ビニル樹脂等であり得る。 Specifically, fluorine resin such as Teflon, polyimide resin, polycarbonate, polypropylene resin, may be a vinyl chloride resin or the like.
【0055】 [0055]
強度及び熱伝導性の双方が満たされるように、樹脂膜303の厚さは1μm以上200μm以下であることが望ましい。 As both the strength and thermal conductivity are satisfied, it is desirable that the thickness of the resin film 303 is 1μm or more 200μm or less.
【0056】 [0056]
加熱体304は、炭化ケイ素、チタン、ニッケル−クロム合金等のある程度の電気抵抗を有する材質によって構成され得る。 Heating body 304, silicon carbide, titanium, nickel - be constituted by a material having a certain electrical resistance, such as chromium alloys. 加熱体304の一部は、樹脂膜304の底面に連通しており、通電するための電気的接点を成し、通電によって反応セル302の中のPCR混合液が加熱される。 Part of the heating body 304 is communicated with the bottom surface of the resin film 304, forms an electrical contact for energizing, PCR mixture in the reaction cell 302 is heated by energization.
【0057】 [0057]
温度検出部305は、0〜100℃の温度範囲において抵抗率が直線状に変化する金属、例えば白金、チタン等からなり得る。 Temperature detection unit 305, metal resistivity in the temperature range of 0 to 100 ° C. is varied linearly, such as platinum, may consist of titanium or the like. 温度検出部305の一部も、樹脂膜303の底面に連通しており、通電するための電気的接点を成している。 A part of the temperature detecting portion 305 communicates with the bottom surface of the resin film 303, and has electrical contacts for energizing.
【0058】 [0058]
図6に示されているように、第一の基板の上には、試料出入口401が設けられた第二の基板402が接合される。 As shown in FIG. 6, on the first substrate, the second substrate 402 in which the sample entrance 401 is provided is bonded. 試料出入口401は、第一の基板403の各反応セル404の両端部に夫々対応するように1対ずつ配置されており、各反応セル内にPCR混合液を注入及び排出するための小孔である。 Sample entrance 401 is arranged in pairs so that each corresponding to both ends of the reaction cell 404 of the first substrate 403, a small hole for injecting and discharging the PCR mixture in each reaction cell is there. 第二の基板302は、反応セル内のPCR混合液が蒸発するのを防止するように気密な構成になっている。 The second substrate 302 is, PCR mixture in the reaction cell is in airtight structure to prevent the evaporation.
【0059】 [0059]
第一の基板と第二の基板が接合されてなるPCR反応槽501は、図7に示されているような基板部材502の上に載置固定され、枠部材503が被せられている。 PCR reaction tank 501 where the first substrate and the second substrate formed by bonding is placed and fixed on the substrate member 502 as shown in FIG. 7, the frame member 503 is covered. 枠部材503には、前記図6に記載の1対の試料出入口401に対応して気密に合接可能な1対の試料注入口504が設けられており、中央部は中空となっていて、適宜反応槽内のモニタリングが可能となっている。 The frame member 503, FIG. 6 and sample inlet 504 of conjoined possible pair airtight is provided corresponding to the sample entrance 401 a pair according to the central portion have a hollow, monitoring suitable reaction vessel is possible.
【0060】 [0060]
自動核酸検査装置においては、図7の試料注入口504にピペットの先端が挿入され、該試料注入口504を通じて、前記図6に記載の反応セル404の中にPCR混合液が加えられる。 In automated nucleic acid testing apparatus, the tip of the pipette is inserted into the sample inlet 504 in FIG. 7, through the sample inlet 504, PCR mixture is added into the reaction cell 404 according to FIG. 6.
【0061】 [0061]
PCRモジュールストッカー121中には、複数のPCRモジュール120が重層されており、PCRハンド108によって、PCR反応装置119の上に搬送される。 During PCR module stocker 121, a plurality of PCR modules 120 are layered, by PCR hand 108, is conveyed over the PCR reactor 119.
【0062】 [0062]
PCRモジュール120がPCR反応装置119の上に搬送された後、PCRモジュール120内部の各反応セルに、PCR試薬カップストッカー116に収容された容器中のPCR混合液が分注される。 After PCR module 120 is conveyed onto the PCR reactor 119, the PCR module 120 within each reaction cell, it is dispensed PCR mix in a container housed in the PCR reagent cup stocker 116 min. 該分注も前記ピペット手段によってなされる。 Dispensing also made by the pipette unit. PCRモジュール120上に配列されている試料注入口(図7参照)に、ピペット手段に取り付けたピペットチップの先端部を挿入した後、PCR混合液を吐出する。 PCR module 120 sample inlet which is arranged on (see FIG. 7), after inserting the distal end portion of the pipette tip attached to the pipette means, for ejecting the PCR mix. 吐出されたPCR混合液はPCRモジュール120内部の反応セル内に達する。 Discharged PCR mixture reached PCR module 120 within the interior of the reaction cell. PCR混合液の容量は、100μL以下であることが好ましい。 Volume of PCR mix is ​​preferably 100μL less. ここで、PCR後の反応セルは、洗浄で再使用するよりも新たに交換する方がコンタミネーションも無く、正確な検査を実施できるので、上記のように交換式のモジュールにした利点は大きい。 Here, the reaction cell after PCR is better to newly replace than reused in washing contamination even without, it is possible to implement an accurate test, the great advantage that the interchangeable modules as described above.
【0063】 [0063]
PCR反応装置121は、PCRモジュール120の加熱体に通電して、PCRモジュール120の各反応セル内のPCR混合液を加熱する機能、及び加熱されたPCR混合液を冷却する機能を有する通常のPCR増幅装置である。 PCR reaction apparatus 121 by energizing the heating element of the PCR module 120, functions to heat the PCR mixture in each reaction cell in the PCR module 120, and a conventional PCR having the function of cooling the heated PCR mix an amplifier.
【0064】 [0064]
PCR反応装置121には、従来型のモジュール(例えば特開平10−117764参照)も装着して使用し得るように適宜の位置決め手段や加熱手段を設けたり、共通の枠体を設けた構造となっているので、汎用性に優れている。 The PCR reaction apparatus 121, a conventional module (for example, see JP-A-10-117764) is also may be provided an appropriate positioning means and the heating means so as to use by mounting, provided a common frame structure since the are, it is excellent in versatility.
【0065】 [0065]
PCRの反応サイクルは、典型的には、熱変性ステップ、アニーリングステップ、及び伸長反応ステップの繰り返しからなり、PCR反応装置121によって、各ステップに適した温度になるように加熱・冷却を行う。 Reaction cycles of PCR are typically heat denaturation step, an annealing step, and consists repeated elongation reaction steps, by PCR reactor 121, heat and cooling so that the temperature suitable for each step. これらの操作は、当業者には周知のものであり、温度、反応時間、サイクル数の設定は、検査者によって、宜選択され得る。 These operations, to those skilled in the known, temperature, reaction time, the number of cycles set by the examiner may be selected Yichun. 冷却の方式は、コンプレッサー方式、ペルティエ方式を含む任意の方式であり得る。 Method of cooling, compressor system can be any system including Peltier systems.
【0066】 [0066]
PCR反応が終了した後、増幅された核酸を含むPCR混合液は、ピペット手段によって濃縮用ヒートブロック112にセットされたサンプルカップに移され、ディネーチャー反応が行われる。 After the PCR reaction has ended, PCR mixture containing amplified nucleic acid is transferred to a sample cup which is set to concentrating heat block 112 by the pipette unit, denaturing reaction. サンプルカップには、PCR混合液を加える前又は加えた後に、好ましくはPCR混合液を加える前に、ディネーチャー溶液収納部124に収納されているディネーチャー溶液が添加される。 The sample cup, before or after adding addition of PCR mix, preferably prior to the addition of the PCR mix, denaturing solution housed in denaturation solution storage section 124 are added. ディネーチャー溶液は、グアニジウム塩、尿素、界面活性剤等を含む周知の核酸変性液である。 Denaturation solution is a well-known nucleic acid denaturation solution containing guanidinium salt, urea, a surfactant or the like.
【0067】 [0067]
濃縮用ヒートブロック112は、好ましくは90〜95℃に加熱され、増幅された核酸は変性して一本鎖になる。 Concentrating the heat block 112 is preferably heated to 90-95 ° C., nucleic acid amplified is denatured to single and chain. 加熱は、3〜5分程度行えばよいであろう。 Heating would be may be performed 3 to 5 minutes.
【0068】 [0068]
核酸増幅工程において、非対称PCR反応、すなわちプライマー対の一方のみ過剰に加えたPCR反応を行えば、ディネーチャー工程は省略することも可能である。 In a nucleic acid amplification step, asymmetric PCR reactions, i.e. by performing one only added in excess PCR reactions primer pair, denaturing step can be omitted.
【0069】 [0069]
このような変性処理を施したPCR混合液は、ポンプ107とピペット手段によって、予めハイブリダイゼーション試薬カップストッカー118に収納されている各サンプル管に移される。 Such modification treatment of the PCR mixture was subjected is by a pump 107 and the pipette unit is moved to each sample tube housed in advance in the hybridization reagent cup stocker 118. 該サンプル管には、ピペット手段によって、ハイブリダイゼーション試薬117が予め添加されている。 The said sample tube, by pipetting means, hybridization reagent 117 is added in advance. ピペット手段に取り付けられたチップは、廃棄箱113に廃棄される。 Chip mounted on the pipette unit is discarded in the disposal box 113.
【0070】 [0070]
ハイブリダイゼーション試薬117は、5×SSC(NaCl、クエン酸ナトリウム混合液)、10% SDS、10×Denhardt)を含む溶液であり得る。 Hybridization reagent 117, 5 × SSC (NaCl, sodium citrate mixture), be a solution containing 10% SDS, 10 × Denhardt).
【0071】 [0071]
ハイブリダイゼーション試薬117を添加した後、PCR混合液は検体毎に、反応部128にセットした反応トレイ126中に載置されている各反応素子125上に分注される。 After addition of the hybridization reagent 117, PCR mixture for each specimen is dispensed onto each reaction element 125 which is placed in the reaction tray 126 is set in the reaction unit 128. 分注されるPCR混合液の容量は、典型的には数十μLである。 Min capacity of PCR mix to be dispensed is typically a few tens of [mu] L.
【0072】 [0072]
反応素子125は、ロボットアーム105によって、反応トレイ126の少なくとも一面に形成された、反応素子125を収容するための反応素子収容孔802(図8)の中に載置される。 The reaction element 125, the robotic arm 105, which is formed on at least one surface of the reaction tray 126, is placed in a reaction element accommodating hole 802 for accommodating the reaction element 125 (Fig. 8).
【0073】 [0073]
反応トレイ126は、自動化に適するように、図8〜10に示した構造を有するトレイを使用することが好ましい。 The reaction tray 126 as appropriate to automation, it is preferable to use a tray having a structure shown in Figures 8-10.
【0074】 [0074]
図8は、好ましい構造を有する反応トレイ801の上面図である。 Figure 8 is a top view of a reaction tray 801 having the preferred structure. 反応トレイ801は伝熱性の良い部材、例えばアルミ、真ちゅう、銅等を成形したものであり、反応トレイ801の一面には、反応素子収容孔802が8個設けられている。 The reaction tray 801 good heat conductivity member, for example, aluminum, brass, is obtained by molding copper or the like, on one surface of the reaction tray 801, the reaction element accommodation hole 802 is provided eight. 反応素子収容孔802は、1以上の任意の個数であり得る。 The reaction element accommodation hole 802 can be one or more arbitrary number.
【0075】 [0075]
図9は、反応素子収納孔802を拡大した上面図であり、図10は、図9の線A-A'での断面図である。 Figure 9 is an enlarged top view of a reaction device housing hole 802, FIG. 10 is a sectional view at the line A-A 'in FIG.
【0076】 [0076]
反応素子収納孔802は、開口部方向に拡幅する傾斜部分803、傾斜部分803の下部に連続して設けられた垂直部分804、底面上に配設された突起805、及び反応素子収納孔802の一隅に形成された陥入部806を具備する。 The reaction element housing hole 802 is inclined portion 803 widening the opening direction, the vertical portion 804 provided continuously at the bottom of the inclined portion 803, the protrusion 805 disposed on the bottom surface, and the reaction element accommodating hole 802 comprising the invagination 806 formed at one corner.
【0077】 [0077]
垂直部分804は、収容すべき反応素子が動かないように、小型の反応素子のサイズと適合するような大きさであるために、垂直部分804の内部には、反応素子を握持するためのロボットアーム105を挿脱する際の位置決めが難しい。 Vertical portion 804, so that the reaction element to be accommodated does not move, because it is sized to fit the size of a small reaction element, to the interior of the vertical portion 804, for gripping the reaction element it is difficult to positioning when inserting and removing the robot arm 105. このため、反応素子収容孔802は、ロボットアーム105を挿入するための空間として傾斜部分803を備えている。 Therefore, the reaction element accommodation hole 802 is provided with an inclined portion 803 as a space for inserting the robot arm 105. もし、傾斜部分803がなければ、開口部分の大きさは反応素子とほぼ同じ大きさとなるため、反応素子収納孔802に反応素子を出し入れすることが極めて困難となる。 If there is no inclined portion 803, since the size of the aperture is substantially the same size as the reaction element, to be out the reaction element to the reaction element accommodating hole 802 it is extremely difficult. 傾斜部分803の開口部の大きさは、反応素子を握持したロボットアーム105を挿入し得る任意の大きさであり得る。 The size of the opening portion of the inclined portion 803 can be any size capable of inserting the robot arm 105 the reaction element grips.
【0078】 [0078]
反応素子収納孔802の内部において、反応素子は突起805の上に載置される。 Inside the reaction element accommodating hole 802, the reaction element is placed on the protrusion 805. 反応素子収納孔802には、サンプル及び洗浄液等の液体が添加されるので、突起805がなければ、反応素子収納孔802の底面と反応素子の間に液体が浸潤し、反応素子の取り出しが困難となる。 The reaction element housing hole 802, the liquid such as sample and washing liquid is added, if there is no protrusion 805, the liquid between the bottom surface and the reaction element of the reaction element accommodating hole 802 is infiltrated, difficult to take out the reaction element to become. 反応素子を安定に載置し得るように、各突起の高さは、同じであることが好ましく、2つ以上、好ましくは4つ以上配設することが好ましく、突起805の位置は反応と測定を行う領域、例えば中央部分を避けた領域に設けるのが好ましい。 As can the reaction device stably mounted, the height of each projection is preferably the same, two or more, preferably preferably be disposed four or more, the position of the projection 805 is reacted with measured area for, preferably, for example, of providing a region except the central portion.
【0079】 [0079]
陥入部806は、反応素子収納孔802の底面と略同一の深さで且つ突起805より低位置の深さを有しており、洗浄・乾燥装置129に取り付けられたノズル130を最適な位置に移動させることを可能にする程度に十分に反応素子収納孔802の対角線方向に延在させた空間である。 Dimple 806, from and projection 805 on the bottom surface and substantially the same depth of the reaction element accommodating hole 802 has a depth of the low position, the nozzle 130 mounted to the cleaning and drying apparatus 129 to an optimum position it is a space that extend sufficiently diagonal reaction element receiving hole 802 to an extent that makes it possible to move the. すなわち、陥入部806が存在すれば、ノズル130を陥入部806の内部に移動させることができるので、ノズル130が移動し得る領域が増大し、洗浄液等を最適な位置に吐出又は吸引することができる。 That is, if there are dimples 806, it is possible to move the nozzle 130 to the interior of invaginated portion 806, is a region where the nozzle 130 can move is increased, discharges or sucks the cleaning liquid or the like in an optimum position it can. 陥入部806は、1以上設けてもよく、開口部の周縁に設置してもよい。 Dimple 806 may be provided one or more, it may be placed on the periphery of the opening.
【0080】 [0080]
なお、図9の陥入部806以外の3つの小さな陥入部は、精密に反応素子収納孔802を形成する上で予め設けられるものであって、材質や製法によっては必須な部分ではない。 Incidentally, the small invagination three non dimple 806 of FIG. 9, there is to be previously provided in forming a precise reaction element accommodating hole 802, it is not a mandatory part depending on the material and production method.
【0081】 [0081]
反応トレイ126は、反応前には、反応トレイ収納箱に収納されており、反応時に、ロボットアーム104によって、反応部128に移される。 The reaction tray 126, prior to reaction, the reaction tray storage box is housed in, during the reaction, by the robot arm 104 and transferred to the reaction unit 128.
【0082】 [0082]
反応トレイ126上の反応素子収納孔802の中に載置される反応素子125は、所望の核酸が高密度に固相されており、一般にDNAチップ又はマイクロアレーと称されるものである。 Reaction device 125 to be mounted into a reaction element accommodating hole 802 on the tray 126 is a solid phase at a high density desired nucleic acid is typically what is referred to as DNA chip or microarray.
【0083】 [0083]
反応素子の材質は、表面形状が平坦で微細加工に適した任意の材質であり得る。 The material of the reaction element, the surface shapes may be any material suitable for microfabrication flat. 従って、該反応素子の材質は、ガラス、シリコン単結晶板、石英、パイレックス等の非晶質、アルミニウム、ステンレス等の金属、フッ素樹脂、ポリプロピレン等のプラスチックであり得る。 Thus, the material of the reaction element, glass, a silicon single crystal plate, quartz, amorphous Pyrex such as aluminum, metal such as stainless steel, fluorocarbon resin, may be a plastic such as polypropylene. シリコン単結晶板は、周知の半導体プロセス技術により容易に加工できるので最も好ましい。 Silicon single crystal plate is the most preferred because it easily processed by a known semiconductor process technologies.
【0084】 [0084]
反応素子125は、加工の容易さから矩形状であることが好ましいが、例えば、菱形、六角形及び八角形等の多角形、円形、楕円形のような任意の形状であり得る。 The reaction element 125 is preferably a rectangular shape for ease of machining, for example, rhombic, polygonal shape such as a hexagon and octagon, circle, may be of any shape, such as elliptical.
【0085】 [0085]
反応素子125は、任意の大きさであり得るが、形状が長方形である場合、長辺が0.1〜15cm、短辺が0.1〜15cmであることが好ましい。 The reaction device 125 can be any size, if the shape is rectangular, the long sides 0.1~15Cm, it is preferable that the short side is 0.1~15Cm. 反応素子125の厚さは、0.01〜0.5cmであり得る。 The thickness of the reaction device 125 may be 0.01~0.5Cm.
【0086】 [0086]
反応素子125に核酸分子を固相する方法は公知であり、例えばScience 251:767-773(1991)に開示されている。 How to solid phase nucleic acid molecule in a reaction element 125 are known, for example, Science 251: disclosed 767-773 (1991).
【0087】 [0087]
該方法の概略は、 Outline of the method,
▲1▼シリコン基板上にシラン処理を施すことにより、該基板上にアミノ基を形成し、各アミノ基に光保護分子を結合させる、 ▲ 1 ▼ by performing silane treatment on a silicon substrate, an amino group formed on the substrate, coupling light protective molecules to each amino group,
▲2▼マスクを用いることにより、所望の位置に選択的に紫外線を照射し、該所望の位置の光保護分子を外して、該位置のアミノ基のみを露出せしめる、 ▲ 2 ▼ by using a mask, selectively irradiated with ultraviolet rays to a desired position, remove the photoprotective molecules position of said desired and allowed exposing only the amino group of said position,
▲3▼露出したアミノ基のみに、光保護分子を連結させた所望の核酸塩基を結合させる、 ▲ 3 ▼ only the exposed amino group, to bind the desired nucleobase ligated photoprotection molecule,
▲4▼ ▲2▼ 及び▲3▼の工程を繰り返し、核酸分子を伸長させるというものである。 ▲ 4 ▼ ▲ 2 ▼ and ▲ 3 ▼ repeated steps, is that to extend the nucleic acid molecule.
【0088】 [0088]
また、国際公開WO93/09668号(特表平7-506561号)、国際公開WO99/11754号にも核酸分子を固相化するための他の改良法が開示されており、当業者に公知の任意の方法を用いて核酸分子を固相化し得る。 Further, International Publication WO93 / No. 09668 (Kohyo No. 7-506561), WO WO99 / ​​11754 Another improved method for immobilizing nucleic acid molecules to No. is disclosed, known to those skilled in the art any method may immobilized nucleic acid molecules using.
【0089】 [0089]
一般的には、1cm 2の反応素子125に、数千種類以上の核酸分子を固相化することができる。 In general, the reaction device 125 of 1 cm 2, it is possible to immobilize the thousands or more nucleic acid molecules. 従って、反応素子125を用いれば、多項目の検査を同時に実施することが可能となる。 Therefore, the use of the reaction device 125, it becomes possible to carry out inspection of multiple items at the same time.
【0090】 [0090]
反応素子125に、核酸に代えて、又は核酸とともに核酸以外の物質を固相化してもよい。 The reaction element 125, in place of the nucleic acid, or substances other than nucleic acid may turned into solid phase with the nucleic acid. 核酸以外の物質としては、抗体を含むタンパク質が含まれる。 The substances other than nucleic acids include a protein that comprises an antibody. 反応素子125に抗体を固相化すれば、免疫検査が可能である。 If immobilize the antibody on the reaction element 125, it is possible immunoassay.
【0091】 [0091]
反応素子を用いると、多項目の検査を短時間で実施し得るので、本発明の自動核酸検査装置には反応素子を適用することが極めて好ましいが、反応素子を使用しない方法も可能である。 With reaction element, since may be performed in a short time test of multiple items, the automatic nucleic acid testing apparatus of the present invention it is highly preferred to apply the reaction element, the method not using the reaction device are also possible. このような方法としては、古典的なゲル電気泳動法の他、プラズモン共鳴検出法を挙げることができるが、これらに限定されない。 Such methods, other classical gel electrophoresis can be exemplified plasmon resonance detection methods, but are not limited to.
【0092】 [0092]
反応素子125上に固相されている核酸と、ハイブリダイゼーション試薬117を添加した前記PCR混合液中の被増幅核酸との反応は、下方に図示せぬヒーターを配備した反応・洗浄・乾燥装置129上で行われる。 A nucleic acid that has been solid phase on the reaction element 125, the reaction with the amplified nucleic acid of the PCR mix in the addition of the hybridization reagent 117, reaction, washing and drying device deployed a heater (not shown) downward 129 It is carried out in the above. 加熱温度及び反応時間の目安は、それぞれ40〜50℃、30〜120分程度であるが、所望の核酸の塩基組成に応じて適宜設定すればよい。 Estimated heating temperature and the reaction time, 40 to 50 ° C., respectively, but is about 30 to 120 minutes, it may be appropriately set according to the base composition of the desired nucleic acid.
【0093】 [0093]
キャリブレーションの目的で使用する標準トレイは、標準品収納部131に収納されている。 Standard tray to be used for the purpose of calibration is housed in a standard housing portion 131. キャリブレーションを行うことによって、楕円偏光測定(反射強度)結果から、ハイブリダイゼーション後の反応素子の厚さ、密度変化等を定量化できる。 By performing calibration, the ellipsometric measurements (reflection intensity) result, the thickness of the reaction device after hybridization, the density change or the like can be quantified.
【0094】 [0094]
ハイブリダイゼーション反応を行った後、反応トレイ126は、この反応・洗浄・乾燥装置129によって、引き続き洗浄乾燥される。 After hybridization reaction, the reaction tray 126, by the reaction, washing and drying device 129, it is subsequently washed and dried. ノズル130は反応素子125上に洗浄液を吐出するための洗浄液吐出ノズル、洗浄液と混合されたPCR混合液を吸引するための試料吸引ノズル、及び反応素子125を乾燥するための空気吹付ノズルを具備し得る。 Nozzle 130 includes an air blowing nozzle for drying the sample suction nozzle, and the reaction device 125 for sucking the cleaning liquid discharge nozzle, PCR mixture is mixed with the cleaning liquid for discharging washing liquid on the reaction element 125 obtain. これらのノズルは、自動吐出及び自動吸引を行う目的で用いられる一般的なノズルであり、例えば細い金属であり得る。 These nozzles are common nozzles used for the purpose of performing the automatic ejection and an automatic suction, such as from thin metal. 各ノズル間の切り替えは、例えば電磁バルブによって行われる。 Switching between the nozzles is performed, for example, by electromagnetic valves.
【0095】 [0095]
ハイブリダイゼーション反応、洗浄、及び乾燥が終了した後、反応素子125は、核酸検出手段132に移動され、反応トレー126は反応トレー回収部127に移送し回収される。 Hybridization reaction, washing, and after drying is complete, the reaction device 125 is moved to the nucleic acid detection unit 132, a reaction tray 126 is transferred to the reaction tray collecting unit 127 collecting.
【0096】 [0096]
反応素子125は壊れやすく、且つ核酸検出手段132への装着は精度良く行わなければならないので、反応素子125の移動はロボットアーム105に取り付けられた空気吸引機構(図示せず)によって行うことが好ましい。 The reaction device 125 is fragile, so and attached to a nucleic acid detection unit 132 must be performed accurately, the movement of the reaction device 125 is preferably performed by the air suction mechanism attached to the robot arm 105 (not shown) . 空気吸引機構は、反応素子の周辺部(すなわち、検出領域以外の部分)等に、エアポンプ等の空気吸引手段が接続された吸引口を近づけ、前記空気吸引手段によって作り出された陰圧を利用して前記吸引口に反応素子125を吸い付け得る装置である。 Air suction mechanism, the peripheral portion of the reaction element (i.e., detecting a portion other than the region) or the like, close the suction port air suction means of the air pump or the like connected, utilizing the negative pressure created by the air suction means it is a device capable of sucked reaction element 125 to the suction port Te. 反応素子125は、吸引孔に吸い付けられた状態で、核酸検出手段132の所定部位まで移動される。 The reaction device 125 is a suctioned was state the suction holes, is moved to a predetermined portion of the nucleic acid detection unit 132.
【0097】 [0097]
核酸検出手段132は、蛍光検出手段、比色計、化学発光検出手段を含む任意の検出手段であり得るが、PCR増幅工程での蛍光ラベル操作等が一切不要であり、且つ多項目を同時に測定し得るので、楕円偏光解析によって検出することが極めて好ましい。 Nucleic acid detection unit 132, fluorescence detector, colorimeter, may be any detection means including chemiluminescent detection means, a fluorescent label operation or the like in the PCR amplification process is no unnecessary, and simultaneously measuring multiple items since may, it is highly preferable to detect by ellipsometry.
【0098】 [0098]
ここで、「楕円偏光解析」とは、膜の光特性を解析することを意味し、より具体的には膜圧と屈折光を測定することを意味する。 Here, "ellipsometry" means to analyze the optical properties of the film, means measuring the film thickness and refractive light more specifically. 楕円偏光解析自体は公知であり、典型的には、半導体の膜圧を測定する目的で使用されているが、核酸分析の分野で使用されたことはない。 The ellipsometry per se is known, typically, have been used for the purpose of measuring the film pressure of the semiconductor, it has never been used in the field of nucleic acid analysis.
【0099】 [0099]
楕円偏光解析を用いれば、ハイブリッドを形成した部分の厚さの変化(1Å以上)又は密度の変化を検出でき、検出操作は、およそ1分で終了する。 The use of ellipsometry, a change in thickness of the portion forming the hybrid can detect changes in (1 Å or more) or density, detection operation is completed in approximately 1 minute.
【0100】 [0100]
使用し得る楕円偏光解析装置には、比較楕円偏光解析装置、又は折返し光路型比較楕円偏光解析装置が含まれるが、これらに限定されない。 The ellipsometry system that may be used, compared ellipsometry apparatus, or include folded optical path type comparator ellipsometry devices, and the like.
【0101】 [0101]
楕円偏光解析装置としては、特開平61−258104、特開平5―203564等を参照にした構造を採用することができる。 The ellipsometry system can employ a structure Hei 61-258104, the Japanese Patent Laid-Open 5-203564, etc. to the reference.
【0102】 [0102]
核酸検出手段132による検出終了後、使用済みの反応素子125は、反応素子廃棄箱133(ロボットアーム103の直下、点線部)に廃棄されるとともに、反応トレー126は使用済み反応トレー収納箱134に移される。 After detection completion by nucleic acid detection unit 132, the spent reaction element 125 (immediately below the robotic arm 103, dotted line) reaction element reject bin 133 while being discarded, the reaction tray 126 to the spent reaction tray storage box 134 It is transferred.
【0103】 [0103]
核酸検出手段132の測定結果は、コンピューター等の情報処理手段135で処理された後、ユーザーインターフェース136に設けた出力装置(プリンター、好ましくは表示画面)によって出力される。 Measurement results of the nucleic acid detection unit 132 after being processed by the information processing means 135 such as a computer, an output device provided to the user interface 136 (printer, preferably the display screen) is output by.
【0104】 [0104]
以上の工程が、一組のサンプル(図1では8サンプル)の自動検査を行う工程の概要であるが、本発明の主題の範囲の範囲内で、抽出・増幅・検出手段等に多くの修飾又は変更を行い得ることは当業者に自明であろう。 Above steps, is a summary of steps for performing the automatic inspection of a set of samples (8 samples in Figure 1), within the scope of the subject matter of the present invention, many modifications to the extraction, amplification and detection means or the like or that changes may be made will be apparent to those skilled in the art. 例えば、核酸抽出手段としてのフリーフロー電気泳動素子及び/又はキャピラリー電気泳動素子は複数並設して処理能力を高めてもよい。 For example, free flow electrophoresis device and / or capillary electrophoresis device as a nucleic acid extraction unit may be increased several juxtaposed and the processing capability.
【0105】 [0105]
一組のサンプルの検査が終了した後には、引き続き次の組のサンプルの検査を実行し得る。 After a set of inspection of the sample is completed, it can continue to perform the inspection of the next set of samples. 検査時間を短縮するためには、一組のサンプルの検査が終了する前に、次の組のサンプルの検査を開始することも有用である。 To shorten the inspection time, before a set of test sample is completed, it is useful to start the inspection of the next set of samples.
【0106】 [0106]
【発明の効果】 【Effect of the invention】
本発明の自動核酸検査装置によれば、短時間で、正確に、多数の検体について核酸検査を行うことが可能である。 According to the automatic nucleic acid testing apparatus of the present invention, a short time, accurately, it is possible to perform nucleic acid testing for a large number of specimens.
【図1】本発明の自動核酸検査装置内部の上面図。 [1] Automatic nucleic acid testing device top view of the interior of the present invention.
【図2】本発明の自動核酸検査装置に使用し得るフリーフロー電気泳動を示す図。 It shows a free flow electrophoresis can be used in automated nucleic acid testing apparatus of the present invention; FIG.
【図3】本発明の自動核酸検査装置に使用し得るPCRモジュールを構成する基板の上面図。 Top view of a substrate constituting a PCR module which may be used for automated nucleic acid testing apparatus of the present invention; FIG.
【図4】本発明の自動核酸検査装置に使用し得るPCRモジュールを構成する基板の側面図。 Side view of a substrate constituting a PCR module which may be used for automated nucleic acid testing apparatus of the present invention; FIG.
【図5】加熱体及び温度検出部が埋設されたPCRモジュールを構成する基板の側面図。 Figure 5 is a side view of a substrate heater and the temperature detecting unit constitutes a PCR module embedded.
【図6】本発明のPCRモジュールの構成を示す図。 6 is a diagram showing a configuration of a PCR module of the present invention.
【図7】本発明のPCRモジュールを示す図。 FIG. 7 shows the PCR module of the present invention.
【図8】複数の反応素子収納孔を備えた反応トレーを示す図。 8 shows a reaction tray comprising a plurality of reaction device housing bore.
【図9】反応素子収納孔を拡大した上面図。 [9] an enlarged top view of a reaction device housing bore.
【図10】反応素子収納孔を拡大した側面図。 Figure 10 is a side view enlarging a reaction element receiving hole.

Claims (7)

  1. 核酸を含有する複数のサンプルから核酸成分を流出口を介して連続的に抽出可能な、 フリーフロー電気泳動及び/又はキャピラリー電気泳動である核酸抽出手段と、 Nucleic acid which the extractable plurality of sample nucleic acid component continuously through an outlet from containing, a nucleic acid extraction unit, a free-flow electrophoresis and / or capillary electrophoresis,
    該核酸抽出手段によって抽出された前記核酸成分中に含まれ得る所望の核酸を前記流出口から所定のサンプルカップに回収し、回収された核酸を反応セルに分注し、特異的に増幅するための核酸増幅手段と、 The desired nucleic acid may be included in the nucleic acid component extracted by the nucleic acid extraction unit is recovered to a predetermined sample cup from the outlet, the recovered nucleic acid was dispensed into the reaction cell minute, to amplify specifically a nucleic acid amplification means,
    該核酸増幅手段によって増幅された前記所望の核酸を検出するための核酸検出手段と、 A nucleic acid detection means for detecting the desired nucleic acid amplified by the nucleic acid amplification means,
    を備えた自動核酸検査装置。 Automated nucleic acid testing device provided with.
  2. 前記核酸抽出手段によって抽出された前記核酸成分を含有する溶液を濃縮し、及び/又は前記増幅手段によって増幅された前記所望の核酸を変性するためのヒートブロックをさらに備えた請求項1に記載の自動核酸検査装置。 Wherein the nucleic acid component extracted by the nucleic acid extraction unit and concentrating the solution containing, and / or according to claim 1, further comprising a heat block for modifying said desired nucleic acid amplified by the amplifying means automated nucleic acid testing device.
  3. 前記核酸増幅手段が、複数の反応セルを具備する収容部と、前記収容部を交換するための搬送手段をさらに備えたことを特徴とする請求項1に記載の自動核酸検査装置。 The nucleic acid amplification means, automated nucleic acid testing apparatus according to claim 1, wherein a housing portion having a plurality of reaction cells, further comprising a conveying means for exchanging the accommodating portion.
  4. 前記核酸増幅手段が、前記核酸成分と、耐熱性ポリメラーゼと、前記所望の核酸中の部分配列を有するプライマーとをPCR溶液を加熱及び冷却するためのPCR反応装置であることを特徴とする請求項1に記載の自動核酸検査装置。 Claims wherein the nucleic acid amplification means, said nucleic acid component, wherein the thermostable polymerase, that a primer having a partial sequence of the desired nucleic acid is a PCR reaction apparatus for heating and cooling the PCR solution automated nucleic acid testing apparatus according to 1.
  5. 前記核酸検出手段が楕円偏光解析であることを特徴とする請求項1に記載の自動核酸検査装置。 Automated nucleic acid testing apparatus according to claim 1, wherein said nucleic acid detection means is ellipsometry.
  6. 請求項4に記載の自動核酸検査装置を用いた自動核酸検査方法において、前記PCR溶液を入れるための容器として、加熱体を備えた容器を用いることを特徴とする自動核酸検査方法。 In automated nucleic acid testing method using an automatic nucleic acid testing apparatus according to claim 4, as a container for containing the PCR solution, automated nucleic acid testing method is characterized by using a vessel equipped with a heating element.
  7. 請求項1〜5の何れか1項に記載の自動核酸検査装置を用いた自動核酸検査方法において、前記所望の核酸と相補的な核酸を含む核酸群が固相された反応素子に、増幅された前記所望の核酸をハイブリダイズせしめた後、前記検出手段によって前記所望の核酸のハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする自動核酸検査方法。 In automated nucleic acid testing method using an automatic nucleic acid testing apparatus according to any one of claims 1 to 5, the reaction device nucleic group is a solid phase containing the nucleic acids complementary to the desired nucleic acid is amplified wherein after allowed hybridizing a desired nucleic automated nucleic acid testing method characterized by detecting hybridization of the desired nucleic acid by said detecting means is.
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