JP4048271B2

JP4048271B2 - Parasite inorganic pyrophosphatase, nucleic acid molecule encoding the same, and use thereof

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Publication number: JP4048271B2
Application number: JP2002243551A
Authority: JP
Inventors: 尚利辻; 尚磯部; 春江春日; イスラムカイルル; 武新川; 安喜松本
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2008-02-20
Anticipated expiration: 2022-08-23
Also published as: JP2004081032A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、寄生虫の感染防御に関わる蛋白質、それをコードするDNA及びそれらの使用に関する。具体的には、寄生虫とは蠕虫を指し、これには寄生線虫、包虫、吸虫が含まれ、これらの寄生虫の感染防御抗原蛋白質、該感染防御蛋白質をコードするDNA、該DNAを含むベクター、該ベクターを保持する組換え体細胞、寄生虫の感染防御抗原に対する抗体及び寄生虫の感染を防御するワクチンに関する。本発明により、寄生虫の感染防御を目的とした化合物の合成、あるいは人および動物における寄生虫感染から守るためのワクチン開発や治療薬の開発に応用できる。
【０００２】
【従来の技術】
人類や家畜生産に甚大な被害をもたらしてき感染症は、ワクチンの普及によってその多くは制圧されてきた。しかし、ワクチンが開発途上にある寄生虫感染症は、依然として世界各地に分布している。とりわけ、熱帯・亜熱帯地域では寄生虫の蔓延に加え衛生状態の不備から寄生虫による人への健康被害、家畜生産への被害は莫大な額にのぼる。また、先進諸国でも最近は寄生虫による新興、再興の人畜共通感染の脅威が大きな社会問題になりつつある。寄生虫病防除の中心は化学療法剤などの薬剤利用に深く依存している。しかしながら、薬剤の連続使用によるいわゆる薬剤耐性がいずれの薬剤に対しても確立され、殺虫効果の消失するものも少なくない。さらに、薬剤の使用には常に人あるいは動物への副作用を考えなくてはならず、同時に、食と環境の安全性を脅かす薬物残留問題があり、消費者から敬遠される傾向にある。そのうえ、薬剤の使用には有効性や適用範囲に加えて、膨大な開発コストの面からも限界が生じつつあり、21世紀における寄生虫による人および家畜生産の被害を薬剤使用によって防ぐことは非常に難しい状況にある。
【０００３】
人や家畜、愛玩動物の小腸に寄生する回虫（AscarisやToxocara属）は、熱帯・亜熱帯地域に限らず先進諸国を含め世界的に分布する寄生虫である。一般に、寄生線虫は固有宿主が限定されているが、回虫に関しては本来の固有宿主ではない非固有宿主への感染が顕著に見られる寄生虫である。そのため、豚を固有宿主とする寄生虫(Ascaris suum) や犬回虫(Toxocara canis)の人への感染例が多数報告され、人畜共通感染症としても重要視されている(松山ら, 日本呼吸器学会誌 36：208-212（1998）,Maruyama et al., Lancet 347:1766-1767 (1996))。また、マウス等の実験動物でも感染が成立し、豚の代替宿主として寄生虫-マウス感染系は広く免疫学的試験等に利用されている（Kennedy et al., Clin Exp Immunol 80: 219-224. (1990)）。
【０００４】
寄生虫感染でもウイルスや細菌感染症に見られるような宿主の再感染防御能の獲得が知られており、古くから実験室段階で実証されている (Maizels et al., Immunol Rev 171:125-147. (1999)) 。こうした背景から寄生虫ワクチンとして実用化に至った寄生虫はPoynterによって開発された牛肺虫である（Poynter, D., Adv. Parasitol., 1:179-212.(1963)）。しかし、感染幼虫を放射線照射によって製造された寄生虫ワクチンには常に人為感染の副作用があり、また、生ワクチンであるため投与の煩雑さで敬遠されるに至った。寄生虫感染においても、虫体抽出物あるいは放射線照射した感染ステージである第3期幼虫（L3）で防御免疫が誘導されることは、豚、ウサギ、マウスで明らかにされている(Stewart et al., Vet Parasitol 17: 319-326. (1985), Stankiewicz et al., J Parasitol 36:245-257(1990))。なかでも、寄生虫幼虫ステージの抽出抗原や表層抗原を免疫した動物では、顕著な感染阻止が認められことから、幼虫抗原には防御免疫を誘導する分子が含まれていることが示唆されてきている(Hill et al., Vet Immunol Immunopathol 42:161-169 (1994))。
【０００５】
遺伝子組換え技術は、他の感染症と同様に寄生虫ワクチン開発に向け有効な手段となっている。現在、各国で感染防御抗原あるいは寄生虫に特有な変態関連酵素等をコードする遺伝子クローニングが精力的に進められ、安全なワクチン蛋白質の製造が試みられてきている(Blaxter et al., Parasitol Today 16:5-6. (2000)) 。しかし、遺伝子クローニング技術を基にした作製された組換え抗原あるいはインヒビター等の化合物による寄生虫感染防除技術の確立には至っていない。
【０００６】
こうした中で近年では新しい寄生虫病化学療法剤として寄生虫の持つ変態関連酵素が注目されている。寄生虫は成虫から生み出された虫卵から成虫に至るまでのに合計４回の変態を他の生物とは異なった特異な発育過程をとる。たとえば、システインプロテナーゼは寄生虫の変態期に重要な役割を果たしていることが分かり、同時にシステインプロテナーゼの阻害剤によって寄生虫の変態が阻止されることが確認され、変態に関連した酵素のインヒビターが寄生虫化学療法剤の新規ターゲット分子として期待されている（Lustigman, Parasitol Today. 8:294-297.(2000); Chandrashekar and Mehta. Parasitol Today. 16:11-7. (2000)）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、寄生虫の駆除及び寄生虫感染から家畜及び人を守るための化合物の合成を提供し、様々な人畜共通の寄生虫感染症の防除法を提供するものである。具体的には、寄生虫の感染防御抗原蛋白質、該感染防御抗原蛋白質をコードするDNA、該DNAを含むベクター、該ベクターを保持する組換え体細胞、寄生虫の感染防御抗原に対する抗体及び寄生虫の感染を防御するワクチンならびに寄生虫感染防除のために化合物の提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、寄生虫の変態関連酵素に着目し、その中から無機ピロホスファターゼを分離した。無機ピロホスファターゼはピロリン酸を加水分解して２分子の正リン酸を生じる反応を触媒する。本発明者らは、この酵素が酵素学的に寄生虫の発育・生存、とりわけ変態に必須な酵素であることを発見した。無機ピロホスファターゼの活性を阻害するフッ化ナトリウムは近年、人や動物に重大な原虫病をもたらす病原性原虫でトキソプラズマ原虫やマラリア原虫の発育を阻止することが分かってきている（Rodrigues et al., Biochem. J. 349:737-745）。さらに、フッ化ナトリウムは細菌特有の代謝活性を阻害する作用があり、現在では虫歯予防等を目的とした歯科領域では広く用いられている。寄生虫から分離された無機ピロホスファターゼが寄生虫の発育・生存の重要であることが示された報告はなく、寄生虫無機ピロホスファターゼをコードする遺伝子及びその組換え蛋白質ならびにその阻害剤は寄生虫感染の予防・防除を目的とした化合物の作出に有効である。
【０００９】
本発明者らは、寄生虫から新規な無機ピロホスファターゼをコードするDNAを単離し、該DNAがコードする抗原無機ピロホスファターゼの組換え抗原及び虫体抽出蛋白質において無機ピロホスファターゼ酵素活性を確認し、無機ピロホスファターゼの特異阻害剤を幼虫培養液に添加したところ幼虫の変態が阻止されることを見出し、該蛋白質が寄生虫の変態酵素であることを突き止め本発明を完成するに至った。本発明は寄生虫における寄生虫の無機ピロホスファターゼをコードする遺伝子（Ascaris suum AdR44遺伝子）、該感染防御抗原蛋白質及び該感染防御抗原蛋白質コード領域を蛋白質発現ベクターに挿入し、精製した組換え感染防御抗原蛋白質の作製に関連する。また、本発明は感染防御抗原に対する抗体、及び抗体の作製方法に関連する。さらに、本発明は該感染防御蛋白質をワクチンとして用いた回虫感染防御能の誘導、また寄生虫の無機ピロホスファターゼの活性を阻害する化合物に関連する。
【００１０】
即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（a）又は（b）に示す寄生虫の無機ピロホスファターゼをコードするDNA。
（a）配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
（b）配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ寄生虫の無機ピロホスファターゼの生物学的活性を有する蛋白質。
（２）以下の（c）又は（d）に示すDNAである（１）に記載のDNA。
(ｃ) 配列表の配列番号１の79位から1161位の塩基配列を含むDNA。
(ｄ) 配列表の配列番号１の79位から1161位の塩基配列を含むDNAと相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ寄生虫の無機ピロホスファターゼの生物学的活性を有する蛋白質をコードするDNA。
（３）以下の（a）又は（b）に示す蛋白質。
（a）配列表の配列番号２で示す寄生虫の無機ピロホスファターゼのアミノ酸配列を有する蛋白質。
（b）配列表の配列番号２で示す寄生虫の無機ピロホスファターゼのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ寄生虫の無機ピロホスファターゼの生物学的活性を有する蛋白質。
（４）（１）または（２）のDNAを含む組換え体分子。
（５）（１）または（２）のDNAを含むベクター。
（６）（５）のベクターを含む組換え体細胞。
（７）（６）の組換え体細胞を培養し、その培養物から寄生虫の無機ピロホスファターゼを採取することを特徴とする、寄生虫の無機ピロホスファターゼを産生する方法。
（８）（３）の寄生虫の無機ピロホスファターゼを認識する抗体。
（９）モノクローナル抗体である（８）の抗体。
（１０）寄生虫の無機ピロホスファターゼの活性を阻害するインヒビターまたは化合物を含む寄生虫駆除剤。
（１１）寄生虫の無機ピロホスファターゼの活性を阻害するインヒビターまたは化合物がフッ化ナトリウムまたはイミダイドホスフェートである（１０）の寄生虫駆除剤。
（１２）（３）の寄生虫の無機ピロホスファターゼを含む、回虫感染防御のための全身性及び粘膜誘導型ワクチン。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明におけるcDNAライブラリーの作製、遺伝子のクローニング、スクリーニングおよび塩基配列の決定等の分子生物学、寄生虫学、免疫学並びに生化学的な技術はJ.Sambrook, E.F.Fritsch & T.Maniatis (1989): Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ed Harlow and David Lanc(1988):Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press；獣医臨床寄生虫学編集委員会編（1998）、獣医臨床寄生虫学、文英堂、等の当業者に良く知られた文献に記載された方法に従って行えばよい。また、DNA解析は、MacVector（登録商標）（コダック社）およびGENETYX（ソフトウェアー開発社）等のソフトウェアを用いて行うことができる。
【００１２】
本発明のDNAは、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列を有する寄生虫の無機ピロホスファターゼをコードする総てのDNAを含む。また、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ寄生虫の無機ピロホスファターゼの生物学的活性を有する蛋白質をコードする総てのDNAも含む。ここで、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ寄生虫の無機ピロホスファターゼの生物学的活性を有する蛋白質とは、下に記載のとおりである。
【００１３】
さらに、本発明のDNAは、配列番号１の79位から1161位までの塩基配列からなるDNA（無機ピロホスファターゼをコードする遺伝子（Ascaris suumAdR44遺伝子）または配列番号１に示す全塩基配列からなるDNAを含む。さらに、これらのDNAと相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる総てのDNAも含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、寄生虫の無機ピロホスファターゼをコードするDNA配列とBLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに90％以上の相同性、好ましくは95％以上の相同性、より好ましくは97％以上の相同性が配列間に存在するときのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。通常、完全ハイブリッドの融解温度より約5℃〜約30℃、好ましくは約10℃〜約25℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、J.Sambrookら、Molecular Cloninｇ, A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記載されており、ここに記載の条件を使用し得る。
【００１４】
また、本発明の蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するもの又は、その類似蛋白質すなわち配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同等の性質を有し、アミノ酸配列中、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであり、寄生虫無機ピロホスファターゼのアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上の相同性を有するのが望ましい。ここで、実質的に同質の性質とは、寄生虫の無機ピロホスファターゼ蛋白質の生物学的活性を有することを意味し、生物学的活性を有するとは寄生虫感染防御能を有することを意味する。
【００１５】
本発明の寄生虫感染幼虫の無機ピロホスファターゼをコードするcDNAは、以下のような方法で得ることができる。
本発明で使用した豚回虫は、豚回虫感染豚より得ることができる。成虫から未成熟卵を得て、Douvres and Urban, J Parasitol., 69:549-558 (1983)らの方法によって感染ステージである第３期幼虫（L3）を含む成熟卵に発育させ、cDNAのライブラリーの作成のために供することができる。
【００１６】
回虫L3より、通常行われる方法または市販のmRNA単離キットを用いて、mRNA（poly(A)RNA）を精製する。例えば、回虫L3を、グアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して全RNAを得た後、オリゴdT-セルロースやセファロース２B等を担体とするポリU-セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、又はバッチ法によりpoly(A)+mRNAを得ることができる。
【００１７】
このようにして選られたmRNAを鋳型として、逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成し、DNAポリメラーゼを用いて二本鎖DNAを合成し、適当なベクターに組み込んで、該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してcDNAライブラリーを作製する。cDNAは、適当な制限酵素とリガーゼを用いる通常の方法でベクターに組込むことができる。例えば、得られたcDNAを、適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法などがある。この際、後述のベクター、宿主細胞を用いてcDNAライブラリーを得ることが出来る。
【００１８】
このようにして得られたクローン化DNAライブラリーから、目的のDNAを選択する。選択方法として、イムノスクリーニング法、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等の方法を用いることができる。例えば、得られたクローン群を、イソプロピル-１-チオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）等の誘導物質により蛋白質を発現させ、これをナイロン膜若しくはセルロース膜に転写し、目的蛋白質に対する抗体または該抗体を含む血清を用いて免疫学的に対応するクローンを選択することができる。
【００１９】
このようにして調製したクローンから目的cDNAの塩基配列を決定する。
塩基配列の決定は、例えば、マキサム・ギルバート法（Maxam,A.M. andGilbert, W.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,74,560,1977）又はジデオキシ法（Messing, J et al.,Nucl.Acids Res.,9,309,1981）等により行うことができる。これらの原理を応用した塩基配列自動解析装置を用いて配列を決定することもできる。
【００２０】
得られた目的DNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等の遺伝子増幅法により増幅することができる。PCRは、例えば、蛋白質核酸酵素「PCR法最前線―基礎技術から応用まで―」第４巻、第５号、1996年４月号増刊、共立出版に記載されている技術により行うことができる。目的のDNAをクローン化又は増幅した後、目的DNAを回収し、これを入手可能な適当な発現ベクターに組み込んで、さらに適当な宿主細胞に形質転換し、適当な培地中で培養、発現させ、目的蛋白質を回収、精製することができる。
【００２１】
この際のベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pKC30、pCFM536等の大腸菌プラスミド、pUB110等の枯草菌プラスミド、pG-1、YEp13、YCp50等の酵母プラスミド、λgt110、λZAPII等のファージのDNA等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスDNA、SV40とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモータを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００２２】
ベクターは、商業的に入手可能なものを使用することができ、例えば細菌性のものではpQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pBluescriptII KS、ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)、pET-11a(Novagen)、真核性のものではpXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL、SV40（Pharmacia）等がある。
【００２３】
複製開始点として、大腸菌ベクターに対して、例えばColiE1、R因子、F因子由来のものが、酵母ベクターに対して、例えば2μmDNA、ARS１由来のものが、哺乳類細胞用ベクターに対して、例えばSV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のものを用いることができる。また、プロモーターとしてアデノウイルス又はSV40プロモーター、大腸菌lacまたはtrpプロモーター、ファージラムダP_Lプロモーター、酵母用としてのADH、PHO5、GPD、PGK、AOX１プロモーター、蚕細胞用としての角多角体病ウイルス由来プロモーター等を用いることができる。
【００２４】
選択マーカーとして、大腸菌用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を、酵母用ベクターには、Leu2、Trp1、Ura3遺伝子等を、哺乳類細胞には、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を挙げることができる。
【００２５】
DNAのベクターへの導入は、任意の方法で行うことができる。ベクターは、種々の制限部位をその内部に持つポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限部位を含んでいることが望ましい。ベクター中の特定の制限部位を特定の制限酵素で切断し、その切断部位にDNAを挿入することができる。本発明のDNAおよび調節配列を含む発現ベクターを適切な宿主細胞の形質転換に用いて、宿主細胞に本発明の寄生虫感染幼虫無機ピロホスファターゼを発現、産生させることができる。
【００２６】
宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞、CHO、COS、BHK、3T3、C127等の哺乳類細胞等が挙げられる。
形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポーレーション等の公知の方法で行うことができる。
【００２７】
得られたリコンビナント蛋白質は、各種の分離精製方法により、分離・精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。この際、発現産物がGST等との融合蛋白質として発現される場合は、目的蛋白質と融合している蛋白質またはペプチドの性質を利用して精製することもできる。例えばヒスチジンが6個以上並んだアミノ酸配列、いわゆるヒスチジンタグとの融合蛋白質として発現させた場合、ヒスチジンタグを有する蛋白質はキレートカラムに結合するので、キレートカラムを用いて精製することができる。またGSTとの融合蛋白質として発現させた場合、GSTはグルタチオンに対して親和性を有するので、グルタチオンを担体に結合させたカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより効率的に精製することができる。
【００２８】
寄生虫の無機ピロホスファターゼに対する抗体は、以下のようにして調製することができる。
該無機ピロホスファターゼを抗原として、当業者に良く知られた方法に従い例えばマウス、モルモット、ウサギ、ヤギ等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し、十分に免疫した後、動物から採血し、血清分離し、抗回虫感染幼虫無機ピロホスファターゼ抗体を作製することができる。この際、適当なアジュバントを使用することもできる。モノクローナル抗体も公知の方法により作製し得る。例えば、寄生虫感染幼虫の無機ピロホスファターゼで免疫したマウスの脾細胞とマウスのミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマの培養上清又は該ハイブリドーマを腹腔内に投与したマウスの腹水から調製することができる。免疫抗原として用いる寄生虫感染幼虫の無機ピロホスファターゼは、寄生虫から抽出した天然蛋白質、組換え蛋白質でもよいし、化学合成したものでもよい。また、全アミノ酸配列を有する蛋白質でも良いし、該蛋白質の部分構造を有するペプチドフラグメントや他の蛋白質との融合蛋白質でも良い。ペプチドフラグメントは該蛋白質を適当な蛋白質分解酵素で分解した断片も用い得るし、配列番号１に示す塩基配列の一部を発現ベクターに組み込んで発現させた産物でも良い。融合蛋白質は、配列番号１に示す塩基配列の一部を他の蛋白質をコードする遺伝子と連結させて、発現ベクターに組み込んで発現させて製造することもできるし、ポリペプチドフラグメントを適当なキャリア蛋白質と化学結合により結合させた上で使用することもできる。得られた抗体の反応性は、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、ウエスタンブロッティング等の当業者によく知られた方法により測定することができる。
【００２９】
寄生虫の無機ピロホスファターゼを、寄生虫感染防止のためのワクチンとして用いることができる。
ワクチンとして用いる寄生虫の無機ピロホスファターゼ蛋白質は、寄生虫から抽出した天然蛋白質、組換え蛋白質でもよいし、化学合成したものでもよい。また、全アミノ酸配列を有する蛋白質でも良いし、該蛋白質の部分構造を有するペプチドフラグメントや他の蛋白質との融合蛋白質でも良い。フラグメントの場合、フラグメントが回虫の感染を防御する抗体（中和抗体）が認識するエピトープ（中和エピトープ）を含んでいることが必要である。ペプチドフラグメントは該蛋白質を適当な蛋白質分解酵素で分解した断片も用い得るし、配列番号１に示す塩基配列の一部を発現ベクターに組み込んで発現させた産物でも良い。
【００３０】
ワクチンは、１種又は数種のアジュバント、例えばフロイントの完全若しくは不完全アジュバント、コレラトキシン、易熱性大腸菌毒素、水酸化アルミニウム、カリウムミョウバン、サポニン若しくはその誘導体、ムラミルジペプチド、鉱物油または植物油、NAGO、ノバソームまたは非イオン性ブロック共重合体、DEAEデキストラン等を含むことができる。また、医薬上許容される担体を含んでいてもよい。医薬上許容される担体は、ワクチン接種される動物の健康に悪影響を及ぼさない（すなわち、少なくとも、該動物にワクチン接種しない場合に病気により認められる影響より著しい悪影響を及ぼさない）化合物であると理解される。医薬上許容される担体は、例えば、無菌水または無菌生理塩溶液であることが可能である。より複雑な形態の場合には、該担体は例えばバッファーであることが可能である。
【００３１】
本発明のワクチンは、通常の能動免疫法で投与することができ、注射により投与する全身性ワクチンでも、注射によらず経口投与等により投与する粘膜誘導型ワクチンでもあり得る。すなわち、予防的に有効な量（すなわち、回虫による攻撃に対して動物において免疫を誘導する抗原を発現しうる免疫化抗原）にて、剤形に適合した方法による単回または反復投与により投与することができる。ワクチンは、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口的または鼻腔内に投与することができる。また、本発明のワクチンは、同じおよび／または他の寄生虫の他の抗原成分と有効に混合することが可能である。
【００３２】
ワクチンの投与量、投与回数は対象動物により変わり得るが、例えば本発明の寄生虫幼虫無機ピロホスファターゼを数十μｇ含むワクチンを１週間から数週間に一度の頻度で、数回投与することにより動物に防御免疫を誘導し得る。
【００３３】
さらに、本発明は分離した寄生虫感染幼虫の無機ピロホスファターゼに対するインヒビターおよび該インヒビターを有効成分として含む寄生虫駆除剤に関する。分離した寄生虫の無機ピロホスファターゼ蛋白質に対するインヒビターに関する言葉は、天然物あるいは核酸技術もしくは化学合成から得られたものも含まれる。インヒビターは無機ピロホスファターゼの活性中心に直接結合するものも、あるいは活性中心においてMg²⁺との結合に対してOH^-と競合するものでもよい。インヒビターとしては、例えばフッ化ナトリウム、イミダイドホスフェート等が挙げられる。本発明の寄生虫駆除剤は、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。かかる駆除剤は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、無機ピロホスファターゼに対するインヒビターを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。
【００３４】
その投与量は、症状、年齢、体重および投与経路に依存するであろうから、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定すべきである。有効用量は、in vitroにおける試験または動物モデル試験系から導かれる。
【００３５】
また、本発明は、それら蛋白質、核酸、抗体、動物の治療を目的とした治療的化合物としてのインヒビター等、ならびにその応用も含まれる。
本発明の寄生虫の無機ピロホスファターゼ蛋白質及び核酸は、寄生虫ワクチンあるいは抗寄生虫剤の新規ターゲットに利用することもできる。
【００３６】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１本発明における寄生虫の無機ピロホスファターゼ塩基配列の分離及び決定
寄生虫である豚回虫（Ascaris suum）の成虫は、茨城県食肉処理場下妻支所にてA. suum感染豚より採取した。成虫から得た未成熟卵はDouvres and Urban, J Parasitol., 69:549-558. (1983)らの方法によって感染ステージのL3を含む成熟卵に発育させ、以下の操作に供した。寄生虫感染幼虫の無機ピロホスファターゼをコードする遺伝子は、イムノスクリーニングによるA. suum ♀cDNAライブラリーから単離した。使用したcDNAライブラリーは、λZapII ベクター（ストラータジーン社）を用いてメーカーの推奨する方法により作製した。使用した血清は、A. suum L3を４回感染させたウサギの血清であった（Kasuga et al., Parasitology 121:671-677. (2000)）。使用したファージはE.Coli XL-1Blue に感染させ、シャーレ（直径150ｍｍ）に５×10⁴になるよう調製し、37℃で４時間培養した。プラーク出現後、isopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG）を浸漬させたニトロセルロース膜で培地の表層を覆い、さらに３時間培養した。培養シャーレから取り除いたニトロセルロース膜は、0.02% Tween 添加Tris-HCl（TBST）で洗浄し、さらに５％添加TBSTに室温１時間ブロッキングした。ニトロセルロース膜は、1：200に希釈したA. suum L3感染ウサギ血清と３時間室温で反応させ、TBSTで十分洗浄した後アルカリホスファターゼ標識抗ウサギIgG山羊血清と１時間反応させ、陽性ファージを5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium (NBT/BCIP)を用いて検出した。検出したクローンは、さらに上記スクリーニングを繰り返し、陽性クローンを単離した。単離したファージはExAssist^TMヘルパーファージとE.Coli SOLR^TMを用いてメーカーの推奨する方法に従いDNAのインビボーイクサイションを行った。
【００３７】
アルカリ溶菌法により調製した組換え体プラスミドDNA（AdR44）はM13Reverse及びForwardプライマー（アプライドバイオシステム社）を用い、Dye-terminater Sequencing法（アプライドバイオシステム社テクニカルマニュアル）によりメーカーの推奨する方法に従い反応させ、反応産物をDNA sequencer Model 370A (version 1.30、アプライドバイオシステム社)を用いて解析し塩基配列を決定した。AdR44は、1375塩基で構成され、5’の79位にATGの開始コドン1159位に終止コドンがそれぞれ認められ、さらにその下流には真核生物に存在するポリアデニレーションが確認された。塩基配列から推定される蛋白質は360残基のアミノ酸から構成され、その内N末領域には17残基の真核生物シグナル配列が確認された。全アミノ酸の推定分子量は40,600Daであったのに対して、シグナル配列を除いた虫体内での予想される成熟蛋白質の分子量は、38,771Daであった。配列表の配列番号１に該DNAの塩基配列を示した。コーディング領域は、79位から1161位であった。配列表の配列番号２にアミノ酸配列を示した。アミノ酸データベースとの相同性検索から、本発明で示す推定アミノ酸構造は、動物の無機ピロホスファターゼをコードする遺伝子とそれぞれ約50％の類似性を示した。
【００３８】
実施例２組換え体蛋白質を発現させるベクター構築のための豚回虫の無機ピロホスファターゼcDNAの分離及び増幅並びに組換え体分子及び組換え体細胞の作出
上記方法で合成したA. suum♀cDNAセンスプライマー（5'-CCG AGC TCG AGA CGT GAA GCG ACA ATC TCG CAA TCT -3'；CTCGAGはXhoIサイト；配列番号３）とアンチセンスプライマー(5'-CCG AAT TCT CAC TTA TGC CGG AGA AAG ACC GTC TAC-3'；G AAT TCはEcoRI サイト；配列番号４)を用いたPCR反応にて増幅した。
【００３９】
PCR反応は50μｌの反応液〔１ng A. suum♀ｃDNA、１μMセンス及び１μMアンチセンスプライマー、10mM Tris-HCL(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、2.5U AmpliTaq DNA polymerase（プロメガ社）〕を調製し、DNA Thermal Cycler（パーキンエルマー社）を用いて、95℃にて30秒間、55℃にて30秒間、72℃にて２分間の反応を35サイクルで実施した。増幅したPCR産物はゲル電気泳動を行い、増幅したDNA断片をDNA精製キット（キアゲン社）を用いて蒸留水中に回収し、回収液を制限酵素XhoI及びEcoRIで３時間酵素処理した。プラスミド発現ベクターであるｐTrcHis発現ベクター（インビトローゲン社）も挿入断片と同様に制限酵素XhoI及びEcoRI で３時間酵素処理した。制限酵素処理した挿入断片及びベクターをDNAライゲーションキット（宝酒造社）を用いてメーカーの推奨する方法に従ってDNA断片を挿入し、大腸菌Top10を用いて形質転換を行い、L-ampプレートに蒔き白色のコロニーから寄生虫感染幼虫の無機ピロホスファターゼコード領域の挿入されたクローンを選択した。
【００４０】
実施例３大腸菌における寄生虫感染幼虫の無機ピロホスファターゼの作出及び、作出した蛋白質の性状
形質転換した大腸菌を37℃でアンピシリンを含んだSOB液で培養し、培養後SOB液のOD600が0.5に到達した時点で1mMのIPTGを添加し、さらに４時間培養を続けた。経時的に産生される蛋白産生の変化は12.5％SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動｛Laemmli, et al., Nature 227:680-685(1970)｝を実施した後、クマーシー染色で確認した。その結果、約37kDa付近に組換え蛋白質の産生が認められ。また、同様に実施した電気泳動のゲルをニトロセルロース膜（アマシャム社）に電気的に転写した。転写後、膜を５％スキムミルクで30分間ブロッキングし、次いで、TBSで10,000倍に希釈されたアルカリホスファターゼ標識されたT7モノクローナル抗体（ノバーゲン社）と１時間反応させた。TBSTで洗浄した後、結合した蛋白質を基質NBT/BCIP（ギブコBRL社）を用いて可視化した。その結果、このウエスタンブロット解析によって約37kDa付近に確認された組換え蛋白質と反応することが認められ、組換え蛋白質に（His）₆が付加されていることが確認された（図１）。図１でレーン１は、発現前の大腸菌ライセート、レーン２は、発現後の大腸菌ライセート、レーン３は、精製した豚回虫抽出蛋白質の37kDa組換え抗原蛋白質を示している。
【００４１】
実施例４大腸菌からの豚回虫の無機ピロホスファターゼの精製、及び精製した寄生虫の無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質に対する抗体作製
豚回虫の無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質はメタルキレートクロマトグラフィー（インビトローゲン）を用いてメーカーの推奨するイミダゾール溶出法によって精製した(Tsuji et al., Mol Biochem Parasitol 97: 69-79(1998))。溶出された蛋白質はCentrisart I (ザルトリウス社, cut off 10,000 MW) を用いて濃縮し、Slide-A-Lyzer^TM Dialysis Cassette (ピアス社)を用いてリン酸緩衝食塩液中にて透析を行った。この精製した豚回虫無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質は、以下の抗体作製、各種動物の豚回虫免疫血清の反応性、無機ピロホスファターゼの酵素活性の測定に使用した。
【００４２】
豚回虫の無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質に対するポリクローナル抗体はマウスを用いて以下のように作製した｛Tsuji et al., Mol Biochem Parasitol 97: 69-79, (1998)｝。豚回虫の無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質50μgをTiterMax Gold^TM(シンテックス社)とともに皮下接種し、４週間後再度同量を接種した。再投与２週後に採血を行い、血清を-20℃に保存した。豚回虫の無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質を用いたウエスタンブロット解析によって、作製された37kDa組換え蛋白質マウス免疫血清は、37kDaの組換え蛋白質と強く反応することが確認された。
【００４３】
実施例５精製した豚回虫の無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質の各種動物のA.suum L3免疫血清との反応性
実施例４で作製した44kDa組換え蛋白質とウサギ、マウス及び豚の豚回虫免疫血清との反応性をSDS-PAGE/ウエスタンブロット法を用いて調べた。SDS-PAGE (Laemmli, et al., Nature 227:680-685(1970))で分離した無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質を定法に従いニトロセルロース膜（アマシャム社）に転写した。転写後、膜を５％スキムミルクで30分間ブロッキングし、次いで、TBSで500倍に希釈されたウサギ、マウス及び豚の免疫血清と１時間反応させた。TBSTで転写膜を洗浄した後、免疫血清と結合した蛋白質を検出するためにアルカリホスファターゼ標識された抗ウサギ、マウス及び豚-IgG抗体（カッペル社）と１時間反応させ、結合した蛋白質を基質NBT/BCIP（ギブコBRL社）を用いて可視化した。その結果、いずれの免疫血清も37kDaの抗原組換え体蛋白質と陽性反応を示し、37kDa組換え蛋白質の抗原性が確認された。
【００４４】
実施例６イムノブロット法によるネイティブ（天然型）豚回虫の無機ピロホスファターゼの性状及び人回虫及び犬回虫における無機ピロホスファターゼ様分子の性状
実施例４で作製したマウス寄生虫の無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質免疫血清を用いて、寄生虫の無機ピロホスファターゼ蛋白質抽出液のSDS-PAGE/ウエスタンブロット法を行った。SDS-PAGE (Laemmli, et al., Nature 227:680-685(1970))で分離した後、定法に従いニトロセルロース膜（アマシャム社）に転写した。転写後、膜を５％スキムミルクで30分間ブロッキングし、次いで、TBSで1,000倍に希釈されたマウスの無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質免疫血清と１時間反応させた。TBSTで洗浄したのち、免疫血清と結合した蛋白質を検出するために、アルカリホスファターゼ標識された抗マウス-IgG抗体（カッペル社）と１時間反応させ、結合した蛋白質を基質NBT/BCIP（ギブコBRL社）を用いて可視化した。その結果、マウス血清と反応する約37ｋDaの単一バンドが確認され、豚回虫抽出蛋白液中の天然型寄生虫感染幼虫の無機ピロホスファターゼが同定できた。さらに、人回虫及び犬回虫抽出蛋白からも豚回虫抽出蛋白の場合と同様の37kDaの大きさに陽性反応が確認された（図１）。図１でレーン１は人回虫、レーン２は犬回虫、レーン３は豚回虫、レーン４は寄生虫無機ピロホスファターゼ組換え蛋白を示している。
【００４５】
実施例７免疫組織化学法による豚回虫の無機ピロホスファターゼの局在
豚回虫♀成虫をリン酸緩衝液（PBS）にパラホルムアルデヒドを４％になるように調製した溶液で虫体を固定し、定法に従ってパラフィン切片を作製した。キシレン・アルコール系列を通した組織切片を10％正常ヤギ血清で30分ブロッキングした。組織切片にPBSで100倍に希釈されたマウスの無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質免疫血清と一晩反応させた。PBS-Tween20(PBST)で洗浄したのち、免疫血清と結合した蛋白質を検出するために、ビオチン標識された抗マウス-IgG抗体（カッペル社）と20分反応させた。PBSTで洗浄した後、ペルオキダーゼ標識されたアビジンを20分反応させ、PBSTで洗浄した後基質ジアミノベンチジンテトラハイドロクロライド（シグマ社）を用いて可視化した。その結果、陽性反応は角皮下層、背及び腹部索、筋肉、子宮及び卵巣で確認された。また、人回虫とマウスの無機ピロホスファターゼ組換え体蛋白質免疫血清を用いた同様な解析でも無機ピロホスファターゼの発現を示す陽性部位は豚回虫と同じ組織であった。
【００４６】
実施例８豚回虫の無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質の無機ピロホスファターゼ活性の解析
はじめに無機ピロホスファターゼ活性を基質、ピロリン酸(PPi)を生リン酸にする反応をTakaha et al., J. Appl. Glycosci 48:71-78(2001)に従いモリブデン酸塩ブルーに基づいた比色法を用いて分光光度計で測定した。標準反応液は5mM Mg²⁺、100mM Tris-HCl（pH7.5）及び1mM Na₄P₂O₇で作製した。反応は標準反応液を混和した200μlの反応液の中に希釈した無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質10μlを加え55℃で実施し、200mMのグリシン溶液（pH3.0）を加え反応を停止させた。直ちに25mM硫酸を用いて調製した1％アンモニアモリブデン酸塩125μl及び0.05％硫酸カリウムで調製した1％アスコルビン酸125μlを加え十分混和し37℃で30分放置した。反応曲線を作製するため酵素濃度及び反応時間を決定した。コントロール反応は酵母の無機ピロホスファターゼ(シグマ社)及び豚回虫無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質を作製した大腸菌発現系で作製した豚回虫感染防御抗原（As14, Tsuji et al., Infect. Immune. 69:7285-7292）を用いた。成分濃度は豚回虫無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質活性に依存したMg²⁺、pH、温度、金属イオン濃度で求めた。温度安定性は異なる温度でMg²⁺存在の有無下で30分放置して調べた。ピロリン酸(PPi)の加水分解によって生じた生リン酸の濃度は分光光度計（島津製作所）を用いて波長700nmで測定した。豚回虫無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質の特異活性は分/蛋白質から産生されるμmolPiで表記した。ミカエル定数（Km）及び最大速度（Vmax）は55℃のピロリン酸濃度0.05〜0.5mMの存在下で酵素を反応させ求めた。その結果、豚回虫無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質の最大加水分解速度は、Km値は0.12±0.01mMであった（図2）。この値はすでに報告されている牛網膜無機ピロホスファターゼのKm値0.0009〜0.00147、ラット肝臓無機ピロホスファターゼのKm値0.005mM及び牛ROS無機ピロホスファターゼのKm値0.026と比較して有意な値であった。Vmaxは1分/豚回虫無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質1mgで正リン酸849.01±14.64 μmolPiであった。無機ピロホスファターゼによるピロリン酸の加水分解はMg²⁺要求性であることから、1mMのピロリン酸を用いて豚回虫無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質の最大Mg²+濃度を算出した。最大酵素活性を示すMg²⁺濃度は5mMで、濃度の増加に伴い活性は減少した。また、豚回虫無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質の至適pHは7.5であった。次に、豚回虫無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質の耐熱性について調べた。酵素活性の最大値は温度55℃で948.11±18.20 μmolPi/min/mgを認めたが、その活性は温度60℃では半減した。豚回虫無機ピロホスファターゼ組換え蛋白質の熱安定性を5mMのMg²⁺存在下と除去下で異なる温度で30min反応させ活性を調べた。酵素活性はMg²⁺存在下では温度50℃で、除去下では40℃まで熱安定性であった。酵素活性の80％が消失する温度はMg²⁺存在下と除去下ともに55℃であった。さらに、無機ピロホスファターゼは二価の金属イオンによって活性が賦活化されるか検討した。その結果、二価の金属イオン濃度を5mM に統一し、5mMのMg²⁺存在下で得られる活性を100とした場合、Co²⁺及びCu²⁺では35％活性が確認され、Fe²⁺では30％、Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺では18％であった。
【００４７】
実施例９虫体由来のネイティブ型無機ピロホスファターゼ活性の解析
実施例8の酵素活性系を用いて豚回虫L3及びL3の分泌排泄抗原を用いて虫体抽出抗原に含まれる無機ピロホスファターゼ活性を調べた。L3抽出抗原では1.52±0.02μmolPi/min/ｍｇに対して、分泌排泄抗原では0.51±0.03μmolPi/min/mｇであった。虫体由来のネイティブ型無機ピロホスファターゼの活性は、無機ピロホスファターゼの活性中心に結合するイミドダイホスフェート（IDP, Baykov et al., Arch Biochem. Biophys. 273:287-291）及び活性中心においてMg²⁺との結合に対してOH^-と競合するフッ化ナトリウム（NaF, Salminen et al., Biochemistry 34:782-791）の２つの阻害剤によって容量依存性に阻害されることが確認された。
【００４８】
実施例１０無機ピロホスファターゼ阻害剤を用いた豚回虫幼虫ステージの変態阻止試験
実施例９までによって、豚回虫無機ピロホスファターゼは寄生虫の生存に欠くことのできない必須の酵素であることが示された。そこで、無機ピロホスファターゼの阻害剤であるイミドダイホスフェート（IDP, Baykov et al., Arch Biochem. Biophys. 273:287-291）及びフッ化ナトリウム（NaF, Salminen et al., Biochemistry 34:782-791）を用いて豚回虫幼虫L3ステージがL4へと変態するIn vitro培養を行った。ウサギに豚回虫成熟卵1×10⁵を経口投与し、投与後７日にウサギの肺から豚回虫L3ステージを回収した。回収したL3は10％牛胎児血清になるように調製したRPMI-1640を24穴のプラスチックプレート（住友ベークライト）に入れこの中にL3が50〜100匹なるように調製し、温度37℃、5％CO₂の環境下で、濃度を調製した阻害剤を添加し培養した。経時的にL3の変態を観察し培養は10日間実施した。変態阻止率はコントロール群の変態率（52.6±4.1）に対する阻害剤添加群の変態率の割合で算出した。その結果、イミドダイホスフェートでは変態が一部阻止されたのに対して、フッ化ナトリウムは濃度依存的に変態が阻止された。L3の発育及び生存に影響を及ぼさないイミドダイホスフェートの濃度は最大10mMでこのときの変態阻止率は55％であった。これに対して、フッ化ナトリウムでは1mMで65％の変態阻止率が認められ、L3の発育及び生存にも全く影響を確認されなかった。変態は2mMで完全に阻止された。これらの成績から、豚回虫の変態は無機ピロホスファターゼの阻害剤で阻止されることが分かり、寄生虫の発育・生存には無機ピロホスファターゼは必須の酵素であることが示された。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、寄生虫（Ascaris suum）の無機ピロホスファターゼ蛋白質をコードするDNAからなる遺伝子、該DNAを含むベクター及び組換え体細胞、寄生虫の無機ピロホスファターゼ蛋白質、該抗原を認識する抗体並びに該抗原を含む寄生虫感染防御のための全身性及び粘膜誘導型ワクチン、また寄生虫の駆除及び寄生虫感染から家畜及び人を守るための化合物の合成及び様々な人畜共通の寄生虫感染症の防除が可能になる。
【００５０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】イムノブロット法による人回虫、犬回虫及び豚回虫におけるネイティブ型寄生虫無機ピロホスファターゼの発現及び無機ピロホスファターゼ組換え蛋白の結果を示す図である。
【図２】無機ピロホスファターゼ組換え蛋白の酵素活性の結果を示す表である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein involved in the protection of parasitic infection, DNA encoding the same, and use thereof. Specifically, parasites refer to helminths, including parasitic nematodes, helminths, and flukes. These parasites have anti-defense antigen proteins, DNAs encoding the anti-infection proteins, and the DNAs. The present invention relates to a vector comprising, a recombinant cell carrying the vector, an antibody against a parasitic infection protective antigen, and a vaccine protecting against parasitic infection. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it can be applied to the synthesis of compounds aiming at protection against parasitic infection, or the development of vaccines and therapeutic drugs for protecting against parasitic infections in humans and animals.
[0002]
[Prior art]
Infectious diseases that have caused enormous damage to humanity and livestock production have been largely suppressed by the spread of vaccines. However, parasitic infections for which vaccines are still being developed are still distributed around the world. In particular, in the tropical and subtropical regions, in addition to the spread of parasites, the damage to human health and livestock production due to parasites can be enormous. Also, in advanced countries, the threat of new and reviving zoonotic infections due to parasites has recently become a major social problem. The center of parasitic disease control depends heavily on the use of drugs such as chemotherapeutic agents. However, so-called drug resistance due to continuous use of drugs is established for any drug, and many of them lose their insecticidal effect. Furthermore, the use of drugs must always be considered for side effects on humans or animals, and at the same time, there are drug residue problems that threaten food and environmental safety and tend to be avoided by consumers. In addition to the effectiveness and scope of use of drugs, in addition to the huge development costs, there are limits to the use of drugs to prevent damage to human and livestock production by parasites in the 21st century. It is a difficult situation.
[0003]
Roundworms (genus Ascaris and Toxocara) that parasitize the small intestine of humans, livestock, and pets are parasites that are distributed not only in tropical and subtropical regions but also in developed countries. In general, parasitic nematodes have a limited number of native hosts, but as regards roundworms, parasites that are prominently infected with non-native hosts that are not native hosts. For this reason, many cases of infection of humans with parasites (Ascaris suum) and dog roundworms (Toxocara canis) with pigs as an intrinsic host have been reported (Matsuyama et al., Japan Respiratory System). Academic Journal 36: 208-212 (1998), Maruyama et al., Lancet 347: 1766-1767 (1996)). In addition, infection is established in laboratory animals such as mice, and the parasite-mouse infection system is widely used for immunological tests and the like as an alternative host for pigs (Kennedy et al., Clin Exp Immunol 80: 219-224). (1990)).
[0004]
It has been known to acquire the host's ability to protect against reinfection, as seen in viruses and bacterial infections, even with parasitic infections, and has long been demonstrated at the laboratory stage (Maizels et al., Immunol Rev 171: 125- 147. (1999)). From this background, the parasite that has been put to practical use as a parasitic vaccine is the cattle pneumonia developed by Poynter (Poynter, D., Adv. Parasitol., 1: 179-212. (1963)). However, parasitic vaccines produced by irradiating infected larvae always have side effects of human infection, and since they are live vaccines, they have been avoided due to the complexity of administration. In parasitic infections, it has been clarified in pigs, rabbits, and mice that protective immunity is induced by the larvae extract or the third stage larvae (L3), the stage of infection after irradiation (Stewart et al ., Vet Parasitol 17: 319-326. (1985), Stankiewicz et al., J Parasitol 36: 245-257 (1990)). In particular, in animals immunized with parasite larval stage extracted antigens and surface antigens, significant infection inhibition was observed, suggesting that larval antigens contain molecules that induce protective immunity. (Hill et al., Vet Immunol Immunopathol 42: 161-169 (1994)).
[0005]
As with other infectious diseases, genetic recombination technology has become an effective means for developing parasitic vaccines. At present, gene cloning that encodes infection-related antigens or transformation-related enzymes specific to parasites has been vigorously promoted in various countries, and attempts have been made to produce safe vaccine proteins (Blaxter et al., Parasitol Today 16 : 5-6. (2000)). However, a parasitic infection control technique has not yet been established by a recombinant antigen or a compound such as an inhibitor produced based on the gene cloning technique.
[0006]
Under these circumstances, in recent years, the parasite-related enzyme has attracted attention as a new parasitic chemotherapeutic agent. Parasites undergo a unique developmental process that differs from other organisms in a total of four transformations from the eggs produced by adults to adults. For example, it was found that cysteine proteinase plays an important role in the parasite metamorphosis stage, and at the same time it was confirmed that inhibitors of cysteine proteinase blocked parasite metamorphosis, and inhibitors of enzymes related to metamorphosis Is expected as a novel target molecule of a parasitic chemotherapeutic agent (Lustigman, Parasitol Today. 8: 294-297. (2000); Chandrashekar and Mehta. Parasitol Today. 16: 11-7. (2000)).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides the control of parasites and the synthesis of compounds for protecting livestock and humans from parasitic infections, and provides a method for controlling various common parasitic infections. Specifically, parasite infection defense antigen protein, DNA encoding the infection defense antigen protein, vector containing the DNA, recombinant cell holding the vector, antibody against the parasitic infection defense antigen, and parasite The purpose of the present invention is to provide a vaccine that protects against infections as well as compounds for controlling parasitic infections.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors paid attention to the parasite metamorphosis-related enzyme, and separated inorganic pyrophosphatase from the enzyme. Inorganic pyrophosphatase catalyzes a reaction that hydrolyzes pyrophosphate to yield two molecules of normal phosphate. The present inventors have discovered that this enzyme is an enzyme that is essential for the development and survival of parasites, especially for metamorphosis, enzymatically. Sodium fluoride, which inhibits the activity of inorganic pyrophosphatase, has recently been shown to be a pathogenic protozoan that causes serious protozoan diseases in humans and animals and to block the development of Toxoplasma gondii and Plasmodium (Rodrigues et al. Biochem. J. 349: 737-745). Furthermore, sodium fluoride has an action of inhibiting the metabolic activity peculiar to bacteria, and is now widely used in the dental field for the purpose of preventing tooth decay. There has been no report that inorganic pyrophosphatase isolated from parasites is important for the growth and survival of parasites, and the gene encoding parasitic inorganic pyrophosphatase and its recombinant protein and its inhibitors are parasites. It is effective for the production of compounds for the purpose of prevention and control of infection.
[0009]
The present inventors isolated a DNA encoding a novel inorganic pyrophosphatase from the parasite, and confirmed the inorganic pyrophosphatase enzyme activity in the recombinant antigen of the antigen inorganic pyrophosphatase encoded by the DNA and the insect extract protein, When a specific inhibitor of inorganic pyrophosphatase was added to the larva culture, it was found that the larval metamorphosis was inhibited, and the present inventors found that the protein is a parasite mutating enzyme and completed the present invention. The present invention relates to a purified recombinant infection defense by inserting a parasite inorganic pyrophosphatase gene (Ascaris suum AdR44 gene) in the parasite, the infection defense antigen protein, and the infection defense antigen protein coding region into a protein expression vector. Related to the production of antigenic proteins. The present invention also relates to an antibody against an infection protective antigen and a method for producing the antibody. Furthermore, the present invention relates to a compound that inhibits the activity of protecting against roundworm infection using the infection protection protein as a vaccine and inhibits the activity of parasite inorganic pyrophosphatase.
[0010]
That is, the present invention is as follows.
(1) A DNA encoding a parasitic inorganic pyrophosphatase shown in the following (a) or (b).
(A) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, it has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and has biological activity of a parasite inorganic pyrophosphatase protein.
(2) The DNA according to (1), which is the DNA shown in (c) or (d) below.
(c) DNA comprising a base sequence from positions 79 to 1161 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(d) Biology of parasite inorganic pyrophosphatase which hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence from positions 79 to 1161 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing Which encodes a protein having specific activity.
(3) The protein shown in the following (a) or (b).
(A) a protein having an amino acid sequence of a parasitic inorganic pyrophosphatase represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(B) a parasite inorganic pyrophosphatase having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the parasite inorganic pyrophosphatase shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing; A protein having the biological activity of
(4) A recombinant molecule comprising the DNA of (1) or (2).
(5) A vector comprising the DNA of (1) or (2).
(6) A recombinant cell comprising the vector of (5).
(7) A method for producing a parasitic inorganic pyrophosphatase, comprising culturing the recombinant cell of (6) and collecting the parasitic inorganic pyrophosphatase from the culture.
(8) An antibody recognizing the parasite inorganic pyrophosphatase of (3).
(9) The antibody according to (8), which is a monoclonal antibody.
(10) A parasite-controlling agent comprising an inhibitor or compound that inhibits the activity of parasite inorganic pyrophosphatase.
(11) The parasite-controlling agent according to (10), wherein the inhibitor or compound that inhibits the activity of parasite inorganic pyrophosphatase is sodium fluoride or imidide phosphate.
(12) A systemic and mucosal-derived vaccine for protection against roundworm infection, comprising the parasite inorganic pyrophosphatase of (3).
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Molecular biology, parasitology, immunology and biochemical techniques such as cDNA library preparation, gene cloning, screening and nucleotide sequence determination in the present invention are described in J. Sambrook, EFFritsch & T. Maniatis (1989). : Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ed Harlow and David Lanc (1988): Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Veterinary Clinical Parasitology Editorial Board (1998) The methods described in literatures well known to those skilled in the art, such as veterinary clinical parasitology, Bunei-do, etc. may be used. DNA analysis can be performed using software such as MacVector (registered trademark) (Kodak) and GENETYX (Software Development).
[0012]
The DNA of the present invention includes all DNAs encoding a parasitic inorganic pyrophosphatase having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having biological activity of parasitic inorganic pyrophosphatase Also includes all DNA encoding. Here, the protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added and having the biological activity of a parasitic inorganic pyrophosphatase is as described below.
[0013]
Furthermore, the DNA of the present invention is a DNA comprising a nucleotide sequence from positions 79 to 1161 of SEQ ID NO: 1 (a gene encoding an inorganic pyrophosphatase (Ascaris suumAdR44 gene) or a DNA comprising the entire nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, it includes all DNA that can hybridize under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to these DNAs, where stringent conditions are the parasite inorganic pyrogens. 90% homology, preferably 95% homology, more preferably 97% when calculated using DNA sequences encoding phosphatases and BLAST etc. (eg using default or default parameters) It means that hybridization occurs only when the above homology exists between sequences, usually about 5 ° C. to about 30 ° C. above the melting temperature of the complete hybrid, Preferably, hybridization occurs at a temperature lower by about 10 ° C. to about 25 ° C. For stringent conditions, see J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). The conditions described herein may be used.
[0014]
The protein of the present invention has substantially the same properties as those having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or its similar protein, ie, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, It has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and has 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more homology with the amino acid sequence of parasite inorganic pyrophosphatase It is desirable to have sex. Here, the substantially homogeneous property means having the biological activity of the parasite inorganic pyrophosphatase protein, and having the biological activity means having the ability to protect against parasitic infection. .
[0015]
The cDNA encoding the inorganic pyrophosphatase of the parasitic larvae of the present invention can be obtained by the following method.
The roundworm swine used in the present invention can be obtained from a swine roundworm-infected pig. An immature egg is obtained from an adult and developed into a mature egg containing the third stage larva (L3), which is the infection stage, by the method of Douvres and Urban, J Parasitol., 69: 549-558 (1983). Can be used for library creation.
[0016]
From roundworm L3, mRNA (poly (A) RNA) is purified using a commonly used method or a commercially available mRNA isolation kit. For example, roundworm L3 is treated with guanidine reagent, phenol reagent, etc. to obtain total RNA, and then affinity column method or batch method using poly U-sepharose etc. with oligo dT-cellulose or Sepharose 2B as carrier To obtain poly (A) + mRNA.
[0017]
Using the mRNA selected in this way as a template, synthesize single-stranded cDNA using reverse transcriptase, synthesize double-stranded DNA using DNA polymerase, and incorporate it into an appropriate vector. Then, transform E. coli etc. to prepare cDNA library. cDNA can be incorporated into a vector by a conventional method using an appropriate restriction enzyme and ligase. For example, there is a method in which the obtained cDNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site of an appropriate vector DNA, and ligated to a vector. At this time, a cDNA library can be obtained using the vectors and host cells described below.
[0018]
The target DNA is selected from the cloned DNA library thus obtained. As a selection method, methods such as an immunoscreening method, a plaque hybridization method, and a colony hybridization method can be used. For example, the obtained clone group is expressed with a inducer such as isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG), transferred to a nylon membrane or a cellulose membrane, and an antibody against the target protein or the Immunologically corresponding clones can be selected using serum containing antibodies.
[0019]
The nucleotide sequence of the target cDNA is determined from the thus prepared clone.
The determination of the base sequence is performed, for example, by the Maxam Gilbert method (Maxam, AM and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560, 1977) or the dideoxy method (Messing, J et al., Nucl. Acids). Res., 9, 309, 1981). It is also possible to determine the sequence using an automatic base sequence analyzer that applies these principles.
[0020]
The obtained target DNA can be amplified by a gene amplification method such as polymerase chain reaction (PCR). PCR can be performed, for example, by the technique described in Protein Nucleic Acid Enzyme “Frontiers of PCR Methods—From Basic Technology to Application—” Vol. 4, No. 5, April 1996 issue, Kyoritsu Publishing. After cloning or amplifying the target DNA, the target DNA is recovered, incorporated into an appropriate expression vector that can be obtained, further transformed into an appropriate host cell, cultured and expressed in an appropriate medium, The target protein can be recovered and purified.
[0021]
As the vector at this time, any vector can be used as long as it can be replicated in a host cell such as a plasmid, a phage, or a virus. Examples include E. coli plasmids such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pKC30, and pCFM536, Bacillus subtilis plasmids such as pUB110, yeast plasmids such as pG-1, YEp13, and YCp50, and phage DNA such as λgt110 and λZAPII. Examples of vectors for mammalian cells include viral DNA such as baculovirus, vaccinia virus, adenovirus, SV40 and its derivatives. The vector contains a replication origin, a selection marker, and a promoter, and may contain an enhancer, a transcription termination sequence (terminator), a ribosome binding site, a polyadenylation signal, and the like as necessary.
[0022]
Commercially available vectors can be used, such as pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBluescriptII KS, ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia), Examples of pET-11a (Novagen) and eukaryotic ones include pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL, SV40 (Pharmacia).
[0023]
As an origin of replication, for E. coli vectors, for example, those derived from ColiE1, R factor, F factor, for yeast vectors, for example, 2 μm DNA, those derived from ARS1, for mammalian cells, for example, SV40, Those derived from adenovirus and bovine papilloma virus can be used. In addition, as a promoter, adenovirus or SV40 promoter, E. coli lac or trp promoter, phage lambda P _L Promoters, ADH, PHO5, GPD, PGK, AOX1 promoters for yeast, keratopolyhedrovirus-derived promoters for sputum cells, and the like can be used.
[0024]
As selection markers, vectors for E. coli include kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, tetracycline resistance gene, etc., yeast vectors include Leu2, Trp1, Ura3 gene, etc., and mammalian cells include neomycin resistance gene, thymidine kinase. Gene, dihydrofolate reductase gene and the like.
[0025]
DNA can be introduced into the vector by any method. The vector preferably contains a polylinker with various restriction sites therein or contains a single restriction site. A specific restriction site in the vector can be cleaved with a specific restriction enzyme, and DNA can be inserted into the cleavage site. An expression vector containing the DNA of the present invention and a regulatory sequence can be used for transformation of an appropriate host cell to allow the host cell to express and produce the parasite-infected larval inorganic pyrophosphatase of the present invention.
[0026]
As host cells, bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, fungal cells such as Aspergillus spp., Yeast cells such as baker's yeast, methanol-utilizing yeast, insect cells such as Drosophila S2, Spodoptera Sf9, CHO, Examples include mammalian cells such as COS, BHK, 3T3, and C127.
Transformation can be performed by known methods such as calcium chloride, calcium phosphate, DEAE-dextran mediated transfection, electroporation and the like.
[0027]
The obtained recombinant protein can be separated and purified by various separation and purification methods. For example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be used alone or in appropriate combination. In this case, when the expression product is expressed as a fusion protein with GST or the like, it can be purified by utilizing the properties of the protein or peptide fused with the target protein. For example, when expressed as a fusion protein with an amino acid sequence in which 6 or more histidines are arranged, that is, a so-called histidine tag, the protein having the histidine tag binds to the chelate column and can be purified using the chelate column. Further, when expressed as a fusion protein with GST, GST has an affinity for glutathione, and therefore can be efficiently purified by affinity chromatography using a column in which glutathione is bound to a carrier.
[0028]
Antibodies against parasitic inorganic pyrophosphatase can be prepared as follows.
After inoculating the inorganic pyrophosphatase as an antigen multiple times, for example, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, or intravenously in animals such as mice, guinea pigs, rabbits, goats, etc. according to methods well known to those skilled in the art Blood can be collected from the animal, serum separated, and anti-roundworm infected larvae inorganic pyrophosphatase antibody can be prepared. At this time, an appropriate adjuvant can also be used. Monoclonal antibodies can also be produced by known methods. For example, a hybridoma obtained by cell fusion of a mouse spleen cell immunized with an inorganic pyrophosphatase of a parasite-infected larva and a mouse myeloma cell was prepared, and the culture supernatant of the hybridoma or the mouse administered with the hybridoma intraperitoneally From ascites. The inorganic pyrophosphatase of the parasitic larvae used as the immunizing antigen may be a natural protein, a recombinant protein extracted from the parasite, or a chemically synthesized one. Further, it may be a protein having the entire amino acid sequence, or a peptide fragment having a partial structure of the protein or a fusion protein with another protein. The peptide fragment may be a fragment obtained by degrading the protein with an appropriate proteolytic enzyme, or may be a product obtained by incorporating a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 into an expression vector. The fusion protein can be produced by linking a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 with a gene encoding another protein and incorporating it into an expression vector for expression, or the polypeptide fragment can be produced by a suitable carrier protein. It can also be used after being bonded with a chemical bond. The reactivity of the obtained antibody can be measured by methods well known to those skilled in the art, such as enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), and Western blotting.
[0029]
Parasite inorganic pyrophosphatase can be used as a vaccine to prevent parasitic infections.
The parasite inorganic pyrophosphatase protein used as a vaccine may be a natural protein extracted from the parasite, a recombinant protein, or a chemically synthesized protein. Further, it may be a protein having the entire amino acid sequence, or a peptide fragment having a partial structure of the protein or a fusion protein with another protein. In the case of a fragment, it is necessary that the fragment contains an epitope (neutralizing epitope) recognized by an antibody that protects against roundworm infection (neutralizing antibody). The peptide fragment may be a fragment obtained by degrading the protein with an appropriate proteolytic enzyme, or may be a product obtained by incorporating a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 into an expression vector.
[0030]
The vaccine can be one or several adjuvants, such as Freund's complete or incomplete adjuvant, cholera toxin, heat-labile E. coli toxin, aluminum hydroxide, potassium alum, saponin or derivatives thereof, muramyl dipeptide, mineral oil or vegetable oil, NAGO , Novasome or nonionic block copolymers, DEAE dextran, and the like. Further, it may contain a pharmaceutically acceptable carrier. A pharmaceutically acceptable carrier is understood to be a compound that does not adversely affect the health of the animal being vaccinated (ie, at least not significantly adversely affected by the disease if the animal is not vaccinated). Is done. The pharmaceutically acceptable carrier can be, for example, sterile water or a sterile physiological salt solution. In the case of more complex forms, the carrier can be, for example, a buffer.
[0031]
The vaccine of the present invention can be administered by a normal active immunization method, and can be a systemic vaccine administered by injection or a mucosal-derived vaccine administered by oral administration or the like without injection. That is, administered in a prophylactically effective amount (ie, an immunizing antigen capable of expressing an antigen that induces immunity in an animal against attack by roundworms) by single or repeated administration in a manner appropriate to the dosage form be able to. The vaccine can be administered intradermally, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, orally or intranasally. Also, the vaccine of the present invention can be effectively mixed with other antigen components of the same and / or other parasites.
[0032]
The dose and frequency of administration of the vaccine may vary depending on the subject animal. For example, the animal can be administered by administering several times a vaccine containing several tens of μg of the parasite larvae inorganic pyrophosphatase of the present invention once a week to several weeks. Can induce protective immunity.
[0033]
Furthermore, the present invention relates to an inhibitor for inorganic pyrophosphatase of isolated parasite-infected larvae and a parasite-controlling agent containing the inhibitor as an active ingredient. Terms relating to inhibitors of isolated parasite inorganic pyrophosphatase proteins include natural products or those obtained from nucleic acid technology or chemical synthesis. Inhibitors may be those that bind directly to the active center of inorganic pyrophosphatase or Mg at the active center ²⁺ OH for binding with ^- It may be competing with. Examples of the inhibitor include sodium fluoride and imidide phosphate. The parasite control agent of the present invention can be administered in various forms. Examples of such administration forms include oral administration using tablets, capsules, granules, powders, syrups, and the like, or parenteral administration using injections, drops, suppositories, and the like. Such a pesticide is produced by a known method and includes a carrier, a diluent, and an excipient that are usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose and magnesium stearate are used as carriers and excipients for tablets. An injection is prepared by dissolving, suspending or emulsifying an inhibitor of inorganic pyrophosphatase in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection. As an aqueous solution for injection, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. Suitable solubilizers such as polyalcohols such as alcohol and propylene glycol, nonionic surfactants and the like You may use together. As the oily liquid, sesame oil, soybean oil or the like is used, and as a solubilizing agent, benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like may be used in combination.
[0034]
The dosage will depend on the symptoms, age, weight and route of administration and should be determined according to the judgment of the physician and the circumstances of each patient. Effective doses are derived from in vitro studies or animal model test systems.
[0035]
The present invention also includes such proteins, nucleic acids, antibodies, inhibitors as therapeutic compounds for the treatment of animals, and applications thereof.
The parasitic inorganic pyrophosphatase protein and nucleic acid of the present invention can also be used as a novel target for a parasitic vaccine or an antiparasitic agent.
[0036]
【Example】
The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1 Separation and determination of the base sequence of inorganic pyrophosphatase of parasites in the present invention
The adult parasite, Ascaris suum, was collected from A. suum-infected pigs at the Shimotsuma branch of Ibaraki slaughterhouse. Immature eggs obtained from adults were developed into mature eggs containing L3 at the infection stage by the method of Douvres and Urban, J Parasitol., 69: 549-558. (1983) and subjected to the following operations. The gene encoding the inorganic pyrophosphatase of parasite-infected larvae was isolated from an A. suum ♀ cDNA library by immunoscreening. The cDNA library used was prepared by the method recommended by the manufacturer using λZapII vector (Stratagene). The serum used was that of rabbits infected with A. suum L3 four times (Kasuga et al., Parasitology 121: 671-677. (2000)). The phage used was infected with E.Coli XL-1Blue, and 5 × 10 5 in a petri dish (diameter 150 mm) ^Four And cultured at 37 ° C. for 4 hours. After the appearance of the plaque, the surface layer of the medium was covered with a nitrocellulose membrane soaked with isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), and further cultured for 3 hours. The nitrocellulose membrane removed from the culture dish was washed with Tris-HCl (TBST) supplemented with 0.02% Tween and further blocked with TBST supplemented with 5% for 1 hour at room temperature. The nitrocellulose membrane was reacted with A. suum L3-infected rabbit serum diluted 1: 200 at room temperature for 3 hours, washed thoroughly with TBST, then reacted with alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit IgG goat serum for 1 hour, Detection was performed using -bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate / nitroblue tetrazolium (NBT / BCIP). For the detected clone, the above screening was further repeated, and a positive clone was isolated. The isolated phage is ExAssist ^TM Helper phage and E.Coli SOLR ^TM DNA was used for in vivo excitation according to the method recommended by the manufacturer.
[0037]
Recombinant plasmid DNA (AdR44) prepared by alkaline lysis is reacted according to the manufacturer's recommended method using dye-terminater sequencing (Applied Biosystems Technical Manual) using M13Reverse and Forward primers (Applied Biosystems). The reaction product was analyzed using DNA sequencer Model 370A (version 1.30, Applied Biosystems) to determine the base sequence. AdR44 was composed of 1375 bases, and a stop codon was found at the 1159th position of the start codon 1159 of ATG at position 5 ′, and polyadenylation present in eukaryotes was further confirmed downstream thereof. The protein deduced from the base sequence was composed of 360-residue amino acids, of which a 17-residue eukaryotic signal sequence was confirmed in the N-terminal region. The estimated molecular weight of all amino acids was 40,600 Da, whereas the expected molecular weight of the mature protein in the worm body excluding the signal sequence was 38,771 Da. The nucleotide sequence of the DNA is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The coding region was from 79th to 1161st. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. From the homology search with the amino acid database, the deduced amino acid structure shown in the present invention showed about 50% similarity to the gene encoding animal inorganic pyrophosphatase.
[0038]
Example 2 Isolation and amplification of Aspergillus oryzae inorganic pyrophosphatase cDNA for construction of vectors expressing recombinant proteins and production of recombinant molecules and cells
A. suum♀ cDNA sense primer (5′-CCG AGC TCG AGA CGT GAA GCG ACA ATC TCG CAA TCT -3 ′; CTCGAG is XhoI site; SEQ ID NO: 3) and antisense primer (5′-CCG) AAT TCT CAC TTA TGC CGG AGA AAG ACC GTC TAC-3 ′; G AAT TC was amplified by PCR reaction using EcoRI site; SEQ ID NO: 4).
[0039]
PCR reaction was performed using 50 μl of reaction solution [1 ng A. suum♀ cDNA, 1 μM sense and 1 μM antisense primer, 10 mM Tris-HCL (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl. ₂ 2.5U AmpliTaq DNA polymerase (Promega)] and using DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer) for 30 seconds at 95 ° C, 30 seconds at 55 ° C, and 2 minutes at 72 ° C. Performed in 35 cycles. The amplified PCR product was subjected to gel electrophoresis, the amplified DNA fragment was recovered in distilled water using a DNA purification kit (Qiagen), and the recovered solution was enzymatically treated with restriction enzymes XhoI and EcoRI for 3 hours. The plasmid expression vector pTrcHis expression vector (Invitrogen) was treated with restriction enzymes XhoI and EcoRI for 3 hours in the same manner as the inserted fragment. Insert the DNA fragment into the restriction fragment-treated insert and vector using the DNA ligation kit (Takara Shuzo) according to the manufacturer's recommended method, perform transformation using Escherichia coli Top10, and spread on the L-amp plate. We selected clones with inserted inorganic pyrophosphatase coding region of parasite-infected larvae.
[0040]
Example 3 Production of inorganic pyrophosphatase of parasite-infected larvae in E. coli and properties of the produced protein
The transformed Escherichia coli was cultured in an SOB solution containing ampicillin at 37 ° C. After the culture, 1 mM IPTG was added when the OD600 of the SOB solution reached 0.5, and the culture was further continued for 4 hours. Changes in protein production over time were confirmed by Coomassie staining after electrophoresis {Laemmli, et al., Nature 227: 680-685 (1970)} on a 12.5% SDS-polyacrylamide gel. As a result, recombinant protein production was observed around 37 kDa. Moreover, the gel of electrophoresis performed similarly was electrically transcribe | transferred to the nitrocellulose film | membrane (Amersham). After the transfer, the membrane was blocked with 5% skim milk for 30 minutes, and then reacted with alkaline phosphatase-labeled T7 monoclonal antibody (Novagen) diluted 1: 10,000 with TBS for 1 hour. After washing with TBST, the bound protein was visualized using the substrate NBT / BCIP (Gibco BRL). As a result, it was found that this Western blot analysis reacted with the recombinant protein confirmed at around 37 kDa. ₆ Was confirmed to be added (FIG. 1). In FIG. 1, lane 1 shows the E. coli lysate before expression, lane 2 shows the E. coli lysate after expression, and lane 3 shows the 37 kDa recombinant antigen protein of the purified swine roundworm extract protein.
[0041]
Example 4 Purification of Aspergillus oryzae inorganic pyrophosphatase from Escherichia coli and production of antibody against purified parasite inorganic pyrophosphatase recombinant protein
Porcine roundworm inorganic pyrophosphatase recombinant protein was purified by metal chelate chromatography (Invitrogen) by the manufacturer's recommended imidazole elution method (Tsuji et al., Mol Biochem Parasitol 97: 69-79 (1998)) . The eluted protein was concentrated using Centrisart I (Sartorius, cut off 10,000 MW) and slide-A-Lyzer ^TM Dialysis was performed in phosphate buffered saline using Dialysis Cassette (Pierce). This purified porcine roundworm inorganic pyrophosphatase recombinant protein was used for the following antibody production, reactivity of pig roundworm immune serum of various animals, and measurement of enzyme activity of inorganic pyrophosphatase.
[0042]
A polyclonal antibody against Aspergillus oryzae inorganic pyrophosphatase recombinant protein was prepared as follows using a mouse {Tsuji et al., Mol Biochem Parasitol 97: 69-79, (1998)}. 50μg of inorganic pyrophosphatase recombinant protein from Ascaris hog ^TM (Sintex) was inoculated subcutaneously and 4 weeks later, the same amount was inoculated again. Two weeks after the re-administration, blood was collected and the serum was stored at -20 ° C. Western blot analysis using an inorganic pyrophosphatase recombinant protein from Aspergillus pigworm confirmed that the prepared 37 kDa recombinant protein mouse immune serum reacted strongly with the 37 kDa recombinant protein.
[0043]
Example 5 Reactivity of purified pig roundworm inorganic pyrophosphatase recombinant protein with various animal A.suum L3 immune sera
The reactivity between the 44 kDa recombinant protein prepared in Example 4 and the rabbit roundworm, mouse, and porcine roundworm immune sera was examined using SDS-PAGE / Western blotting. The inorganic pyrophosphatase recombinant protein separated by SDS-PAGE (Laemmli, et al., Nature 227: 680-685 (1970)) was transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham) according to a standard method. After transfer, the membrane was blocked with 5% skim milk for 30 minutes and then reacted with rabbit, mouse and pig immune sera diluted 500-fold with TBS for 1 hour. After washing the transfer membrane with TBST, in order to detect proteins bound to immune sera, they were reacted with alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit, mouse and swine-IgG antibodies (Cappel) for 1 hour, and the bound proteins were treated with the substrate NBT. Visualization was performed using / BCIP (Gibco BRL). As a result, all immune sera positively reacted with the 37 kDa antigen recombinant protein, confirming the antigenicity of the 37 kDa recombinant protein.
[0044]
Example 6 Properties of inorganic pyrophosphatase in native (natural) swine roundworm by immunoblotting and properties of inorganic pyrophosphatase-like molecule in roundworm and dog roundworm
Using the mouse parasite inorganic pyrophosphatase recombinant protein immune serum prepared in Example 4, the parasite inorganic pyrophosphatase protein extract was subjected to SDS-PAGE / Western blotting. After separation by SDS-PAGE (Laemmli, et al., Nature 227: 680-685 (1970)), it was transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham) according to a conventional method. After the transfer, the membrane was blocked with 5% skim milk for 30 minutes, and then reacted with mouse inorganic pyrophosphatase recombinant protein immune serum diluted 1,000 times with TBS for 1 hour. After washing with TBST, in order to detect proteins bound to immune sera, it was reacted with alkaline phosphatase-labeled anti-mouse-IgG antibody (Kappel) for 1 hour, and the bound proteins were treated with the substrate NBT / BCIP (Gibco BRL). ) And visualized. As a result, a single band of about 37 kDa that reacts with mouse serum was confirmed, and an inorganic pyrophosphatase of a natural parasite-infected larva in a swine roundworm extract protein solution could be identified. In addition, positive reaction was confirmed from the roundworm and roundworm extract proteins at 37 kDa as in the case of the roundworm extract protein (FIG. 1). In FIG. 1, lane 1 shows human roundworm, lane 2 shows dog roundworm, lane 3 shows pig roundworm, lane 4 shows parasite inorganic pyrophosphatase recombinant protein.
[0045]
Example 7 Localization of inorganic pyrophosphatase in swine roundworm by immunohistochemistry
Parasite sections were prepared according to a conventional method by immobilizing worm bodies with a solution prepared by adjusting paraformaldehyde to 4% in phosphate buffered saline (PBS). Tissue sections through xylene / alcohol series were blocked with 10% normal goat serum for 30 minutes. Tissue sections were reacted overnight with mouse inorganic pyrophosphatase recombinant protein immune serum diluted 100-fold with PBS. After washing with PBS-Tween20 (PBST), in order to detect the protein bound to the immune serum, it was reacted with a biotin-labeled anti-mouse-IgG antibody (Cappel) for 20 minutes. After washing with PBST, peroxidase-labeled avidin was reacted for 20 minutes, washed with PBST, and then visualized using the substrate diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma). As a result, positive reactions were confirmed in the horny subcutaneous layer, dorsal and abdominal cords, muscles, uterus and ovary. In addition, in the same analysis using human roundworm and mouse inorganic pyrophosphatase recombinant protein immune serum, the positive site showing the expression of inorganic pyrophosphatase was the same tissue as swine roundworm.
[0046]
Example 8 Analysis of Inorganic Pyrophosphatase Activity of Porcine Ascaris Inorganic Pyrophosphatase Recombinant Protein
First, a colorimetric method based on molybdate blue according to Takaha et al., J. Appl. Glycosci 48: 71-78 (2001), using inorganic pyrophosphatase activity as substrate and pyrophosphate (PPi) as raw phosphate. Was measured with a spectrophotometer. Standard reaction solution is 5 mM Mg ²⁺ , 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mM Na _Four P ₂ O ₇ It was made with. The reaction was carried out at 55 ° C. by adding 10 μl of diluted inorganic pyrophosphatase recombinant protein in 200 μl of the reaction solution mixed with the standard reaction solution, and the reaction was stopped by adding 200 mM glycine solution (pH 3.0). Immediately after, 125 μl of 1% ammonia molybdate prepared with 25 mM sulfuric acid and 125 μl of 1% ascorbic acid prepared with 0.05% potassium sulfate were added and mixed well and left at 37 ° C. for 30 minutes. Enzyme concentration and reaction time were determined to generate a reaction curve. The control reaction is that of the yeast roundworm infection protective antigen (As14, Tsuji et al., Infect. Immune. 69: 7285) produced by the Escherichia coli expression system in which the yeast inorganic pyrophosphatase (Sigma) and the pig roundworm inorganic pyrophosphatase recombinant protein were prepared. -7292) was used. Ingredient concentrations depend on the activity of recombinant protein of swine roundworm inorganic pyrophosphatase ²⁺ , PH, temperature, and metal ion concentration. Temperature stability is Mg at different temperatures ²⁺ Investigated by leaving for 30 minutes in the presence or absence. The concentration of raw phosphoric acid produced by hydrolysis of pyrophosphate (PPi) was measured at a wavelength of 700 nm using a spectrophotometer (Shimadzu Corporation). Specific activity of pig roundworm inorganic pyrophosphatase recombinant protein was expressed in μmol Pi produced from min / protein. The Michael constant (Km) and the maximum velocity (Vmax) were determined by reacting the enzyme in the presence of a pyrophosphate concentration of 0.05 to 0.5 mM at 55 ° C. As a result, the Km value of the maximum hydrolysis rate of Aspergillus oryzae inorganic pyrophosphatase recombinant protein was 0.12 ± 0.01 mM (FIG. 2). This value was significant compared to the previously reported Km value of bovine retinal inorganic pyrophosphatase 0.0009 to 0.00147, rat liver inorganic pyrophosphatase Km value 0.005 mM, and bovine ROS inorganic pyrophosphatase Km value 0.026. . Vmax was 19.0 min / min and 1 mg of swine roundworm inorganic pyrophosphatase recombinant protein, and the phosphate was 849.01 ± 14.64 μmol Pi. Hydrolysis of pyrophosphate by inorganic pyrophosphatase is Mg ²⁺ Since it is a requirement, the maximum Mg of Aspergillus oryzae inorganic pyrophosphatase recombinant protein using 1 mM pyrophosphate ² + Concentration was calculated. Mg showing maximum enzyme activity ²⁺ The concentration was 5 mM, and the activity decreased with increasing concentration. In addition, the optimum pH of the swine roundworm inorganic pyrophosphatase recombinant protein was 7.5. Next, the heat resistance of the swine roundworm inorganic pyrophosphatase recombinant protein was examined. The maximum enzyme activity was found to be 948.11 ± 18.20 μmol Pi / min / mg at 55 ° C, but the activity was halved at 60 ° C. Thermostability of pig roundworm inorganic pyrophosphatase recombinant protein 5 mM Mg ²⁺ The activity was examined by reacting for 30 min at different temperatures in the presence and removal. Enzyme activity is Mg ²⁺ It was thermally stable up to 50 ° C in the presence and up to 40 ° C under removal. The temperature at which 80% of enzyme activity disappears is Mg ²⁺ It was 55 ° C both in the presence and removal. Furthermore, it was examined whether the activity of inorganic pyrophosphatase is activated by divalent metal ions. As a result, the concentration of divalent metal ions was unified to 5 mM, and 5 mM Mg ²⁺ When the activity obtained in the presence is 100, Co ²⁺ And Cu ²⁺ Confirmed 35% activity, Fe ²⁺ Then 30%, Zn ²⁺ , Mn ²⁺ , Ca ²⁺ It was 18%.
[0047]
Example 9 Analysis of native inorganic pyrophosphatase activity derived from worms
Using the enzyme activity system of Example 8, the inorganic pyrophosphatase activity contained in the worm body extract antigen was examined using the secretory excretion antigens of swine roundworm L3 and L3. The L3 extracted antigen was 1.52 ± 0.02 μmol Pi / min / mg, whereas the secretory excretion antigen was 0.51 ± 0.03 μmol Pi / min / mg. The activity of the native inorganic pyrophosphatase derived from worms is expressed in imide diphosphate (IDP, Baykov et al., Arch Biochem. Biophys. 273: 287-291) that binds to the active center of inorganic pyrophosphatase and Mg at the active center. ²⁺ OH for binding with ^- It was confirmed that it was inhibited in a dose-dependent manner by two inhibitors of sodium fluoride (NaF, Salminen et al., Biochemistry 34: 782-791) competing with.
[0048]
Example 10 Metastasis inhibition test of Ascaris larva stage using an inorganic pyrophosphatase inhibitor
Up to Example 9, it was shown that swine roundworm inorganic pyrophosphatase is an essential enzyme indispensable for the survival of parasites. Thus, imidodiphosphates (IDP, Baykov et al., Arch Biochem. Biophys. 273: 287-291) and sodium fluoride (NaF, Salminen et al., Biochemistry 34: 782-791) are inhibitors of inorganic pyrophosphatase. ) Was used to perform in vitro culture in which the L3 stage of swine roundworm larvae was transformed to L4. Rabbits with swine roundworm mature eggs 1 × 10 ^Five Was orally administered, and 7 days after the administration, the roundworm L3 stage was collected from the lungs of rabbits. RPMI-1640 prepared so that the collected L3 is 10% fetal bovine serum is placed in a 24-well plastic plate (Sumitomo Bakelite) and prepared so that L3 is 50 to 100 animals at a temperature of 37 ° C, 5 % CO ₂ In this environment, an inhibitor whose concentration was adjusted was added and cultured. The L3 metamorphosis was observed over time, and the culture was carried out for 10 days. The transformation inhibition rate was calculated by the ratio of the transformation rate of the inhibitor added group to the transformation rate (52.6 ± 4.1) of the control group. As a result, the imide diphosphate partially inhibited transformation, whereas sodium fluoride inhibited transformation in a concentration-dependent manner. The concentration of imide diphosphate that did not affect the growth and survival of L3 was 10 mM at maximum, and the transformation inhibition rate was 55%. In contrast, sodium fluoride showed a 65% transformation inhibition rate at 1 mM, and no effect was observed on the growth and survival of L3. The transformation was completely prevented at 2 mM. From these results, it was found that the transformation of swine ascaris was inhibited by an inhibitor of inorganic pyrophosphatase, indicating that inorganic pyrophosphatase is an essential enzyme for the growth and survival of parasites.
[0049]
【The invention's effect】
According to the present invention, a gene comprising a DNA encoding a parasite (Ascaris suum) inorganic pyrophosphatase protein, a vector and a recombinant cell containing the DNA, a parasite inorganic pyrophosphatase protein, an antibody recognizing the antigen, and the Systemic and mucosal-derived vaccines for protection against parasitic infections, including antigens, as well as the control of parasites and the synthesis of compounds to protect livestock and humans from parasitic infections and the control of various common parasitic infections Is possible.
[0050]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 shows the expression of native parasite inorganic pyrophosphatase and results of inorganic pyrophosphatase recombinant protein in human roundworm, canine roundworm and swine roundworm by immunoblot method.
FIG. 2 is a table showing the results of enzyme activity of inorganic pyrophosphatase recombinant proteins.

Claims

A method for controlling animal roundworms of non-human animals by inhibiting the inorganic pyrophosphatase activity of animal roundworms with sodium fluoride .

2. The method of claim 1, comprising administering to the non-human animal sodium fluoride that inhibits the activity of animal roundworm inorganic pyrophosphatase.

The method according to claim 1 or 2, wherein the animal roundworm is Ascaris suum.

A roundworm repellent containing sodium fluoride that inhibits the activity of inorganic pyrophosphatase in animal roundworms .

Roundworm pesticide according to claim 4, wherein the animal roundworm is Ascaris suum (Ascaris suum).