JP3613577B2

JP3613577B2 - 16 kDa antigen of Ascarisuum-infected larvae, nucleic acid molecules encoding the same, and use thereof

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Publication number: JP3613577B2
Application number: JP2002000796A
Authority: JP
Inventors: 尚利辻; 尚磯部; 春江春日; 武新川; 安喜松本
Original assignee: 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構
Priority date: 2002-01-07
Filing date: 2002-01-07
Publication date: 2005-01-26
Anticipated expiration: 2022-01-07
Also published as: JP2003199576A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、寄生虫の感染防御に関わる蛋白質、それをコードするＤＮＡ及びそれらの使用に関する。具体的には、Ａｓｃａｒｉｓ及びＴｏｚｏｃａｒａ属を含むＡｓｃａｒｉｄ線虫の感染防御抗原蛋白質、該感染防御蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを保持する組換え体細胞、寄生虫の感染防御抗原に対する抗体及び寄生虫の感染を防御するワクチンに関する。本発明により、Ａｓｃａｒｉｓ及びＴｏｘｏｃａｒａ属の回虫感染防御を目的とした化合物の合成、あるいは人および動物における回虫感染から守るためのワクチン開発や治療薬の開発に応用できる。
【０００２】
【従来の技術】
人類や家畜生産に甚大な被害をもたらしてきた感染症は、ワクチンの普及によってその多くは制圧されてきた。しかし、ワクチンが開発途上にある寄生虫感染症は、依然として世界各地に分布している。とりわけ、熱帯・亜熱帯地域では寄生虫の蔓延に加え衛生状態の不備から寄生虫による人への健康被害、家畜生産への被害は莫大な額にのぼる。また、先進諸国でも最近は寄生虫による新興、再興の人畜共通感染の脅威が大きな社会問題になりつつある。寄生虫病防除の中心は化学療法剤などの薬剤利用に深く依存している。しかしながら、薬剤の連続使用によるいわゆる薬剤耐性がいずれの薬剤に対しても確立され、殺虫効果の消失するものも少なくない。さらに、薬剤の使用には常に人あるいは動物への副作用を考えなくてはならず、同時に、食と環境の安全性を脅かす薬物残留問題があり、消費者から敬遠される傾向にある。そのうえ、薬剤の使用には有効性や適用範囲に加えて、膨大な開発コストの面からも限界が生じつつあり、２１世紀における寄生虫による人および家畜生産の被害を薬剤使用によって防ぐことは非常に難しい状況にある。
【０００３】
人や家畜、愛玩動物の小腸に寄生する回虫（ＡｓｃａｒｉｓやＴｏｘｏｃａｒａ属）は、熱帯・亜熱帯地域に限らず先進諸国を含め世界的に分布する寄生虫である。一般に、寄生線虫は固有宿主が限定されているが、回虫に関しては本来の固有宿主ではない非固有宿主への感染が顕著に見られる寄生虫である。そのため、豚を固有宿主とする豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）や犬回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａｃａｎｉｓ）の人への感染例が多数報告され、人畜共通感染症としても重要視されている（松山ら，日本呼吸器学会誌３６：２０８−２１２（１９９８），Ｍａｒｕｙａｍａｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ３４７：１７６６−１７６７（１９９６））。また、マウス等の実験動物でも感染が成立し、豚の代替宿主として豚回虫−マウス感染系は広く免疫学的試験等に利用されている（Ｋｅｎｎｅｄｙｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＥｘｐＩｍｍｕｎｏｌ８０：２１９−２２４．（１９９０））。
【０００４】
寄生虫感染でもウイルスや細菌感染症に見られるような宿主の再感染防御能の獲得が知られており、古くから実験室段階で実証されている（Ｍａｉｚｅｌｓｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｖ１７１：１２５−１４７．（１９９９））。こうした背景から寄生虫ワクチンとして実用化に至った寄生虫はＰｏｙｎｔｅｒによって開発された牛肺虫である（Ｐｏｙｎｔｅｒ，Ｄ．，Ａｄｖ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，１：１７９−２１２．（１９６３））。しかし、感染幼虫を放射線照射によって製造された寄生虫ワクチンには常に人為感染の副作用があり、また、生ワクチンであるため投与の煩雑さで敬遠されるに至った。豚回虫感染においても、虫体抽出物あるいは放射線照射した感染ステージである第３期幼虫（Ｌ３）で防御免疫が誘導されることは、豚、ウサギ、マウスで明らかにされている（Ｓｔｅｗａｒｔｅｔａｌ．，ＶｅｔＰａｒａｓｉｔｏｌ１７：３１９−３２６．（１９８５），Ｓｔａｎｋｉｅｗｉｃｚｅｔａｌ．，ＪＰａｒａｓｉｔｏｌ３６：２４５−２５７（１９９０））。なかでも、豚回虫幼虫ステージの抽出抗原や表層抗原を免疫した動物では、顕著な感染阻止が認められことから、幼虫抗原には防御免疫を誘導する分子が含まれていることが示唆されてきている（Ｈｉｌｌｅｔａｌ．，ＶｅｔＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ４２：１６１−１６９（１９９４））。
【０００５】
遺伝子組換え技術は、他の感染症と同様に寄生虫ワクチン開発に向け有効な手段となっている。現在、各国で感染防御抗原あるいは寄生虫に特有な変態関連酵素等をコードする遺伝子クローニングが精力的に進められ、安全なワクチン蛋白質の製造が試みられてきている（Ｂｌａｘｔｅｒｅｔａｌ．，ＰａｒａｓｉｔｏｌＴｏｄａｙ１６：５−６．（２０００））。しかし、ワクチン候補分子を製造しても、感染の成立する宿主が限定されてしまうため、マウス等の実験小動物を用いた有効性評価が難しく、組換え技術によって製造された寄生虫感染を防ぐいわゆる感染防御抗原の評価が大きな障害となり、現状では単一分子あるいは複数の分子を組み合わせた組換え抗原によるワクチンの実用化に至っていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、寄生虫の駆除及び寄生虫感染から家畜及び人を守るための化合物の合成を提供し、様々な人畜共通の寄生虫感染症の防除法を提供するものである。具体的には、Ａｓｃａｒｉｓ及びＴｏｚｏｃａｒａ属回虫の感染防御抗原蛋白質、該感染防御抗原蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを保持する組換え体細胞、寄生虫の感染防御抗原に対する抗体及び寄生虫の感染を防御するワクチンを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、豚回虫感染幼虫から、新規な１６ｋＤａの抗原をコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡがコードする抗原がマウスにおいて回虫感染を防御することを見出し、該抗原が回虫感染防御抗原であることを突き止め本発明を完成するに至った。本発明は寄生虫における感染防御抗原をコードする遺伝子（ＡｓｃａｒｉｓｓｕｕｍＬ２Ｒ３７遺伝子）、該感染防御抗原蛋白質及び該感染防御抗原蛋白質コード領域を蛋白質発現ベクターに挿入し、精製した組換え感染防御抗原蛋白質の作製に関連する。また、本発明は感染防御抗原に対する抗体、及び抗体の作製方法に関連する。さらに、本発明は該感染防御蛋白質をワクチンとして用いた、回虫感染防御能の誘導に関連する。
【０００８】
即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示す豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質。
（２）以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項１に記載のＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号１の７６位から５２５位の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列表の配列番号１の７６位から５２５位の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号２で示す豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質のアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）配列表の配列番号２で示す豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質。
（４）（１）または（２）のＤＮＡを含む組換え体分子。
（５）（１）または（２）のＤＮＡを含むベクター。
（６）（５）のベクターを含む組換え体細胞。
（７）（６）の組換え体細胞を培養し、その培養物から豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を採取することを特徴とする、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を産生する方法。
（８）（３）の豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を認識する抗体。
（９）モノクローナル抗体である（８）の抗体。
（１０）（３）の豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を含む、回虫感染防御のための全身性及び粘膜誘導型ワクチン。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明におけるｃＤＮＡライブラリーの作製、遺伝子のクローニング、スクリーニングおよび塩基配列の決定等の分子生物学、寄生虫学、免疫学並びに生化学的な技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ；ＥｄＨａｒｌｏｗａｎｄＤａｖｉｄＬａｎｃ（１９８８）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ；獣医臨床寄生虫学編集委員会編（１９９８）、獣医臨床寄生虫学、文英堂、等の当業者に良く知られた文献に記載された方法に従って行えばよい。また、ＤＮＡ解析は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）（コダック社）およびＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェアー開発社）等のソフトウェアを用いて行うことができる。
【００１１】
本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列を有する豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質をコードする総てのＤＮＡを含む。また、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質をコードする総てのＤＮＡも含む。ここで、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質とは、下に記載のとおりである。
【００１２】
さらに、本発明のＤＮＡは、配列番号１の７６位から５２５位までの塩基配列からなるＤＮＡ（豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原をコードするＤＮＡ、すなわちＡｓｃａｒｉｓｓｕｕｍＬ２Ｒ３７遺伝子）または配列番号１に示す全塩基配列からなるＤＮＡを含む。さらに、これらのＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる総てのＤＮＡも含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原をコードするＤＮＡ配列と９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、より好ましくは９７％以上の相同性が配列間に存在するときのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。通常、完全ハイブリッドの融解温度より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）に記載されており、ここに記載の条件を使用し得る。
【００１３】
また、本発明の蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するもの又は、その類似蛋白質すなわち配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同等の性質を有し、アミノ酸配列中、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであり、豚回虫感染幼虫１６ｋＤａ抗原のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の相同性を有するのが望ましい。ここで、実質的に同質の性質とは、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有することを意味し、生物学的活性を有するとは豚回虫感染防御能を有することを意味する。
【００１４】
本発明の豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原をコードするｃＤＮＡは、以下のような方法で得ることができる。
【００１５】
Ａｓｃａｒｉｓ属またはＴｏｘｏｃａｒａ属回虫の成虫は、回虫感染豚より得ることができる。成虫から未成熟卵を得て、ＤｏｕｖｒｅｓａｎｄＵｒｂａｎ，ＪＰａｒａｓｉｔｏｌ．，６９：５４９−５５８（１９８３）らの方法によって感染ステージである第３期幼虫（Ｌ３）を含む成熟卵に発育させ、ｃＤＮＡのライブラリーの作成のために供することができる。
【００１６】
回虫Ｌ３より、通常行われる方法または市販のｍＲＮＡ単離キットを用いて、ｍＲＮＡ（ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ）を精製する。例えば、回虫Ｌ３を、グアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂ等を担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、又はバッチ法によりｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを得ることができる。
【００１７】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡを合成し、適当なベクターに組み込んで、該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡは、適当な制限酵素とリガーゼを用いる通常の方法でベクターに組込むことができる。例えば、得られたｃＤＮＡを、適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法などがある。この際、後述のベクター、宿主細胞を用いてｃＤＮＡライブラリーを得ることが出来る。
【００１８】
このようにして得られたクローン化ＤＮＡライブラリーから、目的のＤＮＡを選択する。選択方法として、イムノスクリーニング法、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等の方法を用いることができる。例えば、得られたクローン群を、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等の誘導物質により蛋白質を発現させ、これをナイロン膜若しくはセルロース膜に転写し、目的蛋白質に対する抗体または該抗体を含む血清を用いて免疫学的に対応するクローンを選択することができる。
このようにして調製したクローンから目的ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００１９】
塩基配列の決定は、例えば、マキサム・ギルバート法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．ａｎｄＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７４，５６０，１９７７）又はジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，９，３０９，１９８１）等により行うことができる。これらの原理を応用した塩基配列自動解析装置を用いて配列を決定することもできる。
【００２０】
得られた目的ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の遺伝子増幅法により増幅することができる。ＰＣＲは、例えば、蛋白質核酸酵素「ＰＣＲ法最前線―基礎技術から応用まで―」第４巻、第５号、１９９６年４月号増刊、共立出版に記載されている技術により行うことができる。目的のＤＮＡをクローン化又は増幅した後、目的ＤＮＡを回収し、これを入手可能な適当な発現ベクターに組み込んで、さらに適当な宿主細胞に形質転換し、適当な培地中で培養、発現させ、目的蛋白質を回収、精製することができる。
【００２１】
この際のベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモータを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００２２】
ベクターは、商業的に入手可能なものを使用することができ、例えば細菌性のものではｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、真核性のものではｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等がある。
【００２３】
複製開始点として、大腸菌ベクターに対して、例えばＣｏｌｉＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子由来のものが、酵母ベクターに対して、例えば２μｍＤＮＡ、ＡＲＳ１由来のものが、哺乳類細胞用ベクターに対して、例えばＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のものを用いることができる。また、プロモーターとしてアデノウイルス又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージラムダＰ_Ｌプロモーター、酵母用としてのＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＰＤ、ＰＧＫ、ＡＯＸ１プロモーター、蚕細胞用としての核多角体病ウイルス由来プロモーター等を用いることができる。
【００２４】
選択マーカーとして、大腸菌用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を、酵母用ベクターには、Ｌｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝子等を、哺乳類細胞には、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を挙げることができる。
【００２５】
ＤＮＡのベクターへの導入は、任意の方法で行うことができる。ベクターは、種々の制限部位をその内部に持つポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限部位を含んでいることが望ましい。ベクター中の特定の制限部位を特定の制限酵素で切断し、その切断部位にＤＮＡを挿入することができる。本発明のＤＮＡおよび調節配列を含む発現ベクターを適切な宿主細胞の形質転換に用いて、宿主細胞に本発明の豚回虫感染幼虫１６ｋＤａ抗原を発現、産生させることができる。
【００２６】
宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７等の哺乳類細胞等が挙げられる。
【００２７】
形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポーレーション等の公知の方法で行うことができる。
【００２８】
得られたリコンビナント蛋白質は、各種の分離精製方法により、分離・精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。この際、発現産物がＧＳＴ等との融合蛋白質として発現される場合は、目的蛋白質と融合している蛋白質またはペプチドの性質を利用して精製することもできる。例えばヒスチジンが６個以上並んだアミノ酸配列、いわゆるヒスチジンタグとの融合蛋白質として発現させた場合、ヒスチジンタグを有する蛋白質はキレートカラムに結合するので、キレートカラムを用いて精製することができる、またＧＳＴとの融合蛋白質として発現させた場合、ＧＳＴはグルタチオンに対して親和性を有するので、グルタチオンを担体に結合させたカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより効率的に精製することができる。
【００２９】
豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原に対する抗体は、以下のようにして調製することができる。
【００３０】
該１６ｋＤａ抗原を抗原として、当業者に良く知られた方法に従い例えばマウス、モルモット、ウサギ、ヤギ等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し、十分に免疫した後、動物から採血し、血清分離し、抗回虫感染幼虫１６ｋＤａ抗原抗体を作製することができる。この際、適当なアジュバントを使用することもできる。モノクローナル抗体も公知の方法により作製し得る。例えば、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原で免疫したマウスの脾細胞とマウスのミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマの培養上清又は該ハイブリドーマを腹腔内に投与したマウスの腹水から調製することができる。免疫抗原として用いる豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原は、豚回虫から抽出した天然蛋白質、組換え蛋白質でもよいし、化学合成したものでもよい。また、全アミノ酸配列を有する蛋白質でも良いし、該蛋白質の部分構造を有するペプチドフラグメントや他の蛋白質との融合蛋白質でも良い。ペプチドフラグメントは該蛋白質を適当な蛋白質分解酵素で分解した断片も用い得るし、配列番号１に示す塩基配列の一部を発現ベクターに組み込んで発現させた産物でも良い。融合蛋白質は、配列番号１に示す塩基配列の一部を他の蛋白質をコードする遺伝子と連結させて、発現ベクターに組み込んで発現させて製造することもできるし、ポリペプチドフラグメントを適当なキャリア蛋白質と化学結合により結合させた上で使用することもできる。得られた抗体の反応性は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウエスタンブロッティング等の当業者によく知られた方法により測定することができる。
【００３１】
豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原を、回虫感染防止のためのワクチンとして用いることができる。
ワクチンとして用いる豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質は、豚回虫から抽出した天然蛋白質、組換え蛋白質でもよいし、化学合成したものでもよい。また、全アミノ酸配列を有する蛋白質でも良いし、該蛋白質の部分構造を有するペプチドフラグメントや他の蛋白質との融合蛋白質でも良い。フラグメントの場合、フラグメントが回虫の感染を防御する抗体（中和抗体）が認識するエピトープ（中和エピトープ）を含んでいることが必要である。ペプチドフラグメントは該蛋白質を適当な蛋白質分解酵素で分解した断片も用い得るし、配列番号１に示す塩基配列の一部を発現ベクターに組み込んで発現させた産物でも良い。
【００３２】
ワクチンは、１種又は数種のアジュバント、例えばフロイントの完全若しくは不完全アジュバント、コレラトキシン、易熱性大腸菌毒素、水酸化アルミニウム、カリウムミョウバン、サポニン若しくはその誘導体、ムラミルジペプチド、鉱物油または植物油、ＮＡＧＯ、ノバソームまたは非イオン性ブロック共重合体、ＤＥＡＥデキストラン等を含むことができる。また、医薬上許容される担体を含んでいてもよい。医薬上許容される担体は、ワクチン接種される動物の健康に悪影響を及ぼさない（すなわち、少なくとも、該動物にワクチン接種しない場合に病気により認められる影響より著しい悪影響を及ぼさない）化合物であると理解される。医薬上許容される担体は、例えば、無菌水または無菌生理塩溶液であることが可能である。より複雑な形態の場合には、該担体は例えばバッファーであることが可能である。
【００３３】
本発明のワクチンは、通常の能動免疫法で投与することができ、注射により投与する全身性ワクチンでも、注射によらず経口投与等により投与する粘膜誘導型ワクチンでもあり得る。すなわち、予防的に有効な量（すなわち、回虫による攻撃に対して動物において免疫を誘導する抗原を発現しうる免疫化抗原）にて、剤形に適合した方法による単回または反復投与により投与することができる。ワクチンは、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口的または鼻腔内に投与することができる。また、本発明のワクチンは、同じおよび／または他の寄生虫の他の抗原成分と有効に混合することが可能である。
【００３４】
ワクチンの投与量、投与回数は対象動物により変わり得るが、例えば本発明の豚回虫感染幼虫１６ｋＤａ抗原を数十μｇ含むワクチンを１週間から数週間に一度の頻度で、数回投与することにより動物に防御免疫を誘導し得る。
【００３５】
さらに、本発明は分離した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原に対するインヒビターに関する。分離した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質に対するインヒビターに関する言葉は、天然物あるいは核酸技術もしくは化学合成から得られたものも含まれる。
【００３６】
また、本発明は、それら蛋白質、核酸、抗体、動物の治療を目的とした治療的化合物としてのインヒビター等、ならびにその応用も含まれる。
本発明の豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質及び核酸は、寄生虫ワクチンあるいは抗寄生虫剤の新規ターゲットに利用することもできる。
【００３７】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３８】
実施例１本発明における豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原塩基配列の分離及び決定
豚回虫Ａ．ｓｕｕｍの成虫は、茨城県食肉処理場下妻支所にてＡ．ｓｕｕｍ感染豚より採取した。成虫から得た未成熟卵はＤｏｕｖｒｅｓａｎｄＵｒｂａｎ，ＪＰａｒａｓｉｔｏｌ．，６９：５４９−５５８．（１９８３）らの方法によって感染ステージのＬ３を含む成熟卵に発育させ、以下の操作に供した。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原をコードする遺伝子は、イムノスクリーニングによるＡ．ｓｕｕｍＬ３ｃＤＮＡライブラリーから単離した。使用したｃＤＮＡライブラリーは、λＺａｐＩＩベクター（ストラータジーン社）を用いてメーカーの推奨する方法により作製した。使用した血清は、Ａ．ｓｕｕｍＬ３を４回感染させたウサギの血清であった（Ｋａｓｕｇａｅｔａｌ．，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ１２１：６７１−６７７．（２０００））。
使用したファージはＥ．ＣｏｌｉＸＬ−１Ｂｌｕｅに感染させ、シャーレ（直径１５０ｍｍ）に５×１０^４になるよう調製し、３７℃で４時間培養した。プラーク出現後、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を浸漬させたニトロセルロース膜で培地の表層を覆い、さらに３時間培養した。培養シャーレから取り除いたニトロセルロース膜は、０．０２％Ｔｗｅｅｎ添加Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＴＢＳＴ）で洗浄し、さらに５％添加ＴＢＳＴに室温１時間ブロッキングした。ニトロセルロース膜は、１：２００に希釈したＡ．ｓｕｕｍＬ３感染ウサギ血清と３時間室温で反応させ、ＴＢＳＴで十分洗浄した後アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ山羊血清と１時間反応させ、陽性ファージを５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を用いて検出した。検出したクローンは、さらに上記スクリーニングを繰り返し、陽性クローンを単離した。単離したファージはＥｘＡｓｓｉｓｔ（商標）ヘルパーファージとＥ．ＣｏｌｉＳＯＬＲ（商標）を用いてメーカーの推奨する方法に従いＤＮＡのインビボーイクサイションを行った。
【００３９】
アルカリ溶菌法により調製した組換え体プラスミドＤＮＡ（Ｌ２Ｒ３７）はＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ及びＦｏｒｗａｒｄプライマー（アプライドバイオシステム社）を用い、Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（アプライドバイオシステム社テクニカルマニュアル）によりメーカーの推奨する方法に従い反応させ、反応産物をＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒＭｏｄｅｌ３７０Ａ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．３０、アプライドバイオシステム社）を用いて解析し塩基配列を決定した。Ｌ２Ｒ３７は、６１５塩基で構成され、５’には非翻訳領域に続き７６位にＡＴＧの開始コドン５２６位に終止コドンがそれぞれ認められ、さらにその下流には真核生物に存在するポリアデニレーションが確認された。塩基配列から推定される蛋白質は１５０残基のアミノ酸から構成され、その内Ｎ末領域には１８残基の真核生物シグナル配列が確認された。全アミノ酸の推定分子量は１６，４２４Ｄａで等電点は５．２３であったのに対して、シグナル配列を除いた虫体内での予想される成熟蛋白質の分子量は、１４，４２０Ｄａ、等電点は４．９１であった。配列表の配列番号１に該ＤＮＡの塩基配列を示した。コーディング領域は、７６位から５２５位であった。配列表の配列番号２にアミノ酸配列を示した。アミノ酸データベースとの相同性検索から、本発明で示す推定アミノ酸構造は、人象皮症の病原体であるフィラリアの抗原分子あるいは土壌線虫のひとつであるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓｅの遺伝子産物とそれぞれ約５０％の類似性を示した。しかしながら、現在のＧｅｎＢａｎｋ（商標）データーベース上で人及びマウス等の哺乳動物で確認されている蛋白質との間で類似性を示した蛋白質は確認されなかった。このことから分離された遺伝子がコードする蛋白質は、線虫特有のものであることが示唆された。
【００４０】
実施例２組換え体蛋白質を発現させるベクター構築のための豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原ｃＤＮＡの分離及び増幅並びに組換え体分子及び組換え体細胞の作出
上記方法で合成したＡ．ｓｕｕｍＬ３ｃＤＮＡセンスプライマー（５’−ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＡＣＴＴＧＣ−３’；ＣＴＣＧＡＧはＸｈｏＩサイト；配列番号３）とアンチセンスプライマー（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣＣＴＴ−３’；ＧＡＡＴＴＣはＥｃｏＲＩサイト；配列番号４）を用いたＰＣＲ反応にて増幅した。
【００４１】
ＰＣＲ反応は５０μｌの反応液〔１ｎｇＡ．ｓｕｕｍＬ３ｃＤＮＡ、１μＭセンス及び１μＭアンチセンスプライマー、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、２．５ＵＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（プロメガ社）〕を調製し、ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（パーキンエルマー社）を用いて、９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７２℃にて２分間の反応を３５サイクルで実施した。増幅したＰＣＲ産物はゲル電気泳動を行い、増幅したＤＮＡ断片をＤＮＡ精製キット（キアゲン社）を用いて蒸留水中に回収し、回収液を制限酵素ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで３時間酵素処理した。プラスミド発現ベクターであるｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクター（インビトローゲン社）も挿入断片と同様に制限酵素ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで３時間酵素処理した。制限酵素処理した挿入断片及びベクターをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社）を用いてメーカーの推奨する方法に従ってＤＮＡ断片を挿入し、大腸菌Ｔｏｐ１０を用いて形質転換を行い、Ｌ−ａｍｐプレートに蒔き白色のコロニーから豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原コード領域の挿入されたクローンを選択した。
【００４２】
実施例３大腸菌における豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原の作出及び、作出した蛋白質の性状
形質転換した大腸菌を３７℃でアンピシリンを含んだＳＯＢ液で培養し、培養後ＳＯＢ液のＯＤ_６０００．５に到達した時点で１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を続けた。経時的に産生される蛋白産生の変化は１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動｛Ｌａｅｍｍｌｉ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５（１９７０）｝を実施した後、クマーシー染色で確認した。その結果、約２２ｋＤａ付近に組換え蛋白質の産生が認められ。また、同様に実施した電気泳動のゲルをニトロセルロース膜（アマシャム社）に電気的に転写した。転写後、膜を５％スキムミルクで３０分間ブロッキングし、次いで、ＴＢＳで１０，０００倍に希釈されたアルカリホスファターゼ標識されたＴ７モノクローナル抗体（ノバーゲン社）と１時間反応させた。ＴＢＳＴで洗浄した後、結合した蛋白質を基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ギブコＢＲＬ社）を用いて可視化した。その結果、このウエスタンブロット解析によって約２２ｋＤａ付近に確認された組換え蛋白質と反応することが認められ、組換え蛋白質に（Ｈｉｓ）_６が付加されていることが確認された（図１）。図１でレーン１は、発現前の大腸菌ライセート、レーン２は、発現後の大腸菌ライセート、レーン３は、精製した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ組換え抗原蛋白質を示している。
【００４３】
実施例４大腸菌からの豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原の精製、及び精製した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質に対する抗体作製
豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質はメタルキレートクロマトグラフィー（インビトローゲン）を用いてメーカーの推奨するイミダゾール溶出法によって精製した（Ｔｓｕｊｉｅｔａｌ．，ＭｏｌＢｉｏｃｈｅｍＰａｒａｓｉｔｏｌ９７：６９−７９（１９９８））。溶出された蛋白質はＣｅｎｔｒｉｓａｒｔＩ（ザルトリウス社，ｃｕｔｏｆｆ１０，０００ＭＷ）を用いて濃縮し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）ＤｉａｌｙｓｉｓＣａｓｓｅｔｔｅ（ピアス社）を用いてリン酸緩衝食塩液中にて透析を行った。この精製した豚回虫感染幼虫抗原組換え体蛋白質は、以下の抗体作製、各種動物の豚回虫免疫血清の反応性、豚回虫感染幼虫を用いた攻撃試験の検討に使用した。
【００４４】
豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質に対するポリクローナル抗体はマウスを用いて以下のように作製した｛Ｔｓｕｊｉｅｔａｌ．，ＭｏｌＢｉｏｃｈｅｍＰａｒａｓｉｔｏｌ９７：６９−７９，（１９９８）｝。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質５０μｇをＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（商標）（シンテックス社）とともに皮下接種し、４週間後再度同量を接種した。再投与２週後に採血を行い、血清を−２０℃に保存した。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質を用いたウエスタンブロット解析によって、作製された１６ｋＤａ組換え蛋白質マウス免疫血清は、２２ｋＤａ付近の組換え蛋白質と強く反応することが確認された。
【００４５】
実施例５精製した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質の各種動物のＡ．ｓｕｕｍＬ３免疫血清との反応性
実施例４で作製した１６ｋＤａ組換え蛋白質とウサギ、マウス及び豚の豚回虫免疫血清との反応性をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法を用いて調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５（１９７０））で分離した１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質を定法に従いニトロセルロース膜（アマシャム社）に転写した。転写後、膜を５％スキムミルクで３０分間ブロッキングし、次いで、ＴＢＳで５００倍に希釈されたウサギ、マウス及び豚の免疫血清と１時間反応させた。ＴＢＳＴで転写膜を洗浄した後、免疫血清と結合した蛋白質を検出するためにアルカリホスファターゼ標識された抗ウサギ、マウス及び豚−ＩｇＧ抗体（カッペル社）と１時間反応させ、結合した蛋白質を基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ギブコＢＲＬ社）を用いて可視化した。その結果、いずれの免疫血清も２２ｋＤａの抗原組換え体蛋白質と陽性反応を示し、１６ｋＤａ組換え蛋白質の抗原性が確認された。
【００４６】
実施例６イムノブロット法によるネイティブ（天然型）豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原の性状及び人回虫及び犬回虫における豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原様分子の性状
実施例４で作製したマウス豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質免疫血清を用いて、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５（１９７０））で分離した後、定法に従いニトロセルロース膜（アマシャム社）に転写した。転写後、膜を５％スキムミルクで３０分間ブロッキングし、次いで、ＴＢＳで１，０００倍に希釈されたマウス豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質免疫血清と１時間反応させた。ＴＢＳＴで洗浄したのち、免疫血清と結合した蛋白質を検出するために、アルカリホスファターゼ標識された抗マウス−ＩｇＧ抗体（カッペル社）と１時間反応させ、結合した蛋白質を基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ギブコＢＲＬ社）を用いて可視化した。その結果、マウス血清と反応する約１６ｋＤａの単一バンドが確認され、Ａ．ｓｕｕｍＬ３抽出蛋白液中の天然型豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原が同定できた。この成績により本発明の表題に用いた１６ｋＤａは、Ｌ２Ｒ３７がコードする豚回虫の成熟抗原の分子量である。さらに、人回虫抽出蛋白を用いて上記の方法を行ったところ、豚回虫抽出蛋白の場合と同様の１６ｋＤａの大きさに陽性反応が確認された。しかし、犬回虫抽出蛋白には陽性反応は確認されなかった。これらのことから検出された１６ｋＤａ抗原は豚及び人回虫に共通して存在する分子であることが示された（図２）。図２でレーン１は人回虫、レーン２は犬回虫、レーン３は豚回虫、レーン４は豚回虫感染幼虫１６ｋＤａ組換え抗原蛋白質を示している。
【００４７】
実施例７豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質を免疫したマウスにおけるＡ．ｓｕｕｍＬ３攻撃試験
マウス２０匹を４群（５匹／１群）に分け、それぞれ豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質免疫群、アジュバンド対照群、感染耐化群および未処置群を構成した。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質免疫群のマウスに初回に５０μｇの豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質をフロイトの完全アジュバント（ディフコ社）と共に皮下接種し、その４週間後および６週間後に１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質をフロインドの不完全アジュバントと共に皮下接種し合計３回免疫処置を行った。アジュバンド対照群には、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質免疫群で使用したアジュバントを免疫処置日と同一日に皮下接種した。感染耐化群は、Ａ．ｓｕｕｍＬ３を頻回感染させることによって作製した。すなわち、感染ステージであるＬ３を含んだ成熟卵を初回２，０００個経口投与し、その後４週目および６週目に４，０００個投与した。実験群マウスへのＡ．ｓｕｕｍＬ３のチャレンジは最終免疫および経口投与の１週間後に成熟卵５，０００個を経口投与することで行った。感染後、７日目にて安楽死させ肺を取り出しべ−ルマン法により抗生物質を加えたＰＢＳ中に肺組織内の幼虫を遊出させ、顕微鏡下でその幼虫数をカウントした。数値は平均値±標準偏差で示した。感染防御の効果判定は未処置群との幼虫数増減で行った。
【００４８】
未処置群では、２５３．５±４１．５匹、アジュバンド対照群では、２７５．５±１０８．１匹、これらに対して、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質を免疫群では、１２４．８±９５．３匹、であった。また、各群のマウス血清を用いて、イムノブロット法によって豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質の特異抗体を測定した。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質を免疫群ではいずれのマウス血清も希釈倍率１，６００倍あるいは３，２００倍で強い陽性反応が確認された。未処置群及びアジュバンド対照群ではいずれも陽性反応は確認されなかった。すなわち、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質の免疫によって、Ａ．ｓｕｕｍ幼虫回収率が有意に減少し、Ａ．ｓｕｕｍＬ３に対する豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質による防御免疫誘導が確認された。なお、Ａ．ｓｕｕｍＬ３感染マウスにおけるＡ．ｓｕｕｍＬ３チャレンジの防御免疫誘導は、今回設定した感染耐化群のチャレンジ試験において肺からの幼虫回収が０であったことからも立証された。
【００４９】
実施例８経鼻免疫による豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質の感染防御能
実施例７において、実験室内で汎用されている免疫方法によって作製された豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質免疫マウスにＡ．ｓｕｕｍＬ３感染に対する防御免疫誘導が確認された。そこで、さらにワクチン投与による動物への侵襲負担の軽減及び投与の省力化を図るため、鼻腔投与による豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質の防御免疫誘導能について検討した。アジュバントにはコレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ、Ｃ−９９０３、シグマ社）を用いた。
【００５０】
マウス１５匹を３群（５匹／１群）に分け、それぞれ豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質＋ＣＴＢ免疫群、ＣＴＢ免疫対照群、および未処置群を構成した。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質＋ＣＴＢ免疫群のマウスには初回、５０μｇの豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質と２５μｇＣＴＢの混和液を鼻腔内にマイクロキャピラリーラウンドチップを用いて投与し、その４週間後および６週間後に同様に投与し合計３回の免疫処置を行った。ＣＴＢ免疫対照群には、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質免疫群で使用したＣＴＢを免疫処置日と同一日に鼻腔投与した。
実験群マウスへのＡ．ｓｕｕｍＬ３のチャレンジは最終免疫および経口投与の１週間後に成熟卵５，０００個を経口投与することで行った。感染後、７日目に安楽死させ肺を取り出し、ベ−ルマン法により抗生物質を加えたＰＢＳ中に肺組織内の幼虫を遊出させ、顕微鏡下でその幼虫数をカウントした。回収した幼虫数は平均値±標準偏差で示した。感染防御の効果判定は未処置群との幼虫数増減で行った。また、各群のマウス血清を用いて、ＥＬＩＳＡによる豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質に対する特異抗体を測定した。すなわち、０．１Ｍ炭酸バッファーｐＨ９．６を用いて２μｇ／ｍｌに調整した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白をポリスチレン性マイクロプレート（ＡＥ１６４０，住友ベークライト社）の各ウエルをコートした。プレートは４℃で１６時間放置後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ添加ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。各ウエルは１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社）加ＰＢＳで３７℃１時間ブロックした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、系列希釈した血清を添加し３７℃度で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで５回洗浄しウエルに１：１０，０００に調整したホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ（ベッチル社）を加え３７℃で１時間反応させた。反応後プレートはＰＢＳＴで５回洗浄し、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）基質溶液（ＡＢＴＳ，ＫＰＬ）を添加し３７℃で発色させた。反応の停止は１％ＳＤＳ添加によって行った。発色の測定はマイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＦＬＵＯＲ、和光）を用いてＡ_４０５で測定した。抗体価は最高希釈倍率のｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｌｏｇ_２ｔｉｔｅｒで示した。その結果、未処置群では、１７３．４±４９．６匹。ＣＴＢ免疫対照群では、２００．８±５２．８匹であった。これらに対して、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質＋ＣＴＢの免疫群では、７６．４±２５．６匹であった。その結果、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質＋ＣＴＢの免疫群では、１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質に対する特異ＩｇＧ抗体価１９．０±０．７０が確認された。未処置群及びＣＴＢ免疫対照群ではいずれも抗体価は＜６であった。すなわち、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質の経鼻による粘膜免疫によって、Ａ．ｓｕｕｍ幼虫回収率が有意に減少し、Ａ．ｓｕｕｍＬ３感染に対する豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質による防御免疫誘導が確認された。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、該ＤＮＡを含むベクター及び組換え体細胞、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ）感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質、該抗原を認識する抗体並びに該抗原を含む豚回虫感染防御のための全身性及び粘膜誘導型ワクチンが提供され、寄生虫の駆除及び寄生虫感染から家畜及び人を守るための化合物の合成及び様々な人畜共通の寄生虫感染症の防除が可能になる。
【００５２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原の電気泳動の結果を示す図である。
【図２】イムノブロット法による人回虫における豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ関連抗原ならびにネイティブ型豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原の結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein involved in the protection against parasitic infection, DNA encoding the same, and use thereof. Specifically, an Ascarid nematode infection-protecting antigen protein including Ascaris and Tozocara genera, a DNA encoding the infection-protecting protein, a vector containing the DNA, a recombinant cell carrying the vector, and a parasitic infection protection The present invention relates to an antibody against an antigen and a vaccine that protects against parasitic infection. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be applied to the synthesis of compounds aimed at protecting Ascaris and Toxocara ascaris infection, or to the development of vaccines and therapeutic agents for protecting against roundworm infection in humans and animals.
[0002]
[Prior art]
Many of the infectious diseases that have caused enormous damage to humanity and livestock production have been suppressed by the spread of vaccines. However, parasitic infections for which vaccines are still being developed are still distributed around the world. In particular, in the tropical and subtropical regions, in addition to the spread of parasites, the damage to human health and livestock production due to parasites can be enormous. Also, in advanced countries, the threat of new and reviving zoonotic infections due to parasites has recently become a major social problem. The center of parasitic disease control depends heavily on the use of drugs such as chemotherapeutic agents. However, so-called drug resistance due to continuous use of drugs is established for any drug, and many of them lose their insecticidal effect. Furthermore, the use of drugs must always be considered for side effects on humans or animals, and at the same time, there are drug residue problems that threaten food and environmental safety and tend to be avoided by consumers. In addition to the effectiveness and scope of use of drugs, there is a limit in terms of huge development costs, and it is extremely difficult to prevent damage to human and livestock production by parasites in the 21st century. It is a difficult situation.
[0003]
The roundworms (genus Ascaris and Toxocara) that parasitize the small intestine of humans, domestic animals, and pets are parasites that are distributed not only in tropical and subtropical regions but also in developed countries. In general, parasitic nematodes have a limited number of native hosts, but as regards roundworms, parasites that are prominently infected with non-native hosts that are not native hosts. For this reason, many cases of Ascaris suum and Toxocara canis inhabitants have been reported and are regarded as important zoonotic diseases (Matsuyama et al., Japan Respiratory System). Academic Journal 36: 208-212 (1998), Maruyama et al., Lancet 347: 1766-1767 (1996)). Moreover, infection is established even in laboratory animals such as mice, and the swine roundworm-mouse infection system is widely used for immunological tests and the like as an alternative host for pigs (Kennedy et al., Clin Exp Immunol 80: 219-224). (1990)).
[0004]
The acquisition of host reinfection protective ability as seen in viruses and bacterial infections is known even in parasitic infections, and has been demonstrated in the laboratory for a long time (Maizels et al., Immunol Rev 171: 125- 147. (1999)). The parasite that has been put to practical use as a parasitic vaccine from such a background is a bovine lungworm developed by Poynter (Poynter, D., Adv. Parasitol., 1: 179-212. (1963)). However, parasitic vaccines produced by irradiating infected larvae always have side effects of human infection, and since they are live vaccines, they have been avoided due to the complexity of administration. In swine roundworm infection, it has been clarified in pigs, rabbits, and mice that protective immunity is induced by worm extract or the third stage larvae (L3), which is the stage of infection that has been irradiated (Stewart et al , Vet Parasitol 17: 319-326 (1985), Stankiewicz et al., J Parasitol 36: 245-257 (1990)). In particular, in animals immunized with the extracted antigens and surface antigens of the Ascaris larvae stage, significant infection inhibition was observed, suggesting that larval antigens contain molecules that induce protective immunity. (Hill et al., Vet Immunol Immunopathol 42: 161-169 (1994)).
[0005]
As with other infectious diseases, genetic recombination technology has become an effective means for developing parasitic vaccines. At present, gene cloning encoding an infection-related antigen or a transformation-related enzyme peculiar to a parasite has been energetically promoted in each country, and production of a safe vaccine protein has been attempted (Blaxter et al., Parasitol Today 16). : 5-6 (2000)). However, even if a vaccine candidate molecule is produced, since the host in which infection is established is limited, it is difficult to evaluate the effectiveness using small experimental animals such as mice, and so-called prevention of parasitic infection produced by recombinant technology. Evaluation of infection-preventing antigens has become a major obstacle, and at present, a vaccine with a recombinant antigen combining a single molecule or a plurality of molecules has not been put into practical use.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides the control of parasites and the synthesis of compounds for protecting livestock and humans from parasitic infections, and provides a method for controlling various common parasitic infections. Specifically, Ascaris and Tozocara roundworm infection protection antigen protein, DNA encoding the infection protection antigen protein, vector containing the DNA, recombinant cell harboring the vector, antibody against parasitic infection protection antigen And it aims at providing the vaccine which protects against a parasitic infection.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have isolated a DNA encoding a novel 16 kDa antigen from a roundworm of pig roundworm infection, and found that the antigen encoded by the DNA protects against roundworm infection in mice. As a result, the present invention has been completed. The present invention relates to a gene encoding an anti-infection antigen in a parasite (Ascaris sumlL2R37 gene), the anti-infection antigen protein, and the anti-infection antigen protein coding region inserted into a protein expression vector to produce a purified recombinant anti-infection antigen protein is connected with. The present invention also relates to an antibody against an infection protective antigen and a method for producing the antibody. Furthermore, the present invention relates to the induction of roundworm infection protection ability using the infection protection protein as a vaccine.
[0008]
That is, the present invention is as follows.
(1) DNA encoding a 16 kDa antigen protein of Ascaris suum shown in the following (a) or (b).
(A) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(B) Biology of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing Protein with active activity.
(2) The DNA according to claim 1, which is the DNA shown in (c) or (d) below.
(C) DNA comprising a base sequence from positions 76 to 525 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(D) a 16 kDa antigen of Ascaris suum that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence from positions 76 to 525 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing DNA encoding a protein having the biological activity of the protein.
(3) The protein shown in the following (a) or (b).
(A) A protein having the amino acid sequence of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum represented by SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
(B) the amino acid sequence of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and A protein having the biological activity of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum.
(4) A recombinant molecule comprising the DNA of (1) or (2).
(5) A vector comprising the DNA of (1) or (2).
(6) A recombinant cell comprising the vector of (5).
(7) The recombinant cell of (6) is cultured, and the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum is collected from the culture, and the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum is produced. how to.
(8) An antibody that recognizes the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum of (3).
(9) The antibody according to (8), which is a monoclonal antibody.
(10) A systemic and mucosal derived vaccine for protection against roundworm infection, comprising the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum of (3).
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0010]
Molecular biology, parasitology, immunology and biochemical techniques such as preparation of cDNA library, cloning of genes, screening and determination of nucleotide sequences in the present invention are described in J. Org. Sambrook, E .; F. Fritsch & T. Maniatis (1989): Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratories Press; Ed Harlow and David Lanc (1988): Antibiology Ed. (1998), veterinary clinical parasitology, buneido, etc., may be performed according to methods described in literature well known to those skilled in the art. DNA analysis can be performed using software such as MacVector (registered trademark) (Kodak) and GENETYX (Software Development).
[0011]
The DNA of the present invention includes all DNAs encoding the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. In addition, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, it has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and the biological activity of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum It also includes all DNA encoding proteins with activity. Here, a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having the biological activity of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum is described below. It is as follows.
[0012]
Further, the DNA of the present invention is a DNA comprising the nucleotide sequence from position 76 to position 525 of SEQ ID NO: 1 (DNA encoding the 16 kDa antigen of roundworms infected with swine roundworm, that is, Ascaris sumLL2R37 gene) or all nucleotides shown in SEQ ID NO: Includes DNA consisting of sequences. Furthermore, all DNAs that can hybridize under stringent conditions with DNAs that are complementary to these DNAs are also included. Here, the stringent condition is a sequence having 90% or more homology, preferably 95% or more homology, more preferably 97% or more homology with a DNA sequence encoding the 16 kDa antigen of roundworms infected with swine roundworm. It means that hybridization occurs only when present in between. Usually, it means a case where hybridization occurs at a temperature about 5 ° C. to about 30 ° C., preferably about 10 ° C. to about 25 ° C. lower than the melting temperature of the complete hybrid. For stringent conditions, see J.M. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), and the conditions described herein may be used.
[0013]
The protein of the present invention has substantially the same properties as those having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or its similar protein, ie, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, It has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and it is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, with the amino acid sequence of the round worm infection larva 16kDa antigen. It is desirable to have homology. Here, the substantially homogeneous property means that it has the biological activity of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum-infected larvae, and having biological activity has the ability to protect against infection with swine roundworm. It means having.
[0014]
The cDNA encoding the 16 kDa antigen of the roundworm of the swine roundworm infection of the present invention can be obtained by the following method.
[0015]
Adults of Ascaris or Toxocara roundworms can be obtained from roundworm-infected pigs. Immature eggs are obtained from adults, and are described in Douvres and Urban, J Parasitol. 69: 549-558 (1983) and the like, it can be developed into mature eggs containing the third stage larvae (L3), which is the stage of infection, and can be used for the construction of a library of cDNA.
[0016]
From roundworm L3, mRNA (poly (A) RNA) is purified using a commonly used method or a commercially available mRNA isolation kit. For example, roundworm L3 is treated with a guanidine reagent, a phenol reagent or the like to obtain total RNA, and then an affinity column method using poly U-sepharose or the like using oligo dT-cellulose or Sepharose 2B as a carrier, or a batch method. Thus, poly (A) + mRNA can be obtained.
[0017]
Using the mRNA thus obtained as a template, single-stranded cDNA is synthesized using reverse transcriptase, double-stranded DNA is synthesized using DNA polymerase, and incorporated into an appropriate vector. Then, transform E. coli etc. to prepare a cDNA library. cDNA can be incorporated into a vector by an ordinary method using an appropriate restriction enzyme and ligase. For example, the obtained cDNA may be cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site of an appropriate vector DNA, and ligated to a vector. At this time, a cDNA library can be obtained using the vector and host cell described below.
[0018]
The target DNA is selected from the cloned DNA library thus obtained. As a selection method, methods such as an immunoscreening method, a plaque hybridization method, and a colony hybridization method can be used. For example, the obtained clone group is expressed with a inducer such as isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG), transferred to a nylon membrane or cellulose membrane, and an antibody against the target protein or the Immunologically corresponding clones can be selected using serum containing antibodies.
The base sequence of the target cDNA is determined from the thus prepared clone.
[0019]
The determination of the base sequence is carried out by, for example, the Maxam Gilbert method (Maxam, AM and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560, 1977) or the dideoxy method (Messing, J et al. , Nucl. Acids Res., 9, 309, 1981) and the like. It is also possible to determine the sequence using an automatic base sequence analyzer that applies these principles.
[0020]
The obtained target DNA can be amplified by a gene amplification method such as polymerase chain reaction (PCR). PCR can be performed, for example, by the technique described in Protein Nucleic Acid Enzyme “The Forefront of PCR Methods—From Basic Technology to Application—” Vol. 4, No. 5, April 1996 issue, Kyoritsu Publishing. After cloning or amplifying the target DNA, the target DNA is recovered, incorporated into an appropriate expression vector that can be obtained, further transformed into an appropriate host cell, cultured and expressed in an appropriate medium, The target protein can be recovered and purified.
[0021]
As the vector at this time, any vector can be used as long as it can be replicated in a host cell such as a plasmid, a phage, or a virus. Examples thereof include Escherichia coli plasmids such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pKC30, and pCFM536, Bacillus subtilis plasmids such as pUB110, yeast plasmids such as pG-1, YEp13, and YCp50, and phage DNAs such as λgt110 and λZAPII. Examples of vectors for mammalian cells include viral DNA such as baculovirus, vaccinia virus, adenovirus, SV40 and its derivatives. The vector contains a replication origin, a selection marker, and a promoter, and may contain an enhancer, a transcription termination sequence (terminator), a ribosome binding site, a polyadenylation signal, and the like as necessary.
[0022]
Commercially available vectors can be used, such as pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBluescript II KS, ptr99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia), pET-11a (Novagen), eukaryotic ones include pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL, SV40 (Pharmacia) and the like.
[0023]
As an origin of replication, E. coli vectors, for example, those derived from ColiE1, R factor, F factor, yeast vectors, for example, 2 μm DNA, ARS1, derived from mammalian cell vectors, for example, SV40, Those derived from adenovirus and bovine papilloma virus can be used. In addition, as a promoter, adenovirus or SV40 promoter, E. coli lac or trp promoter, phage lambda P_LPromoters, ADH, PHO5, GPD, PGK, AOX1 promoters for yeast, nuclear polyhedrosis virus-derived promoters for sputum cells, and the like can be used.
[0024]
As selection markers, vectors for Escherichia coli include kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, tetracycline resistance gene, etc., yeast vectors include Leu2, Trp1, Ura3 gene, etc., and mammalian cells include neomycin resistance gene, thymidine kinase. Gene, dihydrofolate reductase gene and the like.
[0025]
DNA can be introduced into the vector by any method. The vector preferably contains a polylinker with various restriction sites therein or contains a single restriction site. A specific restriction site in the vector can be cleaved with a specific restriction enzyme, and DNA can be inserted into the cleavage site. An expression vector containing the DNA and regulatory sequences of the present invention can be used for transformation of an appropriate host cell to allow the host cell to express and produce the roundworm infected larva 16 kDa antigen of the present invention.
[0026]
Examples of host cells include bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, fungal cells such as Aspergillus strains, yeast cells such as baker's yeast and methanol-utilizing yeast, insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9, CHO, Examples include mammalian cells such as COS, BHK, 3T3, and C127.
[0027]
Transformation can be performed by known methods such as calcium chloride, calcium phosphate, DEAE-dextran mediated transfection, electroporation and the like.
[0028]
The obtained recombinant protein can be separated and purified by various separation and purification methods. For example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be used alone or in appropriate combination. In this case, when the expression product is expressed as a fusion protein with GST or the like, it can be purified using the properties of the protein or peptide fused with the target protein. For example, when expressed as a fusion protein with an amino acid sequence of 6 or more histidines, a so-called histidine tag, the protein having the histidine tag binds to the chelate column and can be purified using the chelate column. When expressed as a fusion protein with GST, GST has an affinity for glutathione and can therefore be efficiently purified by affinity chromatography using a column in which glutathione is bound to a carrier.
[0029]
Antibodies against the 16 kDa antigen of roundworms infected with swine roundworm can be prepared as follows.
[0030]
The 16 kDa antigen is used as an antigen in accordance with a method well known to those skilled in the art, for example, by inoculating multiple times subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, and intravenously in animals such as mice, guinea pigs, rabbits, goats, etc. From which blood is collected and serum is separated to produce anti-roundworm-infected larva 16 kDa antigen antibodies. At this time, an appropriate adjuvant can also be used. Monoclonal antibodies can also be produced by known methods. For example, a hybridoma obtained by cell fusion of a spleen cell of a mouse immunized with a 16 kDa antigen of a roundworm infected with swine roundworm and a myeloma cell of a mouse is prepared, and the culture supernatant of the hybridoma or the mouse administered with the hybridoma intraperitoneally is prepared. It can be prepared from ascites. The 16 kDa antigen of the roundworm infected with swine roundworm used as an immunizing antigen may be a natural protein, a recombinant protein extracted from swine roundworm, or a chemically synthesized one. Further, it may be a protein having the entire amino acid sequence, or a peptide fragment having a partial structure of the protein or a fusion protein with another protein. The peptide fragment may be a fragment obtained by degrading the protein with an appropriate proteolytic enzyme, or may be a product obtained by incorporating a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 into an expression vector. The fusion protein can be produced by linking a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 with a gene encoding another protein and incorporating it into an expression vector for expression, or the polypeptide fragment can be produced by a suitable carrier protein. It can also be used after being bonded with a chemical bond. The reactivity of the obtained antibody can be measured by methods well known to those skilled in the art, such as enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), and Western blotting.
[0031]
The 16 kDa antigen of swine roundworm-infected larvae can be used as a vaccine for preventing roundworm infection.
The 16 kDa antigen protein of Ascaris swine infection larva used as a vaccine may be a natural protein, a recombinant protein extracted from swine ascaris, or a chemically synthesized protein. Further, it may be a protein having the entire amino acid sequence, or a peptide fragment having a partial structure of the protein or a fusion protein with another protein. In the case of a fragment, it is necessary that the fragment contains an epitope (neutralizing epitope) recognized by an antibody that protects against roundworm infection (neutralizing antibody). The peptide fragment may be a fragment obtained by degrading the protein with an appropriate proteolytic enzyme, or may be a product obtained by incorporating a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 into an expression vector.
[0032]
The vaccine can be one or several adjuvants, such as Freund's complete or incomplete adjuvant, cholera toxin, heat-labile E. coli toxin, aluminum hydroxide, potassium alum, saponin or derivatives thereof, muramyl dipeptide, mineral oil or vegetable oil, NAGO , Novasome or nonionic block copolymers, DEAE dextran and the like. Further, it may contain a pharmaceutically acceptable carrier. A pharmaceutically acceptable carrier is understood to be a compound that does not adversely affect the health of the animal being vaccinated (ie, at least not significantly adversely affected by the disease if the animal is not vaccinated). Is done. The pharmaceutically acceptable carrier can be, for example, sterile water or a sterile physiological salt solution. In the case of more complex forms, the carrier can be, for example, a buffer.
[0033]
The vaccine of the present invention can be administered by a normal active immunization method, and can be a systemic vaccine administered by injection or a mucosal-derived vaccine administered by oral administration or the like without injection. That is, administered in a prophylactically effective amount (ie, an immunizing antigen capable of expressing an antigen that induces immunity in an animal against attack by roundworms) by single or repeated administration in a manner appropriate to the dosage form be able to. The vaccine can be administered intradermally, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, orally or intranasally. Also, the vaccine of the present invention can be effectively mixed with other antigen components of the same and / or other parasites.
[0034]
The dose and frequency of administration of the vaccine may vary depending on the target animal. For example, the animal can be administered several times at a frequency of once a week to several weeks with a vaccine containing several tens of μg of the roundworm infected larvae 16 kDa of the present invention. Can induce protective immunity.
[0035]
Furthermore, the present invention relates to inhibitors against the 16 kDa antigen of isolated roundworms of swine roundworm infection. The term relating to the inhibitor against the 16 kDa antigen protein of the isolated swine roundworm-infected larva includes natural products or those obtained from nucleic acid technology or chemical synthesis.
[0036]
The present invention also includes such proteins, nucleic acids, antibodies, inhibitors as therapeutic compounds for the treatment of animals, and applications thereof.
The 16 kDa antigen protein and nucleic acid of the roundworm infected larvae of the present invention can also be used as a novel target for a parasitic vaccine or an antiparasitic agent.
[0037]
【Example】
The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0038]
Example 1 Separation and determination of 16 kDa antigen base sequence of roundworms infected with swine roundworm in the present invention
Hog roundworm A. The adults of Sum are A. at the Shimotsuma branch of Ibaraki slaughterhouse. It was collected from a suum-infected pig. Immature eggs obtained from adults are described in Douvres and Urban, J Parasitol. 69: 549-558. (1983) et al. Were used to develop the mature egg containing L3 at the infection stage and subjected to the following operations. The gene coding for the 16 kDa antigen of roundworms infected with swine roundworm was obtained by A. Isolated from a sum L3 cDNA library. The cDNA library used was prepared by the method recommended by the manufacturer using λZapII vector (Stratagene). The serum used was A. It was the serum of a rabbit infected four times with suum L3 (Kasuga et al., Parasitology 121: 671-677. (2000)).
The phage used was E. coli. Infected with Coli XL-1Blue and 5 × 10 5 in a petri dish (diameter 150 mm)⁴And cultured at 37 ° C. for 4 hours. After the appearance of the plaque, the surface layer of the medium was covered with a nitrocellulose membrane soaked with isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), and further cultured for 3 hours. The nitrocellulose membrane removed from the culture dish was washed with 0.02% Tween-added Tris-HCl (TBST), and further blocked with 5% added TBST for 1 hour at room temperature. Nitrocellulose membranes were prepared from A.I. After reacting with a serum of Sum L3 infected rabbit for 3 hours at room temperature, thoroughly washed with TBST and then reacted with alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit IgG goat serum for 1 hour. Detected using tetrazolium (NBT / BCIP). For the detected clone, the above screening was further repeated, and a positive clone was isolated. The isolated phage is ExAssist ™ helper phage and E. coli. In vivo excitation of the DNA was performed according to the manufacturer's recommended method using Coli SOLR ™.
[0039]
Recombinant plasmid DNA (L2R37) prepared by the alkaline lysis method is reacted according to the method recommended by the manufacturer using the Dye-terminator Sequencing method (Applied Biosystems Technical Manual) using M13 Reverse and Forward primer (Applied Biosystems). The reaction product was analyzed using DNA sequencer Model 370A (version 1.30, Applied Biosystems), and the nucleotide sequence was determined. L2R37 is composed of 615 bases, and 5 ′ has an untranslated region followed by a stop codon at position 526 of the ATG at position 526, followed by polyadenylation present in eukaryotes. confirmed. The protein deduced from the base sequence was composed of 150 amino acid residues, of which an 18-residue eukaryotic signal sequence was confirmed in the N-terminal region. The estimated molecular weight of all amino acids was 16,424 Da and the isoelectric point was 5.23, whereas the expected molecular weight of the mature protein in the insect body excluding the signal sequence was 14,420 Da, the isoelectric point Was 4.91. The nucleotide sequence of the DNA is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The coding region was from position 76 to position 525. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. From the homology search with the amino acid database, the deduced amino acid structure shown in the present invention is approximately 50% similar to the gene product of Caenorhabditis elegans, an antigenic molecule of filaria which is a pathogen of elephant dermatosis or one of soil nematodes. Showed sex. However, no protein was found that showed similarity to proteins that have been identified in mammals such as humans and mice on the current GenBank ™ database. This suggests that the protein encoded by the isolated gene is unique to nematodes.
[0040]
Example 2 Isolation and amplification of the 16 kDa antigen cDNA of Ascaris elegans infection for the construction of a vector expressing recombinant protein and production of recombinant molecules and cells
A. synthesized by the above method. SUMU L3 cDNA sense primer (5′-CCG AGC TCG AGA ATG AAG TAT CTC ATC ACA GTT ACT TGC-3 ′; CTCGAG is XhoI site; SEQ ID NO: 3) and antisense primer (5′-CCG AAT TCT CATCTA CCG GCC AGC GAT TGC CTT-3 ′; G AAT TC was amplified by PCR reaction using EcoRI site; SEQ ID NO: 4).
[0041]
PCR reaction was performed using 50 μl of reaction solution [1 ng A. sumL3 cDNA, 1 μM sense and 1 μM antisense primer, 10 mM Tris-HCL (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 2.5 U AmpliTaq DNA polymerase (Promega)] and using DNA Thermal Cycler (PerkinElmer) for 30 seconds at 95 ° C., 30 seconds at 55 ° C., and 2 minutes at 72 ° C. Was performed in 35 cycles. The amplified PCR product was subjected to gel electrophoresis, the amplified DNA fragment was recovered in distilled water using a DNA purification kit (Qiagen), and the recovered solution was enzymatically treated with restriction enzymes XhoI and KpnI for 3 hours. The plasmid expression vector pTrcHis expression vector (Invitrogen) was treated with restriction enzymes XhoI and KpnI for 3 hours in the same manner as the inserted fragment. The DNA fragment was inserted into the restriction fragment-treated insert fragment and vector using the DNA ligation kit (Takara Shuzo) according to the manufacturer's recommended method, transformed using Escherichia coli Top10, plated on an L-amp plate, and white colonies. Were selected from the clones in which the 16 kDa antigen-coding region of the roundworm infected with swine roundworm was inserted.
[0042]
Example 3 Production of 16 kDa antigen of Ascaris elegans in E. coli and properties of the produced protein
The transformed Escherichia coli is cultured in an SOB solution containing ampicillin at 37 ° C., and the OD of the SOB solution is then cultured.₆₀₀When reaching 0.5, 1 mM IPTG was added, and the culture was further continued for 4 hours. Changes in protein production over time were analyzed by electrophoresis on a 12.5% SDS-polyacrylamide gel {Laemmli, et al. , Nature 227: 680-685 (1970)}, and confirmed by Coomassie staining. As a result, the production of recombinant protein was observed around 22 kDa. Similarly, the electrophoresis gel was transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham). After the transfer, the membrane was blocked with 5% skim milk for 30 minutes, and then reacted with alkaline phosphatase-labeled T7 monoclonal antibody (Novagen) diluted 10,000 times with TBS for 1 hour. After washing with TBST, the bound protein was visualized using the substrate NBT / BCIP (Gibco BRL). As a result, it was found that this Western blot analysis reacted with the recombinant protein confirmed at around 22 kDa, and the recombinant protein (His)₆Was confirmed to be added (FIG. 1). In FIG. 1, lane 1 shows the E. coli lysate before expression, lane 2 shows the E. coli lysate after expression, and lane 3 shows the purified 16 kDa recombinant antigen protein of the roundworm infected with swine roundworm.
[0043]
Example 4 Purification of the 16 kDa antigen of roundworms infected with swine roundworm from Escherichia coli and production of antibodies against the 16 kDa antigen recombinant protein of purified roundworms infected with swine roundworm
The 16 kDa antigen recombinant protein of swine roundworm larvae was purified by metal chelate chromatography (Invitrogen) by the manufacturer's recommended imidazole elution method (Tsuji et al., Mol Biochem Parasitol 97: 69-79 (1998)). ). The eluted protein was concentrated using Centrisart I (Sartorius, cut off 10,000 MW), and dialyzed in phosphate buffered saline using Slide-A-Lyser (trademark) Dialysis Casette (Pierce). Went. The purified porcine roundworm infection larva antigen recombinant protein was used for the following antibody production, reactivity of pig roundworm immune sera of various animals, and examination of an attack test using pig roundworm infection larvae.
[0044]
A polyclonal antibody against the 16 kDa antigen recombinant protein of roundworm infected with swine roundworm was prepared as follows using a mouse {Tsuji et al. , Mol Biochem Parasitol 97: 69-79, (1998)}. 50 μg of 16 kDa antigen recombinant protein of Ascaris mori larvae was transferred to TiterMax Gold ™(Sintex) was inoculated subcutaneously and 4 weeks later, the same amount was inoculated again. Two weeks after the re-administration, blood was collected, and the serum was stored at -20 ° C. Western blot analysis using the 16 kDa antigen recombinant protein of roundworms infected with swine roundworm confirmed that the produced 16 kDa recombinant protein mouse immune serum reacted strongly with the recombinant protein around 22 kDa.
[0045]
Example 5 A. Recombinant Protein of 16 kDa Antigen Recombinant Protein of Porcine Ascaris Infected Larvae Reactivity with suum L3 immune serum
The reactivity of the 16 kDa recombinant protein prepared in Example 4 with the rabbit, mouse, and porcine roundworm immune sera was examined using SDS-PAGE / Western blotting. The 16 kDa antigen recombinant protein separated by SDS-PAGE (Laemmli, et al., Nature 227: 680-685 (1970)) was transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham) according to a standard method. After transfer, the membrane was blocked with 5% skim milk for 30 minutes and then reacted with rabbit, mouse and pig immune serum diluted 500-fold with TBS for 1 hour. After washing the transfer membrane with TBST, in order to detect proteins bound to immune sera, it was reacted with alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit, mouse and pig-IgG antibodies (Cappel) for 1 hour, and the bound proteins were treated with the substrate NBT. / BCIP (Gibco BRL) was used for visualization. As a result, all immune sera positively reacted with the 22 kDa antigen recombinant protein, confirming the antigenicity of the 16 kDa recombinant protein.
[0046]
Example 6 Properties of 16 kDa antigens of native (natural) swine roundworm infected larvae by immunoblotting and properties of 16 kDa antigen-like molecules of swine roundworm infected larvae in human roundworms and dog roundworms
SDS-PAGE / Western blotting of the 16 kDa antigen protein extract of roundworm infected with swine roundworm was performed using the 16 kDa antigen recombinant protein immune serum of roundworm infected with mouse swine roundworm prepared in Example 4. After separation by SDS-PAGE (Laemmli, et al., Nature 227: 680-685 (1970)), the resultant was transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham) according to a conventional method. After the transfer, the membrane was blocked with 5% skim milk for 30 minutes, and then reacted with 16 kDa antigen recombinant protein immune serum of mouse swine roundworm infected larva diluted 1,000 times with TBS for 1 hour. After washing with TBST, in order to detect a protein bound to immune serum, it was reacted with an alkaline phosphatase-labeled anti-mouse-IgG antibody (Kappel) for 1 hour, and the bound protein was reacted with the substrate NBT / BCIP (Gibco BRL). ) And visualized. As a result, a single band of about 16 kDa that reacts with mouse serum was confirmed. The 16 kDa antigen of natural swine roundworm infected larvae in the sumlL3 extracted protein solution could be identified. Based on this result, 16 kDa used in the title of the present invention is the molecular weight of the mature antigen of swine roundworm encoded by L2R37. Furthermore, when the above method was performed using roundworm extract protein, a positive reaction was confirmed at the same size of 16 kDa as in the case of roundworm extract protein. However, a positive reaction was not confirmed with the roundworm extract protein. It was shown that the 16 kDa antigen detected from these things is a molecule which exists in common in pigs and roundworms (FIG. 2). In FIG. 2, lane 1 shows human roundworm, lane 2 shows dog roundworm, lane 3 shows swine roundworm, lane 4 shows roundworm-infected larva 16kDa recombinant antigen protein.
[0047]
Example 7 A. in a mouse immunized with 16 kDa antigen recombinant protein of roundworm infected with swine roundworm suuml3 attack test
Twenty mice were divided into 4 groups (5 mice / 1 group), and 16 kDa antigen recombinant protein immunization group, adjuvant control group, infection resistant group and untreated group of swine roundworm infected larvae were constituted respectively. First round mice infected with 16 kDa antigen recombinant protein immunized group of swine roundworm infected larvae were subcutaneously inoculated with 50 μg of 16 kDa antigen recombinant protein of swine roundworm infected larvae together with Freud's complete adjuvant (Difco) 4 weeks and 6 weeks later Later, 16 kDa antigen recombinant protein was inoculated subcutaneously with Freund's incomplete adjuvant and immunized three times in total. The adjuvant control group was inoculated subcutaneously on the same day as the day of immunization with the adjuvant used in the 16 kDa antigen recombinant protein immunization group of roundworms infected with swine roundworm. The infection resistance group is A. It was prepared by frequent infection with sumL3. That is, the first 2,000 mature eggs containing L3 in the infection stage were orally administered for the first time, and then 4,000 eggs were administered at the 4th and 6th weeks. A. To experimental group mice. The challenge of sumL3 was performed by orally administering 5,000 mature eggs one week after the final immunization and oral administration. On the 7th day after infection, the lungs were taken out, the lungs were taken out, the larvae in the lung tissue were released in PBS to which antibiotics were added by the Berman method, and the number of larvae was counted under a microscope. Numerical values are shown as mean ± standard deviation. The effect of infection protection was determined by increasing or decreasing the number of larvae compared to the untreated group.
[0048]
In the untreated group, 253.5 ± 41.5 animals, in the adjuvant control group, 275.5 ± 108.1 animals, against which the 16 kDa antigen recombinant protein of swine roundworm infected larvae was 124 in the immunized group. 8 ± 95.3. In addition, specific antibodies of the 16 kDa antigen recombinant protein of roundworms infected with swine worms were measured by immunoblotting using mouse serum of each group. In the immunized group, a strong positive reaction was confirmed at a dilution ratio of 1,600 times or 3,200 times in the immunized group of the 16 kDa antigen recombinant protein of roundworms infected with swine roundworm. No positive reaction was confirmed in either the untreated group or the adjuvant control group. That is, by immunization of the 16 kDa antigen recombinant protein of roundworms infected with swine roundworm, A. S. larvae recovery rate was significantly reduced. Induction of protective immunity by 16 kDa antigen recombinant protein of roundworms infected with swine roundworm against sumL3 was confirmed. In addition, A. A. SumumL3-infected mice The protective immunity induction of the suml3 challenge was proved by the fact that the number of larvae recovered from the lung was zero in the challenge test of the infection-resistant group established this time.
[0049]
Example 8 Infection protection ability of 16 kDa antigen recombinant protein of roundworms infected with swine roundworm by nasal immunization
In Example 7, a 16 kDa antigen-recombinant protein-immunized mouse of Ascaris porcine infection larva prepared by a immunization method widely used in the laboratory was used for A. Induction of protective immunity against sumlL3 infection was confirmed. Therefore, in order to further reduce the burden of invasion to animals by administration of vaccine and to save labor in administration, the ability to induce protective immunity of 16 kDa antigen recombinant protein of swine roundworm infected larvae by nasal administration was examined. As an adjuvant, cholera toxin B subunit (CTB, C-9903, Sigma) was used.
[0050]
Fifteen mice were divided into 3 groups (5 mice / 1 group), and 16 kDa antigen recombinant protein + CTB immunized group, CTB immunized control group, and untreated group of swine roundworm-infected larvae were constructed. For the first time, mice with 16 kDa antigen recombinant protein + CTB immunized group of swine roundworm infected larvae were administered a mixture of 50 μg of 16 kDa antigen recombinant protein of swine roundworm infected larvae and 25 μg CTB in the nasal cavity using a microcapillary round chip, Four weeks and six weeks later, the same administration was carried out for a total of three immunizations. In the CTB immunized control group, CTB used in the 16 kDa antigen recombinant protein immunized group of roundworms infected with swine roundworm was administered nasally on the same day as the immunization day.
A. To experimental group mice. The challenge of sumL3 was performed by orally administering 5,000 mature eggs one week after the final immunization and oral administration. After infection, the animals were euthanized on the 7th day, the lungs were taken out, the larvae in the lung tissue were released in PBS to which antibiotics were added by the Belleman method, and the number of larvae was counted under a microscope. The number of collected larvae was expressed as an average value ± standard deviation. The effect of infection protection was determined by increasing or decreasing the number of larvae compared to the untreated group. Moreover, the specific antibody with respect to 16 kDa antigen recombination protein of the roundworm of the swine roundworm infected by ELISA was measured using the mouse | mouth serum of each group. That is, each well of a polystyrene microplate (AE1640, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) was coated with a 16 kDa antigen recombinant protein of swine roundworm infected larvae adjusted to 2 μg / ml using 0.1 M carbonate buffer pH 9.6. The plate was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours, and then washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween (PBST). Each well was blocked with PBS supplemented with 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma) for 1 hour at 37 ° C. After washing 5 times with PBST, serially diluted serum was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, horseradish peroxidase (HRP) -conjugated anti-mouse IgG (Betchel), which was washed 5 times with PBST and adjusted to 1: 10,000, was added to the well and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, the plate was washed 5 times with PBST, and 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) substrate solution (ABTS, KPL) was added to cause color development at 37 ° C. The reaction was stopped by adding 1% SDS. Color measurement is performed using a microplate reader (SPECTRAFLUOR, Wako)₄₀₅Measured with Antibody titer is reciprocal log at the highest dilution₂Indicated by titer. As a result, in the untreated group, 173.4 ± 49.6 animals. In the CTB immunized control group, the number was 200.8 ± 52.8. On the other hand, in the immunized group of 16 kDa antigen recombinant protein + CTB of roundworm infected with pig roundworm, the number was 76.4 ± 25.6. As a result, a specific IgG antibody titer of 19.0 ± 0.70 against the 16 kDa antigen recombinant protein was confirmed in the immunization group of 16 kDa antigen recombinant protein + CTB of roundworm infected with pig roundworm. The antibody titer was <6 in both the untreated group and the CTB immunized control group. That is, by nasal mucosal immunization of the 16 kDa antigen recombinant protein of roundworm infected with swine roundworm, S. larvae recovery rate was significantly reduced. Induction of protective immunity by a 16 kDa antigen recombinant protein of Ascaris elegans against sumL3 infection was confirmed.
[0051]
【The invention's effect】
According to the present invention, a gene comprising a DNA encoding a 16 kDa antigen protein of Ascaris suum-infected larvae, a vector and a recombinant cell containing the DNA, a 16 kDa antigen protein of Ascaris suum-infected larvae, the antigen And systemic and mucosal-derived vaccines for the protection of roundworm infections containing the antigen, and the synthesis of compounds to protect livestock and humans from parasitic infection and parasitic infection Allows control of common parasitic infections.
[0052]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 shows the results of electrophoresis of a 16 kDa antigen of roundworms infected with swine roundworm.
FIG. 2 is a diagram showing the results of 16 kDa-related antigens of swine roundworm-infected larvae and 16 kDa antigens of native swine roundworm-infected larvae in human roundworms by immunoblotting.

Claims

A DNA encoding a 16 kDa antigen protein of Ascaris suum shown in (a) or (b) below.
(A) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(B) Biology of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing Protein with active activity.

The DNA according to claim 1, which is the DNA shown in the following (c) or (d).
(C) DNA comprising a base sequence from positions 76 to 525 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(D) a 16 kDa antigen of Ascaris suum that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence from positions 76 to 525 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing DNA encoding a protein having the biological activity of the protein.

The protein shown in the following (a) or (b).
(A) A protein having the amino acid sequence of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum represented by SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
(B) the amino acid sequence of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and A protein having the biological activity of the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum.

A recombinant molecule comprising the DNA according to claim 1 or 2.

A vector comprising the DNA according to claim 1 or 2.

A recombinant cell comprising the vector according to claim 5.

A recombinant cell according to claim 6 is cultured, and a 16 kDa antigen protein of Ascaris suum is collected from the culture, thereby producing a 16 kDa antigen protein of Ascaris suum. Method.

An antibody that recognizes the 16 kDa antigen protein of Ascaris suum according to claim 3.

The antibody according to claim 8, which is a monoclonal antibody.

A systemic and mucosal-derived vaccine for protection against roundworm infection comprising the Ascaris suum 16 kDa antigen protein according to claim 3.