JP4040372B2

JP4040372B2 - Nucleic acid chip and nucleic acid chip analysis method

Info

Publication number: JP4040372B2
Application number: JP2002191390A
Authority: JP
Inventors: 博光高瀬; 浩行橋本; 尚志岡本
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2022-06-28
Also published as: JP2004037122A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基板上にマトリクス状に配置された核酸プローブ、言謂、核酸チップ、ならびに核酸チップを構成する核酸の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップ等、各種の核酸プローブ分子を基板上にマトリクス状に配置したもの、所謂、核酸チップは、ゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの目的に利用されるようななってきた。また、それら核酸チップを利用した解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
【０００３】
核酸チップの作製方法には、幾つかの手法が知られている。ＤＮＡチップを例にとって説明すると、フォトリソグラフィーを用いて、直接基板上にＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第５４０５７８３公報等）、あるいは、予め合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を、基板上に供給し結合する方法（米国特許第５６０１９８０公報、特開平１１−１８７９００号公報、ＳｃｉｅｎｃｅＶｏｌ．２７０，４６７，１９９５等）が代表的なＤＮＡチップの作製法である。
【０００４】
一般的には、前記二種の方法によって核酸チップは作製されるが、作製された核酸チップを先に述べた用途に使用しようとする場合、解析の信頼性、すなわち、定量性、再現性を保証するためには、各マトリクスに存在するプローブ、すなわち、プローブに利用する核酸の量、つまり、密度を知ることが重要である。また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するかを知ること（イメージング）も、やはり、定量性、再現性の確保といった見地から重要である。
【０００５】
しかし、核酸チップ上の核酸プローブは、原理的には単分子膜レベルとされており、基本的に、マトリクス位置の顕影化を含めた核酸プローブの分析には、きわめて高感度な表面解析技術が必要となる。
【０００６】
前記の要件を満足する高感度な表面解析技術の一つとして、プローブ自体にアイソトープラベルを施す方法が知られてはいるが、ラベル化の手法が煩雑であり、利用されるアイソトープラベル自体、被爆源となる危険性を有し、そのため、特殊な施設、装置が必要等の理由で、汎用性の観点で難点を有している。
【０００７】
別の方法として、プローブを蛍光標識する方法、または、プローブと特異的に結合する物質に蛍光標識を施し、これとプローブを結合させる方法、すなわち、DNAチップにおいては、蛍光ハイブリダイゼーション法が考えられる。しかしながら、標識に利用する蛍光色素の安定性、蛍光クエンチング、あるいは、蛍光色素の基板表面への非特異的吸着、さらには、特異的結合（ハイブリダイゼーション）の定量性（安定性、再現性）等、高い定量性を達成する上では、種々の問題が存在しており、プローブ自体の存在量を定量的に把握するには、なお課題が残る。
【０００８】
その他、一般的な検出対象に利用可能な高感度表面分析手段として、ＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光）法を用いたＡＴＲ法、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）法等があるが、いずれも、生体関連物質である、核酸チップの核酸プローブ自体の定量的分析、あるいは、イメージングには十分な感度を有しているとはいえない。特に、核酸チップの作製用基板として、一般的なガラスを用いる場合には、例えば、ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）法では、基板のガラス自体に起因する吸収の影響、また、ＸＰＳ法では、ガラス自体は絶縁性材料であるため、チャージアップの影響等があり、有効な分析手段とはいえない。
【０００９】
また、生体関連物質に利用可能な、別の高感度表面分析手段として、レーザー共鳴イオン化法（ＲＩＳ：ＲｅｓｏｎａｎｃｅＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によるＤＮＡの検出方法が、米国特許第５８２１０６０公報に開示されている。この方法では、試料表面から放出される注目元素のイオン化エネルギーに相当する波長のレーザービームを照射して、当該元素をイオン化し検出するものである。その際、試料表面から元素を放出させる手段としては、レーザービームを用いる方式、イオンを用いる方式が開示されているが、特定元素の検出しかできないという技術的な制約を持つ。
【００１０】
さらに、他の高感度表面分析手段としては、動的二次イオン質量分析法（ｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ）があるが、この手法では、二次イオンを生成する過程で、有機化合物を小さいフラグメントイオン、または粒子にまで分解している。そのため、質量スペクトルから得られる化学構造情報は多くなく、例えば、構成する塩基は共通した四種しかない核酸関連物質のような有機物の分析には、得られる情報は不十分であり、汎用的に利用するには適していない。
【００１１】
これに対して、同じく二次イオン質量分析法の一手法として知られている、飛行時間型二次イオン質量分析（TOF−SIMS）法は、固体試料の最表面にどのような原子または分子が存在するかを調べるための分析方法であり、下記する特長を持つ。すなわち、１０⁹ａｔｏｍｓ／ｃｍ²（最表面１原子層の１／１０⁵に相当する量）の極微量成分の検出能があること、有機物、無機物のどちらにも適用できること、表面に存在するすべての元素や化合物を測定できること、試料表面に存在する物質からの二次イオンのイメージングが可能なことである。
【００１２】
以下に、この飛行時間型二次イオン質量分析法の原理を簡単に説明する。
【００１３】
高真空中において、高速のイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射すると、スパッタリング現象によって表面の構成成分が真空中に放出される。この過程で発生する正または負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を、電場によって一方向に収束し、一定距離だけ離れた位置で検出する。スパッタの際には、試料表面の組成に応じて、様々な質量をもった二次イオンが発生するが、一定の電界中では、質量の軽いイオンほど早く、反対に重いイオンほど遅い速度で飛行する。そのため、二次イオンが発生してから、検出器に到達するまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。
【００１４】
一方、ｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ法では、既に述べたように、イオン化の際、有機化合物は小さいフラグメントイオンまたは粒子にまで分解してしまうため、質量スペクトルから得られる化学構造情報、例えば、質量範囲は限定されるのに対し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では、一次イオン照射量が著しく少ないため、有機化合物は化学構造を保った状態でイオン化され、幅の広い質量範囲で測定される質量スペクトルから有機化合物の構造をより直接的に知ることができる。加えて、固体試料表面の最も外側で発生した二次イオンのみが、真空中へ放出されるので、試料の最表面（深さ数Å程度）の情報を、選択的に得ることができる。
【００１５】
また、試料が絶縁物の場合には、一次イオンの照射、ならびに、二次イオンの発生に伴い、絶縁性固体表面に正の電荷が蓄積する。この蓄積電荷による電界の影響を除去するため、一次イオンをパルス的に照射し、そのパルスの間隙に、電子線をパルス照射することにより、蓄積電荷を中和する手法が採用されている。そのため、絶縁物についても、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による分析を行うことが可能である。加えて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法では、一次イオンビームを走査しつつ、二次イオンの分析を行うことによって、試料表面の二次イオン像（二次元的なマッピング）を測定することもできる。
【００１６】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により、基板に固定した単分子膜レベルの核酸を検出した例は、既に報告があり（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅ１２^th ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＳｅｃｏｎｄａｒｙＩｏｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ９５１，１９９９）、この例では、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法で検出可能な核酸由来のフラグメントイオンとして、塩基の分解フラグメントイオン、および、リン酸バックボーンの分解フラグメントイオンがあげられている。
【００１７】
また、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いた定量分析の試みとしては、異なる濃度の標準溶液を清浄なシリコン基板上に塗布、乾燥後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法でこの標準試料を測定し、二次イオンピーク強度から検量線を作成した上で、被分析試料の二次イオンピーク強度と比較する方法（Ｃ．Ｍ．Ｊｏｈｎｅｔａｌ．，ＳＩＭＳ VIII，ｐ６５７，ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，１９９２）や、シリコン基板上に微量金属元素をスピンコートした全反射蛍光Ｘ線分析用の標準試料を用いる方法（Ｐ．Ｌａｚｚｅｒｉｅｔａｌ．，ＳｕｒｆａｃｅａｎｄＩｎｔｅｒｆａｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．２９，７９８（２０００））などが知られている。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により定量分析をする上では、以下のような問題点があった。すなわち、検出される２次イオン強度は、その測定条件、具体的には、１次イオンの照射条件（加速エネルギー、入射角、イオン種、照射量）、２次イオンの検出条件（エネルギー幅）、加えて、試料が絶縁体の場合には、帯電補正のためにパルス照射される電子線に因る脱離、また、帯電中和の程度などに依って、相違するという問題があった。
【００１９】
特に、試料が絶縁体の場合には、標準試料と被測定試料とでは、１次イオンを照射した際の帯電状況は必ずしも同じとは限らない。そのため、試料を替えるごとに、高い定量性を達成する上では、厳密に測定条件を最適化する必要があり、最適化が不十分の場合には測定結果の精度が失われることとなる。また、検量線の作成は、測定対象となる濃度の水準数だけ、標準試料を必要とするため、煩わしい作業を伴っていた。
【００２０】
また、核酸チップの標準試料を、Ｐ．Ｌａｚｚｅｒｉらが報告したようなスピンコート法で作製する場合、広い面積で平均すると、その濃度の再現性はよく、塗布形成がなされているものの、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法のスポットサイズの測定領域、具体的には、数１０μｍ²から数１００μｍ²の微少な領域毎では、塗布面内の均一性が十分とはいえず、測定結果の信頼性に大きな問題を与えていた。
【００２１】
本発明は、前記の課題をが解決するもので、本発明の目的は、複数の核酸関連物質が基板上にマトリクス状に配置された、所謂、核酸チップのプローブを構成する核酸関連物質を、飛行時間型２次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法により分析する上、高い定量性を達成可能な、核酸チップの分析方法と、かかる分析方法を利用することで、核酸チップ上に配置される核酸プローブ・ドットに存在する核酸の量すなわち、形成密度（プローブ・ドットあたりの核酸の量）を簡便に決定することが可能な形態とされた核酸チップを提供することである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意検討を進めたところ、核酸チップ上に配置される、形成密度は判明していない核酸プローブ・ドットに加えて、基板表面の一部に、前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを設け、前記濃度基準用の核酸プローブ・ドットに対して、２次イオン質量分析を行った際に検出される２次イオンの信号強度を基準として、基板上に配置される、未知濃度の核酸プローブ・ドットの核酸濃度を、２次イオン質量分析法によって決定することが可能であり、また、その定量性は優れた再現性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２３】
すなわち、本発明にかかる核酸チップは、
複数の核酸関連物質からなる核酸プローブ・ドットが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップであって、
前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、
前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを具えていることを特徴とする核酸チップである。その際、前記濃度基準用の核酸プローブ・ドットとして、
複数段階の平均的な核酸密度を有する、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、複数種の核酸プローブ・ドットを具えていることが好ましい。また、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、核酸プローブ・ドットは、
別途に、該ドット当たりの平均的な核酸密度を、化学分析により決定されていることが望ましい。例えば、前記化学分析手段として、
誘導結合プラズマ質量分析法（ＩｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙＣｏｕｐｌｅｄＰｌａｓｍａＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下ＩＣＰ−ＭＳと略す）による分析を用いて、該ドット当たりの平均的な核酸密度を決定することが可能である。
【００２４】
また、本発明にかかる核酸チップでは、前記核酸プローブは、一本鎖核酸で構成されていることが好ましい。その際、前記核酸プローブは、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）のいずれかから構成されている一本鎖であることできる。
【００２５】
さらには、本発明にかかる核酸チップでは、
一本鎖核酸で構成される前記核酸プローブと、該核酸プローブに対するハイブリダイゼーションにより導入された標的核酸の両者が、その基板上に配置されていることもできる。
【００２６】
対応して、本発明にかかる核酸チップの分析方法は、
複数の核酸関連物質からなる核酸プローブ・ドットが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップの分析方法であって、
前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、
前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを設け、
前記濃度基準用の核酸プローブ・ドットとして、
複数段階の平均的な核酸密度を有する、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、複数種の核酸プローブ・ドットを具え、
前記複数段階の平均的な核酸密度を有する、複数種の核酸プローブ・ドットに対して、２次イオン質量分析を行った際に検出される２次イオンの信号強度に基づいて作成される検量線を用いて、
基板上に配置される、未知濃度の核酸プローブ・ドットの核酸濃度を、２次イオン質量分析法によって決定することを特徴とする核酸チップの分析方法である。その際、前記２次イオン質量分析として、飛行時間型２次イオン質量分析法を用いることが好ましい。
【００２７】
また、前記２次イオン質量分析において検出される２次イオン強度は、
１次イオンのドーズ量を、１×１０¹⁴／ｃｍ²以下に選択される一定値とした際、１次イオンの照射される一定の面積から放出される、前記核酸プローブに由来する特定の２次イオンの積分強度（カウント数）であることができる。さらには、前記２次イオン質量分析において検出される２次イオン強度は、
１次イオンのドーズ量を、１×１０¹²／ｃｍ²以下に選択される一定値とした際、１次イオンの照射される一定の面積から放出される、前記核酸プローブに由来する特定の２次イオンの積分強度（カウント数）であることもできる。
【００２８】
本発明にかかる核酸チップの分析方法においては、
前記２次イオン質量分析において検出される２次イオンとして、
アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルの各塩基から水素原子が１個脱離した陰イオン、あるいは、Ｐ^-、ＰＯ^-、ＰＯ₂ ^-、ＰＯ₃ ^-からなる、核酸プローブに由来する２次イオン種の群から選択される陰イオンを利用することが好ましい。
【００２９】
さらには、本発明にかかる核酸チップの分析方法では、前記２次イオン質量分析において検出される２次イオンの強度に基づき、
１次イオンの照射位置に対応させ、２次イオン強度を二次元的に表示するイメージ像として、検出結果を表示する工程を設けることも望ましい。
【００３０】
加えて、本発明は、核酸チップの製造方法として、
複数の核酸関連物質からなる核酸プローブが基板上にマトリクス状に配置された核酸チップの製造方法であって、
核酸チップにおいて、前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを設ける際、少なくとも、
前記基板上に核酸プローブ・ドットをマトリクス状に形成する工程、
前記核酸プローブ・ドットが形成されている基板表面の一部に、
前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを基板上に形成する工程とを有することを特徴とする核酸チップの製造方法をも提供している。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００３２】
本発明にかかる核酸チップは、核酸チップ基板上の一部に、形成されているプローブ・ドットの核酸濃度が既知である領域を形成し、該領域でＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により検出される２次イオン強度から検量線を作成し、この検量線を用いて、核酸チップ基板上の他の領域で検出された２次イオン強度から、そのプローブ・ドットに固定されている核酸プローブの核酸量（形成密度）を決定するものである。
【００３３】
すなわち、本発明にかかる核酸チップでは、複数の核酸関連物質が基板上にマトリクス状に配置された、所謂、核酸チップが形成されている基板上の一部に、ドット当たりの核酸濃度が既知である核酸プローブ・ドットを設け、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により定量的測定の際、濃度基準に利用する。また、そのドット当たりの核酸濃度が既知である核酸プローブ・ドットとして、核酸チップ基板上に、段階的に核酸濃度を変えた核酸プローブ・ドットを形成することで、その場で検量線を作成でき、より高い定量性を有する測定が可能となる。一般に、濃度基準に利用する、ドット当たりの核酸濃度が既知である核酸プローブ・ドットに関しては、別途、同一の作製条件で作製した核酸プローブ・ドットを用いて、予め化学分析により、ドット当たりに含有される核酸濃度を決定された核酸プローブ・ドットを用いる。
【００３４】
本発明の対象とする核酸チップは、一般的には、その外形サイズが１ｃｍ×１ｃｍ、１インチ×１インチ（２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ）、あるいは、スライドグラスサイズ（例えば、２６ｍｍ×７６ｍｍ）の基板を利用して作製し、プローブ・ドットのマトリクスは、その内部に配置されている平面形態とされる。本発明は、既に述べたように、複数の核酸関連物質が基板上にマトリクス状に配置された、所謂、核酸チップについて、その核酸チップ表面の各マトリクス・ドットに固定されている核酸プローブの濃度を、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いて分析する手段を採用し、同一基板内に設けてある前記濃度基準を利用して、高い確度で検定することを可能としている。
【００３５】
本発明の核酸チップにおいては、基板上に配置する核酸プローブは、後述するように基板上に共有結合で固定されていることが好ましい。その共有結合による固定に利用するため、例えば、基板表面処理過程で、該基板表面を、アミノ基を結合したシランカップリング剤（Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン）および架橋剤であるＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（ＥＭＣＳ）で処理し、被覆膜を形成する形態とすることも有効である。
【００３６】
ドット当たりに含有される核酸濃度を決定する際に利用する、化学分析では、段階的に核酸濃度を変えた核酸プローブが多数形成された核酸チップを、例えば、酸処理することによって、核酸プローブを基板から分離し、この溶液に含まれる核酸プローブ量を、その核酸中のリンの量を、微量分析手段を用いて分析することで、別途定量するものである。核酸中のリンの量の定量に利用する微量分析手段は、特に限定されるものではないが、高感度かつ高精度なものが好ましく、例えば、ＩＣＰ−ＭＳ法などが挙げられる。ＩＣＰ−ＭＳ法でのリンの検出限界は、１０ｐｐｂ程度であり、定量を行うには、少なくとも、この２〜３倍、すなわち２０〜３０ｐｐｂ程度が必要である。また、試料量（溶液量）としては、最低限１ｍｌ必要である。
【００３７】
一方、後述のインクジェット法により、核酸プローブを形成する場合には、１インチ×３インチの面積に、例えば、２００行×３００列程度のマトリクス・サイズの核酸プローブを形成することも、さほど困難なことではない。また、インクジェット法での１回の吐出量は、高い再現性を示し、その平均値（ｐｌのオーダー）は高い確度で推定できる。一方、上記濃度基準用ドットの作製に利用する、吐出溶液中のプローブＤＮＡ濃度（μＭのオーダー）は、前もって設定するものであり、勿論判明している。
【００３８】
これらの値に加えて、吐出量中の、プローブＤＮＡの固定量（水洗等で固定されなかった分を差し引いた量、数１０％のレベル）を用いて、上記ＩＣＰ−ＭＳ分析に必要な試料量を達成する上で、基板上から溶出させるべき、核酸プローブ・ドットの総数は、ある程度推定できる。具体的には、上記の標準的な条件で核酸チップを作製した場合、一種類の濃度（μＭのオーダー）につき、２００行×３００列程度のマトリクス・サイズ、ドット当たりの吐出量（ｐｌのオーダー）の核酸チップで、数１０枚を用いることが必要となる。
【００３９】
なお、核酸チップ上に付設される濃度基準用ドットに関して、各濃度毎の、核酸濃度が既知のプローブ・ドット数は、特に限定されるものではないが、複数個形成するのが好ましい。
【００４０】
また、本発明の核酸チップでは、上記核酸プローブが一本鎖核酸で構成され、具体的には、一本鎖核酸で構成される核酸プローブを、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）のいずれかで構成することができる。さらには、核酸チップが、核酸プローブとする一本鎖核酸と、この核酸プローブに対するハイブリダイゼーションにより導入された標的核酸の両者から構成されている形態の核酸チップとなっていてもよい。
【００４１】
本発明は、段階的に核酸濃度を変えた、濃度基準用の核酸プローブ・ドット複数間で検出される２次イオンの信号強度に基づき作成された検量線を用いて、未知濃度の核酸プローブ・ドットの核酸濃度を決定することを可能とする。その際、本発明の分析方法では、飛行時間型２次イオン質量分析で検出される２次イオン強度を用いることが、より高い定量性を達成する上で有効である。
【００４２】
なお、上述の２次イオン強度とは、計数率ではなく、一定条件で一定時間計数した積分強度であることが好ましい。正確には、１次イオンのドーズ量を、いわゆるｓｔａｔｉｃ条件と言われる１×１０¹²／ｃｍ²以下の一定値とし、一定の面積から放出される下記２次イオンの計数値（カウント数）とすることが好ましい。なお、１次イオンのドーズ量は、少なくとも１×１０¹⁴／ｃｍ²以下とする必要がある。
【００４３】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法による測定において、利用される１次イオンとしては、Ｃｓ⁺イオン、Ｇａ⁺イオンあるいはＡｒ⁺イオンを用いることが可能である。２次イオン種としては、プローブ核酸、およびハイブリダイゼーションで導入された標的核酸が、一本鎖核酸、より具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ｃＲＮＡ（コンプリメンタリーＲＮＡ）の場合、核酸の骨格を構成するリン酸に由来するＰ^-，ＰＯ^-，ＰＯ₂ ^-，ＰＯ₃ ^-等が挙げられる。また、塩基種からプロトンが脱離したもの、即ち、塩基種がアデニンの場合は、Ｃ₅Ｈ₄Ｎ₅ ^-（１３４ａ．ｍ．ｕ．）、グアニンの場合はＣ₅Ｈ₄Ｎ₅Ｏ^-（１５０ａ．ｍ．ｕ．）、シトシンの場合はＣ₄Ｈ₄Ｎ₃Ｏ^-（１１０ａ．ｍ．ｕ．）、チミンの場合はＣ₅Ｈ₅Ｎ₂Ｏ₂ ^-（１２５ａ．ｍ．ｕ）も、２次イオン種として検出可能である。また、核酸プローブが、ＲＮＡプローブの場合にはチミンの代わりにウラシルに由来するＣ₄Ｈ₃Ｎ₂Ｏ₂ ^-（１１１ａ．ｍ．ｕ）を検出する以外は、ＤＮＡプローブと同様な２次イオンを検出することが可能である。また、核酸チップを構成する基板として、例えば、ガラスなどの絶縁物基板を用いる際には、１次イオン照射と併せて、併用される電子線照射は、１次イオンのパルス幅、周波数および試料の誘電率、さらには、ガラス基板の厚さを考慮して、適切な照射条件を決定する必要がある。
【００４４】
本発明の核酸チップの分析方法では、また、核酸に起因する２次イオン強度を、１次イオン照射のスキャンに合わせて、二次元的なイメージとして、定量的に表示できることも特徴である。
【００４５】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。なお、これら実施例は本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明はかかる形態に限定されるものではない。
【００４６】
図１は、基板上にプローブを複数個スポット状に結合させたプローブアレイの平面配置および断面構造を模式的に示す図ある。１０１は、任意の条件で作製したプローブ群、１０２は、核酸濃度が既知であるプローブ群である。断面図では、１０３は基板、１０４は有機物質からなる表面処理層、１００は核酸プローブである。以下、図１に例示する構成のプローブアレイについて、公知の方法（特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法９）を応用して、作製する工程について説明する。
【００４７】
（実施例１）
塩基種をチミン、塩基長を４０ｍｅｒとしたＤＮＡプローブを用いるＤＮＡチップの作製
（１）基板洗浄
２５．４ｍｍ×５０．８ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板１０３をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰIII）に一晩浸した。さらに、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に、基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、洗浄済基板は、そのまま次の表面処理工程に供した。
【００４８】
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシランＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いで、この溶液に、（１）で得た洗浄済基板を室温で1時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。さらに、基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして、最終的に基板表面にアミノ基を導入しシランカップリング層を形成した。
【００４９】
一方、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１（容量比）混合溶媒に、濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解し、ＥＭＣＳ溶液とした。シランカップリング処理を行った石英基板を、このＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基を反応させ、表面にＥＭＣＳ層を形成した。以上の処理により、結合可能な官能基を有する有機物質からなる表面処理層１０４を形成した。すなわち、この段階で、基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板は、ＤＭＳＯ／エタノール混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
【００５０】
（３）プローブＤＮＡの合成
DNA合成業者（ベックス）に依頼して、配列番号１の一本鎖核酸（ｄTの40量体）を合成した。なお、配列番号１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には、合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いて、スルファニル基（ＳＨ）を導入した。ＤＮＡ合成後、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製には、HPLCを用いた。合成から精製までの一連の工程は、すべて合成業者に依頼して行った。
配列番号：１
５’−ＨＳ−（ＣＨ₂）₆−Ｏ−ＰＯ₂−Ｏ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’
（４）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
（３）に記載する配列番号１の一本鎖ＤＮＡを、最終濃度８μＭで、グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液に溶解した。
【００５１】
一方、サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キヤノン）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン）を、数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造した。この改造を施したヘッドを、平板である石英基板上へ、インク吐出が可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に、前記ＤＮＡ溶液を数１００μｌ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板を装着して、ＥＭＣＳ処理表面にスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は４ｐｌ／ｄｒｏｐｌｅｔで、スポッティングの範囲は、基板上の２０ｍｍ×３０ｍｍの範囲に、２００ｄｐｉ、すなわち、１２７μｍのピッチで吐出した。この条件では、マトリックス（１５７行２３６列）状にスポッティングされたドットの直径は約５０μｍであった。
【００５２】
スポッティング終了後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、基板表面のマレイミド基と、核酸プローブ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させ、ＤＮＡプローブを固定させた。次いで、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。ＤＮＡ結合基板（ＤＮＡチップ）は、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析直前に窒素ガスを吹き付けて乾燥し、真空デシケーター中でさらに乾燥した。この条件で、ＤＮＡチップを計１５枚作製した。
【００５３】
さらに、スポッティングに用いるＤＮＡ溶液中の、配列番号１の一本鎖ＤＮＡ濃度を、５μＭ、２．５μＭに選択して、同様の操作で、ＤＮＡチップを各々２５枚、３５枚作製した。以上の３種を、標準ＤＮＡチップとした。
【００５４】
次に、一本鎖ＤＮＡの一般的な溶液濃度（約８μＭ）を用いたＤＮＡチップを上記と同条件で作製した。ただし、該ＤＮＡチップにおいては、端部の１行目から３行目には標準ＤＮＡチップ作製に使用した同じ一本鎖ＤＮＡ溶液三種を用いた。すなわち、基板最端の１行目を、濃度１０μＭのＤＮＡ溶液でプローブを形成した行、２行目を、濃度５μＭのＤＮＡ溶液でプローブを形成した行、３行目を、濃度２．５μＭのＤＮＡ溶液でプローブを形成した行となるように設定した。また、端部の１行目から３行目以外の行（４行目から１５７行目）を、別ロットのＤＮＡ濃度８μＭとした溶液を用いて作製した。なお、プローブアレイの数は任意に設定できる。
【００５５】
（実施例２）
核酸チップ上の核酸の定量
３種類のＤＮＡ濃度で作製した標準ＤＮＡチップを、それぞれ酸で洗浄してＤＮＡプローブを溶解させた後、該酸溶液をＰが飛散しない条件で１ｍｌ以下になるまで濃縮した。次いで、該濃縮溶液に超純水を加えて１ｍｌになるように定容した。この溶液を、ＩＣＰ−ＭＳ装置に導入してＰの重量を測定した。この値をもとに、測定に供したドットの数（スポッティングの数）を考慮して、各濃度で作製したＤＮＡプローブの（１ドット当たりの）ＤＮＡ分子数の平均値を決定した。なお、各ＤＮＡ濃度で作製した基板の枚数は、ＩＣＰ−ＭＳ装置でのＰの検出限界濃度（約１０ｐｐｂ）と、各基板上のＤＮＡの分子数を考慮して決定すればよく、実施例１で示した枚数に限定されるものではない。
【００５６】
（実施例３）
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定
図１に示したＤＮＡチップを、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦＳＩＭＳＩＶ：ＩＯＮＴＯＦ社）の分析室に搬送し、表１の条件で１次イオンの注入ドーズ量が１×１０¹² ａｔｏｍｓ／ｃｍ²になるまで照射して、その間に検出される２次イオンＰＯ₃ ^-（質量電荷比７８．９５８ａｍｕ（アトムマスユニット））を積算して累積強度を求めた。図２に、１行目から３行目までの各ＤＮＡ濃度のドット位置で測定された２次イオン強度の平均値と、ＤＮＡの形成密度（１ドット当たりのＤＮＡ分子数）との対応を示した。ここでは、プローブＤＮＡを固定する直前、表面処理済基板において測定されたＰＯ₃ ^-の強度を、バックグランドとした。
【００５７】
各行のドットにおけるＤＮＡの形成密度と２次イオン強度は比例することが確認された。同じ測定条件で、インクジェットプリンターで吐出させるＤＮＡ溶液中の核酸濃度を８μＭとして形成した、核酸プローブについて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定したところ、ＰＯ₃ ^-のカウント数から求められた各ドットにおけるＤＮＡの形成密度（１ドット当たりのＤＮＡ分子数）は、およそ２．０×１０⁷で、任意に選択した１０個のドット内でのバラツキは、２０％以下であった。
【００５８】
【表１】

【００５９】
（実施例４）
形成密度分布の画像表示
実施例３に用いた同じ試料の複数の核酸プローブを設定して、１次イオンを試料面で走査し、発生する２次イオンを各走査点に対応させて表示させ、各走査点で得られたＰ^-の強度を複数の段階に分けて擬似カラーを設定し、Ｐ^-の強度分布すなわち、核酸の面密度（プローブ・ドット当たりの核酸の分子数）形成密度の分布を定量的に比較した。
【００６０】
【発明の効果】
本発明の核酸チップでは、チップ基板上に、前記核酸プローブ・ドットの形成と同じ手法により形成される、ドット当たりの平均的な核酸密度が決定された、濃度基準用の核酸プローブ・ドットを具え、ＤＮＡ等の核酸プローブを含むドット内のプローブ核酸量、あるいは、ハイブリダイゼーション後の標的核酸量などを定量的に評価する際、前記の濃度基準用の核酸プローブ・ドットを利用して、例えば、複数段階の平均的な核酸密度を有する、複数種の濃度基準用の核酸プローブ・ドットに対して、２次イオン質量分析を行った際に検出される２次イオンの信号強度に基づいて作成される検量線を用いて、
基板上に配置される、未知濃度の核酸プローブ・ドットの核酸濃度を、２次イオン質量分析法によって決定することができ、従来法と比較して、再現性、定量性が向上する。本発明の手法を用いることにより、核酸チップ製品の信頼性を高めることができる。また、核酸チップ内にマトリックス状に配置されている、核酸プローブ・ドットの形成密度の分布を画像として表示することも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかるバイオチップについて、その構成の一例を示す平面配置と断面形状（ＡＡ’での断面）を模式的に示す図である。
【図２】バイオチップについて、測定される２次イオン強度とＤＮＡ形成密度（プローブ・ドット当たりのＤＮＡ分子数）の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１００：核酸プローブ
１０１：核酸濃度が未知の核酸プローブが形成される領域
１０２：核酸濃度が既知の核酸プローブが形成される領域
１０３：基板
１０４：有機物質からなる表面処理層[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to nucleic acid probes arranged in a matrix on a substrate, a so-called nucleic acid chip, and a method for analyzing nucleic acids constituting the nucleic acid chip.
[0002]
[Prior art]
DNA chips, RNA chips and other nucleic acid probe molecules arranged in a matrix on a substrate, so-called nucleic acid chips have come to be used for purposes such as genome analysis or gene expression analysis. . In addition, the results of analysis using these nucleic acid chips are expected to provide important indicators for diagnosis, prognosis prediction, treatment policy determination, etc. of cancer, genetic diseases, lifestyle-related diseases, infectious diseases and the like.
[0003]
Several methods are known for producing nucleic acid chips. Taking a DNA chip as an example, a method of sequentially synthesizing DNA probes directly on a substrate using photolithography (US Pat. No. 5,405,783), or a pre-synthesized DNA or cDNA (complex) A typical method for producing a DNA chip is a method of supplying and binding a mental DNA on a substrate (US Pat. No. 5,601,980, JP-A-11-187900, Science Vol. 270, 467, 1995, etc.).
[0004]
In general, a nucleic acid chip is prepared by the above two methods. However, when the prepared nucleic acid chip is to be used for the above-described applications, the reliability of analysis, that is, the quantitativeness and reproducibility are improved. In order to guarantee, it is important to know the amount of the probe present in each matrix, that is, the amount of nucleic acid used for the probe, that is, the density. It is also important from the standpoint of securing quantitativeness and reproducibility to know what kind of matrix shape (shape, size, state) actually exists (imaging).
[0005]
However, in principle, the nucleic acid probe on the nucleic acid chip is at the level of a monomolecular film. Basically, it is an extremely sensitive surface analysis technology for analysis of nucleic acid probes including visualization of matrix positions. Is required.
[0006]
As one of high-sensitivity surface analysis techniques that satisfy the above requirements, a method of applying an isotope label to the probe itself is known, but the labeling method is complicated, and the isotope label itself that is used is exposed. There is a risk of becoming a source, and therefore there is a difficulty in terms of versatility because special facilities and devices are necessary.
[0007]
As another method, a method of fluorescently labeling the probe or a method of applying a fluorescent label to a substance that specifically binds to the probe and binding the probe to the probe, that is, a DNA chip, a fluorescent hybridization method can be considered. . However, the stability of the fluorescent dye used for labeling, fluorescence quenching, or nonspecific adsorption of the fluorescent dye to the substrate surface, and the quantitative nature of the specific binding (hybridization) (stability, reproducibility) In order to achieve high quantitativeness, various problems exist, and problems still remain to quantitatively grasp the abundance of the probe itself.
[0008]
Other high-sensitivity surface analysis means that can be used for general detection targets include the ATR method using the FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy) method and the XPS (X-ray photoelectron spectroscopy) method. It cannot be said that it has sufficient sensitivity for quantitative analysis or imaging of the nucleic acid probe itself of the nucleic acid chip, which is a biological substance. In particular, when a general glass is used as a substrate for preparing a nucleic acid chip, for example, in the FT-IR (ATR) method, the influence of absorption caused by the glass of the substrate itself, and in the XPS method, the glass itself is used. Since is an insulating material, it is not effective analysis means due to the influence of charge-up.
[0009]
In addition, as another high-sensitivity surface analysis method that can be used for biological materials, laser resonance ionization (RIS)ResonanceIonizationSA method for detecting DNA by spectroscopy is disclosed in US Pat. No. 5,821,060. In this method, a laser beam having a wavelength corresponding to the ionization energy of the element of interest emitted from the sample surface is irradiated to ionize and detect the element. At this time, as means for emitting elements from the sample surface, a method using a laser beam and a method using ions are disclosed, but there is a technical limitation that only a specific element can be detected.
[0010]
Furthermore, as another high-sensitivity surface analysis means, there is dynamic secondary ion mass spectrometry (dynamic-SIMS). In this method, in the process of generating secondary ions, organic compounds are converted into small fragment ions, or It is broken down into particles. Therefore, there is not much chemical structure information obtained from mass spectra.For example, the information obtained is insufficient for analysis of organic substances such as nucleic acid-related substances that have only four common bases. Not suitable for use.
[0011]
In contrast, the time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS) method, also known as a method of secondary ion mass spectrometry, is the kind of atom or molecule on the outermost surface of a solid sample. It is an analysis method for checking whether it exists, and has the following features. That is, 10⁹atoms / cm²(1/10 of one atomic layer on the outermost surface^FiveThat can be applied to both organic and inorganic substances, that all elements and compounds present on the surface can be measured, and secondary ions from substances present on the sample surface. Is possible.
[0012]
The principle of this time-of-flight secondary ion mass spectrometry will be briefly described below.
[0013]
When a solid sample surface is irradiated with a high-speed ion beam (primary ions) in a high vacuum, surface components are released into the vacuum by a sputtering phenomenon. The positively or negatively charged ions (secondary ions) generated in this process are converged in one direction by the electric field and detected at a position separated by a certain distance. During sputtering, secondary ions with various masses are generated depending on the composition of the sample surface, but in a constant electric field, lighter mass ions fly faster and heavier ions fly faster. To do. Therefore, the mass of the generated secondary ions can be analyzed by measuring the time (time of flight) from when the secondary ions are generated until reaching the detector.
[0014]
On the other hand, in the dynamic-SIMS method, as described above, since the organic compound is decomposed into small fragment ions or particles upon ionization, the chemical structure information obtained from the mass spectrum, for example, the mass range is limited. On the other hand, in the TOF-SIMS method, the irradiation amount of primary ions is remarkably small, so that the organic compound is ionized while maintaining its chemical structure, and the structure of the organic compound is determined from the mass spectrum measured in a wide mass range. You can know more directly. In addition, since only the secondary ions generated on the outermost surface of the solid sample surface are released into the vacuum, information on the outermost surface (a depth of several tens of meters) of the sample can be selectively obtained.
[0015]
Further, when the sample is an insulator, positive charges accumulate on the surface of the insulating solid with irradiation of primary ions and generation of secondary ions. In order to remove the influence of the electric field due to the accumulated charge, a method of neutralizing the accumulated charge by irradiating primary ions in a pulsed manner and irradiating the pulse gap with an electron beam is employed. Therefore, the insulator can be analyzed by the TOF-SIMS method. In addition, in the TOF-SIMS method, a secondary ion image (two-dimensional mapping) on the sample surface can be measured by analyzing the secondary ions while scanning the primary ion beam.
[0016]
There has already been reported an example in which a monomolecular film-level nucleic acid immobilized on a substrate is detected by the TOF-SIMS method (Proceeding of the 12).^th  International Conference on Secondary Ion Mass Spectrometry 951, 1999). In this example, fragment ions derived from nucleic acids that can be detected by the TOF-SIMS method include base fragment fragments and phosphate backbone fragment ions. Yes.
[0017]
  In addition, as a trial of quantitative analysis using the TOF-SIMS method, a standard solution having a different concentration is applied on a clean silicon substrate, dried, and then the standard sample is measured by the TOF-SIMS method. A calibration curve was prepared from the sample and compared with the secondary ion peak intensity of the sample to be analyzed (CM John et al., SIMSVIII, P657, Wiley and Sons, 1992), or a method using a standard sample for total reflection X-ray fluorescence analysis in which a trace metal element is spin-coated on a silicon substrate (P. Lazzeri et al., Surface and Interface Analysis, Vol. 29, 798 (2000)).
[0018]
[Problems to be solved by the invention]
However, there are the following problems in quantitative analysis by the conventional TOF-SIMS method. That is, the detected secondary ion intensity is the measurement condition, specifically, the irradiation condition of primary ions (acceleration energy, incident angle, ion species, irradiation amount), and the detection condition of secondary ions (energy width). In addition, when the sample is an insulator, there is a problem that it differs depending on the detachment due to the electron beam irradiated with pulses for charge correction, the degree of charge neutralization, and the like.
[0019]
In particular, when the sample is an insulator, the charging state when the primary ions are irradiated is not necessarily the same between the standard sample and the sample to be measured. Therefore, every time the sample is changed, in order to achieve high quantitativeness, it is necessary to strictly optimize the measurement conditions. If the optimization is insufficient, the accuracy of the measurement result is lost. In addition, the preparation of a calibration curve involves a cumbersome work because it requires standard samples for the number of levels of the concentration to be measured.
[0020]
In addition, a standard sample of a nucleic acid chip was prepared as described in In the case of producing by a spin coating method as reported by Lazzeri et al., The average size over a wide area, the reproducibility of the concentration is good, and although the coating is formed, the measurement area of the spot size of the TOF-SIMS method, specifically Is several tens of μm²To several hundred μm²In each minute area, the uniformity in the coated surface is not sufficient, which gives a serious problem to the reliability of the measurement result.
[0021]
The present invention solves the above-described problems, and an object of the present invention is to provide a nucleic acid-related substance constituting a probe of a so-called nucleic acid chip in which a plurality of nucleic acid-related substances are arranged in a matrix on a substrate. In addition to analysis by time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS), a method for analyzing a nucleic acid chip that can achieve high quantitativeness, and using this analysis method, it is arranged on a nucleic acid chip. An object of the present invention is to provide a nucleic acid chip having a form capable of easily determining the amount of nucleic acid present in a nucleic acid probe / dot, that is, the formation density (the amount of nucleic acid per probe / dot).
[0022]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors, in addition to nucleic acid probe dots arranged on the nucleic acid chip, the formation density of which is not known, on a part of the substrate surface, A concentration reference nucleic acid probe dot is formed by the same method as the formation of the nucleic acid probe dot and the average nucleic acid density per dot is determined. Based on the signal intensity of the secondary ions detected when secondary ion mass spectrometry is performed, the nucleic acid concentration of the nucleic acid probe / dot having an unknown concentration arranged on the substrate is determined by secondary ion mass spectrometry. Further, the inventors have found that the quantification thereof shows excellent reproducibility, and have completed the present invention.
[0023]
That is, the nucleic acid chip according to the present invention is:
A nucleic acid chip in which nucleic acid probes and dots made of a plurality of nucleic acid-related substances are arranged in a matrix on a substrate,
A portion of the substrate surface on which the nucleic acid probe dot is formed,
A nucleic acid chip comprising a nucleic acid probe / dot for reference of concentration, which is formed by the same technique as the formation of the nucleic acid probe / dot and in which an average nucleic acid density per dot is determined. At that time, as the nucleic acid probe dot for the concentration reference,
Preferably, it comprises a plurality of nucleic acid probe dots with an average nucleic acid density per dot having a plurality of stages of average nucleic acid density. In addition, the nucleic acid probe dot for which the average nucleic acid density per dot was determined is
Separately, it is desirable that the average nucleic acid density per dot is determined by chemical analysis. For example, as the chemical analysis means,
Analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry (hereinafter abbreviated as ICP-MS) can be used to determine the average nucleic acid density per dot.
[0024]
In the nucleic acid chip according to the present invention, the nucleic acid probe is preferably composed of a single-stranded nucleic acid. In that case, the nucleic acid probe is
It can be a single strand composed of any of DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), cDNA (complementary DNA), and cRNA (complementary RNA).
[0025]
Furthermore, in the nucleic acid chip according to the present invention,
Both the nucleic acid probe composed of a single-stranded nucleic acid and the target nucleic acid introduced by hybridization with the nucleic acid probe may be disposed on the substrate.
[0026]
Correspondingly, the method for analyzing a nucleic acid chip according to the present invention comprises:
A method for analyzing a nucleic acid chip in which nucleic acid probes and dots comprising a plurality of nucleic acid-related substances are arranged in a matrix on a substrate,
A portion of the substrate surface on which the nucleic acid probe dot is formed,
A nucleic acid probe / dot for concentration reference is provided, which is formed by the same method as the formation of the nucleic acid probe / dot, the average nucleic acid density per dot is determined, and
As the concentration standard nucleic acid probe dot,
Comprising a plurality of nucleic acid probe dots with an average nucleic acid density per dot having a multi-stage average nucleic acid density;
A calibration curve created based on the signal intensity of secondary ions detected when secondary ion mass spectrometry is performed on a plurality of types of nucleic acid probe dots having an average nucleic acid density in a plurality of stages. Using,
A method for analyzing a nucleic acid chip, wherein the nucleic acid concentration of a nucleic acid probe / dot having an unknown concentration arranged on a substrate is determined by secondary ion mass spectrometry. At that time, it is preferable to use time-of-flight secondary ion mass spectrometry as the secondary ion mass spectrometry.
[0027]
The secondary ion intensity detected in the secondary ion mass spectrometry is
The dose amount of primary ions is 1 × 10¹⁴/ Cm²When the constant value selected below is used, it can be the integrated intensity (count number) of a specific secondary ion derived from the nucleic acid probe released from a constant area irradiated with the primary ion. Furthermore, the secondary ion intensity detected in the secondary ion mass spectrometry is
The dose amount of primary ions is 1 × 10¹²/ Cm²When the constant value selected below is used, it may be the integrated intensity (count number) of a specific secondary ion derived from the nucleic acid probe released from a constant area irradiated with the primary ion.
[0028]
In the method for analyzing a nucleic acid chip according to the present invention,
As secondary ions detected in the secondary ion mass spectrometry,
An anion in which one hydrogen atom is eliminated from each base of adenine, thymine, guanine, cytosine, uracil, or P^-, PO^-, PO₂ ^-, PO_Three ^-Preferably, an anion selected from the group of secondary ion species derived from nucleic acid probes is used.
[0029]
Furthermore, in the method for analyzing a nucleic acid chip according to the present invention, based on the intensity of secondary ions detected in the secondary ion mass spectrometry,
It is also desirable to provide a step of displaying the detection result as an image image that displays the secondary ion intensity two-dimensionally in correspondence with the irradiation position of the primary ions.
[0030]
In addition, the present invention provides a method for producing a nucleic acid chip,
A method for producing a nucleic acid chip in which nucleic acid probes comprising a plurality of nucleic acid-related substances are arranged in a matrix on a substrate,
In the nucleic acid chip, when providing the nucleic acid probe dot for concentration reference in which the average nucleic acid density per dot is determined on a part of the substrate surface on which the nucleic acid probe dot is formed, at least,
Forming nucleic acid probe dots in a matrix on the substrate;
On a part of the substrate surface on which the nucleic acid probe dot is formed,
A nucleic acid chip comprising a step of forming a nucleic acid probe / dot for concentration reference on a substrate, wherein an average nucleic acid density per dot is determined by the same method as the formation of the nucleic acid probe / dot. The manufacturing method is also provided.
[0031]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
[0032]
In the nucleic acid chip according to the present invention, a region where the nucleic acid concentration of the formed probe dot is known is formed on a part of the nucleic acid chip substrate, and secondary ions detected by the TOF-SIMS method in the region. Create a calibration curve from the intensity, and use this calibration curve to determine the amount of nucleic acid (formation density) of the nucleic acid probe immobilized on the probe dot from the secondary ion intensity detected in other areas on the nucleic acid chip substrate. ).
[0033]
That is, in the nucleic acid chip according to the present invention, the nucleic acid concentration per dot is known on a part of the substrate on which the so-called nucleic acid chip is formed, in which a plurality of nucleic acid-related substances are arranged in a matrix on the substrate. A certain nucleic acid probe dot is provided and used for concentration reference in quantitative measurement by the TOF-SIMS method. In addition, a calibration curve can be created on the spot by forming nucleic acid probes / dots with different nucleic acid concentrations in stages on the nucleic acid chip substrate as nucleic acid probe / dots with known nucleic acid concentrations per dot. Thus, measurement with higher quantification becomes possible. In general, nucleic acid probes / dots with known nucleic acid concentrations per dot that are used for concentration standards are separately contained per dot by chemical analysis in advance using nucleic acid probes / dots prepared under the same preparation conditions. A nucleic acid probe dot having a determined nucleic acid concentration is used.
[0034]
The nucleic acid chip targeted by the present invention generally has an external size of 1 cm × 1 cm, 1 inch × 1 inch (25.4 mm × 25.4 mm), or a slide glass size (for example, 26 mm × 76 mm). The matrix of probe dots is formed in a planar form arranged inside thereof. As described above, the present invention relates to a so-called nucleic acid chip in which a plurality of nucleic acid-related substances are arranged in a matrix on a substrate, and the concentration of the nucleic acid probe fixed to each matrix dot on the surface of the nucleic acid chip. By adopting a means for analyzing the above using the TOF-SIMS method, it is possible to test with high accuracy by using the concentration standard provided in the same substrate.
[0035]
In the nucleic acid chip of the present invention, the nucleic acid probe to be arranged on the substrate is preferably immobilized on the substrate by a covalent bond as described later. In order to use for fixing by the covalent bond, for example, in the substrate surface treatment process, the substrate surface is treated with a silane coupling agent (N-β- (aminoethyl) -γ-aminopropyltrimethoxysilane) having an amino group bonded thereto. It is also effective to form a coating film by treating with N-maleimidocaproyloxysuccinimide (EMCS) which is a crosslinking agent.
[0036]
In chemical analysis, which is used when determining the concentration of nucleic acid contained per dot, a nucleic acid probe is formed by, for example, acid treatment of a nucleic acid chip on which a large number of nucleic acid probes having different nucleic acid concentrations are formed stepwise. Separated from the substrate, the amount of the nucleic acid probe contained in this solution is separately quantified by analyzing the amount of phosphorus in the nucleic acid using a microanalytical means. The trace analysis means used for quantifying the amount of phosphorus in the nucleic acid is not particularly limited, but is preferably highly sensitive and highly accurate, and includes, for example, the ICP-MS method. The detection limit of phosphorus in the ICP-MS method is about 10 ppb, and at least 2 to 3 times, that is, about 20 to 30 ppb is necessary for quantification. The sample amount (solution amount) requires a minimum of 1 ml.
[0037]
On the other hand, when a nucleic acid probe is formed by an inkjet method described later, it is very difficult to form a nucleic acid probe having a matrix size of about 200 rows × 300 columns, for example, in an area of 1 inch × 3 inches. Not that. In addition, a single ejection amount in the ink jet method shows high reproducibility, and an average value (pl order) can be estimated with high accuracy. On the other hand, the probe DNA concentration (in the order of μM) in the discharge solution used for the production of the above-mentioned concentration reference dots is set in advance, and is of course known.
[0038]
In addition to these values, the sample necessary for the ICP-MS analysis using the fixed amount of probe DNA (amount obtained by subtracting the amount not fixed by washing with water, a level of several tens of percent) in the discharge amount In order to achieve the quantity, the total number of nucleic acid probe dots to be eluted from the substrate can be estimated to some extent. Specifically, when a nucleic acid chip is produced under the above standard conditions, a matrix size of about 200 rows × 300 columns and a discharge amount per dot (order of pl) for one kind of concentration (order of μM). It is necessary to use several tens of nucleic acid chips.
[0039]
Regarding the concentration reference dots attached on the nucleic acid chip, the number of probes / dots having a known nucleic acid concentration for each concentration is not particularly limited, but it is preferable to form a plurality.
[0040]
In the nucleic acid chip of the present invention, the nucleic acid probe is composed of a single-stranded nucleic acid. Specifically, the nucleic acid probe composed of a single-stranded nucleic acid is a DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), cDNA ( Complementary DNA) or cRNA (complementary RNA) can be used. Furthermore, the nucleic acid chip may be a nucleic acid chip of a form composed of both a single-stranded nucleic acid used as a nucleic acid probe and a target nucleic acid introduced by hybridization with the nucleic acid probe.
[0041]
The present invention uses a calibration curve created based on the signal intensity of secondary ions detected between a plurality of concentration-standard nucleic acid probes / dots in which the nucleic acid concentration is changed stepwise, It makes it possible to determine the nucleic acid concentration of a dot. At that time, in the analysis method of the present invention, it is effective to use the secondary ion intensity detected by time-of-flight secondary ion mass spectrometry to achieve higher quantitativeness.
[0042]
The above-mentioned secondary ion intensity is preferably not the counting rate but the integrated intensity counted for a certain time under a certain condition. To be precise, the dose amount of the primary ions is 1 × 10 which is called a so-called static condition.¹²/ Cm²It is preferable to set the following constant value and the count value (count number) of the following secondary ions released from a certain area. The dose amount of primary ions is at least 1 × 10.¹⁴/ Cm²It is necessary to do the following.
[0043]
In the measurement by the TOF-SIMS method, the primary ion used is Cs.⁺Ion, Ga⁺Ion or Ar⁺Ions can be used. As the secondary ion species, the probe nucleic acid and the target nucleic acid introduced by the hybridization are single-stranded nucleic acids, more specifically, DNA, RNA, cDNA (complementary DNA), cRNA (complementary RNA). In this case, P derived from phosphoric acid constituting the skeleton of the nucleic acid^-, PO^-, PO₂ ^-, PO_Three ^-Etc. In the case where protons are eliminated from the base species, that is, when the base species is adenine, C_FiveH_FourN_Five ^-(134a.mu.), C for guanine_FiveH_FourN_FiveO^-(150 a.m.u.), C for cytosine_FourH_FourN_ThreeO^-(110a.m.u.), C for thymine_FiveH_FiveN₂O₂ ^-(125a.m.u) can also be detected as a secondary ion species. When the nucleic acid probe is an RNA probe, C derived from uracil instead of thymine._FourH_ThreeN₂O₂ ^-Other than detecting (111a.mu.u), it is possible to detect secondary ions similar to those of the DNA probe. Further, when an insulating substrate such as glass is used as the substrate constituting the nucleic acid chip, for example, the electron beam irradiation used in combination with the primary ion irradiation is performed with the pulse width, frequency and sample of the primary ions. It is necessary to determine appropriate irradiation conditions in consideration of the dielectric constant of the glass substrate and the thickness of the glass substrate.
[0044]
The nucleic acid chip analysis method of the present invention is also characterized in that the secondary ion intensity caused by the nucleic acid can be quantitatively displayed as a two-dimensional image in accordance with the scan of the primary ion irradiation.
[0045]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. In addition, although these Examples are examples of the best embodiment concerning this invention, this invention is not limited to this form.
[0046]
FIG. 1 is a diagram schematically showing a planar arrangement and a cross-sectional structure of a probe array in which a plurality of probes are coupled in a spot shape on a substrate. 101 is a probe group prepared under arbitrary conditions, and 102 is a probe group whose nucleic acid concentration is known. In the cross-sectional view, 103 is a substrate, 104 is a surface treatment layer made of an organic substance, and 100 is a nucleic acid probe. Hereinafter, a process of manufacturing a probe array having the configuration illustrated in FIG. 1 by applying a known method (method 9 described in JP-A-11-187900) will be described.
[0047]
  Example 1
  Preparation of DNA chip using DNA probe with base species as thymine and base length as 40mer
  (1) Substrate cleaning
  A detergent for ultrasonic cleaning (Branson: GP) in which a synthetic quartz substrate 103 of 25.4 mm × 50.8 mm × 1 mm is put in a rack and diluted to 10% with pure water.III) Overnight. Furthermore, ultrasonic cleaning was performed in a detergent for 20 minutes, and then the detergent was removed by washing with water. After rinsing with pure water, sonication was further performed for 20 minutes in a container containing pure water. Next, the substrate was immersed in a 1N sodium hydroxide aqueous solution preheated to 80 ° C. for 10 minutes. Subsequently, washing with water and pure water were performed, and the washed substrate was directly subjected to the next surface treatment process.
[0048]
(2) Surface treatment
A 1 wt% aqueous solution of an amino group-bonded silane coupling agent, N-β- (aminoethyl) -γ-aminopropyltrimethoxysilane KBM603 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was stirred at room temperature for 2 hours, and the molecules of the silane compound The methoxy group was hydrolyzed. Next, the washed substrate obtained in (1) was immersed in this solution for 1 hour at room temperature, washed with pure water, and dried by blowing nitrogen gas on both sides of the substrate. Further, the substrate was baked in an oven heated to 120 ° C. for 1 hour, and finally amino groups were introduced on the surface of the substrate to form a silane coupling layer.
[0049]
On the other hand, 2.7 mg of N-maleimidocaproyloxysuccinimide (Dojindo Laboratories: hereinafter EMCS) is mixed in a 1: 1 (volume ratio) mixed solvent of dimethyl sulfoxide (DMSO) / ethanol at a concentration of 0.3 mg / ml. The resulting solution was dissolved into an EMCS solution. The quartz substrate that has been subjected to the silane coupling treatment is immersed in this EMCS solution at room temperature for 2 hours, and the amino group supported on the substrate surface by the silane coupling treatment reacts with the succinimide group of EMCS, and the surface is subjected to EMCS. A layer was formed. Through the above treatment, the surface treatment layer 104 made of an organic material having a functional group capable of bonding was formed. That is, at this stage, an EMCS-derived maleimide group is present on the substrate surface. The substrate pulled up from the EMCS solution was sequentially washed with a DMSO / ethanol mixed solvent and ethanol, and then dried by blowing nitrogen gas.
[0050]
(3) Synthesis of probe DNA
A DNA synthesizer (Vex) was commissioned to synthesize a single-stranded nucleic acid of SEQ ID NO: 1 (dT 40-mer). A sulfanyl group (SH) was introduced into the 5 ′ end of the single-stranded DNA of SEQ ID NO: 1 using a thiol modifier (Glen Research) during synthesis. After DNA synthesis, deprotection and DNA recovery were performed by conventional methods, and HPLC was used for purification. A series of steps from synthesis to purification was performed by a synthesizer.
SEQ ID NO: 1
5'-HS- (CH₂)₆-O-PO₂-O-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3 '
(4) DNA ejection by thermal jet printer and binding to substrate
The single-stranded DNA of SEQ ID NO: 1 described in (3) is glycerin 7.5 wt%, urea 7.5 wt%, thiodiglycol 7.5 wt%, acetylene alcohol (trade name: acetylenol EH; Dissolved in a solution containing 1 wt% of Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.
[0051]
On the other hand, a printer head BC-50 (Canon) for a bubble jet printer BJF-850 (Canon) using a bubble jet method, which is a kind of thermal jet method, was modified so that several hundred μl of solution could be ejected. The modified head was mounted on a discharge drawing machine modified so that ink can be discharged onto a flat quartz substrate. Several hundreds of μl of the DNA solution was injected into the modified tank portion of the head, an EMCS processing substrate was mounted on the discharge drawing machine, and spotted on the EMCS processing surface. In addition, the discharge amount at the time of spotting was 4 pl / droplet, and the spotting range was a 20 mm × 30 mm range on the substrate, and was discharged at a pitch of 200 dpi, that is, 127 μm. Under this condition, the diameter of dots spotted in a matrix (157 rows and 236 columns) was about 50 μm.
[0052]
After the spotting, the substrate was left in a humidified chamber for 30 minutes, and the maleimide group on the surface of the substrate was reacted with the sulfanyl group (—SH) at the 5 ′ end of the nucleic acid probe to immobilize the DNA probe. Next, the substrate was washed with pure water and stored in pure water. The DNA binding substrate (DNA chip) was dried by blowing nitrogen gas immediately before analysis by TOF-SIMS, and further dried in a vacuum desiccator. Under these conditions, a total of 15 DNA chips were produced.
[0053]
Further, the single-stranded DNA concentration of SEQ ID NO: 1 in the DNA solution used for spotting was selected to 5 μM and 2.5 μM, and 25 and 35 DNA chips were prepared in the same manner. The above three types were used as standard DNA chips.
[0054]
Next, a DNA chip using a general solution concentration (about 8 μM) of single-stranded DNA was prepared under the same conditions as described above. However, in the DNA chip, three kinds of the same single-stranded DNA solution used for preparing the standard DNA chip were used in the first to third lines at the end. That is, the first row at the end of the substrate has a probe formed with a DNA solution with a concentration of 10 μM, the second row has a probe formed with a DNA solution with a concentration of 5 μM, and the third row has a concentration of 2.5 μM. It was set to be a row in which the probe was formed with the DNA solution. In addition, lines other than the 1st to 3rd lines (from the 4th line to the 157th line) at the end were prepared using a solution with a DNA concentration of 8 μM in another lot. The number of probe arrays can be set arbitrarily.
[0055]
(Example 2)
Quantification of nucleic acids on nucleic acid chips
Standard DNA chips prepared at three different DNA concentrations were each washed with acid to dissolve the DNA probe, and then the acid solution was concentrated to 1 ml or less under the condition that P did not scatter. Subsequently, ultrapure water was added to the concentrated solution to make a volume of 1 ml. This solution was introduced into an ICP-MS apparatus, and the weight of P was measured. Based on this value, the average number of DNA molecules (per dot) of DNA probes prepared at each concentration was determined in consideration of the number of dots used for measurement (number of spots). The number of substrates prepared at each DNA concentration may be determined in consideration of the P detection limit concentration (about 10 ppb) in the ICP-MS apparatus and the number of DNA molecules on each substrate. It is not limited to the number shown in.
[0056]
(Example 3)
TOF-SIMS measurement
The DNA chip shown in FIG. 1 is transported to the analysis room of a time-of-flight secondary ion mass spectrometer (TOFSIMS IV: ION TOF), and the implantation dose of primary ions is 1 × 10 5 under the conditions shown in Table 1.¹²  atoms / cm²Until the secondary ion PO is detected._Three ^-(Mass-to-charge ratio 78.958 amu (Atom Mass Unit)) was integrated to determine the cumulative intensity. FIG. 2 shows the correspondence between the average value of secondary ion intensity measured at each DNA concentration dot position from the first line to the third line and the formation density of DNA (number of DNA molecules per dot). It was. Here, the PO measured on the surface-treated substrate immediately before the probe DNA is fixed._Three ^-The strength of was used as the background.
[0057]
It was confirmed that the formation density of DNA in each row of dots and the secondary ion intensity were proportional. Under the same measurement conditions, a TOF-SIMS measurement was performed on a nucleic acid probe formed with a nucleic acid concentration of 8 μM in a DNA solution discharged by an inkjet printer._Three ^-The formation density of DNA in each dot (number of DNA molecules per dot) determined from the number of counts was about 2.0 × 10⁷Thus, the variation within 10 arbitrarily selected dots was 20% or less.
[0058]
[Table 1]

[0059]
Example 4
Image display of formation density distribution
A plurality of nucleic acid probes of the same sample used in Example 3 are set, primary ions are scanned on the sample surface, and generated secondary ions are displayed corresponding to each scanning point, and obtained at each scanning point. P^-Pseudo color is set by dividing the intensity of the image into multiple stages, and P^-The distribution of intensity distributions, ie, the surface density of nucleic acids (number of nucleic acid molecules per probe dot) formation density, was quantitatively compared.
[0060]
【The invention's effect】
The nucleic acid chip of the present invention comprises a nucleic acid probe dot for concentration reference, on which an average nucleic acid density per dot is determined, which is formed on the chip substrate by the same method as the formation of the nucleic acid probe dot. , When quantitatively evaluating the amount of probe nucleic acid in a dot containing a nucleic acid probe such as DNA, or the amount of target nucleic acid after hybridization, using the nucleic acid probe dot for concentration reference, for example, It is created based on the signal intensity of secondary ions detected when secondary ion mass spectrometry is performed on multiple types of nucleic acid probe dots for concentration reference having an average nucleic acid density in multiple stages. Using the calibration curve
The nucleic acid concentration of the nucleic acid probe / dot having an unknown concentration arranged on the substrate can be determined by secondary ion mass spectrometry, and reproducibility and quantitative performance are improved as compared with the conventional method. By using the method of the present invention, the reliability of the nucleic acid chip product can be increased. In addition, the distribution of the formation density of nucleic acid probes / dots arranged in a matrix in the nucleic acid chip can be displayed as an image.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing a planar arrangement and a cross-sectional shape (cross section taken along AA ′) showing an example of the configuration of a biochip according to the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between measured secondary ion intensity and DNA formation density (number of DNA molecules per probe dot) for a biochip.
[Explanation of symbols]
100: Nucleic acid probe
101: Region where a nucleic acid probe with an unknown nucleic acid concentration is formed
102: Region where a nucleic acid probe with a known nucleic acid concentration is formed
103: Substrate
104: Surface treatment layer made of organic material

Claims

A method of analyzing a nucleic acid chip in which a nucleic acid probe / dot comprising a plurality of nucleic acid-related substances is arranged on a substrate,
On a part of the substrate surface on which the nucleic acid probe dot is formed,
A nucleic acid probe / dot for concentration reference is provided, which is formed by the same method as the formation of the nucleic acid probe / dot, and the amount of nucleic acid fixed to the dot is determined,
Perform secondary ion mass spectrometry of the nucleic acid probe / dot for concentration reference and the nucleic acid probe / dot of unknown concentration under the same primary ion irradiation condition,
Determine the nucleic acid concentration of the unknown concentration nucleic acid probe / dot based on the concentration standard nucleic acid probe / dot,
The nucleic acid probe dot for concentration reference is
Separately, the amount of nucleic acid immobilized on the dots is determined by chemical analysis
A method for analyzing a nucleic acid chip.

As the chemical analysis means,
ICP-MS (Inductively Coupled PlasmaMass Spectrometry, hereinafter referred to as ICP-MS) with analysis, according to claim 1, characterized in that the amount nucleic acid is fixed to the dot has been determined Nucleic acid chip analysis method.

As the concentration standard nucleic acid probe dot,
A plurality of nucleic acid probe dots having a plurality of nucleic acid amounts, each of which has a determined amount of nucleic acid fixed to the dot,
Using a calibration curve created based on the signal intensity of secondary ions detected when secondary ion mass spectrometry is performed on a plurality of types of nucleic acid probe / dots having a plurality of nucleic acid amounts. 3. The method for analyzing a nucleic acid chip according to claim 1 , wherein the nucleic acid concentration of the nucleic acid probe / dot having an unknown concentration arranged on the substrate is determined by secondary ion mass spectrometry.

The nucleic acid chip is
The nucleic acid probe composed of single-stranded nucleic acid and the target nucleic acid introduced by hybridization with the nucleic acid probe are both disposed on the substrate . The method for analyzing a nucleic acid chip according to one item .

As the secondary ion mass spectrometry,
5. The method according to claim 1, wherein time-of-flight secondary ion mass spectrometry is used.

The secondary ion intensity detected in the secondary ion mass spectrometry is
When the dose amount of the primary ions is set to a constant value selected to be 1 × 10 ¹⁴ / cm ² or less, the specific ion derived from the nucleic acid probe emitted from the constant area irradiated with the primary ions is used. The method according to claim 1, wherein the integrated intensity (count number) of secondary ions is used.

The secondary ion intensity detected in the secondary ion mass spectrometry is
When the dose amount of the primary ions is set to a constant value selected to be 1 × 10 ¹² / cm ² or less, the specific ion derived from the nucleic acid probe emitted from the constant area irradiated with the primary ions is used. The method according to claim 1, wherein the integrated intensity (count number) of secondary ions is used.

As secondary ions detected in the secondary ion mass spectrometry,
Adenine, thymine, guanine, cytosine, anion hydrogen atom from each base uracil released one de ^{^{or,, P -, PO -,}} PO 2 -, PO 3 - consisting of secondary ions derived from the nucleic acid probe The method according to claim 1, wherein an anion selected from the group of species is used.

Based on the intensity of secondary ions detected in the secondary ion mass spectrometry,
In correspondence to the irradiation position of the primary ions, the secondary ion strength as an image image for two-dimensionally displaying, according to any one of claims 1 to 7, characterized by providing the step of displaying the detection result the method of.