JP3990948B2

JP3990948B2 - Analysis method of nucleic acid hybrid using time-of-flight secondary ion mass spectrometry with halogen labeling

Info

Publication number: JP3990948B2
Application number: JP2002191414A
Authority: JP
Inventors: 尚志岡本; 博光高瀬; 浩行橋本
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2007-10-17
Anticipated expiration: 2022-06-28
Also published as: JP2004033038A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の核酸プローブが担体上にマトリクス状に配置されたプローブ担体に試料を反応させて得られる分析用試料の飛行時間型二次イオン質量分析法を用いた分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
DNAチップ、RNAチップ等の核酸チップはゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの目的に利用されるようななってきており、また、それらの解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
【０００３】
核酸チップの作製方法にはいくつかの方法が知られている。DNAチップを例にとって説明すると、基板上にフォトリソグラフィーを用いてDNAプローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第5405783公報等）、あるいは、あらかじめ合成したDNA、または、cDNA（コンプリメンタリーDNA）を基板上に供給し結合する方法（米国特許第5601980公報、特開平11‐187900号公報、Science Vol.270, 467, 1995等）が代表的なDNAチップの作製法である。
【０００４】
一般的には、これらいずれかの方法によって核酸チップが作製され、このチップと、検出を目的とする核酸、いわゆる、標的核酸を含有する溶液とをハイブリダイゼーション条件においた後に、核酸チップ上の核酸プローブと標的核酸のハイブリッド形成の有無を何らかの手段によって検出することによって所望の目的が達成される。
【０００５】
その際、解析の信頼性、すなわち、定量性、再現性を保証するためには各マトリクスに存在するハイブリッドの量、つまり、密度を知ることが重要である。また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するかを知ること（イメージング）も、やはり、定量性、再現性の確保といった見地から重要である。さらに、特に後述するように、チップ作製のための基板に、マトリクスの位置を示すための物理的アドレスが存在しない場合に、例えば、インクジェット法によってプローブ溶液を微小な液滴として供給するような手法でチップを作製すると、物理的アドレスがないので、検出の手段によっては、チップのどの部分を分析しているのかわからないという問題をかかえることになる。そのような場合は、採用している検出手段そのものによるマトリクス位置の顕影化が必要になる。
【０００６】
これらの高感度な表面解析技術としては標的核酸をアイソトープラベルする方法が知られてはいるが、手法が煩雑、危険、特殊な施設、装置が必要等の理由で一般的ではない場合が多い。
【０００７】
別の方法としては標的核酸を蛍光標識する方法、すなわち、蛍光ハイブリダイゼーション法が考えられ、実際に一般的に用いられているが、蛍光色素の安定性、クエンチング、蛍光色素の基板表面への非特異的吸着等の問題があり、ハイブリッド体の定量的な把握には課題が残る場合がある。
【０００８】
他に、一般的な高感度表面分析手段としてはFT-IR（フーリエ変換赤外分光）法を用いたATR法、XPS（X線光電子分光）法等があるが、いずれも核酸チップ上でハイブリッド体の定量的分析、あるいは、イメージングには十分な感度を有しているとはいえない。特に、核酸チップの基板として一般的なガラスを用いる場合には、例えばFT-IR（ATR）ではガラスに起因する吸収の影響、XPSではチャージアップの影響等があり、有効な分析手段とはいえない場合がある。
【０００９】
また、別の高感度表面分析手段としては、レーザー共鳴イオン化法（RIS：Resonance Ionization Spectroscopy）によるDNAの検出方法が米国特許第5821060公報に開示されている。これは試料表面から放出される注目元素のイオン化エネルギーに相当する波長のレーザービームを照射して当該元素をイオン化し検出するもので、試料表面から元素を放出させる手段としては、レーザービームを用いる方式、イオンを用いる方式が開示されているが、特定元素の検出しかできないという問題を持つ。
【００１０】
さらに他の高感度表面分析手段としては、動的二次イオン質量分析法（dynamic-SIMS）があるが、この手法は二次イオンが生成する過程で有機化合物が小さいフラグメントイオン、または粒子にまで分解してしまうために質量スペクトルから得られる化学構造情報が乏しくなり、例えば、核酸関連物質のような有機物の分析には適していない。
【００１１】
これに対して、同じく二次イオン質量分析法の一手法として知られている、飛行時間型二次イオン質量分析（TOF-SIMS）法は、固体試料の最表面にどのような原子または分子が存在するかを調べるための分析方法であり、以下の様な特長を持つ。すなわち、10⁹atoms/cm²（最表面１原子層の1/10⁵に相当する量）の極微量成分の検出能があること、有機物、無機物のどちらにも適用できること、表面に存在するすべての元素や化合物を測定できること、試料表面に存在する物質からの二次イオンのイメージングが可能なことである。
【００１２】
以下、この方法の原理を簡単に説明する。高真空中で、高速のイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射すると、スパッタリング現象によって表面の構成成分が真空中に放出される。このとき発生する正または負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を電場によって一方向に収束し、一定距離だけ離れた位置で検出する。スパッタの際には、試料表面の組成に応じて様々な質量をもった二次イオンが発生するが、軽いイオンほど早く、反対に重いイオンほど遅い速度で飛行するため、二次イオンが発生してから検出されるまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。
【００１３】
従来のdynamic-SIMSでは、すでに述べたように、イオン化の際に有機化合物が小さいフラグメントイオンまたは粒子にまで分解してしまうため、質量スペクトルから得られる化学構造情報が乏しいのに対し、TOF-SIMSでは一次イオン照射量が著しく少ないため、有機化合物は化学構造を保った状態でイオン化され、質量スペクトルから有機化合物の構造を知ることができる。固体試料表面の最も外側で発生した二次イオンのみが、真空中へ放出されるので、試料の最表面（深さ数Å程度）の情報を得ることができる。
【００１４】
TOF-SIMS装置には大きく分けてセクター型とリフレクトロン型のふたつのタイプがある。これらの方法の違いのひとつは被分析試料を固定するホルダの電気的な接地方法である。セクター型では装置の機構上、上記ホルダに数ｋＶの正または負の電圧を印加することで二次イオンを質量分析計に導いているのに対し、リフレクトロン型ではホルダは接地され、二次イオン引き出し電極に数ｋＶから数１０ｋＶの正または負の電圧を印加することで二次イオンを質量分析計に導いている。
【００１５】
TOF-SIMS法では正の一次イオンが多用されるが、一次イオンの極性にかかわらず正の二次イオンと負の二次イオンが発生する。また、一次イオンの極性にかかわらず、一般的な測定条件では一次イオンの照射により二次電子が発生し、この二次電子の発生量が一次イオン量に比べて多量であるために、結果として被分析試料の表面は正に帯電し易く、この帯電電荷が過剰になると（いわゆるチャージアップ状態）測定に支障をきたすことになる。その際、装置構成を考えると、セクター型装置を用いて絶縁物の負の二次イオンを測定する場合に最も大きく正に帯電し得るといえる（発生した二次電子がすべて、上記の正電圧を印加した二次イオン引き出し電極に向かってしまうため）。
【００１６】
上記の正帯電を中和するため、セクター型、リフレクトロン型の両タイプとも帯電中和用のパルス型電子銃を装備することが多い。この電子銃による具体的な帯電中和方法とは、一次イオン（サブ〜数ｎｓｅｃパルス）照射、正または負の二次イオンの飛行時間計測の後、次の一次イオンパルスを照射するまでの間に、上記パルス型電子銃からの電子線を被分析試料に一定時間照射する、というものである。なお、上記電子線を被分析試料に照射する間は、セクタ型ーにおける試料ホルダへの電圧印加、および、リフレクトロン型における二次イオン引き出し電極への電圧印加はともに停止され、接地される。
【００１７】
この方法により、上記の正帯電は緩和され（若しくは解消し）、絶縁物の分析が可能となることが多いが、上記の説明と同様、セクタ型ー装置を使った絶縁物の測定で、負の二次イオンを測定する場合が最も大きく正に帯電し易いため、帯電中和のマージンはこの場合が最も狭い。いずれにしても、チャージアップを回避するには、試料ホルダが電気的に接地されているリフレクトロン型の装置を使う方が、セクター型装置を使うよりも（一般的には）有利である。特に被分析試料の導電率が低い場合（抵抗率が高い、もしくは、誘電率が高いと言い換えることができる）、例えば、ガラス等の場合にはリルレクトロン型の方が測定に適しているといえる。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
さて、リフレクトロン型であれ、セクター型であれ、TOF-SIMS法はきわめて感度の高い分析方法であるために、チャージアップの影響が少ない、例えば、金基板上に単分子膜レベルで形成されたオリゴヌクレオチドを分析することが可能である（Proceeding of the 12^th International Conference on Secondary Ion Mass Spectrometry 951, 1999）。上記文献には、基板に固定化されたDNA、および、PNAのTOF-SIMS法による分析結果が記載されており、それによれば、TOF-SIMS法によって検出されるフラグメントイオンとして、DNAプローブの場合にはリン酸バックボーン由来のPO₂ ^-、とPO₃ ^-イオン、塩基由来の（チミン-H）^-イオンが、また、PNAプローブの場合には、やはり（チミン-H）^-イオンがあげられている。
【００１９】
しかしながら、上述のTOF-SIMS法を検出手段として、一般的に用いられている方法であるDNAチップを標的用いてDNAを検出することにより、所望の遺伝子情報を得ようとすると、
（１）TOF-SIMS法は表面近傍のごく薄い層のみが検出されること、
（２）プローブDNAと標的DNAから生起するフラグメントイオン種が同一である、というふたつの理由により標的DNAのハイブリッドの有無を特異的に検出できないという問題を生ずることになる。
【００２０】
このような問題点を解決する手段としてPNA（ペプチド核酸）を固相に結合してプローブとし標的核酸とハイブリッドを形成させる方法がある（J. C. Feldner et al：SIMS ＸIII国際会議；2001年11月11日〜16日、奈良）。この方法によれば、ペプチド核酸は塩基部分はDNAと同じではあるが、リン酸バックボーンを持たないので、リン酸バックボーンによるフラグメントイオンが検出されれば、PNAプローブと標的核酸とのハイブリッド形成が確認されることになる。
【００２１】
しかしながら、ペプチド核酸は価格が高いため、ペプチド核酸をプローブとしたチップを用いる遺伝子情報の取得は高コストとなり実用的とはいえず、従来技術にはない、検出効率と定量的な検出が可能なフラグメントイオンを供出可能な標的核酸の標識方法が望まれていた。
【００２２】
このようなフラグメントイオンの供出方法として、特開昭61‐11665号公報には電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、高速ゲルろ過法により分子量分離した核酸断片に、S、Br、I、等の非金属元素、または、Ag、Au、Pt、Os、Hg等の金属元素を導入して、これらの元素を原子吸光分析法、プラズマ発行分析法、または、質量分析法によって同定する手段を設けた核酸塩基検出装置に関する記載があるが、質量分析装置に関する具体的な記載、また、特にハロゲン原子の核酸への導入方法に関しての記載はない。
【００２３】
一方、チップ上の核酸ハイブリッドの量的把握を別の観点からみると、実際に核酸プローブ領域として形成されているマトリクスそのものを分析する必要があるが、特開平11-187900号公報にひとつの例として記載されているDNAチップの作製方法である、あらかじめ合成されたDNAプローブの溶液をインクジェット法で基板表面へ吐出、結合せしめる場合、基板上でマトリクス（吐出されたDNAが結合されたスポット）の位置を知る手段がない場合があり、そのような場合にはTOF-SIMS法によって、スポットでのハイブリッド体をイメージングして、イメージングされたスポットにおけるフラグメントイオンの分析が為されることが望ましい。しかしながら、上記、特平11-187900号公報にはそのような記載がなく、また、特開昭61‐11665号公報には上述のように、質量分析法には言及があるが、TOF-SIMS法にチップ上でのハイブリッドのイメージング方法と標的核酸の量的分析に関しては全く記載されていない。
【００２４】
さて、TOF-SIMS法により核酸チップのイメージングと、核酸チップ上の核酸の量的分析を行おうとした際、スポットのサイズ、あるいは、検出の効率等を勘案すると、イメージングされるエリアの面積は、例えば、300μm×300μm以上が望ましいが、DNAチップの作製のための基板として、よく用いられるガラス等の比較的抵抗率の高い基板を用いて、300μm×300μmの範囲を、一次イオンビーム直径を必要な解像度を得るための5μmで、テレビの受像機のように一定の方向にビームを順次スキャン（ラスタースキャン）し、画像を得ようとすると、チャージアップの影響が大きく、良好な画像を得ることができないことになる。
【００２５】
本発明の目的は、プローブ担体に試料を反応させた測定用試料に形成された核酸プローブと標的核酸とのハイブリッド体の形成の有無を、固定化した核酸プローブの状態、例えば、配置位置のイメージングやその量的分析を正確に行うことができる測定用試料の分析方法を提供することにある。
【００２６】
もっとも、本発明の方法は、互いに相手を認識して複合体を形成する物質であって、一方が担体に固定化され、他方にハロゲン原子が標識として導入可能なものであれば適用可能である。そのような物質の例としては、抗原、抗体、酵素等のタンパク質、また酵素と特異的に結合する基質等をあげることができる。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記、TOF-SIMSを用いて、比較的抵抗率の高い担体上の比較的面積の大きな部分での核酸プローブと標的核酸のハイブリッドのイメージングと、量的把握を行う際の課題を検討して結果、以下の発明を為すに至った。
【００２８】
本発明の測定用試料の分析方法は、核酸プローブの固定化領域の多数が担体上に各々が独立してマトリクス状に配置されたプローブ担体に、試料を反応させて得られた分析用試料を分析する方法において、
標的物質が核酸であり、該標的物質としての核酸のピリミジン塩基の５位またはプリン塩基の８位にハロゲン原子が結合しており、前記核酸プローブと前記標的物質の結合体の形成の有無を、該ハロゲン原子を飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）によって測定することにより検出ことを特徴とする分析用試料の分析方法である。
【００２９】
本発明によれば、プローブ担体に試料を反応させた測定用試料に形成されたプローブと標的物質との結合体（核酸の場合は、核酸プローブと標的物質とのハイブリッド体）の形成の有無を、固定化したプローブの状態で、例えば、その配置位置のイメージングやその量的分析を正確に行うことができる測定用試料の分析方法を提供することができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明は、TOF-SIMSを用いてハイブリッド体のイメージングと分析を行うにあたり、標的物質を、好ましくは既定の数のハロゲン原子で標識し、ハロゲン原子のフラグメントイオンをTOF-SIMS法によって検出、分析することにより上記の目的を達成するものである。
【００３１】
ハロゲン原子はイオン化効率が比較的高いので、そのフラグメントイオンを用いての検出の感度の向上が期待できるとともに、一次イオン強度を低減することによりチャージアップの影響も、その分排除でき、後述する方法と合わせて、抵抗率の高い基板上での大面積のイメージングが可能となる。
【００３２】
また、既定の数のハロゲン原子で標識することにより、核酸に対して適用する場合には、上述した核酸固有のフラグメントイオンのみを検出する場合の問題点を解決し、より定量性の高い分析が可能となる。
【００３３】
担体上に固定されるプローブは、特定の標的物質を認識してこれと結合体を形成し得るものであり、核酸の場合は、核酸プローブが相補配列を有することにより標的核酸に対して特異的に結合可能なものである。担体への核酸プローブの固定化には公知の方法が利用でき、担体上に固定化されるプローブの一例としては、標的核酸とハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドなどからなる核酸プローブの一部に必要に応じてリンカーを介して担体との結合部を有するもので、担体との結合部において担体表面に連結された構造を有するものを挙げることができる。なお、このような構成の場合における担体と結合部の核酸プローブの分子内での位置は、所望とするハイブリダイゼーション反応を損なわない範囲内において特に限定されない。
【００３４】
本発明におけるプローブ担体は、プローブを固定化した独立領域、例えばドット状スポットの多数を所定の間隔をおいてマトリクス状などの配置で配列したもので、この形態には、プローブ・アレイ、マイクロチップ、核酸チップなどが含まれる。
【００３５】
一方、プローブは担体表面に結合可能な構造を有しており、担体上へのプローブの固定がこの結合可能な構造を介して行われていることが望ましい。その際、プローブが有する担体表面に結合可能な構造は、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、酸ハライド化物（ハロホルミル基；−ＣＯＸ）、ハライド化物（−Ｘ）、アジリジン、マレイミド基、スクシイミド基、イソチオシアネート基、スルフォニルクロリド基（−ＳＯ₂Ｃｌ）、アルデヒド基（ホルミル基；−ＣＨＯ）、ヒドラジン及びヨウ化アセトアミドなどの有機官能基の少なくとも１種を導入する処理により形成されたものであることが好ましい。また、プローブ側の担体への結合に必要な構造に応じて、担体の表面に必要とされる処理、例えばチオール基用のマレイミド基、アミノ基用のエポキシ基、アルデヒド基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基などを担体表面に形成する処理を施すことで共有結合によるプローブの固定が可能となる。なお、プローブは安定性を考えると、基板表面に共有結合によって結合されていることが望ましい。
【００３６】
プローブと標的物質との組合せとしては、核酸プローブと標的核酸との組合せや、抗原、抗体、酵素等のタンパク質、また酵素と特異的に結合する基質等から選択される結合体を形成し得る組合せをあげることができる。
【００３７】
本発明で用いる核酸プローブは特に限定されるものではないが、標的核酸を認識し得るものであればよいが、例えば、DNA、RNA、PNA（ペプチド核酸）、cDNA（コンプリメンタリーDNA）、cRNA（コンプリメンタリーRNA）のいずれかであることが望ましく、これらの少なくとも１種からなる核酸プローブを担体に固定化することができる。
【００３８】
本発明で用いる標的核酸としては、後述のハロゲン原子による標識方法を勘案するとDNA、RNA、PNA（ペプチド核酸）、cDNA（コンプリメンタリーDNA）、cRNA（コンプリメンタリーRNA）のいずれかであることが望ましく、これらの少なくとも１種からなる標的核酸を含む試料を分析対象とすることができる。標的核酸としては合成の核酸でも動物、人、植物、微生物などの天然由来のものでもよい。
【００３９】
本発明では測定用試料（試料と反応させた後に必要な処理を行ったプローブ担体：以下代表として主に「核酸チップ」で説明する）のイメージング方法として、一次イオンを、核酸チップ表面の特定の面積を有する部分に対して、該面積に対して相対的に小さな面積を有するスポットとしてパルス的に順次照射して、該パルス照射によって発生する二次イオンを、それぞれのパルス照射ごとに飛行時間的に質量分析する方法を用いるが、その際、チャージアップの影響を排除する方法として、一次イオンのパルス照射を、非連続的パターンに基づいて行い、得られたそれぞれの質量分析の結果を、一次パルス非連続の照射のパターンに基づいて再構成して画像化することが極めて有効で望ましい形態である。
【００４０】
その場合、非連続的パターンとして、ランダムなパターン、あるいは、特定のプログラムに従った非連続的なパターンを例としてあげることができる。
【００４１】
連続パターンと非連続パターンを簡単なモデルで説明すると、以下のようになる。
【００４２】
図２に、照射における連続的パターン（１）と非連続パターン（２）の例を示す。この場合、例えば、矩形のエリアを５×５個のスポットで一次イオンパルスを照射するとすると、図２の（１）のように、ひとつのスポットから隣接するスポットに順次全てのスポットを照射するパターンが連続的パターンであり、ひとつのスポットを照射し、次ぎに、すくなくとも隣接しないスポットを順次、全てのスポットを照射する図（２）パターンが非連続的パターンである。
【００４３】
非連続的パターンを乱数に基づいてランダムに形成することも場合によっては可能であるが、その場合には隣接したスポットを連続して照射する可能性もあるので、そのような場合にはあらかじめ、望ましい特定のプログラムにしたがった非連続パターンを形成しておけば良い。望ましいパターンとしては、上述のように、隣接したスポットを連続して照射しない、あるいは、隣接した行、列に存在するスポットを連続して照射しないなどのアルゴリズムが適宜採用できる。
【００４４】
この場合、例えば、矩形のエリアを５×５個のスポットで一次イオンパルスを照射するとすると、上左図のように、ひとつのスポットから隣接するスポットに順次全てのスポットを照射するパターンが連続的パターンであり、ひとつのスポットを照射し、次ぎに、すくなくとも隣接しないスポットを順次、全てのスポットを照射する上右図パターンが非連続的パターンである。
【００４５】
非連続的パターンを乱数に基づいてランダムに形成することも場合によっては可能であるが、その場合には隣接したスポットを連続して照射する可能性もあるので、そのような場合にはあらかじめ、望ましい特定のプログラムにしたがった非連続パターンを形成しておけば良い。望ましいパターンとしては、上述のように、隣接したスポットを連続して照射しない、あるいは、隣接した行、列に存在するスポットを連続して照射しないなどのアルゴリズムが適宜採用できる。
【００４６】
ハロゲン原子の標識の数に関しては特に限定されず、標識の位置、標識方法も、それが可能であり、後のプローブと標的物質との結合体の形成（核酸の場合はハイブリッド体の形成（ハイブリダイゼーション））を阻害しければ、いかような方法も可能であるが、実際には、ひとつのヌクレオチドに対し一個所の標識が現実的であり、その意味では、ハロゲン原子の既定の数は1から上記標的核酸のヌクレオチド数までのいずれかであることが望ましく、核酸が合成オリゴヌクレオチドの場合には、標識の手間、コスト、また、ハロゲン原子のイオン化効率の高さ等を勘案して1から5個であれば、さらに望ましいといえる。また、PCR法のように酵素伸長反応を用いて標識の導入を図ろうとする場合、標識が蛍光色素のように比較的大きな場合には立体障害等により標識導入数に限りがあるが、標識がハロゲン原子であれば、例えば、一種類の塩基（例えばアデニン）を全て標識することが可能であるので、標識数を定量的に把握できるとともに、感度、標識導入方法の点からも望ましいといえる。
【００４７】
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子を挙げることができ、TOF-SIMS法ではフッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子の各フラグメントイオンが検出可能である。これらの４種のハロゲン原子は、例えば以下に記載される方法により核酸プローブに導入可能である。
【００４８】
プローブ担体の各マトリクスの標的物質である核酸を、それぞれ別のハロゲン原子によって標識しても良い。
【００４９】
なお、標的物質の含有が未知である試料については、試料に対してハロゲン原子による標識処理を行って、これをプローブと反応させることで、試料中にプローブが認識し得る標的物質が存在する場合、これらの結合体が形成されるので、この結合体を標識したハロゲン原子を用いて検出することが可能となる。
【００５０】
TOF-SIMS法ではフッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子の各フラグメントイオンが検出可能であり、また、後述の方法によれば、標的核酸にも、上記4種のハロゲン原子を導入可能なので、本発明には、これらのハロゲン原子が利用できる。
【００５１】
ハロゲン原子の標的核酸への導入方法についても、特に限定されないが、よく知られている例としては、ハロゲン原子を標的核酸のヌクレオチドの塩基に結合させる方法をあげることができ、本発明でも、この方法を好適に用いることができる。その際、ハロゲン原子が標的核酸の、該標的核酸が核酸プローブとハイブリッドを形成する際に、該ハイブリッド形成を阻害しない位置に結合していることが望ましい。そのような位置は、ピリミジン塩基の5位、プリン塩基の8位である。ただし、標的核酸の全てのヌクレオチド塩基のハロゲン原子がこの位置に結合していることは必ずしも必須ではない。
【００５２】
ハロゲン原子の標的核酸へのより具体的な方法としては、標的核酸が合成DNAの場合、DNAをDNA自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、以下に構造式で示す２’‐デオキシリボヌクレオシド‐３’‐フォスフォロアミダイトを用いる方法を例としてあげることができる。
【００５３】
【化２】

（上記各式において、Ｘはハロゲン原子を、DMTOはジメトキシトリチル基を、iPrはイソプロピル基を、CNEtは２‐シアノエチルを表す。）
また、核酸プローブが合成RNAの場合には、RNAをRNA自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、リボヌクレオシド‐3’‐フォスフォロアミダイトを用いればよく、そのような合成ユニットの例として、以下に構造式の化合物をあげることができる。
【００５４】
【化３】

（上記式において、Xはハロゲン原子（F、Cl、BrまたはI）を、DMTOはジメトキシトリチルを、iPrはイソプロピルを、CNEtは2‐シアノエチルを、Meはメチルを、TBDMSはt-ブチルジメトキシシリルをそれぞれ表す。）
さらに、核酸プローブが合成PNAの場合では、PNAをPNA自動合成装置で合成する際に、ハロゲン原子を結合した合成ユニット、すなわち、核酸塩基結合ペプチドアナログを用いれば好適である。
【００５５】
また、標的核酸がcDNAの場合には、cDNAを逆転写酵素によって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した2’‐デオキシリボヌクレオシド‐5’‐三リン酸を用いる方法がハロゲン原子導入法の例としてあげることができる。
【００５６】
標的核酸がゲノムDNAから誘導されたDNAの場合には、ハロゲン原子の該DNAへの導入が該DNAをDNAポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合した2’‐デオキシリボヌクレオシド‐5’‐三リン酸を用いる方法を例としてあげることができ、標的核酸がcRNAの場合には、ハロゲン原子の該cRNAへの導入が該cRNAをRNAポリメレースによって伸展合成する際に、ハロゲン原子を結合したリボヌクレオシド‐5’‐三リン酸を用いて行うことができる。
【００５７】
上記の各伸展反応にはPCR反応、またはRT‐PCR（逆転写PCR）反応を用いることも可能である。
【００５８】
本発明で用いる核酸チップの核酸プローブ種は特に限定されるものではなく、DNA、RNA、PNA（ペプチド核酸）、cDNA（コンプリメンタリーDNA）、cRNA（コンプリメンタリーRNA）、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド等を用いることができる。
【００５９】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。
【００６０】
実施例１（核酸プローブチップの作製）
特開平11-187900号公報に記載の方法に準じて核酸プローブチップを作製した。
【００６１】
（１）基板洗浄
25．4mm×25．4mm×1mmの合成石英基板をラックに入れ、純水で10％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：GPIII）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、そのまま次工程に供した。
【００６２】
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシランＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液に上記（１）で得た基板を室温で1時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
【００６３】
次いでＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った石英基板をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のスクシイミド基を反応させた。この段階で基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
【００６４】
（３）プローブＤＮＡの合成
DNA合成業者（ベックス）に依頼して配列番号：１の一本鎖核酸（ｄTの40量体）を合成した。なお配列番号：１の一本鎖ＤＮＡの5'末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはHPLCを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
【００６５】
配列番号：１
5' HS-(CH₂)₆-O-PO₂-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 3'
【００６６】
（４）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
上記配列番号：１の一本鎖ＤＮＡを８μＭの濃度でグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及び、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液に溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キヤノン：但し、バブルジェットは登録商標である）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン）を数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドを上記石英基板上へ吐出可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に上記ＤＮＡ溶液を数１００μｌ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板を装着して、ここにスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は４ｐｌ／ｄｒｏｐｌｅｔで、スポッティングの範囲は基板の中央部に１０ｍｍ×１０ｍｍの範囲に２００ｄｐｉすなわち１２７μｍのピッチで吐出した。この条件ではスポッティングされたドットの直径は約５０μｍであった。
【００６７】
スポッティング終了後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を純水で洗浄し、1MのNaClを含む50mMリン酸緩衝液（pH＝7.0、以下溶液A）中で保存した。
【００６８】
実施例２（ハイブリダイゼーション、および、TOF-SIMSによるイメージング、分析）
（１）モデル標的核酸の合成
配列番号：２
5' A（Br）A（Br）A（Br）A（Br）A（Br）AAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3'
【００６９】
【化４】

【００７０】
あらかじめ5個の臭素原子で修飾したモデル標識核酸（配列番号：２、dAの40量体）を合成した（ベックス）。5’側の5個のヌクレオチドは上図に構造をしめした、8-ブロモ‐3’‐デオキシアデノシンフォスフォロアミダイトを用いて、自動合成機での合成時に導入した。脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはHPLCを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。なお、配列中のA（Bｒ）が臭素標識デオキシアデノシンをしめしている。また、標識位置であるアデニンの８位はハイブリダイゼーションを阻害しない位置であることが知られている。
【００７１】
（２）ブロッキング、および、ハイブリダイゼーション
実施例１で作製したチップを2%牛胸腺アルブミン（BSA）を含む溶液A中に室温下、3時間浸漬し、チップ表面をブロッキング（核酸等の非特異的吸着を目的とする）した後、上記配列番号：２のモデル標的核酸を50nMの濃度で溶解した溶液Aに浸漬し、45℃で15時間ハイブリダイゼーションを行った。次いで、純水（室温）でリンスした後、窒素ガスを吹き付けて乾燥し、TOF-SIMSの分析まで真空デシケーター中で保存した。
【００７２】
（３）TOF-SIMSによる分析
ハイブリダイゼーションを行ったDNAチップのイメージング、および、分析をION TOF社製TOF-SIMS IVを用いて行った。
【００７３】
以下に装置条件をまとめた。
＜一次イオン＞
一次イオン：25kV Ga⁺、ランダムスキャンモード
一次イオンのパルス周波数：2.5kHz（400μsec / shot）
一次イオンパルス幅：1ns
一次イオンビーム直径：5μm
＜二次イオン＞一次イオンの照射パターンについて再構成しイメージング
二次イオン検出モード：negative
測定領域：300μm×300μm
二次イオンimageのpixel数：128×128
積算回数：256
【００７４】
（４）結果
図1に（２）でハイブリダイゼーションを行ったDNAチップをTOF-SIMS IV型装置で上記条件に基づき分析し、得られたデータから臭素イオンについてイメージングを行った結果を示す。図1-1、1-2は、それぞれ、⁷⁹Br^-イオン、⁸¹Br^-イオンに由来するものである。
【００７５】
【表１】

表1は図1から各1個のスポットのカウント数を示したものである。図1、および、表1からDNAチップ上で核酸プローブとハイブリッドを形成した臭素標識標的DNAのスポットの標識物質である臭素によるイメージングと、量的な把握が可能であることがわかる。
【００７６】
実施例3 （ゲノム由来の臭素標識標的DNAのイメージング、分析）
（１）ゲノム由来の標的DNA検出用核酸チップの作製
Nature Biotechnology Vol. 18, 438, 2000にはヒト口腔扁平上皮癌のふたつのセルライン、HSC4とHSC5のゲノムDNAのエキソン７の変異を検出するためのオリゴヌクレオチドチップの作製と、このチップを用いての、上記エキソンから誘導された蛍光標識DNAの検出に関して記載されている。
【００７７】
本実施例では上記方法に準じて、オリゴヌクレオチドチップを作製し、標識を蛍光から臭素に替えてDNAを合成し、さらに、このDNAを用いてハイブリダイゼーションを行った。
【００７８】
以下に具体的な手順について述べる。
・DNAプローブの合成とチップの作製
配列番号：３
5' HS-(CH₂)₆-O-PO₂-O-GATGGGCCTCCGGTTCAT 3'
【００７９】
上記HSC４のエキソン７の塩基配列の一部（コドンNo.248を含む部分）に相補的な塩基配列を有し、5’末端に基板への結合のためのチオール基を担持した、配列番号：３のDNAを実施例１と同様に合成し、また、このDNAを用いて実施例１と同様にしてDNAチップを作製した。
【００８０】
（２）ゲノム由来の臭素標識DNAの合成
配列番号：４
E7S : 5' - ACTGGCCTCATCTTGGGCCT- 3' (exon 7, sense)
配列番号：５
E7A : 5' - TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC- 3' (exon 7, anti-sense)
【００８１】
【化５】

【００８２】
まず、配列番号：４、５のPCRプライマー（HSC4、HSC5に共通：ベックスに合成依頼）を用いて、HSC４のゲノムからエキソン７の部分をPCR反応で合成した。すなわち、20ngのゲノムDNAと各0.4μMのセンス、アンチセンスプライマーを含む50μlのPCRミクスチャーを94℃（30sec）、60℃（45sec）のサイクルを40回繰り返してPCR増幅を行った。得られる鎖長は171ヌクレオチドと設計されている。
【００８３】
次に、上記増幅産物の一部を鋳型として、0.2μMのセンスプライマー（配列番号：４）と、上図に構造を示した臭素標識ヌクレオチドの一種である、5‐ブロモ‐2’‐デオキシウリジン三リン酸（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を10μMで用いてssPCR（一本鎖PCR）を行った。PCRサイクルは96℃（30sec）、50℃（30sec）、60℃（4min）、25サイクルである。なお、得られた臭素標識一本鎖DNAはゲルろ過によって精製した。
【００８４】
（３）ブロッキング、および、ハイブリダイゼーション
（１）で作製したチップを実施例１と同様な方法よりブロッキングした後、純水でリンスし、以下のハイブリダイゼーションに用いた。（２）で合成したゲノム由来のDNA を10nMの濃度で溶解した、20％ホルムアミドを含む6×SSPE（0.9M NaCl、60mM NaH2PO4、6mM EDTA）中にブロッキングをほどこしたチップを浸漬し、80℃で10min加熱し、ついで、45℃で15時間ハイブリダイゼーションを行ない、その後、2×SSPEを用いて55℃で洗いの操作を加えた。つぎに、純水（室温）で軽くリンスし、窒素ガスを吹き付けて乾燥した後、TOF-SIMSによる分析まで真空デシケーター中で保存した。
【００８５】
（４）TOF-SIMSによるイメージング、分析
実施例２と同様な条件でハイブリダイゼーション後のDNAチップのTOF-SIMSでのイメージング、および、分析を行った。
数値データのみを表２に示した。
【００８６】
【表２】

表２からゲノムから誘導し、かつ、臭素ラベルをほどこした標的DNAの、DNAチップ上でハイブリダイゼーションがTOF-SIMSよって量的に把握が可能であることがわかる。
【００８７】
なお、本実施例とほぼ同様の方法によりmRNAから誘導したcDNAのハロゲン原子による標識とTOF-SIMSによるイメージング、および、分析も可能である。
【００８８】
【発明の効果】
本発明により、飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて、核酸チップ上でハイブリッドを形成したハロゲン標識標的核酸のハロゲン原子を分析することにより、標的核酸のイメージングを行うと同時に、量的把握が可能となった。
【００８９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例2のイメージング結果を示す図であり、（1-1）は配列番号：１、⁷⁹Br^-イオンでの結果を、（1-2）は配列番号：１、⁸¹Br^-イオンでの結果をそれぞれ示す。
【図２】イメージング用の一次イオン照射におけるスポットの連続照射（１）と非連続照射（２）について説明するための図であり、（２）における番号は照射スポットの照射順を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an analysis method using time-of-flight secondary ion mass spectrometry for an analysis sample obtained by reacting a sample with a probe carrier in which a plurality of nucleic acid probes are arranged in a matrix on a carrier.
[0002]
[Prior art]
Nucleic acid chips such as DNA chips and RNA chips have been used for purposes such as genome analysis or gene expression analysis, and the results of such analysis have been shown to be cancer, genetic diseases, lifestyle diseases. It is expected to provide important indicators for diagnosis of infectious diseases, prognosis, decision of treatment policy, and the like.
[0003]
Several methods are known for producing nucleic acid chips. Taking a DNA chip as an example, a method of sequentially synthesizing DNA probes on a substrate using photolithography (US Pat. No. 5,540,783, etc.), or pre-synthesized DNA or cDNA (complementary DNA) And the like (US Pat. No. 5601980, Japanese Patent Laid-Open No. 11-187900, Science Vol. 270, 467, 1995, etc.) is a typical method for producing a DNA chip.
[0004]
In general, a nucleic acid chip is prepared by any of these methods, and after this chip and a nucleic acid for detection, ie, a solution containing a target nucleic acid, are subjected to hybridization conditions, the nucleic acid on the nucleic acid chip is The desired object is achieved by detecting the presence or absence of hybridization between the probe and the target nucleic acid by some means.
[0005]
At that time, in order to guarantee the reliability of analysis, that is, quantitativeness and reproducibility, it is important to know the amount of hybrids existing in each matrix, that is, the density. It is also important from the standpoint of securing quantitativeness and reproducibility to know what kind of matrix shape (shape, size, state) actually exists (imaging). Further, as will be described later, when the physical address for indicating the position of the matrix does not exist on the substrate for chip production, for example, a method of supplying the probe solution as fine droplets by the inkjet method, for example When the chip is manufactured, there is no physical address, so depending on the detection means, there is a problem that it does not know which part of the chip is analyzed. In such a case, it is necessary to visualize the matrix position by the detection means employed.
[0006]
As these high-sensitivity surface analysis techniques, a method for isotopically labeling a target nucleic acid is known, but it is often not common because the method is complicated, dangerous, special facilities and equipment are required.
[0007]
As another method, a method of fluorescently labeling a target nucleic acid, that is, a fluorescence hybridization method is conceivable and is generally used in practice, but the stability of the fluorescent dye, quenching, and the fluorescent dye to the substrate surface are considered. There are problems such as non-specific adsorption, and there are cases where problems remain in quantitative grasp of the hybrid.
[0008]
Other common high-sensitivity surface analysis methods include the ATR method using FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy) and XPS (X-ray photoelectron spectroscopy) methods, all of which are hybridized on the nucleic acid chip. It cannot be said that it has sufficient sensitivity for quantitative analysis or imaging of the body. In particular, when general glass is used as the substrate of the nucleic acid chip, for example, FT-IR (ATR) has the effect of absorption due to glass, XPS has the effect of charge-up, etc. There may not be.
[0009]
Another high-sensitivity surface analysis method is the laser resonance ionization method (RIS:ResonanceIonizationSUS Pat. No. 5,810,060 discloses a method for detecting DNA by pectroscopy). This is a method in which a laser beam with a wavelength corresponding to the ionization energy of the element of interest emitted from the sample surface is irradiated to ionize and detect the element, and a laser beam is used as a means for emitting the element from the sample surface. Although a method using ions is disclosed, there is a problem that only a specific element can be detected.
[0010]
Yet another high-sensitivity surface analysis method is dynamic secondary ion mass spectrometry (dynamic-SIMS). This method can be applied to fragment ions or particles with small organic compounds in the process of generating secondary ions. Since it decomposes, the chemical structure information obtained from the mass spectrum is poor, and is not suitable for analysis of organic substances such as nucleic acid-related substances.
[0011]
In contrast, time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS), also known as a method of secondary ion mass spectrometry, is used to determine what atoms or molecules are present on the outermost surface of a solid sample. It is an analysis method to check whether it exists, and has the following features. That is, 10⁹atoms / cm²(1/10 of one atomic layer on the outermost surface^FiveThat can be applied to both organic and inorganic substances, that all elements and compounds present on the surface can be measured, and secondary ions from substances present on the sample surface. Is possible.
[0012]
The principle of this method will be briefly described below. When a solid sample surface is irradiated with a high-speed ion beam (primary ions) in a high vacuum, surface components are released into the vacuum by a sputtering phenomenon. The positively or negatively charged ions (secondary ions) generated at this time are converged in one direction by an electric field and detected at a position separated by a certain distance. During sputtering, secondary ions with various masses are generated depending on the composition of the sample surface, but light ions fly faster and heavy ions fly faster, so secondary ions are generated. By measuring the time (time of flight) from detection to detection, the mass of the generated secondary ions can be analyzed.
[0013]
In conventional dynamic-SIMS, as already mentioned, organic compounds are decomposed into small fragment ions or particles during ionization, so chemical structure information obtained from mass spectra is poor, whereas TOF-SIMS Since the amount of primary ion irradiation is extremely small, the organic compound is ionized while maintaining its chemical structure, and the structure of the organic compound can be known from the mass spectrum. Since only the secondary ions generated on the outermost surface of the solid sample surface are released into the vacuum, information on the outermost surface (several depths) can be obtained.
[0014]
There are two types of TOF-SIMS devices: sector type and reflectron type. One of the differences between these methods is the method of electrically grounding the holder for fixing the sample to be analyzed. In the sector type, secondary ions are guided to the mass spectrometer by applying a positive or negative voltage of several kV to the holder due to the mechanism of the apparatus, whereas in the reflectron type, the holder is grounded and the secondary Secondary ions are guided to the mass spectrometer by applying a positive or negative voltage of several kV to several tens of kV to the ion extraction electrode.
[0015]
In the TOF-SIMS method, positive primary ions are frequently used, but positive secondary ions and negative secondary ions are generated regardless of the polarity of the primary ions. Regardless of the polarity of primary ions, secondary electrons are generated by irradiation of primary ions under general measurement conditions, and the amount of secondary electrons generated is large compared to the amount of primary ions. The surface of the sample to be analyzed is easily positively charged, and if this charged charge is excessive (so-called charge-up state), the measurement is hindered. At that time, when considering the device configuration, it can be said that when the negative secondary ion of the insulator is measured using a sector type device, it can be charged most greatly (all the generated secondary electrons are charged with the above positive voltage). To the secondary ion extraction electrode to which is applied).
[0016]
In order to neutralize the positive charge, both the sector type and the reflectron type are often equipped with a pulse type electron gun for neutralizing the charge. The specific charge neutralization method using this electron gun is as follows: irradiation of primary ions (sub to several nsec pulse), measurement of time of flight of positive or negative secondary ions, and irradiation of the next primary ion pulse In addition, the sample to be analyzed is irradiated with an electron beam from the pulse electron gun for a certain period of time. While the sample to be analyzed is irradiated with the electron beam, the voltage application to the sample holder in the sector type and the voltage application to the secondary ion extraction electrode in the reflectron type are both stopped and grounded.
[0017]
This method alleviates (or eliminates) the positive charge and allows the analysis of the insulator in many cases. However, as in the above explanation, the negative charge is measured by measuring the insulator using a sector type apparatus. In this case, the margin of charge neutralization is the narrowest because the secondary ion is measured most easily and positively charged easily. In any case, in order to avoid charge-up, it is advantageous (generally) to use a reflectron type device in which the sample holder is electrically grounded rather than a sector type device. In particular, when the conductivity of the sample to be analyzed is low (it can be said that the resistivity is high or the dielectric constant is high), for example, in the case of glass or the like, the rilrectron type is more suitable for measurement. .
[0018]
[Problems to be solved by the invention]
Now, whether it is a reflectron type or a sector type, the TOF-SIMS method is an extremely sensitive analytical method, so it is less affected by charge-up, for example, it was formed on a gold substrate at the monolayer level. It is possible to analyze oligonucleotides (Proceeding of the 12^th International Conference on Secondary Ion Mass Spectrometry 951, 1999). The above document describes the DNA immobilized on the substrate and the analysis result of the PNA by the TOF-SIMS method. According to this, the fragment ion detected by the TOF-SIMS method is used in the case of a DNA probe. Contains PO derived from phosphate backbone₂ ^-, And PO_Three ^-Derived from ions and bases (thymine-H)^-If the ion is also a PNA probe, again (thymine-H)^-Ions are raised.
[0019]
However, by using the above-described TOF-SIMS method as a detection means and detecting DNA using a DNA chip that is a commonly used method as a target, to obtain desired gene information,
(1) The TOF-SIMS method detects only a very thin layer near the surface.
(2) For the two reasons that the fragment ion species generated from the probe DNA and the target DNA are the same, there arises a problem that the presence or absence of the hybrid of the target DNA cannot be specifically detected.
[0020]
As a means for solving such problems, there is a method in which PNA (peptide nucleic acid) is bound to a solid phase to form a hybrid with a target nucleic acid as a probe (JC Feldner et al: SIMS XIII International Conference; November 11, 2001) Sun-16th, Nara). According to this method, the peptide nucleic acid has the same base as DNA, but does not have a phosphate backbone. Therefore, if a fragment ion is detected by the phosphate backbone, hybridization between the PNA probe and the target nucleic acid is confirmed. Will be.
[0021]
However, since peptide nucleic acids are expensive, obtaining genetic information using a chip using peptide nucleic acids as a probe is expensive and not practical, and detection efficiency and quantitative detection not possible with conventional techniques are possible. A method for labeling a target nucleic acid capable of delivering a fragment ion has been desired.
[0022]
As a method for supplying such fragment ions, JP-A-61-1665 discloses a nucleic acid fragment separated by molecular weight by electrophoresis, liquid chromatography, or high-speed gel filtration. Nucleic acid provided with means to introduce metal elements or metal elements such as Ag, Au, Pt, Os, Hg, etc., and to identify these elements by atomic absorption analysis, plasma emission analysis, or mass spectrometry Although there is a description regarding a base detection device, there is no specific description regarding a mass spectrometer, and particularly no description regarding a method for introducing a halogen atom into a nucleic acid.
[0023]
On the other hand, when the quantitative grasp of the nucleic acid hybrid on the chip is seen from another viewpoint, it is necessary to analyze the matrix itself actually formed as the nucleic acid probe region. One example is disclosed in JP-A-11-187900. When a solution of a previously synthesized DNA probe is ejected and bonded to the substrate surface by an inkjet method, which is a method for producing a DNA chip described in the above, a matrix (spot where the discharged DNA is bound) is formed on the substrate. In some cases, there is no means for knowing the position. In such a case, it is desirable that the hybrid body at the spot is imaged by the TOF-SIMS method and the fragment ions in the imaged spot are analyzed. However, the above Japanese Patent Publication No. 11-187900 does not have such description, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-11665 mentions mass spectrometry as mentioned above, but TOF-SIMS. The method does not describe any hybrid imaging method on the chip and quantitative analysis of the target nucleic acid.
[0024]
Now, when imaging the nucleic acid chip by the TOF-SIMS method and quantitative analysis of the nucleic acid on the nucleic acid chip, considering the spot size or detection efficiency, the area of the imaged area is For example, 300 μm × 300 μm or more is desirable, but a substrate with a relatively high resistivity such as glass, which is often used, is used as a substrate for producing a DNA chip, and a primary ion beam diameter is required in the range of 300 μm × 300 μm. With 5μm to obtain a good resolution, scanning the beam sequentially in a certain direction (raster scan) like a television receiver (raster scan), and obtaining an image is greatly affected by the charge-up and obtains a good image Will not be able to.
[0025]
The object of the present invention is to detect the presence or absence of a hybrid of a nucleic acid probe formed on a measurement sample obtained by reacting a sample with a probe carrier and a target nucleic acid, for example, the state of the immobilized nucleic acid probe, for example, imaging of the arrangement position. It is another object of the present invention to provide a method for analyzing a measurement sample that can accurately perform quantitative analysis thereof.
[0026]
However, the method of the present invention can be applied as long as it is a substance that forms a complex by recognizing each other, one of which is immobilized on a carrier and the other can introduce a halogen atom as a label. . Examples of such substances include antigens, antibodies, proteins such as enzymes, and substrates that specifically bind to enzymes.
[0027]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have used the above-described TOF-SIMS for imaging and quantitative grasping of a hybrid of a nucleic acid probe and a target nucleic acid at a relatively large area on a carrier having a relatively high resistivity. As a result of examining the problems, the inventors have made the following invention.
[0028]
The method for analyzing a measurement sample according to the present invention includes:Nucleic acidIn a method for analyzing an analytical sample obtained by reacting a sample with a probe carrier in which a large number of probe immobilization regions are each independently arranged in a matrix on the carrier,
The target substance is a nucleic acid, which is located at the 5-position of the pyrimidine base or the purine base of the nucleic acid as the target substance.Halogen atomAre combinedThe aboveNucleic acidAn analytical sample analysis method characterized by detecting the presence or absence of a probe / target substance conjugate by measuring the halogen atom by time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS). is there.
[0029]
According to the present invention, whether or not a conjugate of a probe and a target substance (in the case of a nucleic acid, a hybrid of a nucleic acid probe and a target substance) formed on a measurement sample obtained by reacting a sample with a probe carrier is determined. In addition, it is possible to provide an analysis method of a measurement sample that can accurately perform, for example, imaging of the arrangement position and quantitative analysis thereof in the state of the immobilized probe.
[0030]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, when imaging and analyzing a hybrid using TOF-SIMS, the target substance is preferably labeled with a predetermined number of halogen atoms, and fragment ions of the halogen atoms are detected and analyzed by the TOF-SIMS method. By doing so, the above object is achieved.
[0031]
Since the halogen atom has a relatively high ionization efficiency, it can be expected to improve the sensitivity of detection using the fragment ion, and the effect of charge-up can be eliminated by reducing the primary ion intensity. In addition, large area imaging on a substrate with high resistivity is possible.
[0032]
In addition, when applied to nucleic acids by labeling with a predetermined number of halogen atoms, the above-mentioned problems in detecting only fragment ions specific to nucleic acids are solved, and analysis with higher quantification is possible. It becomes possible.
[0033]
The probe immobilized on the carrier is capable of recognizing a specific target substance and forming a conjugate with the target substance. In the case of a nucleic acid, the nucleic acid probe has a complementary sequence and is specific for the target nucleic acid. It can be combined with. A known method can be used to immobilize the nucleic acid probe on the carrier. An example of a probe immobilized on the carrier is a nucleic acid probe comprising an oligonucleotide having a base sequence capable of hybridizing with the target nucleic acid. A part having a binding part with a carrier via a linker as necessary, and a part having a structure connected to the carrier surface in the binding part with the carrier can be mentioned. In addition, the position in the molecule | numerator of the nucleic acid probe of a support | carrier and a coupling | bond part in the case of such a structure is not specifically limited in the range which does not impair the desired hybridization reaction.
[0034]
The probe carrier in the present invention is an independent region in which probes are immobilized, for example, a large number of dot-like spots arranged in a matrix or the like at a predetermined interval. This form includes a probe array, a microchip And nucleic acid chips.
[0035]
On the other hand, the probe has a structure that can be bonded to the surface of the carrier, and it is desirable that the probe be fixed on the carrier via the bondable structure. At that time, the structure that can be bonded to the carrier surface of the probe includes amino group, thiol group, carboxyl group, hydroxyl group, acid halide (haloformyl group; -COX), halide (-X), aziridine, maleimide group, and succinimide. Group, isothiocyanate group, sulfonyl chloride group (-SO₂Cl), an aldehyde group (formyl group; —CHO), hydrazine, iodinated acetamide, and the like. Also, depending on the structure required for binding to the probe-side carrier, the treatment required on the surface of the carrier, for example, a maleimide group for a thiol group, an epoxy group for an amino group, an aldehyde group, or an N-hydroxysuccinimide group The probe can be immobilized by a covalent bond by performing a process for forming the above on the surface of the carrier. In consideration of stability, the probe is preferably bonded to the substrate surface by a covalent bond.
[0036]
As a combination of a probe and a target substance, a combination that can form a conjugate selected from a combination of a nucleic acid probe and a target nucleic acid, a protein such as an antigen, an antibody, an enzyme, or a substrate that specifically binds to the enzyme. Can give.
[0037]
The nucleic acid probe used in the present invention is not particularly limited, and may be any nucleic acid probe that can recognize the target nucleic acid. For example, DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), cDNA (complementary DNA), cRNA ( Complementary RNA) is desirable, and a nucleic acid probe comprising at least one of these can be immobilized on a carrier.
[0038]
The target nucleic acid used in the present invention is preferably DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), cDNA (complementary DNA), or cRNA (complementary RNA) in consideration of the labeling method with halogen atoms described later. A sample containing a target nucleic acid composed of at least one of these can be an analysis target. The target nucleic acid may be a synthetic nucleic acid or a naturally derived animal, human, plant, microorganism or the like.
[0039]
In the present invention, as a method for imaging a measurement sample (probe carrier that has undergone a necessary treatment after reacting with the sample: hereinafter mainly described in “Nucleic acid chip”), primary ions are used as specific ions on the surface of the nucleic acid chip. A portion having an area is sequentially irradiated in a pulse manner as a spot having a relatively small area with respect to the area, and secondary ions generated by the pulse irradiation are emitted in time of flight for each pulse irradiation. In order to eliminate the effect of charge-up, pulse irradiation of primary ions is performed based on the discontinuous pattern, and the results of the respective mass spectrometry obtained are used as the primary analysis method. It is a very effective and desirable form to reconstruct and image based on the pattern of non-pulsed irradiation.
[0040]
In that case, as the discontinuous pattern, a random pattern or a discontinuous pattern according to a specific program can be exemplified.
[0041]
A continuous model and a non-continuous pattern can be explained by a simple model as follows.
[0042]
FIG. 2 shows an example of a continuous pattern (1) and a discontinuous pattern (2) in irradiation. In this case, for example, when a primary ion pulse is irradiated on a rectangular area with 5 × 5 spots, a pattern in which all spots are sequentially irradiated from one spot to an adjacent spot as shown in (1) of FIG. Is a continuous pattern, and a pattern (2) in which all spots are irradiated sequentially by irradiating one spot and then successively at least non-adjacent spots is a discontinuous pattern.
[0043]
In some cases, it is possible to randomly form a discontinuous pattern based on random numbers, but in that case, there is a possibility of irradiating adjacent spots continuously. A non-continuous pattern may be formed according to a desired specific program. As a desirable pattern, as described above, an algorithm such as not continuously irradiating adjacent spots or not continuously irradiating spots existing in adjacent rows and columns can be appropriately employed.
[0044]
In this case, for example, when a primary ion pulse is irradiated on a rectangular area with 5 × 5 spots, a pattern in which all spots are sequentially irradiated from one spot to an adjacent spot as shown in the upper left figure is continuous. A pattern on the upper right, which irradiates one spot and then irradiates all spots in order, at least non-adjacent spots, is a discontinuous pattern.
[0045]
In some cases, it is possible to randomly form a discontinuous pattern based on random numbers, but in that case, there is a possibility of irradiating adjacent spots continuously. A non-continuous pattern may be formed according to a desired specific program. As a desirable pattern, as described above, an algorithm such as not continuously irradiating adjacent spots or not continuously irradiating spots existing in adjacent rows and columns can be appropriately employed.
[0046]
The number of labels on the halogen atom is not particularly limited, and the position of the label and the labeling method are also possible. Any method is possible as long as the hybridization)) is inhibited, but in practice, one label per nucleotide is practical, and in that sense, the predetermined number of halogen atoms is 1 The number is preferably up to the number of nucleotides of the target nucleic acid. When the nucleic acid is a synthetic oligonucleotide, 1 to 5 is taken into consideration in terms of labeling labor, cost, and high ionization efficiency of halogen atoms. It is more desirable if it is individual. In addition, when trying to introduce a label using an enzyme extension reaction as in the PCR method, if the label is relatively large like a fluorescent dye, the number of labels introduced is limited due to steric hindrance, etc. If it is a halogen atom, for example, it is possible to label all kinds of bases (for example, adenine), so that it is possible to quantitatively grasp the number of labels, and it is desirable from the viewpoint of sensitivity and label introduction method.
[0047]
Examples of the halogen atom include fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms, and each fragment ion of fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms can be detected by the TOF-SIMS method. These four types of halogen atoms can be introduced into a nucleic acid probe by, for example, the method described below.
[0048]
The nucleic acid that is the target substance of each matrix of the probe carrier may be labeled with a different halogen atom.
[0049]
For samples whose target substance content is unknown, the target substance that can be recognized by the probe is present in the sample by labeling the sample with a halogen atom and reacting it with the probe. Since these conjugates are formed, the conjugate can be detected using a labeled halogen atom.
[0050]
In the TOF-SIMS method, each fragment ion of fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms can be detected, and according to the method described later, the above four types of halogen atoms can be introduced into the target nucleic acid. For these, these halogen atoms can be used.
[0051]
The method for introducing the halogen atom into the target nucleic acid is not particularly limited, but a well-known example is a method for binding a halogen atom to the nucleotide base of the target nucleic acid. The method can be suitably used. In that case, it is desirable that the halogen atom is bound to a position of the target nucleic acid that does not inhibit the hybridization when the target nucleic acid forms a hybrid with the nucleic acid probe. Such positions are position 5 of the pyrimidine base and position 8 of the purine base. However, it is not always essential that the halogen atoms of all nucleotide bases of the target nucleic acid are bonded to this position.
[0052]
As a more specific method of applying a halogen atom to a target nucleic acid, when the target nucleic acid is a synthetic DNA, a synthesis unit to which a halogen atom is bonded when synthesizing DNA with an automatic DNA synthesizer, that is, the following structural formula The method using the 2′-deoxyribonucleoside-3′-phosphoramidite shown can be mentioned as an example.
[0053]
[Chemical 2]

(In the above formulas, X represents a halogen atom, DMTO represents a dimethoxytrityl group, iPr represents an isopropyl group, and CNEt represents 2-cyanoethyl.)
In addition, when the nucleic acid probe is a synthetic RNA, a synthesis unit to which a halogen atom is bonded, that is, a ribonucleoside-3'-phosphoramidite, may be used when RNA is synthesized by an automatic RNA synthesizer. Examples of such synthesis units include compounds of the structural formula below.
[0054]
[Chemical 3]

(Where X is a halogen atom (F, Cl, Br or I), DMTO is dimethoxytrityl, iPr is isopropyl, CNEt is 2-cyanoethyl, Me is methyl, and TBDMS is t-butyldimethoxysilyl. Represents each.)
Further, when the nucleic acid probe is a synthetic PNA, it is preferable to use a synthesis unit to which a halogen atom is bonded, that is, a nucleobase-binding peptide analog, when synthesizing PNA with a PNA automatic synthesizer.
[0055]
In addition, when the target nucleic acid is cDNA, a method that uses 2'-deoxyribonucleoside-5'-triphosphate to which a halogen atom is bound when the cDNA is extended and synthesized by reverse transcriptase is an example of a halogen atom introduction method. Can be given as
[0056]
In the case where the target nucleic acid is DNA derived from genomic DNA, 2'-deoxyribonucleoside-5'-to which the halogen atom is bonded when introduction of the halogen atom into the DNA is extended and synthesized by DNA polymerase. A method using triphosphate can be given as an example. When the target nucleic acid is cRNA, the introduction of a halogen atom into the cRNA causes the ribonucleic acid to which the halogen atom is bound when the cRNA is extended and synthesized by RNA polymerase. It can be performed using nucleoside-5'-triphosphate.
[0057]
It is also possible to use a PCR reaction or RT-PCR (reverse transcription PCR) reaction for each of the extension reactions.
[0058]
The nucleic acid probe species of the nucleic acid chip used in the present invention is not particularly limited, and DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), cDNA (complementary DNA), cRNA (complementary RNA), oligodeoxynucleotide, oligoribonucleotide Etc. can be used.
[0059]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples.
[0060]
Example 1 (Preparation of nucleic acid probe chip)
A nucleic acid probe chip was prepared according to the method described in JP-A-11-187900.
[0061]
(1) Substrate cleaning
A synthetic quartz substrate of 25.4 mm × 25.4 mm × 1 mm was put in a rack and immersed in an ultrasonic cleaning detergent (Branson: GPIII) diluted to 10% with pure water overnight. Thereafter, ultrasonic cleaning was performed in a detergent for 20 minutes, and then the detergent was removed by washing with water. After rinsing with pure water, ultrasonic treatment was further performed for 20 minutes in a container containing pure water. Next, the substrate was immersed in an aqueous 1N sodium hydroxide solution preheated to 80 ° C. for 10 minutes. Subsequently, washing with water and washing with pure water were carried out and used as they were in the next step.
[0062]
(2) Surface treatment
A 1 wt% aqueous solution of an amino group-bonded silane coupling agent, N-β- (aminoethyl) -γ-aminopropyltrimethoxysilane KBM603 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was stirred at room temperature for 2 hours, and the molecules of the silane compound The methoxy group was hydrolyzed. Next, the substrate obtained in the above (1) was immersed in this solution at room temperature for 1 hour, washed with pure water, and dried by blowing nitrogen gas on both sides of the substrate. Next, the substrate was baked in an oven heated to 120 ° C. for 1 hour to finally introduce amino groups onto the substrate surface.
[0063]
Subsequently, 2.7 mg of N-maleimidocaproyloxysuccinimide (Dojindo Laboratories: hereinafter EMCS) was dissolved in a 1: 1 solution of dimethyl sulfoxide (DMSO) / ethanol to a concentration of 0.3 mg / ml. The quartz substrate subjected to the silane coupling treatment was immersed in the EMCS solution at room temperature for 2 hours, and the amino group supported on the substrate surface by the silane coupling treatment was reacted with the succinimide group of the EMCS solution. At this stage, an EMCS-derived maleimide group is present on the substrate surface. The substrate pulled up from the EMCS solution was sequentially washed with a mixed solvent of DMSO and ethanol and ethanol, and then dried by blowing nitrogen gas.
[0064]
(3) Synthesis of probe DNA
A DNA synthesizer (Vex) was commissioned to synthesize a single-stranded nucleic acid (SEQ ID NO: 1 40-mer). A thiol (SH) group was introduced into the 5 ′ end of the single-stranded DNA of SEQ ID NO: 1 by using a thiol modifier (Glen Research) during synthesis. Deprotection and DNA recovery were performed by conventional methods, and purification was performed using HPLC. All the series of steps from synthesis to purification were performed by a synthesizer.
[0065]
SEQ ID NO: 1
5 'HS- (CH₂)₆-O-PO₂-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 3 '
[0066]
(4) DNA ejection by thermal jet printer and binding to substrate
The single-stranded DNA of SEQ ID NO: 1 was added at a concentration of 8 μM of glycerin 7.5 wt%, urea 7.5 wt%, thiodiglycol 7.5 wt%, and acetylene alcohol (trade name: acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical ( It was dissolved in a solution containing 1 wt%. Bubble jet printer BJF-850 using the bubble jet method, a kind of thermal jet method (Canon: However, Bubble Jet is a registered trademark) Printer head BC-50 (Canon) was modified so that several hundred μl of solution could be discharged, and this head was mounted on a discharge drawing machine modified so that it could be discharged onto the quartz substrate. Several hundreds of μl of the above DNA solution was injected into the remodeling tank portion of this head, and an EMCS-treated substrate was mounted on a discharge drawing machine, and spotted here. In addition, the discharge amount at the time of spotting was 4 pl / droplet, and the spotting range was discharged at a pitch of 200 dpi, that is, 127 μm in the range of 10 mm × 10 mm to the center of the substrate. Under this condition, the diameter of the spotted dot was about 50 μm.
[0067]
After spotting, the substrate was left in a humidified chamber for 30 minutes to react the maleimide group on the surface of the glass plate with the thiol group at the end of the nucleic acid probe. Next, the substrate was washed with pure water and stored in a 50 mM phosphate buffer (pH = 7.0, hereinafter referred to as solution A) containing 1 M NaCl.
[0068]
Example 2 (hybridization and imaging and analysis by TOF-SIMS)
(1) Synthesis of model target nucleic acid
SEQ ID NO: 2
5 'A (Br) A (Br) A (Br) A (Br) A (Br) AAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3'
[0069]
[Formula 4]

[0070]
A model-labeled nucleic acid (SEQ ID NO: 2, 40-mer of dA) previously modified with 5 bromine atoms was synthesized (Vex). Five nucleotides on the 5 'side were introduced at the time of synthesis by an automatic synthesizer using 8-bromo-3'-deoxyadenosine phosphoramidite whose structure is shown in the above figure. Deprotection and DNA recovery were carried out by conventional methods, and HPLC was used for purification. All the series of steps from synthesis to purification were performed by a synthesizer. In addition, A (Br) in the sequence indicates bromine-labeled deoxyadenosine. Further, it is known that the 8th position of adenine, which is a labeling position, is a position that does not inhibit hybridization.
[0071]
(2) Blocking and hybridization
After immersing the chip prepared in Example 1 in solution A containing 2% bovine thymus albumin (BSA) at room temperature for 3 hours to block the chip surface (for nonspecific adsorption of nucleic acids and the like), The model target nucleic acid of SEQ ID NO: 2 was immersed in a solution A dissolved at a concentration of 50 nM, and hybridization was performed at 45 ° C. for 15 hours. Subsequently, after rinsing with pure water (room temperature), nitrogen gas was blown to dry, and the sample was stored in a vacuum desiccator until analysis of TOF-SIMS.
[0072]
(3) Analysis by TOF-SIMS
Imaging and analysis of the hybridized DNA chip were performed using TOF-SIMS IV manufactured by ION TOF.
[0073]
The apparatus conditions are summarized below.
<Primary ion>
Primary ion: 25kV Ga⁺, Random scan mode
Primary ion pulse frequency: 2.5kHz (400μsec / shot)
Primary ion pulse width: 1 ns
Primary ion beam diameter: 5μm
<Secondary ion> Reconstruction and imaging of primary ion irradiation pattern
Secondary ion detection mode: negative
Measurement area: 300μm × 300μm
Number of pixels in secondary ion image: 128 × 128
Integration count: 256
[0074]
(4) Results
FIG. 1 shows the result of imaging the bromide ion from the data obtained by analyzing the DNA chip hybridized in (2) based on the above conditions with a TOF-SIMS IV type apparatus. Figures 1-1 and 1-2 are respectively⁷⁹Br^-ion,⁸¹Br^-It is derived from ions.
[0075]
[Table 1]

Table 1 shows the count number of each spot from FIG. From FIG. 1 and Table 1, it can be seen that imaging with bromine, which is a labeling substance, of a spot of bromine-labeled target DNA hybridized with a nucleic acid probe on a DNA chip is possible.
[0076]
Example 3 (Imaging and analysis of bromine-labeled target DNA derived from genome)
(1) Preparation of nucleic acid chip for detection of genome-derived target DNA
In Nature Biotechnology Vol. 18, 438, 2000, two cell lines of human oral squamous cell carcinoma, the production of oligonucleotide chip for detecting mutations in exon 7 of HSC4 and HSC5 genomic DNA, and using this chip The detection of fluorescently labeled DNA derived from the above exons.
[0077]
In this example, an oligonucleotide chip was prepared according to the above method, DNA was synthesized by changing the label from fluorescence to bromine, and hybridization was performed using this DNA.
[0078]
The specific procedure is described below.
・ Synthesis of DNA probes and preparation of chips
SEQ ID NO: 3
5 'HS- (CH₂)₆-O-PO₂-O-GATGGGCCTCCGGTTCAT 3 '
[0079]
A base sequence complementary to a part of the base sequence of exon 7 of HSC4 (part including codon No. 248) and having a thiol group for binding to the substrate at the 5 ′ end, SEQ ID NO: 3 was synthesized in the same manner as in Example 1, and a DNA chip was produced using this DNA in the same manner as in Example 1.
[0080]
(2) Synthesis of bromine-labeled DNA derived from genome
SEQ ID NO: 4
E7S: 5 '-ACTGGCCTCATCTTGGGCCT- 3' (exon 7, sense)
SEQ ID NO: 5
E7A: 5 '-TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3' (exon 7, anti-sense)
[0081]
[Chemical formula 5]

[0082]
First, using the PCR primers of SEQ ID NOs: 4 and 5 (common to HSC4 and HSC5: Bex requested for synthesis), the exon 7 portion was synthesized from the genome of HSC4 by PCR reaction. That is, PCR amplification was performed by repeating a cycle of 94 ° C. (30 sec) and 60 ° C. (45 sec) 40 times with 50 μl of PCR mixture containing 20 ng of genomic DNA and 0.4 μM of each sense and antisense primer. The resulting chain length is designed to be 171 nucleotides.
[0083]
Next, using a part of the amplification product as a template, 0.2 μM sense primer (SEQ ID NO: 4) and 5-bromo-2′-deoxyuridine, which is a kind of bromine-labeled nucleotide whose structure is shown in the above figure. SsPCR (single-stranded PCR) was performed using triphosphate (Sigma Aldrich Japan) at 10 μM. PCR cycles are 96 ° C. (30 sec), 50 ° C. (30 sec), 60 ° C. (4 min), 25 cycles. The resulting bromine-labeled single-stranded DNA was purified by gel filtration.
[0084]
(3) Blocking and hybridization
The chip prepared in (1) was blocked by the same method as in Example 1, rinsed with pure water, and used for the following hybridization. The chip with blocking is immersed in 6xSSPE (0.9M NaCl, 60mM NaH2PO4, 6mM EDTA) containing 20% formamide in which the DNA derived from the genome synthesized in (2) is dissolved at a concentration of 10nM. For 10 minutes, followed by hybridization at 45 ° C. for 15 hours, followed by washing at 55 ° C. with 2 × SSPE. Next, it was rinsed lightly with pure water (room temperature), blown with nitrogen gas, dried, and then stored in a vacuum desiccator until analysis by TOF-SIMS.
[0085]
(4) Imaging and analysis with TOF-SIMS
Under the same conditions as in Example 2, the DNA chip after hybridization was imaged and analyzed with TOF-SIMS.
Only numerical data is shown in Table 2.
[0086]
[Table 2]

From Table 2, it can be seen that the hybridization of the target DNA derived from the genome and applied with bromine label on the DNA chip can be quantitatively grasped by TOF-SIMS.
[0087]
In addition, labeling of cDNA derived from mRNA with a halogen atom, imaging with TOF-SIMS, and analysis can be performed in substantially the same manner as in this example.
[0088]
【The invention's effect】
According to the present invention, by analyzing the halogen atoms of the halogen-labeled target nucleic acid hybridized on the nucleic acid chip using time-of-flight secondary ion mass spectrometry, the target nucleic acid is simultaneously imaged and quantitatively grasped. Became possible.
[0089]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
1 is a diagram showing the imaging results of Example 2, wherein (1-1) is SEQ ID NO: 1,⁷⁹Br^-The results with ions, (1-2) is SEQ ID NO: 1,⁸¹Br^-The results with ions are shown respectively.
FIG. 2 is a view for explaining continuous irradiation (1) and non-continuous irradiation (2) of spots in primary ion irradiation for imaging, and the numbers in (2) indicate the irradiation order of irradiation spots.

Claims

In a method of analyzing an analytical sample obtained by reacting a sample with a probe carrier in which a large number of nucleic acid probe immobilization regions are independently arranged in a matrix on the carrier,
The target substance is a nucleic acid, a halogen atom is bonded to the 5-position of the pyrimidine base or the purine base of the nucleic acid as the target substance, and whether or not a conjugate of the nucleic acid probe and the target substance is formed, A method for analyzing an analytical sample, wherein the halogen atom is detected by measuring it by time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS).

The analysis method according to claim 1, wherein analysis by TOF-SIMS is a quantitative analysis.

The analysis method according to claim 1, wherein a predetermined number of halogen atoms are labeled on the target substance.

Primary ions are sequentially pulsed to the entire analysis target area as spots having a relatively small area with respect to the analysis target area of the carrier, and secondary ions generated by the pulse irradiation are respectively irradiated. The analysis method according to any one of claims 1 to 3, wherein an image is obtained by performing mass analysis in time of flight for each pulse irradiation.

5. The pulse irradiation of primary ions is performed based on a discontinuous pattern, and the obtained results of mass spectrometry are reconstructed and imaged based on the discontinuous pattern of pulse irradiation of primary ions. Analysis method described .

The analysis method according to claim 5, wherein the discontinuous pattern is a random pattern.

The analysis method according to claim 6, wherein the non-continuous pattern is a particular programmed pattern.

The analysis method according to any one of claims 1 to 7, wherein the halogen atom is any one of fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms.

The analysis method according to claim 8 , wherein the predetermined number of halogen atoms is any one from 1 to the number of nucleotides of the target nucleic acid.

The analysis method according to claim 9 , wherein the predetermined number of halogen atoms is 1 to 5.

The target nucleic acid is a synthetic DNA, and 2'-deoxyribonucleoside-3 ', which is a synthesis unit to which a halogen atom is combined when the synthetic DNA is synthesized by an automatic DNA synthesizer, is introduced into the synthetic DNA. The analysis method according to claim 1, which is carried out using phosphoramidite.

12. The method for analyzing a DNA chip according to claim 11, wherein the synthesis unit to which the halogen atom is bonded is represented by the following structural formula.

(In the above formulas, X represents a halogen atom, DMTO represents a dimethoxytrityl group, iPr represents an isopropyl group, and CNEt represents 2-cyanoethyl.)

The target nucleic acid is a synthetic RNA, and when a halogen atom is introduced into the RNA, a synthesis unit to which a halogen atom is bound when the RNA is synthesized by an RNA automatic synthesizer, that is, a ribonucleoside-3′-phospho The analysis method of Claim 1 performed using an amidite.

The target nucleic acid is a synthetic PNA, and a halogen atom is introduced into the PNA using a synthesis unit, ie, a nucleobase-binding peptide analog, to which a halogen atom is bound when the PNA is synthesized by a PNA automatic synthesizer. The analysis method according to claim 1 .

The target nucleic acid is cDNA, and 2'-deoxyribonucleoside-5'-triphosphate to which the halogen atom is bonded is introduced when the halogen atom is introduced into the cDNA by extension synthesis using reverse transcriptase. The analysis method of Claim 1 performed using.

The target nucleic acid is DNA derived from genomic DNA, and 2′-deoxyribonucleoside-5′-three to which a halogen atom is bonded when the introduction of the halogen atom into the DNA is extended and synthesized by DNA polymerase. The analysis method of Claim 1 performed using phosphoric acid.

A target nucleic acid cRNA, claim 1 for introduction into the cRNA of halogen atoms, the cRNA when extended synthesized by RNA polymerase, using ribonucleoside-5'-triphosphate bound halogen atoms Analysis method.

Nucleic acid probe DNA on a nucleic acid chip, RNA, PNA (peptide nucleic acid), cDNA (complementary DNA), cRNA analysis method according to any one of claims 1 to 17 is either (complementary RNA).