JP4037451B2 - Colon cell and colon cancer cell-related nucleic acid molecules, proteins and peptides - Google Patents

Description

【００１７】
例２
例１のロゼット形成試験で陽性であった、ＬＩＭ１２１５大腸細胞ラインを、１０％胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ培地中で生育させた。集密（confluent）細胞を（１０⁶／ｃｍ²）をＴｒｙｐｓｉｎ−Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液を使用して分離させた。細胞を、１０％の胎児ウシ血清、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．０２５Ｕ／ｍｌのインスリンおよび１０．８２μｇ／ｍｌのα−チオグリセロールを添加した、２５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を含む組織培養シャーレに１／１０で播種した。前記シャーレを、５日間、５％ＣＯ₂の雰囲気中で３７℃でインキュベートした。前記培地の除去後、細胞を、細胞スクレーパによって表面から除去する前に、ＰＢＳで洗浄した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１０⁹細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。
【００１８】
次に、前記ＬＩＭ１２１５大腸癌細胞ラインの表面上でのＡ３３抗原の発現を、標準技術に従いフローサイトメトリーによって分析した。Ｈｅｐ−２表皮ガン細胞ライン（Ｂｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｉｎ．Ｖｏｌ．４４，ｐｐ．７−２６（１９９４））をネガティブコントロールとして使用した。前記細胞を、洗浄し、５ｍＭのＥＤＴＡと５％の胎児ウシ血清とを含有する５００μｌのＰＢＳ中に、５ｘ１０⁶細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞を、５μｇのＡ３３ｍＡｂとともに、４℃で３０分間、インキュベートした。バッファーでの洗浄後、細胞／抗体複合体を、フルオレセイン−結合抗−マウスＩｇＧ（１／５０希釈）とともにインキュベートした。ネガティブコントロールを、細胞を、アイソタイプが一致する非関連抗体（５μｇ）での染色と、その後の、フルオレセイン−結合抗−マウスＩｇＧのみでの染色によって行った。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Becton Dickinson,San Jose,CA,U.S.A.）を使用して行った。
【００１９】
図１は、Ａ３３モノクローナル抗体を用いたＬＩＭ１２１５およびＨｅｐ−２細胞の細胞蛍光分析を示している。前記コントロール抗体で得られた蛍光（パネルＡ）と比較して、ＬＩＭ１２１５の全集団は、Ａ３３ｍＡｂとインキュベートした時、強い均一な蛍光（パネルＢ）を示した。Ｈｅｐ−２細胞（ＣおよびＤ）で得られたパネルに示されたプロファイルは、重複しており、これは、これらの細胞に結合するＡ３３ ｍＡｂは検出されていないことを示している。Ｘ軸は、蛍光強度（対数単位）を示し、Ｙ軸は細胞数を示している。
【００２０】
例３
ロゼット形成試験でＡ３３陽性であった細胞ライン（表１）を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用して、ＰＢＳ，ｐＨ７．４中で溶解させた。当業者に知られているその他のデタージェントも、Ａ３３陽性細胞を溶解するために使用可能である。９つのＡ３３−陽性細胞ラインと、更に、５つのＡ３３−陰性細胞ライン（コントロール）の細胞可溶化物を、非還元条件を使用したウェスタンブロット分析によって、Ａ３３抗原の発現について調査した。約４３ｋＤの分子量を有する分子が、ロゼット形成試験でＡ３３陽性であった大腸癌細胞からの溶解物中に於いてｍＡｂ Ａ３３でのウェスタンブロットによって検出された。この分子は、ロゼット形成試験においてＡ３３について陰性であった細胞ラインから得られた溶解物中、又は、抗−アクチンｍＡｂを含むｍＡｂ Ａ３３以外の抗体によっては検出されなかった。Ａ３３抗原は、非還元条件を使用したＳＤＳゲル電気泳動後に於いてのみウェスタンブロット分析によって検出可能であった。Ａ３３抗原は、還元条件を使用した場合には検出不能であった。図２に示すウェスタンブロットは、ＳＷ１２２２細胞からのアフィニティー精製によって得られたＡ３３抗原を利用した。上側のバンド（図２）は、Ａ３３タンパク質の多量体形態を示している。
【００２１】
例４
Ａ３３抗原を、大腸癌細胞可溶化から免疫沈降させた。これを行うために、大腸癌細胞を、当業者に公知の標準技術を使用して、³Ｈ−ＧｌｃＮＡｃ又は³⁵Ｓで標識化した。ロゼット形成試験でＡ３３陽性であった細胞可溶化と、非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動によって約４３ｋＤのバンドを示した細胞可溶化とを、モノクローナル抗体Ａ３３で免疫沈降させた。
【００２２】
図３は、約４３ｋＤの分子量を有するＡ３３陽性溶解物から免疫沈降された分子を示している。このバンドは、ロゼット形成試験に於いてＡ３３陰性であった溶解物からは沈降しなかった。更に、このバンドは、ｍＡｂ Ａ３３以外の抗体によっては沈降しなかった（”ｎｏ．１°Ａｂ”は、ｍＡｂ Ａ３３が使用されなかったことを示す）。³Ｈ−ＧｌｃＮＡｃは、糖タンパク質のグリコシル化部位に導入される炭水化物であるので、これらの結果は、前記バンドに含まれるＡ３３抗原が、糖タンパク質であるということを示唆している。これを支持する更に別の証拠が、以下の所例に於いて提供される。
【００２３】
例５
³⁵Ｓで標識化されたＳＷ１２２２細胞を、５μ９／ｍｌのツニカマイシンとともに１８時間インキュベートした。ツニカマイシンは、糖タンパク質のグリコシル化を阻止することが知られている。これらの細胞と、更に、ツニカマイシンとともにインキュベートされなかった細胞を溶解し、Ａ３３抗体、ＦＢ−５抗体（コントロール）と、又は抗体なし（コントロール）での免疫沈降を行った。図４は、これら免疫沈降の結果を示している。
【００２４】
ツニカマイシンとともにインキュベートされなかった細胞では、Ａ３３抗体での免疫沈降は、約４３ｋＤのバンドを示した。アイソタイプコントロールである抗体ＦＢ−５、または、抗体なしでの免疫沈降は、そのような４３ｋＤバンドを示さなかった。ツニカマイシンとともにインキュベートされた細胞では、Ａ３３抗体での免疫沈降は、４３ｋＤのバンドと、更に、より低い分子量の３本の他のバンドとを示した。これらの低分子量バンドは、ツニカマイシンの存在に依り、グリコシル化程度の異なるＡ３３抗原の存在を示している。これは、Ａ３３抗原が、糖タンパク質であり、Ｎ結合型オリブ糖を含むこということの別の証拠を提供するものである。
【００２５】
例６
非還元条件下での二次元ゲル電気泳動を使用してＡ３３抗原を同定した。先ず、前記ＬＩＭ１２１５大腸細胞ラインを、１０％胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ培地中で生育させた。集密（coufuant）細胞（１０⁶／ｃｍ²）を、Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液を使用してプラスチックシャーレから分離させた。細胞を、前述したように、１０％の胎児ウシ血清、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．０２４Ｕ／ｍｌのインスリンおよび１０．８２μｇ／ｍｌのα−チオグリセロールを添加した、２５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を含む組織培養シャーレ（１５０ｘ２０ｍｍ）に１／１０で播種した。前記シャーレを、５日間、５％ＣＯ₂の雰囲気中で３７℃でインキュベートした。前記培地の除去後、細胞を、細胞スクレーパによって除去する前に、ＰＢＳで洗浄した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１０⁹細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。
【００２６】
次に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用して３ｘ１０⁸ＬＩＭ１２１５細胞からＡ３３抗原を抽出した。この抽出物を、３０％のグリセロールを含有する、アルギニン／リジン緩衝液，ｐＨ１０から成るサンプルバッファーで１：１に希釈し、非還元条件下で小（８ｘ８ｃｍ）Ｎｏｖｅｘ２次元ゲル電気泳動ゲルで電気泳動した。
【００２７】
前記タンパク質を、第１次元目は、ｐＨ３．５−８．５での等電点泳動によって、第２次元目は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミドゲル）によって分離した。Ａ３３抗原は、ｍＡｂＡ３３を使用したイムノブロット分析（図５Ｂ）と共に、Coomassie Blue Ｒ−２５０での染色によってゲル中で位置決定した。比較のために、抗−アクチンｍＡｂを使用して観察された染色パターン（図５Ａ）を示す。アクチンは、Ａ３３抗原に類似の泳動特性を有するために、比較用に使用した。
【００２８】
例７
前記ＬＩＭ１２１５細胞抽出物とクロマトグラフィーフラクションとについてバイオセンサー分析を行った。これら抽出物とフラクションとを、光学機器バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ^TM，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、Ａ３３ヒト化モノクローナル抗体のＦ（ａｂ）’₂フラグメントをバイオセンサー表面上に固定化して、モニターした。
【００２９】
前記Ｆ（ａｂ）’₂フラグメントを調整するために、Ａ３３抗体を精製した（Ｋｉｎｇｅｔ ａｌ．；Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．７２，ｐｐ．１３６４−１３７２（１９９５））．Ｆ（ａｂ）’₂フラグメントは、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）中に於ける１０ｍｇのＡ３３ｍＡｂのペプシン（１％ｗ／ｗ）消化によって生成された。次に、これらを、０．１５ｍＭ ＮａＣｌ含有の５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡させたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（２．８ｘ６０ｃｍ）カラム（Pharmacia Biotech）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。溶出は、０．５ｍｌ／分の流速で行った。
【００３０】
Ｆ（ａｂ）’₂フラグメントに結合する抗原の検出は、金センサー表面で、又はその近傍での屈折率のわずかな変化を測定する技術である表面プラズモン共鳴の現象に基づく。このバイオセンサーアッセイの前に、細胞抽出物とクロマトグラフィーフラクションとを、ＢＩＡｃｏｒｅ^TM緩衝液（ＨＢＳ）；３．４ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１５ｍＭ ＮａＣｌおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中に、１００μｌの最終容量となるように希釈した。サンプル（３０μｌ）を、５μｌ／分の流速で、前記センサ表面上に注入した。注入相の完了後、同じ流速で３６０秒間、解離を、ＢＩＡｃｏｒｅ緩衝液中でモニターした。残留結合抗原を、溶出させ、表面を、４０μｌの１０ｍＭＮａＯＨを使用して、注入の間に再生させた。この処理によって、前記センサー表面に固定化されたタンパク質は変性しなかった。このことは、Ａ３３抗原を含有するサンプルの注入に於いて、同等のシグナルが得られることによって示される。
【００３１】
図６は、アクチンと、完全Ａ３３抗体、又はＡ３３Ｆ（ａｂ）’₂フラグメントとの間の相互作用のバイオセンサー分析を示している。ウサギ筋肉アクチンの調製物（０．３μｇ）を、完全Ａ３３（上側トレース）又はＡ３３ Ｆ（ａｂ）’₂フラグメント（下側トレース）とのいずれかで固定化されたセンサー表面上に５μｌ／分の流速で注入した。タンパク質／タンパク質相互作用を、表面プラズモン共鳴によってモニターした。注入相の最後に、Ａ３３ＩｇＧへのアクチンの結合に依って、２４７ＲＵのシグナルが観察されたのに対して、Ａ３３Ｆ（ａｂ）’₂へのアクチン結合に対応するシグナルはわずか４ＲＵであった（矢印で示す）。
【００３２】
例８
Ａ３３抗原を、配列分析のためにＬＩＭ１２１５細胞から精製した。図７は、Ａ３３抗原の精製に使用したクロマトグラフィー精製プロトコールを示すフローチャートである。Ａ３３抗原を抽出するために、ＬＩＭ１２１５大腸細胞（２ｘ１０⁹細胞）を回収し、燐酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、１ｍＭＰＭＳＦ，１ｍＭペプスタチン、０．１ｍＭロイペプチン、および０．０１Ｕ／ｍｌアプロチニンを含有する１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中にて、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又は１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４のいずれかで、４℃で３０分間、溶解（１０⁸細胞／ｍｌ）させた。その結果得られた抽出物を、１４，０００ｇで２０分間４℃で２回遠心分離した。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００上清は、Ｇｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＥ−４ＢＤクロマトグラフィーのために直接に取り出した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４抽出上清は、上にリストしたプロテアーゼ阻害剤を含有する、０．０６％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４と、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で、６％のスクロース上に層形成させた。前記ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４抽出物とスクロースとを含むチューブを、３７℃で３０分間インキュベートし、次に、２５℃で、１５分間、５，０００ｇで遠心分離した。デタージェントを、クロマトグラフィー精製のために収集した。
【００３３】
Ｇｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを行うために、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００抽出物又はＴｒｉｔｏｎＸ−１１４デタージェント層を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎの最終濃度となるように希釈し、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に接続されたＧｒｅｅｎ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＥ−４ＢＤカラム（１００ｘ１０ｍｍＩＤ）に４℃にてロードした。前記カラムは、０．１％ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）を含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化させた。アクチンを含む、結合したタンパク質を、１Ｍ ＮａＣｌを用いて段階的に溶出した。そのブレークスルー（漏出）は、Ａ３３抗原を含有しており、これを、下記の、陰イオン−交換ＨＰＬＣのために収集した。
【００３４】
例９
Ａ３３抗原の存在を確認するために、精製過程において、ウェスタンブロット分析を行った。Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ分離とコントロールユニット（Pharmacia Biotech）を使用してプレキャストＰｈａｓｔｇｅｌｓで電気泳動とウェスタンブロット分析とを行った。細胞抽出物と、クロマトグラフィーフラクションとを、Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．１１２０−１１３０（１９９５），に記載されているように非還元条件下で、８−２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｐｈａｓｔｇｅｌ又は８−２５％ネイティブＰｈａｓｔｇｅｌｓで電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン上にトランスファーし、Ａ３３モノクローナル抗体とインキュベートした。ＲＰ−ＨＰＬＣで精製したＡ３３抗原も、非還元条件下と、還元条件下でポリクローナル抗−Ｎ末端ペプチド抗体（ここに記載）を使用し、ウェスタンブロットによって分析した。ＩｇＧ結合を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ−標識化ヤギ抗−マウスＩｇＧ、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ又はヤギ抗−ウサギＩｇＧによって調べ、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）によって検出した。
【００３５】
図８は、ＬＩＭ１２１５大腸細胞のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４抽出物のウェスタンブロット分析を示している。パネルＡは、以下のことを示している。レーン１：０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で可溶化されたＬＩＭ１２１５細胞。レーン２：４３Ｋ Ａ３３抗原を含有するＧｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅブレークスルー。レーン３：４１ｋＤ分子量バンドを含む１Ｍ ＮａＣｌで溶出されたＧｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合タンパク質。レーン４：ウサギ筋肉アクチン（１μｇ）。
【００３６】
パネルＢは以下のことを示している。レーン１：１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４中で可溶化されたＬＩＭ１２１５細胞。レーン２：ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４水相。レーン３：ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４デタージェント相。レーン４：Ｇｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅブレークスルー。レーン４：１Ｍ ＮａＣｌで溶出されたＧｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合タンパク質。
【００３７】
例１０
Ｇｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー（上述）の後、陰イオン−交換ＨＰＬＣを行った。前記Ｇｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅブレークスルーを、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で予め平衡化させておいたＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ１０／１０カラム上に４℃で注入した。タンパク質を、１ｍｌ／分の流速で９０分間に渡って生成させたリニア０−１Ｍ ＮａＣｌグラジェントを使用して前記カラムから溶出させた。フラクション（１ｍｌ）を、フラクションコレクター（ＦＲＡＣ１００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して自動的に収集した。タンパク質を、２８０ｎｍでの吸光度で検出した。Ａ３３抗原を、非還元条件でのウェスタンブロッティングと、バイオセンサー分析との両方によって検出した。
【００３８】
図９は、Ａ３３抗原の陰イオン−交換ＨＰＬＣを示している。前記Ｇｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅブレークスルー画分に含まれていた前記タンパク質を、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ１０／１０陰イオン−交換カラムにロードし、０−１Ｍ ＮａＣｌで示したリニアグラジェントで、１ｍｌ／分の流速で溶出させた。リニアグラジェントを（―――）で示す。１ｍｌのフラクションを収集し、各フラクションのアリコント（２０μｌ）をバイオアッセイ用に採取した。ここに記載したように非還元条件化でのウエスタンブロット分析（図９挿入）により、番号をつけたフラクション中において約４３ｋＤの抗原が検出された。
【００３９】
例１１
次に、サイズ排除ＨＰＬＣを行った。前記Ｍｏｎｏ Ｑ カラム（１０ｍｌ）から溶出された活性のあるフラクションを、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ濃縮器（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して１０倍に濃縮し、０．０５％ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳに対して透析し、４℃でＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ１０／３０カラム上にロードした。タンパク質を０．０５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳで、流速５００μｌ／分で溶出させた。フラクション（０．５ｍｌ）が収集された。タンパク質を、２８０ｎｍで検出し、Ａ３３抗原を、上述したウェスタンブロッティングとバイオセンサー分析との両方を使用してモニターした。
【００４０】
図１０は、Ａ３３抗原のサイズ排除ＨＰＬＣを示している。タンパク質較正標準（ＢＳＡ二量体、ＢＳＡおよびトリプシンインヒビタ）の溶出位置を、クロマトグラフィトレースの上方に示す。Ａ３３抗原も、図中に示したフラクションに於いて非還元条件下でのウェスタンブロット分析によって検出された（挿入Ａ）。８−２５％ネイティブゲルを使用したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２の活性の画分（フラクション２−５）のイムノブロット分析は、Ａ３３抗原は、ネイティブ条件下（ＳＰＳなし）では１８０ｋＤの相対的分子量で泳動されることを示した（挿入Ｂ，図１０）。
【００４１】
例１２
次に、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを行った。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２活性フラクション（２．５ｍｌ）を、１ｍｌ／分の流速で、複数回の各１ｍｌの注入によって、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ３００ミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（３０ｘ２．１ ｍｍ ＩＤ）上にロードした。カラムは、水中の０．１５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる開始溶液で、平衡化させておいた。タンパク質を、１００μｌ／分の流速で、６０％水性ｎ−プロパノール／０．１２５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡまでの６０分間のリニアグラジェントで溶出させた。カラム温度は４５℃であった。タンパク質検出を、２１５ｎｍで行った。Ａ３３抗原を、ウェスタンブロッティングとバイオセンサー分析との両方を使用して検出した。Ａ３３抗原を含むピークを、再精製し、上述したグラジェント条件で、５０μｌ／分の流速で、Ｎ−末端配列分析の前に、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ３００ミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（１００ｘｌ ｍｍ ＩＤ）を使用して更に濃縮した。溶出フラクションを、手作業によって回収した。
【００４２】
図１１は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２活性フラクションのミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣ精製を示している。パネルＡ、大きい枠は、２１５ｎｍでの吸光度、及びバイオセンサーによって分析されたミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣからのフラクションの溶出プロファイルを示している。パネルＡ，挿入Ａ、は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８−２５％ゲル、銀染色）によって分析された各フラクションのアリコット（２μｌ）を示し、パネルＡ，挿入Ｂは、非還元条件下に於けるウェスタンブロットを示している。パネルＢは、ミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣからの個々のフラクションのバイオセンサー分析を示している。各フラクションのアリコット（２０μｌ）を、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ濃縮装置を使用して濃縮し、１００μｌのＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）緩衝液中に再溶解させた。３０μｌのアリコットを、バイオセンサーを使用して分析した。４６分と４８分との間に溶出したフラクションに活性が見られた。
【００４３】
例１３
上述したように、Ａ３３抗原含有逆相ＨＰＬＣフラクションを、アミノ酸配列分析の為にプールした。精製Ａ３３抗原／タンパク質のＮ末端アミノ酸配列分析を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−ＰａｃｋａｒｄモデルＧ１００５Ａタンパク質センサーを、Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．１１２０−１１３０（１９９５）に記載されているルーチン３．０シーケンサープログラムによって運転して行った。下記の３０アミノ酸のＮ末端配列が得られた（配列番号１）
【００４４】
ＸＳＶＥＴＰＱＤＶＬＲＡＳＱＧＫＳＶＴＬＰＸＴＹＨＴＳＸＸＸＲＥＧＬＩＱＷＤ
【００４５】
すべての入手可能なタンパク質、ＤＮＡおよびｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇデータベースのサーチによっても、このＡ３３Ｎ末端は公知のタンパク質と有意なアミノ酸配列アイデンティティーは示されなかった。
【００４６】
更に、Ａ３３抗原含有逆相ＨＰＬＣフラクションに対して、Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａ１．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１８３ ｐｐ．７１５−７２２（１９８９）によって記載されているように、トリプシン消化を行った。ペプチドフラグメントＴ１とＴ２とが得られた。これらのペプチドフラグメントのアミノ酸配列を図１２に示す。
【００４７】
例１４
Ａ３３抗原含有フラクションを、図１３に示すプロトコールを使用してＳＷ１２２２細胞から得た。アフィニティークロマトグラフィーを行うために、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２５７，ｐｐ．１０７６６−１０７６９（１９８２）に記載されたプロトコールに従って、Ａ３３アフィニティーカラムを調製した。Ａ３３モノクローナル抗体を、０．１Ｍボレート、ｐＨ８．２中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１．５ｍｌ プロテイン Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと４℃で一晩インキュベートした。０．１Ｍボレート（ｐＨ９．２）での洗浄後、前記プロテイン−Ａ−モノクローナル抗体複合体を、０．１Ｍボレート，ｐＨ９．２中で２０ｍＭのジメチルピメリミデートと室温で１時間インキュベートした。非−共有結合抗体を、５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５で除去した。残りの活性ジメチルピメリミデート基を、洗浄によって不活性化し、ビーズを０．１ＭエタノールアミンｐＨ８．０とインキュベートした。
【００４８】
逆相ＨＰＬＣフラクションを、アミノ酸配列分析のためにプールした。配列分析は、例１３に記載したように行った。下記のＡ３３Ｎ末端配列が得られた（配列番号４）
【００４９】
ＩＳＶＥＴＰＱＤＶＬＲＡＳＱＧＫＳＶＴＬＰＸＴＹＨＴＳＴＳＳＲＥＧＬＩＱＷＤＫＬ
【００５０】
配列検索を行ったが、公知のタンパク質との有意のＩアミノ酸配列アイデンティティーは全くなかった。このＮ末端配列を、Ａ３３抗原をコードするｃＤＮＡ配列（下記）を得るのに利用した。
【００５１】
更に、Ａ３３抗原含有逆相ＨＰＬＣフラクションに対して、Ｓｉｍｓｏｎ ｅｔ ａ１．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１８３，ｐｐ．７１５−７２２（１９８９）に記載されているＡｓｐ−Ｎエンドプロテイナーゼ消化を行った。ペプチドフラグメントＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４が得られた。これらのペプチドを、ミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。これらのペプチドフラグメントのアミノ酸配列を、図１２に示す。ペプチドＤ４のエドマン分解のサイクル３において一つのアミノ酸が不明であると判定された。Ａｓｐ１１２の側方には、位置１１４のＴｈｒが存在する。これは典型的Ｎグリコシル化モチーフであるので、Ａ３３タンパク質がＮグリコシル化されたものであるという証拠が提供された。
【００５２】
フラクションに対して、Ｓａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ２３４−２３８（１９９１）に記載されているように、ペプシン消化をも行った。ペプチドフラグメントＰ１が得られた。ペプチドフラグメントＰ１のアミノ酸配列を図１２に示す。
【００５３】
ＲＰ−ＨＰＬＣフラグメントに対して、サーモリシン（Thermolysin）／ペプシン／Ａｓｐ−Ｎ消化を行った。サーモリシン消化は、Ｓａｒｋａｒ前出によって記載されているように行った。ペプチドフラグメントＰｃ１とＰｃ２が得られた。ペプチドフラグメントＰｃ１とＰｃ２とのアミノ酸配列を図１２に示す。
【００５４】
例１５
Ａ３３抗原のＮ末端のアミノ酸配列由来の免疫原を利用して免疫化研究を行った。化学合成されたペプチドである、ＳＶＥＴＰＱＤＶＬＲＡＳＱＧＫＳＶＴＬＰ（配列番号１のアミノ酸２−２１）を、ＫＬＨに結合させ、アジュバントと共に、２匹のウサギと２匹のラビットとに注射した。ウサギは、３週間間隔で４回免疫化した。１回目の免疫化に於いて、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用した。続くウサギの免疫化に於いては、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用した。マウスは標準的アジュバントを用いて２週間間隔で４回免疫化した。これらのウサギとマウスから血清を得た。これらの血清に対してウェスタンブロット分析を行った。
ウサギとマウスとの両方が、前記ペプチドと、又、細胞ラインＳＷ１２２１を使用した時における４３ｋＤバンド（同じ４３ｋＤバンドがｍＡｂ Ａ３３によって認識された）と反応するＩｇＧ抗体を生成させたことが判った（図１４）。ＩｇＧを、プロテイン−Ａアフィニチィクロマトグラフィーによってウサギ免疫血清から精製した。精製ＩｇＧを、ＬＩＭ１２１５細胞可溶化と精製Ａ３３抗原との反応性に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によってキャラクタライズした。前記ＩｇＧは、上述した２０アミノ酸ペプチド及び、非還元条件下に於いてｍＡｂ Ａ３３によって認識される前記約４３ｋＤのタンパク質と、強く反応することが判った。更に、ウサギＩｇＧ抗−血清は、還元形態の完全Ａ３３抗原と強く反応した（図１５）。ＬＩＭ１２１５からのＨＰＬＣ精製Ａ３３抗原（０．１μｇ）を、非還元条件下（図１５、レーン１）と、還元条件下（図１５、レーン２）とに於いて、８−２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｐｈａｓｔｇｅｌで電気泳動にかけ、上述した、配列番号１の残基２−２１に対して作成した抗−ペプチドＩｇＧを使用したウェスタンブロットによって分析した。Ａ３３抗原Ｎ末端配列と、そのフラグメントとは、Ａ３３抗原−特異的抗体の開発に利用することができる。これらの抗体は、還元形態又は非還元形態に於いて、Ａ３３抗原、又はそのフラグメントを認識し、これに結合する。
【００５５】
例１６
Ａ３３タンパク質のＡ３３ Ｎ末端のアミノ酸配列を使用して、Ａ３３タンパク質のｃＤＮＡをクローニングした。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ（８０μｇ）を、標準手順を使用してオリゴ（ｄＴ）セルロースのカラムでの２ラウンドのニング濃縮によって集密ＬＩＭ１２１５細胞の内部から調製した。ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーを、このｍＲＮＡを使用して、ファーストストランドＤＮＡ合成（標準手順）を開始するためにオリゴ（ｄＴ）とランダムヘキサマープライマーとを使用してＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）によるλＺＡＰＩＩ発現ベクター中で特別（custum）合成した。
【００５６】
前記ライブラリーの良好なスクリーニングが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して前記ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーから作成したＤＮＡプローブによって達成された。それぞれが８通りのみの縮重を有する６つの１７マーアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｒ９−Ｒ１４）を前記Ａ３３抗原Ｎ末端配列のアミノ酸残基３４−３９（Ｌ ＩＱＷ Ｄ Ｋ（配列番号４のアミノ酸３４−３９））に対応させるようにデザインした。
【００５７】

【００５８】
これらを、λＺＡＰＩＩベクタのバックボーンに存在する配列とハイブリダイズするようにデザインされたセンスプライマと対合にし、Ａ３３抗原テンプレートのソースとしての増幅ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーでのＰＣＲ反応に使用した。良好な反応が、下記のプライマを使用した時に起こった。ＰＣＲ反応のために、使用したテンプレートは、増幅したλＺＡＰＩＩベクター中のＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーであった。使用したプライマーは、下記の通りであった。ＫＳプライマー５’ＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧ（配列番号１８）（１７マー）（λＺＡＰＩＩベクターのマルチクローニングサイト中の配列とハイブリダイズする）そして、Ｒ１０プライマー（上記）。
【００５９】
反応条件は下記の通りであった。

【００６０】
ＰＣＲに使用したタッチダウンプログラムは以下の通りであった。
１ ９５℃ｘ５分
２ ９５℃ｘ１分
３ ６０℃ｘ１分
引き続くサイクルにおいては−２℃
４ ７２℃ｘ２分
５ （２）に戻り１１回繰り返し
６ ９５℃ｘ１分
７ ３７℃ｘ２分
８ ７２℃ｘ２分
９ ９５℃ｘ１分
１０ ４５℃ｘ２分
１１ ７２℃ｘ２分
１２ （９）に戻り１３回繰り返し
１３ ７２℃ｘ５分
１４ ４℃維持
【００６１】
三つの産物が生成され、これらは、１．４ｋｂ、０．５ｋｂおよび０．３ｋｂ長であった。
【００６２】
前記１．４ｋｂ産物（Ｒ１０／１とする）と、前記０．５ｋｂ産物（Ｒ１０／２とする）とを３％アガロースゲルで分離し、Ｂｒｅｓａ−ｃｌｅａｎ^TM核酸精製キット（Ｂｒｅｓａｔｅｃ，Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ｓ．オーストラリア）を使用して静止した。より多量の産物を生成するために、これらの精製産物を、更なるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応は、１μｌの前記ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーの代わりに、１μｌの精製ＰＣＲ産物（Ｒ１０／１又はＲ１０／２）をＤＮＡテンプレートとして使用したことを除いて、全く前述したのと同じ要領で行った。
【００６３】
前記Ｒ１０／１ＰＣＲ反応によって二つのバンドが生成された。
上側バンド サイズ１．４ｋｂ（微弱）
下側バンド サイズ０．３ｋｂ（強）１０／１ ３００ｂｐと称する、
前記Ｒ１０／２ＰＣＲ反応によって二つのバンドが生成された。
上側バンド サイズ０．５ｋｂ（強）
下側バンド サイズ０．３ｋｂ（強）１０／２と称する。
【００６４】
前記０．３ｋｂフラグメント（１０／１ ３００ｂｐおよび１０／２）を上述のようにゲルで精製した。両方のフラグメントのヌクレオチド配列決定を行ったところ、各配列の逆相補鎖が、Ａ３３Ｎ末端タンパク質配列の一部分をコードすることがわかった。
【００６５】
次に、ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用する正確な１８９ｂｐＰＣＲ産物を増幅するために、Ａ３３抗原ｃＤＮＡ配列に対する下記の正確なプライマーを合成した。
【００６６】

【００６７】
上記プライマーを、下記の標準式ＰＣＲ反応に使用し、予想されたサイズ（１８９ｂｐ）の産物を生成させた。
【００６８】
標準ＰＣＲ反応条件

【００６９】
下記の標準ＰＣＲプログラム
１ ９５℃ｘ５分間
２ ９５℃ｘ１分間
３ ５５℃ｘ１分間
４ ７２℃ｘ１分間
５ （２）に戻り３０回繰り返し
６ ７２℃ｘ５分間
７ ４℃維持
【００７０】
前記１８９ｂｐ産物を、３％アガロースゲルで分離し、Ｂｒｅｓａ−Ｃｌｅａｎ（登録商標）キットを使用して精製した。次に、それを、周知のランダムプライマー反応とＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ手順を使用して＞１０⁷ｄｐｍ／μｇＤＮＡの比放射能にまで、［α³²Ｐ］ＡＴＰと［α³²Ｐ］ＣＴＰとで放射性標識化し、前記ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーの８００，０００クローンをスクリーニングするのに使用した（標準式手順）。３ラウンドのスクリーニング後、１３の精製Ａ３３抗原ｃＤＮＡクローンが得られ、そのうちの最も長いものは、約２．８ｋｂであった。以下参照。
【００７１】
前記標識化ＰＣＲプローブを、ノザン分析にも使用し、ＬＩＭ１２１５細胞からのトータルＲＮＡとポリ（Ａ）⁺濃縮ＲＮＡ中に、約２．８ｋｂのサイズのｍＲＮＡの単一種との強いハイブリダイズシグナルが生成され、これは、前記２．８ｋｂクローンが、全長に近いものであることを示唆した。複数のクローンを配列決定したところ、すべてがＡ３３抗原Ｎ末端タンパク質配列をコードすることが判った。２．６ｋｂクローン（クローン１１）の完全なヌクレオチド配列を図１６に示す。
【００７２】
一つの２．６ｋｂｃＤＮＡを上述したように放射能標識化し（即ち、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼでのランダムプライマー反応で［α³²Ｐ］ＡＴＰと［α³²Ｐ］ＣＴＰとを使用して）ノザン分析に使用したとき、Ａ３３抗原陽性細胞ライン（ＬＩＭ１２１５，ＬＩＭ１８９９およびＬＩＭ１８６３）と、正常ヒト結腸上皮組織とから調製されたトータルＲＮＡについて、約２．８ｋｂのサイズの強いシグナルが得られたが、Ａ３３抗原陰性細胞ライン（ＬＩＭ２０９９，ＬＩＭ２４０５，ＬＩＭ２５３７）については得られなかった。
【００７３】
３１９アミノ酸翻訳タンパク質生成物（Ａ３３抗原）を、複数の２．６ｋｂクローンのヌクレオチド配列から推定した。タンパク質翻訳は、ｃＤＮＡ配列の５’末端から２番目のＡＴＧに於いて開始させるものと予測された。これは、翻訳開始に関するＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＧＣＣＣ（Ｒ）ＣＣＡＴＧＧ（配列番号２１））を参照して推定された。推定全長翻訳タンパク質産生物は、３１９のアミノ酸からなり、次のアミノ酸配列（配列番号２２）を有している。
【００７４】
【表２】

【００７５】
このタンパク質は、切断されて配列番号２２のアミノ酸２２−３１９に対応する既知のＮ末端を備えた２９８アミノ酸の成熟タンパク質を産生する２１アミノ酸の疎水性リーダ配列を含有するものであると提案される。即ち、
【００７６】
【表３】

【００７７】
最初のイン・フレーム停止コドンの位置により、３３２７６のＭｒを有するポリペプチド鎖が予想される。前記アミノ酸配列から構築された親水性プロットに基づくと、前記分子は、三つの部分を有しているようである。即ち、２１３アミノ酸の細胞外領域（その保存残基の配列アラインメントによって、二つの免疫グロブリン様ドメインを有するものと考えられる）、２４−２７アミノ酸の高度に疎水性の膜貫通ドメイン、そして、極性の高い細胞内Ｃ末端尾。この一般構造は、前記分子がシグナルトランスダクションに関与していることを示唆している。
【００７８】
クローン１１の５’末端から数えて塩基対１１３で始まり、クローン１１の塩基対１０７０まででおわる、前記２９８アミノ酸タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、以下の通り（配列番号２３）である。
【００７９】
【表４】

【００８０】
入手可能なＤＮＡおよびタンパク質データベースとの比較は、上述したアミノ酸（配列番号２２）から成るタンパク質が新規であることを明らかにした。しかしながら、入手可能なｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ（ＥＳＴ）データベースの分析は、ヒトＡ３３抗原ｃＤＮＡの一部（ヌクレオチド２８６−５２９）と、ネズミ胎生期ガン細胞ラインＦ９（ＥＭＢＬ承認番号ＭＭ８８Ａ０９；ＤＤＢＪ承認番号Ｄ２８６５７）由来の２４９塩基対ＥＳＴとの間の７４％の配列類似度を明らかにした。このＥＳＴは、ヒトＡ３３抗原ｃＤＮＡのマウスホモローグの一部に対応している可能性があったので、センスおよびアンチセンスＰＣＲプライマー（１７マー）を、前記ＥＳＴクローンの末端部にハイブリダイズするように以下のようにデザインした。
【００８１】

【００８２】
これらのプライマーを、上述したタッチダウンＰＣＲプログラムに使用して、正常な成体マウス結腸陰窩ｃＤＮＡライブラリーからの２１８ｂｐ産物を増幅した。使用した前記マウスｃＤＮＡライブラリーの詳細については、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７２１４−２７２２５（１９９３）を参照。簡単に説明すると、ｃＤＮＡを、成体マウス結腸陰窩上皮から精製されたポリ（Ａ）⁺濃縮ＲＮＡから逆転写し、次に、これを、λｇｔ−１１発現ベクタにクローニングした。この産物を、ゲル精製し、ＤＮＡ配列決定したところ、この産物が、前記Ｆ９ ＥＳＴと密接に対応しているものであることが示された。
【００８３】
【表５】

【００８４】
前記マウス大腸ＰＣＲ産物の翻訳は、Ａ３３抗原の配列の一部分（切断された分子の残基６４−１０４、配列番号２２の残基８５−１２５）とのかなりのホモロジーを明らかにした。予想ヒトおよびマウスタンパク質配列間のアラインメントを下に示す
【００８５】
【表６】

【００８６】
前記Ｆ９ＰＣＲ産物を、放射性標識化（前と同じく［α³²Ｐ］ＡＴＰと［α³²Ｐ］ＣＴＰ）して、複数のマウス組織ＲＮＡ（結腸陰窩、小腸陰窩、腎臓、肝臓、脳、脾臓、胸腺、肺、膵臓、精巣、心臓および大腿部筋から）のノザン分析に於けるプローブとして使用した。約２．６ｋｂのサイズの強いバンドは、結腸陰窩と小腸陰窩とから調製されたＲＮＡを含むレーンに於いてのみ見られ、精巣および膵臓ＲＮＡが使用された場合には、非常に弱いシグナルが見られた。このヒトＡ３３抗原ｍＲＮＡのサイズとの近い対応性と、更に、前に示したアラインメントと、制限された組織発現とは、共に、前記Ｆ９クローンが、Ａ３３抗原のマウスホモローグをコードするものであることを強く示唆している。更に、これらのデータは、前記Ｆ９ ＥＳＴが、エラーを含んでいることと、真正の配列は、ここに記載する前記ＰＣＲ産物の配列によってより良好に記載される、ということを示唆している。
【００８７】
次に、前記Ｆ９ ＰＣＲ産物を使用して、全長マウスＡ３３ｃＤＮＡクローンを得るために、前述したマウス結腸陰窩ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。標準方法を使用し、２０のクローンが同定され、これらの大半は、約２．２ｋｂのＡ３３ｃＤＮＡインサートを有していたが、２つは、より長い４．２ｋｂのインサートを有していた。標準方法を使用して、これらの二つの長いクローンと、前記２．２ｋｂのクローンの内の二つに対してＤＮＡ配列決定を行った。４．２ｋｂクローンの３’配列は、Ａ３３抗原ｃＤＮＡと対応せず、ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムを利用した公共利用可能なライブラリーの配列類似性検索は、前記３’末端が、胃、非筋肉Ｃａ²⁺ＡＴＰ−ａｓｅのｃＤＮＡに対応するものであることを明らかにした。
【００８８】
４つのクローンの全ての５’末端は、Ａ３３抗原ヌクレオチド配列として認識可能であった。従って、前記４．２ｋｂクローンは、その５’末端にＡ３３ｃＤＮＡを、その３’末端に胃非筋肉Ｃａ²⁺ＡＴＰ−ａｓｅｃＤＮＡを有している。該４．２ｋｂクローンの配列決定は、Ａ３３ｃＤＮＡの２２０２塩基対を示した。前記短いクローンは、前記抗原の２１２２塩基対のｃＤＮＡを含有していた。最も長いＯＲＦの翻訳は、−ＮＨ₂末端が不完全な３１８アミノ酸タンパク質を予測させる。これは、前記ヒト抗原と同じ基本構造を示し、これは、それに対して高度に相同である。２０アミノ酸の疎水性リーダ配列（開始メチオニンを欠く）がみられ（ヒトの２１との比較で）、一つのＶ−セット、一つのＣ２セットの免疫グロブリン様ドメイン、一つの２４アミノ酸疎水性膜貫通ドメイン、そして、６１アミノ酸細胞内ドメインとが提示されている。更に、前記Ｎ末端領域は、ヒト切断部位：ＡＤＡ↑ＩＳＶＥＴ（配列番号３０）に類似のコンセンサスペプチド切断部位：ＡＤＡ↑ＬＴＶＥＴ（配列番号２９）を有し、これらはそれぞれ、２９８アミノ酸の成熟タンパク質を産生する。
【００８９】
全体の分析は、細胞外ドメインに於けるマウスとヒトの配列間の７１％の類似、膜貫通ドメインに於ける６７％の類似度、そして、細胞内ドメインに於ける５４％の類似度を示している。前記マウスタンパク質は、９１、１７９、および２０２に於いて三つの潜在部位を有するヒト配列と比較して、位置７８、９１、１７９および２０２に４つの潜在Ｎ結合型グリコシル化部位を示している。
【００９０】
前記マウスクローンのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、配列番号３１と３２として示す。ヒトとマウスの配列の前記推定アミノ酸配列のアラインメントを図１７に示す。
【００９１】
例１７
上述したプロトコルを使用してさらなる実験を行い、同じくＡ３３をコードする最長のＡ３３抗原ｃＤＮＡクローン（クローン１８）が見つかった。このクローンのヌクレオチド配列を、配列番号３３に示す。クローン１８は約２．８キロベース長であるのに対してクローン１１は、既にしめしたように、２．６キロベース長である点で、このクローンは、上述したクローン１１よりもわずかに長い。配列番号２９に於いて、ヌクレオチド３４５−１３０２は、配列番号３３に示した前記アミノ酸配列をコードするものであると考えられる。
【００９２】
例１８
上述したように、Ａ３３分子は、Ｎ−結合型グリコシル化を有する糖タンパク質であると考えられる。抗原に対する翻訳後の修飾に関する更なる研究が行われた。
【００９３】
上述の文献に報告されているように、細胞ラインＳＷ１２２２、ＬＩＭ １２１５、ＣＯＬＯ ２０５は全てＡ３３に関して陽性であったが、ＳＷ６２０、ＭＦ−ＳＨはＡ３３に関して陰性であった。これら全ての細胞ラインは、³Ｈパルミテートにより５００μＣｉ／ｍｌとなるように代謝的に標識化され、その後デタージェントにより溶解され、上述されるように、溶解物はＡ３３とＦＢ５により沈降させた。ここで再び、ＦＢ５はネガティブコントロールとして機能する。沈降物はその後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と、オートラジオフルオログラフィーにより分析された。
【００９４】
結果は図１８と１９に示される。図１８では、期待通り還元条件下と非還元条件下での分子量において³ＨパルミテートがＡ３３抗原を標識している事がわかる。標識された沈降物は３つの全ての陽性細胞において見つけられたが、陰性細胞においては見つけられなかった。全てのテストにおいてＦＢ５は陰性であった。
【００９５】
ＳＤＳゲルが、オートラジオフルオログラフィーの前に１Mヒドロキシルアミン（ｐＨ７．５）により処理された場合、図１９に示される通り、染色がなくなった。これはパルミテート基（アシル）はチオエステルにより連結されていることを示す。（Cys）₄ドメインが分子中に存在し、パルミテートはこれに連結されていると思われる。
【００９６】
単離され、キャラクタライズされ、配列決定されたＡ３３抗原は、ガン、特にＡ３３抗原の発現により特徴づけられる大腸癌の診断に利用できる。例えば、大腸癌細胞を含んでいると考えられるサンプルをＡ３３抗原あるいはそのフラグメントに特異的な抗体に接触させると、Ａ３３蛋白質／抗体複合体が形成される。もしこのような複合体が存在すれば、大腸ガン診断において、陽性であることが示される。
【００９７】
更に、Ａ３３抗原は、これに連結するリガンド（結合パートナー）を同定するのに利用できる。Ａ３３抗原は、単離され、組換え体として発現されることができ、さらに、組織培養培地、組織抽出物、及び細胞可溶化物を含む生物源を、結合パートナーの存在についてスクリーニングするのに利用できる。結合パートナーが見つかると、単離され、精製され、配列決定される。これはバイオセンサーとアフィニティーや他のクロマトグラフィー技術とを併用して行うことができる。さらに、Ａ３３抗原をタグし、抗原をバイオセンサー表面やアフィニティの担体に対する特定の方向に固定化することに役立てることができる。当業者に知られている技術を使って結合パートナーを同定する事ができる。例えば、Stitt et al.,Cell,Vol.80,pp.661-670（1995）,Nice et al.,J.，Chromatography A.,Vol.660,pp.169-185（1994）and Bartley et al.,Nature,Vol.368,p.558（1994）;Lachmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:2523-2527（1993）等を参照。
【００９８】
更に、Ａ３３抗原をコードするｃＤＮＡについてここに記載される。５’末端や３’末端の端部における非翻訳部分を含め、このｃＤＮＡはＡ３３抗原を発現している組織や細胞ラインよりのＡ３３抗原の二本鎖ｃＤＮＡ分子の生産や、ゲノムＤＮＡよりのＡ３３抗原のゲノムクローンの生産を容易にすることが可能である。これを行うために、Ａ３３のｃＤＮＡが、ｍＲＮＡテンプレートから二本鎖ｃＤＮＡ分子を生産する一般的な行程であるＲＴ−ＰＣＲ（反転写酵素−ＰＣＲ）の技術に利用される相補的プライマーをデザインすることに利用される。更に、Ａ３３のｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡテンプレートよりＡ３３抗原遺伝子の部分を増幅させるための標準PCR反応に利用される相補的プライマーをデザインすることに利用可能である。
【００９９】
Ａ３３抗原が関連蛋白質の新規なファミリーに属する可能性がある。ここに記載されるＡ３３のｃＤＮＡ配列は、Ａ３３抗原に関連する蛋白質をコードするｃＤＮＡとゲノムＤＮＡ分子の部分を増幅するための低ストリンジェント条件下でのＰＣＲ反応に利用される特異的な、ディジェネレートオリゴヌクレオチドのプライマーをデザインすることに利用することが可能である。更に、低ストリンジェント条件下でのゲノムＤＮＡのサザン分析によりＡ３３抗原遺伝子ファミリーのメンバーを同定するための、特異的なディジェネレトオリゴヌクレオチドプローブをデザインするのにＡ３３ｃＤＮＡは利用可能である。
【０１００】
Ａ３３のｃＤＮＡを利用するこれらの行程は、分子生物学における当業者に知られる標準的な行程である。例えば、Molecular Cloning:A Laboratory manual,2_nd edition,1989（Sambrook J,Fritsch EF & Maniatis T編集）Cold Spring Harbor Laboratory Press,U.S.A.やCurrent Protocols in Molecular Biology Volumes I & II,1989（Ausubel,FM編集）Grrne Publishing Associates and Wiley-Interscience,U.S.A.を参照。
【０１０１】
本発明は好適実施形態を参照して説明されたが、これらの実施形態はあくまで本発明の数々の特徴を説明するためのものであって、本発明の思想や範囲内で、これらの実施形態に対していろいろな変更等を加えることが可能である。
【０１０２】
【表７−１】

【０１０３】
【表７−２】

【０１０４】
【表７−３】

【０１０５】
【表８】

【０１０６】
【表９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ３３モノクローナル抗体を用いた、ＬＩＭ１２１５およびＨｅｐ−２細胞の細胞蛍光分析を示す図
【図２】還元条件を使用したＳＤＳゲル電気泳動後検出不能で、非還元条件を使用したＳＤＳゲル電気泳動後のウェスタンブロットによっては検出可能であるＡ３３抗原を示す図であり、”−Ｂ−ＭＥ”は、非還元条件を使用した電気泳動を示し、”＋−ＢＭＥ”は還元条件を使用した電気移動を示す
【図３】ｍＡｂ Ａ３３を用いた、又はそれを用いない、細胞可溶化物の免疫沈降反応を示す図
【図４】ツニカマイシとインキュベートした、又はそれを用いない、細胞可溶化の免疫沈降反応を示す図
【図５】ＬＩＭ１２１５細胞から抽出されたＡ３３抗原の非還元条件下でのウェスタンブロット分析を示す図
【図６】アクチンと、Ａ３３ ＩｇＧ又はＡ３３ Ｆ（ａｂ）’₂フラグメント間の相互作用のバイオセンサー分析を示す図
【図７】Ａ３３抗原の精製に使用したクロマトグラフィー精製プロトコールを示すフローチャート
【図８Ａ】８Ａと図８Ｂとから成り、それぞれ、ＬＩＭ１２１５大腸細胞のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００抽出物とＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４抽出物とのウェスタンブロト分析を示している。
【図８Ｂ】ＬＩＭ１２１５大腸細胞のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４抽出物とのウェスタンブロト分析を示す図
【図９】Ａ３３抗原の陰イオン交換ＨＰＬＣを示す図
【図１０】Ａ３３抗原のサイズ−排除ＨＰＬＣを示す図
【図１１Ａ】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２活性フラクションのミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣ情報を示す図
【図１１Ｂ】図１１ＡのＨＰＬＣフラクション中のＡ３３抗原活性のバイオセンサー分析を示す図
【図１２】Ａ３３抗原中のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を示す図
【図１３】Ａ３３抗原のアウィニティー精製に用いたプロトコールを示すフローチャート
【図１４】キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合させた化学合成ペプチドＳＶＥＴＰＱＤＶＬＲＡＳＱＧＫＳＶＴＬＰ（配列番号１のアミノ酸２−２１）で免疫したマウスとウサギから得た血清のウェスタンブロト分析を示す図
【図１５】Ａ３３抗原のＮ−末端に対して作成した抗−ペプチドＩｇＧを使用した、非還元（パネル１）および還元（パネル２）条件下でのＡ３３抗原のウェスタンブロット分析を示す図
【図１６Ａ】Ａ３３抗原をコードする２．６ｋｂのｃＤＮＡを示す図
【図１６Ｂ】図１６Ａの連続図であり、Ａ３３抗原をコードする２．６ｋｂのｃＤＮＡを示す図
【図１７】ヒトおよびマウスＡ３３の推定アミノ酸配列の比較を示す図
【図１８】パルミテートでの標識化後、ｍＡｂ Ａ３３が標識化Ａ３３抗原を沈降させるということを示す図
【図１９】ヒドロキシルアミンを使用した時の染色の阻害を示す図[0001]
Cross-reference for related applications
This application is a continuation-in-part of US patent application Ser. No. 08 / 511,876 filed Apr. 4, 1995, referred to herein as colon cells and colon cancer cell-related proteins and peptides, both of which are incorporated herein by reference. This is a continuation-in-part application of No. 08 / 597,495 filed on Feb. 2, 1996, which is an application.
[0002]
Field of Invention
The present invention relates to human colon cell and colon cancer cell-related antigens, nucleic acid molecules, proteins and peptides. Specifically, the protein and peptide of the present invention encoded by the nucleic acid molecule of the present invention are found both on the surface and intracellular of human colon cells and human colon cancer cells, and bind to colon cancer antibodies. The protein as an isolated form has a molecular weight of about 40-45 kD when subjected to SDS gel electrophoresis under non-reducing conditions and about 49--when measured by SDS gel electrophoresis under reducing conditions. It has a molecular weight of 55 kD. This protein, its peptide fragments, and its multimers can be used to develop reagents and methods useful for the diagnosis and treatment of cancer.
[0003]
Background of the Invention
Colorectal cancer is a malignant tumor disease. The incidence of colorectal cancer is high in the West, especially in the United States. This type of tumor often metastasizes via lymphatic vessels and blood vessels. Many patients with colorectal cancer eventually die from the disease. In fact, it is estimated that 62,000 Americans and 8,000 Australians die of colorectal cancer each year.
[0004]
To date, tissue treatments and chemotherapy have been developed for the treatment of colorectal cancer. However, there is still no therapeutic method that exhibits sufficient anti-tumor activity to extend the survival of patients with colorectal cancer with metastatic disease with some degree of confidence. As a result, there is still a need for the development of methods and products for the effective treatment of colorectal cancer.
[0005]
Monoclonal antibody A33 is a mouse immunoglobulin that has been subjected to extensive basic medical analysis and localization studies in patients. (Welt et al.,J.Clin.Oncol.,8: 1894-1906 (1990), Welt et al.,J.Clin.Oncol.,12: 1561-1571 (1994), and Welt et al.,J.Clin.Oncol.14: 1787-1797 (1996)). This antibody binds to an antigen found in and on the surface of normal colon cells and colon cancer cells. This antigen is known as the A33 antigen.
[0006]
In tumors derived from the colonic mucosa, the A33 antigen is homogeneously expressed in more than 95% of cases. The A33 antigen has not been detected in many other normal tissues studied. Due to its restricted expression, this system is defined as being substantially “organ-specific” (large intestine, small intestine).
[0007]
Immunofluorescence experiments revealed that mAbA33 was internalized in vitro into macropinosomes of A33 antigen-positive cells in vitro (Daghighian et al.,J.Nuc.Med.37: 1052-1057 (1996)). In the mouse model, mAb A33 was found to be localized to a significant amount in human colon cancer xenografts, within 1 hour after administration, within the cytoplasm of transplanted colon cancer cells. Can be identified. Rapid tumor localization and high levels of antibody uptake by the tumor are thought to be related to the following facts. (1) The A33 antigen is not secreted, so targeting of mAb A33 to tumor cells is due to detached A33 antigen that diffuses from the tumor cells into the vasculature.Tsu(2) mAb A33, when bound to the A33 antigen on the cell membrane, is rapidly internalized into the cell, thereby increasing the amount of antibody bound to the cell, and (3) Colon cancer cell lines express large amounts of A33 antigen and bind to 800,000 mAb A33 molecules per cell. Depending on these characteristics, it is necessary to isolate, characterize and sequence the A33 antigen and, moreover, related proteins with similar characteristics.
[0008]
Many purification protocols typically utilize a reduction step to analyze the protein of interest by SDS gel electrophoresis. This makes it possible to identify and monitor proteins more easily. The inventors of the present application have found the surprising fact that the target A33 protein cannot be identified by Western blotting by utilizing reducing conditions. In order to completely eliminate the reduction step to identify, monitor, and characterize the A33 antigen of the present invention, standard techniques had to be changed. Once the antigen is isolated, it will be possible to study its behavior under reducing conditions.
[0009]
Purification of the A33 antigen was made more difficult by other proteins including actin being perpetuated together at approximately the same position in one-dimensional and two-dimensional gel electrophoresis. Furthermore, mAb A33 binds nonspecifically to actin. The inventors of the present application have determined that this non-specific binding to actin depends on the Fc region of the antibody. By removing the Fc region, we were able to prevent actin binding. Since actin is not a cell surface antigen of colon cancer cells and is not susceptible to reduction, it was clear to the inventors that actin cannot be the target of monoclonal antibody A33.
[0010]
Despite the difficulties in identifying, isolating and characterizing this antigen, more than 10 years after the existence of the A33 antigen was known, the purification, isolation and sequencing of this antigen was successful for the first time with the present invention. This is supported by the fact that
[0011]
As described herein, the inventors of the present application have identified, isolated and characterized the A33 antigen. The present inventors further isolated a cDNA encoding the A33 antigen, determined the nucleotide sequence of this cDNA, and deduced the amino acid sequence of the A33 antigen. Said A33 antigen, referred to herein as A33 protein, develops clinical reagents and methods useful for the prediction, diagnosis and treatment of cancer and other diseases, particularly cancers such as colon, rectal, gastric and small intestinal mucosal cancer. Can be used.
[0012]
Summary of the Invention
The present invention relates to an isolated protein found inside and on the surface of normal human colon cancer cells and human colon cancer cells, as well as peptide fragments of the protein. The protein and peptide are bound by A33 colon cancer antibody or a polyclonal antibody prepared against the region of the protein sequence. When analyzed by SDS gel electrophoresis, the isolated glycoprotein of the present invention has a molecular weight of about 40-45 kD when non-reducing conditions are used and about 40-45 kD when reducing conditions are used. It has a molecular weight of 49-55 kilodaltons. The present invention further relates to a nucleic acid molecule encoding the protein and a method of using the glycoprotein, peptide and nucleic acid molecule in diagnosis and treatment of cancer.
[0013]
Brief Description of Drawings
The foregoing brief description and other objects and features of the present invention will be more fully understood by reference to the following detailed description of the preferred but exemplary embodiments of the invention in conjunction with the accompanying drawings. I will. here,
FIG. 1 shows cytofluorescence analysis of LIM1215 and Hep-2 cells using A33 monoclonal antibody.
FIG. 2 shows the A33 antigen that is undetectable after SDS gel electrophoresis using reducing conditions and is detectable by Western blot after SDS gel electrophoresis using non-reducing conditions. “−B-ME” indicates electrophoresis using non-reducing conditions, and “+ -BME” indicates electromigration using reducing conditions.
FIG. 3 shows the immunoprecipitation reaction of cell lysates with or without mAb A33.
FIG. 4 shows cell-solubilized immunoprecipitation reactions with or without tunica mushrooms.
FIG. 5 consists of FIG. 5A and FIG. 5B and shows Western blot analysis under non-reducing conditions of A33 antigen extracted from LIM1215 cells.
FIG. 6 shows actin and A33 IgG or A33 F (ab) ′.₂Figure 2 shows a biosensor analysis of interactions between fragments.
FIG. 7 is a flow chart showing the chromatographic purification protocol used to purify the A33 antigen.
FIG. 8 consists of FIG. 8A and FIG. 8B and shows Western blot analysis of Triton X-100 extract and Triton X-114 extract of LIM1215 colon cells, respectively.
FIG. 9 shows an anion exchange HPLC of the A33 antigen.
FIG. 10 shows the size-exclusion HPLC of the A33 antigen.
FIG. 11 consists of FIG. 11A and FIG. 11B. FIG. 11A shows microprep RP-HPLC information for the Superose 12 active fraction. FIG. 11B shows a biosensor analysis of A33 antigen activity in the HPLC fraction.
FIG. 12 shows the amino acid sequence of the peptide fragment in the A33 antigen.
FIG. 13 is a flowchart showing the protocol used for the A33 antigen affinity purification.
FIG. 14 shows Western blot analysis of sera from mice and rabbits immunized with the chemically synthesized peptide SVETPQDVLRASQGKSVTLP (amino acids 2-21 of SEQ ID NO: 1) conjugated to keyhole limpet hemocyanin (KLH). .
FIG. 15 shows Western blot analysis of A33 antigen under non-reducing (panel 1) and reducing (panel 2) conditions using anti-peptide IgG made against the N-terminus of A33 antigen.
FIG. 16 consists of FIG. 16A and FIG. 16B. FIG. 16A and its continuation of FIG. 16B show a 2.6 kb cDNA encoding the A33 antigen.
FIG. 17 is a comparison of the deduced amino acid sequences of human and mouse A33.
FIG. 18 shows that mAb A33 precipitates labeled A33 antigen after labeling with palmitate.
FIG. 19 shows the inhibition of staining when using hydroxylamine.
[0014]
Detailed description of the invention
Example 1
A number of colon cancer cell lines listed in Table 1 were obtained. The LIM1215 cell line was obtained from the Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Australia. Cell lines SK-CO-17, SK-CO-19, SK-CO-10, SK-CO-11, and SK-CO-15 were obtained from Ludwig Institute for Cancer Research, New York, and Memorial Sloan Kettering Institute, New York. It was. All other cell lines were obtained from the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
[0015]
Pfleundschuh et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA75: 5122-5126 (1978), deposited under the Budapest Agreement under the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ATCC No. A rosetting assay was performed on each of these cell lines using monoclonal antibody A33 (mAb A33) secreted by the hybridoma cell line cataloged as HB8779. mAb A33 has an IgG2a isotype and binds to an antigen designated as A33 present on or on the surface of human colon cancer, as described herein. Some of the colon cancer cell lines were found to be A33-positive as determined by rosette formation test, immunoassay, and immunohistochemistry (see Table 1 below).
[0016]
[Table 1]

[0017]
Example 2
The LIM1215 colon cell line, which was positive in the rosette formation test of Example 1, was grown in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum. Confluent cells (10⁶/ Cm²) Were separated using Trypsin-Versene solution. Cells were 1/10 in a tissue culture dish containing 25 ml RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, 1 μg / ml hydrocortisone, 0.025 U / ml insulin and 10.82 μg / ml α-thioglycerol. Sowing. The petri dish for 5 days, 5% CO₂Incubated at 37 ° C. in the atmosphere. After removal of the medium, the cells were washed with PBS before being removed from the surface with a cell scraper. Cells are washed in PBS and 10⁹Resuspended at a concentration of cells / ml.
[0018]
Next, the expression of A33 antigen on the surface of the LIM1215 colon cancer cell line was analyzed by flow cytometry according to standard techniques. Hep-2 epidermal cancer cell line (Boring et al.,Cancer J.M. Cin.Vol. 44, pp. 7-26 (1994)) was used as a negative control. The cells are washed and 5 × 10 5 in 500 μl PBS containing 5 mM EDTA and 5% fetal calf serum.⁶Resuspended at a concentration of cells / ml. Cells were incubated with 5 μg A33 mAb for 30 minutes at 4 ° C. After washing with buffer, the cell / antibody complex was incubated with fluorescein-conjugated anti-mouse IgG (1/50 dilution). Negative controls were performed on cells by staining with an unrelated antibody of matched isotype (5 μg) followed by staining with fluorescein-conjugated anti-mouse IgG alone. Flow cytometry was performed using a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, U.S.A.).
[0019]
FIG. 1 shows cells of LIM1215 and Hep-2 cells using A33 monoclonal antibodyfireflyShows optical analysis. Compared to the fluorescence obtained with the control antibody (panel A), the entire population of LIM1215 showed strong uniform fluorescence (panel B) when incubated with A33 mAb. The profiles shown in the panel obtained with Hep-2 cells (C and D) overlap, indicating that no A33 mAb binding to these cells has been detected. The X axis shows the fluorescence intensity (logarithmic unit), and the Y axis shows the number of cells.
[0020]
Example 3
Cell lines that were A33 positive in the rosette formation test (Table 1) were lysed in PBS, pH 7.4 using 0.3% Triton X-100. Other detergents known to those skilled in the art can also be used to lyse A33 positive cells. Cell lysates from nine A33-positive cell lines and five A33-negative cell lines (control) were examined for expression of A33 antigen by Western blot analysis using non-reducing conditions. Molecules with a molecular weight of approximately 43 kD were detected by Western blot with mAb A33 in lysates from colon cancer cells that were A33 positive in the rosette formation test. This molecule was not detected in lysates obtained from cell lines that were negative for A33 in the rosette formation test or by antibodies other than mAb A33 containing anti-actin mAb. The A33 antigen was only detectable by Western blot analysis after SDS gel electrophoresis using non-reducing conditions. The A33 antigen was not detectable when reducing conditions were used. The Western blot shown in FIG. 2 utilized A33 antigen obtained by affinity purification from SW1222 cells. The upper band (Figure 2) shows the multimeric form of the A33 protein.
[0021]
Example 4
A33 antigen was immunoprecipitated from colon cancer cell solubilization. To do this, colon cancer cells are obtained using standard techniques known to those skilled in the art,^ThreeH-GlcNAc or³⁵Labeled with S. Cell solubilization that was A33 positive in the rosette formation test and cell solubilization that showed a band of about 43 kD by SDS gel electrophoresis under non-reducing conditions were immunoprecipitated with monoclonal antibody A33.
[0022]
FIG. 3 shows molecules immunoprecipitated from A33 positive lysate having a molecular weight of approximately 43 kD. This band did not settle from the lysate that was A33 negative in the rosette formation test. Furthermore, this band was not precipitated by antibodies other than mAb A33 (“no. 1 ° Ab” indicates that mAb A33 was not used).^ThreeSince H-GlcNAc is a carbohydrate introduced at the glycosylation site of glycoprotein, these results suggest that the A33 antigen contained in the band is a glycoprotein. Further evidence to support this is provided in the following examples.
[0023]
Example 5
³⁵SW-1222 cells labeled with S were incubated with 5 μ9 / ml tunicamycin for 18 hours. Tunicamycin is known to block glycosylation of glycoproteins. These cells and cells that were not incubated with tunicamycin were further lysed, and immunoprecipitation was performed with A33 antibody, FB-5 antibody (control), or no antibody (control). FIG. 4 shows the results of these immunoprecipitations.
[0024]
In cells that were not incubated with tunicamycin, immunoprecipitation with A33 antibody showed a band of approximately 43 kD. Isoprecipitation antibody FB-5 or immunoprecipitation without antibody did not show such a 43 kD band. In cells incubated with tunicamycin, immunoprecipitation with A33 antibody showed a 43 kD band and, in addition, three other bands of lower molecular weight. These low molecular weight bands indicate the presence of A33 antigens with varying degrees of glycosylation, depending on the presence of tunicamycin. This provides another evidence that the A33 antigen is a glycoprotein and contains an N-linked olive sugar.
[0025]
Example 6
A33 antigen was identified using two-dimensional gel electrophoresis under non-reducing conditions. First, the LIM1215 colon cell line was grown in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum. Coufuant cells (10⁶/ Cm²) Was separated from the plastic dish using Trypsin-Versene solution. Cells were cultured in tissue containing 25 ml RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum, 1 μg / ml hydrocortisone, 0.024 U / ml insulin and 10.82 μg / ml α-thioglycerol as described above. It was seeded at 1/10 in a petri dish (150 × 20 mm). The petri dish for 5 days, 5% CO₂Incubated at 37 ° C. in the atmosphere. After removal of the medium, the cells were washed with PBS before being removed by a cell scraper. Cells are washed in PBS and 10⁹Resuspended at a concentration of cells / ml.
[0026]
Next, 3 × 10 using 0.3% Triton X-100 in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4).⁸A33 antigen was extracted from LIM1215 cells. This extract was diluted 1: 1 with a sample buffer consisting of arginine / lysine buffer, pH 10, containing 30% glycerol, and electrophoresed on a small (8 × 8 cm) Novex two-dimensional gel electrophoresis gel under non-reducing conditions did.
[0027]
The proteins were separated by isoelectric focusing at pH 3.5-8.5 in the first dimension and SDS-PAGE (10% acrylamide gel) in the second dimension. The A33 antigen was used for staining with Coomassie Blue R-250 along with immunoblot analysis using mAb A33 (Figure 5B).ThereforePositioned in the gel. For comparison, the staining pattern observed using anti-actin mAb (FIG. 5A) is shown. Actin was used for comparison because it has similar electrophoretic properties to the A33 antigen.
[0028]
Example 7
Biosensor analysis was performed on the LIM1215 cell extract and chromatographic fractions. These extracts and fractions are combined with an optical instrument biosensor (BIAcore).^TM, Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden) using the A33 humanized monoclonal antibody F (ab) '₂Fragments were immobilized on the biosensor surface and monitored.
[0029]
F (ab) '₂To prepare the fragment, the A33 antibody was purified (Kinget al .;Br. J. et al. Cancer, Vol. 72, pp. 1364-1372 (1995)). F (ab) ’₂The fragment was generated by pepsin (1% w / w) digestion of 10 mg A33 mAb in 0.1 M sodium acetate, pH 3.5. They were then purified by size exclusion chromatography on a Sephacryl S-200 (2.8 × 60 cm) column (Pharmacia Biotech) equilibrated with 50 mM sodium phosphate (pH 7.4) containing 0.15 mM NaCl. Elution was performed at a flow rate of 0.5 ml / min.
[0030]
F (ab) ’₂Detection of antigen binding to the fragment is based on the phenomenon of surface plasmon resonance, a technique that measures slight changes in refractive index at or near the gold sensor surface. Prior to this biosensor assay, cell extracts and chromatographic fractions were analyzed with BIAcore.^TMDilute to a final volume of 100 μl in 10 mM Hepes (pH 7.4) containing buffer (HBS); 3.4 mM EDTA, 0.15 mM NaCl and 0.005% Tween20. Sample (30 μl) was injected over the sensor surface at a flow rate of 5 μl / min. After completion of the injection phase, dissociation was monitored in BIAcore buffer for 360 seconds at the same flow rate. Residual bound antigen was eluted and the surface regenerated during injection using 40 μl of 10 mM NaOH. By this treatment, the protein immobilized on the sensor surface was not denatured. This is shown by the equivalent signal obtained upon injection of a sample containing the A33 antigen.
[0031]
FIG. 6 shows actin and complete A33 antibody or A33F (ab) '₂Figure 2 shows a biosensor analysis of the interaction between fragments. A preparation of rabbit muscle actin (0.3 μg) was added to complete A33 (upper trace) or A33 F (ab) '₂Injection was made at a flow rate of 5 μl / min onto the sensor surface immobilized with either fragment (lower trace). Protein / protein interaction was monitored by surface plasmon resonance. At the end of the injection phase, a signal of 247 RU was observed due to actin binding to A33 IgG, whereas A33F (ab) '₂The signal corresponding to actin binding to was only 4 RU (indicated by arrows).
[0032]
Example 8
A33 antigen was purified from LIM1215 cells for sequence analysis. FIG. 7 is a flow chart showing the chromatographic purification protocol used to purify the A33 antigen. To extract the A33 antigen, LIM1215 colon cells (2 × 10⁹Cells), washed in phosphate-buffered saline (PBS), and in 15 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 1 mM MPMSF, 1 mM pepstatin, 0.1 mM leupeptin, and 0.01 U / ml aprotinin. Dissolved in either 0.3% (v / v) Triton X-100 or 1% (v / v) Triton X-114 for 30 minutes at 4 ° C.⁸Cells / ml). The resulting extract was centrifuged twice at 14,000 g for 20 minutes at 4 ° C. Triton-X100 supernatant was removed directly for Green-Sepharose HE-4BD chromatography. Triton X-114 extract supernatant was 6% in 0.06% (v / v) Triton X-114 and 15 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing the protease inhibitors listed above. Layered on sucrose. The tube containing the Triton X-114 extract and sucrose was incubated at 37 ° C. for 30 minutes and then centrifuged at 5,000 g for 15 minutes at 25 ° C. The detergent was collected for chromatographic purification.
[0033]
To perform Green-Sepharose chromatography, the Triton-X100 extract or Triton X-114 detergent layer was diluted to a final concentration of 0.1% Triton and subjected to high performance protein liquid chromatography (FPLC, Pharmacia Biotech, It was loaded at 4 ° C. on a Green-Sepharose HE-4BD column (100 × 10 mm ID) connected to Uppsala, Sweden). The column was equilibrated with 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 0.1% CHAPS (w / v). Bound proteins, including actin, were eluted stepwise with 1M NaCl. The breakthrough contained the A33 antigen, which was collected for anion-exchange HPLC as described below.
[0034]
Example 9
To confirm the presence of A33 antigen, Western blot analysis was performed during the purification process. Electrophoresis and Western blot analysis were performed on precast Phasegels using a Phassystem separation and control unit (Pharmacia Biotech). Cell extracts and chromatographic fractions were purified from Reid et al. , Electrophoresis, Vol. 16, pp. 1120-1130 (1995), electrophoresed with 8-25% SDS-PAGE Pastgel or 8-25% native Pastgels under non-reducing conditions, transferred onto PVDF membrane, and A33 monoclonal antibody And incubated. The A33 antigen purified by RP-HPLC was also analyzed by Western blot using polyclonal anti-N-terminal peptide antibodies (described herein) under non-reducing and reducing conditions. IgG binding was examined by horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG, goat anti-human IgG or goat anti-rabbit IgG and detected by enhanced chemistry (ECL).
[0035]
FIG. 8 shows Western blot analysis of Triton X-100 and Triton X-114 extracts of LIM1215 colon cells. Panel A shows the following: Lane 1: LIM1215 cells solubilized in 0.3% Triton X-100. Lane 2: Green-Sepharose breakthrough containing 43K A33 antigen. Lane 3: Green-Sepharose binding protein eluted with 1 M NaCl containing a 41 kD molecular weight band. Lane 4: Rabbit muscle actin (1 μg).
[0036]
Panel B shows the following: Lane 1: LIM1215 cells solubilized in 1% Triton X-114. Lane 2: Triton X-114 aqueous phase. Lane 3: Triton X-114 detergent phase. Lane 4: Green-Sepharose breakthrough. Lane 4: Green-Sepharose binding protein eluted with 1 M NaCl.
[0037]
Example 10
Anion-exchange HPLC was performed after Green-Sepharose chromatography (described above). The Green-Sepharose breakthrough was placed on a Mono Q HR10 / 10 column pre-equilibrated in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 0.1% (w / v) CHAPS at 4 ° C. Injected. The protein was eluted from the column using a linear 0-1 M NaCl gradient generated over 90 minutes at a flow rate of 1 ml / min. Fractions (1 ml) were collected automatically using a fraction collector (FRAC100, Pharmacia Biotech). Protein was detected by absorbance at 280 nm. A33 antigen was detected by both Western blotting under non-reducing conditions and biosensor analysis.
[0038]
FIG. 9 shows an anion-exchange HPLC of the A33 antigen. The protein contained in the Green-Sepharose breakthrough fraction was loaded onto a Mono Q HR10 / 10 anion-exchange column and eluted with a linear gradient shown as 0-1 M NaCl at a flow rate of 1 ml / min. I let you. The linear gradient is indicated by (---). 1 ml fractions were collected and an aliquot (20 μl) of each fraction was taken for bioassay. As described herein, Western blot analysis under non-reducing conditions (FIG. 9 insert) detected approximately 43 kD of antigen in the numbered fractions.
[0039]
Example 11
Next, size exclusion HPLC was performed. The active fraction eluted from the Mono Q column (10 ml) was concentrated 10 times using a Speed Vac concentrator (Savant Instruments Inc., NY, USA), 0.05% Dialyzed against PBS containing CHAPS (w / v) and loaded onto a Superose 12 HR10 / 30 column at 4 ° C. The protein was eluted with PBS containing 0.05% (w / v) CHAPS at a flow rate of 500 μl / min. Fractions (0.5 ml) were collected. Protein was detected at 280 nm and A33 antigen was monitored using both Western blotting and biosensor analysis as described above.
[0040]
FIG. 10 shows the size exclusion HPLC of the A33 antigen. The elution position of protein calibration standards (BSA dimer, BSA and trypsin inhibitor) is shown above the chromatographic trace. A33 antigen was also detected by Western blot analysis under non-reducing conditions in the fractions shown in the figure (Insertion A). Immunoblot analysis of the Superose 12 active fraction (Fraction 2-5) using an 8-25% native gel shows that the A33 antigen migrates at a relative molecular weight of 180 kD under native conditions (no SPS). Shown (insert B, FIG. 10).
[0041]
Example 12
Next, reverse phase HPLC chromatography was performed. Superose 12 activity fraction (2.5 ml) was loaded onto a Brownlee Aquapore RP300 microprep RP-HPLC column (30 × 2.1 mm ID) with multiple injections of 1 ml each at a flow rate of 1 ml / min. The column was equilibrated with a starting solution consisting of 0.15% (v / v) trifluoroacetic acid (TFA) in water. The protein was eluted with a linear gradient of 60 minutes to 60% aqueous n-propanol / 0.125% (v / v) TFA at a flow rate of 100 μl / min. The column temperature was 45 ° C. Protein detection was performed at 215 nm. A33 antigen was detected using both Western blotting and biosensor analysis. The peak containing the A33 antigen was re-purified and subjected to a Brownlee Aquapore RP300 microprep RP-HPLC column (100xl mm ID) prior to N-terminal sequence analysis at a flow rate of 50 μl / min under the gradient conditions described above. Further concentration using. The elution fraction was collected manually.
[0042]
FIG. 11 shows the micropreparative RP-HPLC purification of the Superose 12 active fraction. Panel A, large box shows the absorbance at 215 nm and the elution profile of the fraction from the micropreparative RP-HPLC analyzed by the biosensor. Panel A, Insert A, shows an aliquot (2 μl) of each fraction analyzed by SDS-PAGE (8-25% gel, silver stain), Panel A, Insert B, Western under non-reducing conditions. Blot is shown. Panel B shows biosensor analysis of individual fractions from micropreparative RP-HPLC. An aliquot (20 μl) of each fraction was concentrated using a Speed Vac concentrator and redissolved in 100 μl BIAcore® buffer. A 30 μl aliquot was analyzed using a biosensor. Activity was seen in the fraction eluted between 46 and 48 minutes.
[0043]
Example 13
As described above, A33 antigen-containing reverse phase HPLC fractions were pooled for amino acid sequence analysis. N-terminal amino acid sequence analysis of purified A33 antigen / protein was performed using a Hewlett-Packard model G1005A protein sensor as described by Reid et al. , Electrophoresis. Vol. 16, pp. 1120-1130 (1995) and was run according to the routine 3.0 sequencer program. The following 30 amino acid N-terminal sequence was obtained (SEQ ID NO: 1).
[0044]
XSVETPQDVLRASQGKSVTLPXTTYHTSXXXREGLIQWD
[0045]
A search of all available protein, DNA, and expressed sequence tag databases also showed that this A33 N-terminus did not show significant amino acid sequence identity with known proteins.
[0046]
Furthermore, for the A33 antigen-containing reverse phase HPLC fraction, Simpson et al. , Eur. J. et al. Biochem. , Vol. 183 pp. Trypsin digestion was performed as described by 715-722 (1989). Peptide fragments T1 and T2 were obtained. The amino acid sequences of these peptide fragments are shown in FIG.
[0047]
Example 14
A33 antigen-containing fractions were obtained from SW1222 cells using the protocol shown in FIG. To perform affinity chromatography, Schneider et al. , J .; Biol. Chem. Vol. 257, pp. A33 affinity columns were prepared according to the protocol described in 10766-10769 (1982). A33 monoclonal antibody was diluted to 1 mg / ml in 0.1 M borate, pH 8.2 and incubated with 1.5 ml protein A-Sepharose overnight at 4 ° C. After washing with 0.1 M borate (pH 9.2), the protein-A-monoclonal antibody complex was incubated with 20 mM dimethylpimelimidate in 0.1 M borate, pH 9.2 for 1 hour at room temperature. Non-covalently bound antibody was removed with 50 mM glycine, pH 2.5. The remaining active dimethylpimelimidate groups were inactivated by washing and the beads were incubated with 0.1 M ethanolamine pH 8.0.
[0048]
Reverse phase HPLC fractions were pooled for amino acid sequence analysis. Sequence analysis was performed as described in Example 13. The following A33N terminal sequence was obtained (SEQ ID NO: 4).
[0049]
ISVETPQDVLRASQGKSVTLPXTYHTSTSSREGLIQWDKL
[0050]
A sequence search was performed and there was no significant I amino acid sequence identity with known proteins. This N-terminal sequence was used to obtain a cDNA sequence encoding the A33 antigen (below).
[0051]
Furthermore, for the A33 antigen-containing reverse phase HPLC fraction, Simson et al. , Eur. J. et al. Biochem. , Vol. 183, pp. Asp-N endoproteinase digestion described in 715-722 (1989). Peptide fragments D1, D2, D3 and D4 were obtained. These peptides were purified by microprep RP-HPLC. The amino acid sequences of these peptide fragments are shown in FIG. One amino acid was determined to be unknown in cycle 3 of Edman degradation of peptide D4. At the side of Asp 112, Thr at position 114 exists. Since this is a typical N-glycosylation motif, evidence was provided that the A33 protein was N-glycosylated.
[0052]
For fractions, see Sarkar et al. , Proc. Nat'l Acad. Sci. U. S. A. , Vol. 88, pp 234-238 (1991), pepsin digestion was also performed. Peptide fragment P1 was obtained. The amino acid sequence of peptide fragment P1 is shown in FIG.
[0053]
The RP-HPLC fragment was digested with Thermolysin / Pepsin / Asp-N. Thermolysin digestion was performed as described by Sarkar, supra. Peptide fragments Pc1 and Pc2 were obtained. The amino acid sequences of peptide fragments Pc1 and Pc2 are shown in FIG.
[0054]
Example 15
Immunization studies were performed using an immunogen derived from the N-terminal amino acid sequence of the A33 antigen. A chemically synthesized peptide, SVETPQDVLRASQGKSVTLP (amino acids 2-21 of SEQ ID NO: 1), was conjugated to KLH and injected into two rabbits and two rabbits with adjuvant. Rabbits were immunized 4 times at 3 week intervals. Complete Freund's adjuvant (CFA) was used in the first immunization. In the subsequent rabbit immunization, incomplete Freund's adjuvant (IFA) was used. Mice were immunized 4 times with a standard adjuvant at 2-week intervals. Serum was obtained from these rabbits and mice. Western blot analysis was performed on these sera.
It was found that both rabbits and mice generated IgG antibodies that react with the peptide and with the 43 kD band when the cell line SW1221 was used (the same 43 kD band was recognized by mAb A33) ( FIG. 14). IgG was purified from rabbit immune serum by protein-A affinity chromatography. Purified IgG was characterized by SDS-PAGE and Western blot analysis for reactivity of LIM1215 cell solubilization with purified A33 antigen. The IgG was found to react strongly with the 20 amino acid peptide described above and the approximately 43 kD protein recognized by mAb A33 under non-reducing conditions. Furthermore, rabbit IgG anti-serum reacted strongly with the reduced form of complete A33 antigen (FIG. 15). HPLC purified A33 antigen (0.1 μg) from LIM1215 was treated with 8-25% SDS-PAGE Pastgel under non-reducing conditions (FIG. 15, lane 1) and reducing conditions (FIG. 15, lane 2). And analyzed by Western blot using anti-peptide IgG made against residues 2-21 of SEQ ID NO: 1 as described above. The A33 antigen N-terminal sequence and fragments thereof can be used for the development of A33 antigen-specific antibodies. These antibodies recognize and bind to the A33 antigen, or a fragment thereof, in reduced or non-reduced form.
[0055]
Example 16
The A33 protein cDNA was cloned using the A33 N-terminal amino acid sequence of the A33 protein. Poly (A)⁺RNA (80 μg) was prepared from the inside of confluent LIM1215 cells by two rounds of Ning concentration on an oligo (dT) cellulose column using standard procedures. The LIM1215 cDNA library was used to clone Clontech (Palo Alto, California, US) using oligo (dT) and random hexamer primers to initiate first strand DNA synthesis (standard procedure) using this mRNA. A.) in a λZAPII expression vector.
[0056]
Good screening of the library was achieved with DNA probes made from the LIM1215 cDNA library using polymerase chain reaction (PCR). Six 17-mer antisense oligonucleotides (R9-R14) each having only 8 degeneracyes were converted to amino acid residues 34-39 (L IQW DK (amino acids 34-- of SEQ ID NO: 4) of the A33 antigen N-terminal sequence. 39)).
[0057]

[0058]
These were paired with sense primers designed to hybridize to sequences present in the backbone of the λZAPII vector and used in PCR reactions with the amplified LIM1215 cDNA library as the source of the A33 antigen template. A good reaction occurred when using the following primers: For the PCR reaction, the template used was the LIM1215 cDNA library in the amplified λZAPII vector. The primers used were as follows. KS primer 5'CGAGGTCGACGGTATCG (SEQ ID NO: 18) (17mer) (hybridizes with the sequence in the multiple cloning site of λZAPII vector) and R10 primer (above).
[0059]
The reaction conditions were as follows.

[0060]
The touchdown program used for PCR was as follows.
1 95 ° C x 5 minutes
2 95 ° C x 1 min
3 60 ° C x 1 min
-2 ° C in subsequent cycles
4 72 ° C x 2 minutes
5 Return to (2) and repeat 11 times
6 95 ° C x 1 min
7 37 ° C x 2 minutes
8 72 ° C x 2 minutes
9 95 ° C x 1 min
10 45 ° C x 2 minutes
11 72 ° C x 2 minutes
12 Return to (9) and repeat 13 times
13 72 ° C x 5 min
14 Maintained at 4 ° C
[0061]
Three products were produced, which were 1.4 kb, 0.5 kb and 0.3 kb long.
[0062]
The 1.4 kb product (referred to as R10 / 1) and the 0.5 kb product (referred to as R10 / 2) were separated on a 3% agarose gel, and Bresa-clean^TMStationary using a nucleic acid purification kit (Bresatec, Adelaide, S. Australia). These purified products were used as templates for further PCR reactions in order to produce higher amounts of product. The PCR reaction was performed exactly as described above, except that 1 μl of the purified PCR product (R10 / 1 or R10 / 2) was used as the DNA template instead of 1 μl of the LIM1215 cDNA library.
[0063]
Two bands were generated by the R10 / 1 PCR reaction.
Upper band size 1.4 kb (weak)
Lower band size 0.3 kb (strong) 10/1 300 bp,
Two bands were generated by the R10 / 2 PCR reaction.
Upper band size 0.5 kb (strong)
The lower band size is referred to as 0.3 kb (strong) 10/2.
[0064]
The 0.3 kb fragment (10/1 300 bp and 10/2) was purified on a gel as described above. Nucleotide sequencing of both fragments revealed that the reverse complement of each sequence encoded a portion of the A33 N-terminal protein sequence.
[0065]
The following exact primers for the A33 antigen cDNA sequence were then synthesized to amplify the correct 189 bp PCR product used as a probe to screen the LIM1215 cDNA library.
[0066]

[0067]
The primers were used in the standard PCR reaction described below to produce a product of the expected size (189 bp).
[0068]
Standard PCR reaction conditions

[0069]
The following standard PCR program
1 95 ° C x 5 minutes
2 95 ° C x 1 minute
3 55 ° C x 1 minute
4 72 ° C x 1 minute
5 Return to (2) and repeat 30 times
6 72 ° C x 5 minutes
7 Maintain at 4 ℃
[0070]
The 189 bp product was separated on a 3% agarose gel and purified using a Bresa-Clean® kit. It is then analyzed using the well-known random primer reaction and Klenow polymerase procedure> 10⁷To the specific activity of dpm / μg DNA, [α³²P] ATP and [α³²Radiolabeled with P] CTP and used to screen 800,000 clones of the LIM1215 cDNA library (standard procedure). After three rounds of screening, 13 purified A33 antigen cDNA clones were obtained, the longest of which was approximately 2.8 kb. See below.
[0071]
The labeled PCR probe is also used for Northern analysis, and total RNA and poly (A) from LIM1215 cells are used.⁺In the concentrated RNA, a strong hybridization signal was generated with a single species of mRNA of approximately 2.8 kb in size, suggesting that the 2.8 kb clone was near full length. Multiple clones were sequenced and found to all encode the A33 antigen N-terminal protein sequence. The complete nucleotide sequence of the 2.6 kb clone (clone 11) is shown in FIG.
[0072]
One 2.6 kb cDNA is radiolabeled as described above (ie, a random primer reaction with Klenow polymerase [α³²P] ATP and [α³²A size of about 2.8 kb for total RNA prepared from A33 antigen positive cell lines (LIM1215, LIM1899 and LIM1863) and normal human colon epithelial tissue when used for Northern analysis (using P] CTP) However, it was not obtained for the A33 antigen negative cell lines (LIM2099, LIM2405, LIM2537).
[0073]
The 319 amino acid translated protein product (A33 antigen) was deduced from the nucleotide sequences of multiple 2.6 kb clones. Protein translation was predicted to start at the second ATG from the 5 'end of the cDNA sequence. This is the Kozak consensus sequence (GCCC® CC) for translation initiation.ATGG (SEQ ID NO: 21)). The predicted full-length translated protein product consists of 319 amino acids and has the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 22).
[0074]
[Table 2]

[0075]
This protein is proposed to contain a 21 amino acid hydrophobic leader sequence that is cleaved to produce a 298 amino acid mature protein with a known N-terminus corresponding to amino acids 22-319 of SEQ ID NO: 22. . That is,
[0076]
[Table 3]

[0077]
Depending on the position of the first in-frame stop codon, a polypeptide chain with an Mr of 33276 is expected. Based on the hydrophilicity plot constructed from the amino acid sequence, the molecule appears to have three parts. An extracellular region of 213 amino acids (considered to have two immunoglobulin-like domains by sequence alignment of its conserved residues), a highly hydrophobic transmembrane domain of 24-27 amino acids, and a polar High intracellular C-terminal tail. This general structure suggests that the molecule is involved in signal transduction.
[0078]
The cDNA sequence encoding the 298 amino acid protein starting from the base pair 113 and counting from the 5 'end of the clone 11 to the base pair 1070 of the clone 11 is as follows (SEQ ID NO: 23).
[0079]
[Table 4]

[0080]
Comparison with available DNA and protein databases revealed that the protein consisting of the amino acid described above (SEQ ID NO: 22) is novel. However, analysis of the available expressed sequence tag (EST) database is derived from a portion of the human A33 antigen cDNA (nucleotides 286-529) and the murine embryonic cancer cell line F9 (EMBL approval number MM88A09; DDBJ approval number D28657). Revealed 74% sequence similarity between 249 base pairs of ESTs. Since this EST may correspond to a part of the mouse homologue of the human A33 antigen cDNA, the sense and antisense PCR primers (17-mer) were hybridized to the end of the EST clone. Designed as follows.
[0081]

[0082]
These primers were used in the touchdown PCR program described above to amplify a 218 bp product from a normal adult mouse colon crypt cDNA library. For details of the mouse cDNA library used, see, for example, J. Org. Biol. Chem. 268: 27214-27225 (1993). Briefly, cDNA was purified from adult mouse colon crypt epithelium (A)⁺This was reverse transcribed from the concentrated RNA and then cloned into the λgt-11 expression vector. The product was gel purified and DNA sequenced, indicating that this product closely corresponds to the F9 EST.
[0083]
[Table 5]

[0084]
Translation of the mouse colon PCR product revealed considerable homology with a portion of the sequence of the A33 antigen (residues 64-104 of the truncated molecule, residues 85-125 of SEQ ID NO: 22). Alignment between predicted human and mouse protein sequences is shown below
[0085]
[Table 6]

[0086]
The F9 PCR product was radiolabeled (as in [α³²P] ATP and [α³²P] CTP) and Northern analysis of multiple mouse tissue RNAs (from colon crypt, small intestine crypt, kidney, liver, brain, spleen, thymus, lung, pancreas, testis, heart and thigh muscle) Used as a probe. A strong band of about 2.6 kb in size is seen only in lanes containing RNA prepared from colonic and small intestine crypts, and a very weak signal when testis and pancreatic RNA is used. It was observed. The close correspondence with the size of this human A33 antigen mRNA, as well as the alignment shown above and restricted tissue expression, are both that the F9 clone encodes a mouse homologue of the A33 antigen. Strongly suggest. Furthermore, these data suggest that the F9 EST contains errors and that the authentic sequence is better described by the sequence of the PCR product described herein.
[0087]
Next, the aforementioned mouse colon crypt cDNA library was screened to obtain a full-length mouse A33 cDNA clone using the F9 PCR product. Using standard methods, 20 clones were identified, most of which had an approximately 2.2 kb A33 cDNA insert, while two had a longer 4.2 kb insert. DNA sequencing was performed on these two long clones and two of the 2.2 kb clones using standard methods. The 3 'sequence of the 4.2 kb clone does not correspond to the A33 antigen cDNA, and sequence similarity searches of publicly available libraries using the BLAST and FASTA algorithms showed that the 3' end was stomach, non-muscle Ca²⁺It was clarified that it corresponds to cDNA of ATP-ase.
[0088]
All 5 'ends of the four clones were recognizable as A33 antigen nucleotide sequences. Thus, the 4.2 kb clone contains A33 cDNA at its 5 'end and gastric non-muscle Ca at its 3' end.²⁺Has ATP-asec DNA. Sequencing of the 4.2 kb clone showed 2202 base pairs of A33 cDNA. The short clone contained 2122 base pair cDNA of the antigen. The longest ORF translation is -NH₂A 318 amino acid protein with incomplete ends is predicted. This shows the same basic structure as the human antigen, which is highly homologous to it. There is a 20 amino acid hydrophobic leader sequence (lacking the starting methionine) (compared to human 21), one V-set, one C2 set immunoglobulin-like domain, one 24 amino acid hydrophobic transmembrane. Domains and a 61 amino acid intracellular domain are presented. Further, the N-terminal region has a consensus peptide cleavage site: ADA ↑ LTVET (SEQ ID NO: 29) similar to the human cleavage site: ADA ↑ ISVET (SEQ ID NO: 30), each of which contains a mature protein of 298 amino acids. Produce.
[0089]
The overall analysis shows 71% similarity between mouse and human sequences in the extracellular domain, 67% similarity in the transmembrane domain, and 54% similarity in the intracellular domain. ing. The mouse protein shows four potential N-linked glycosylation sites at positions 78, 91, 179 and 202 as compared to a human sequence with three potential sites at 91, 179 and 202.
[0090]
The nucleotide and deduced amino acid sequences of the mouse clone are shown as SEQ ID NOs: 31 and 32. An alignment of the deduced amino acid sequences of human and mouse sequences is shown in FIG.
[0091]
Example 17
Further experiments were performed using the protocol described above and the longest A33 antigen cDNA clone (clone 18), also encoding A33, was found. The nucleotide sequence of this clone is shown in SEQ ID NO: 33. This clone is slightly longer than clone 11 described above in that clone 18 is approximately 2.8 kilobases long while clone 11 is 2.6 kilobases long as already shown. . In SEQ ID NO: 29, nucleotides 345 to 1302 are considered to encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33.
[0092]
Example 18
As mentioned above, the A33 molecule is considered to be a glycoprotein with N-linked glycosylation. Further work has been done on post-translational modifications to the antigen.
[0093]
As reported in the above literature, cell lines SW1222, LIM 1215, COLO 205 were all positive for A33, but SW620, MF-SH were negative for A33. All these cell lines^ThreeIt was metabolically labeled to 500 μCi / ml with H palmitate and then lysed by detergent, and the lysate was precipitated with A33 and FB5 as described above. Here again, FB5 functions as a negative control. The sediment was then analyzed by SDS-PAGE analysis and autoradifluorography.
[0094]
The results are shown in FIGS. In FIG. 18, as expected, in molecular weight under reducing and non-reducing conditions.^ThreeIt can be seen that H palmitate labels the A33 antigen. Labeled sediment was found in all three positive cells but not in negative cells. FB5 was negative in all tests.
[0095]
When the SDS gel was treated with 1M hydroxylamine (pH 7.5) prior to autoradiography, there was no staining as shown in FIG. This indicates that the palmitate group (acyl) is linked by a thioester. (Cys)_FourThere appears to be a domain in the molecule and palmitate linked to it.
[0096]
The isolated, characterized, and sequenced A33 antigen can be used for the diagnosis of cancer, particularly colorectal cancer characterized by the expression of the A33 antigen. For example, when a sample considered to contain colon cancer cells is contacted with an antibody specific for A33 antigen or a fragment thereof, an A33 protein / antibody complex is formed. If such a complex is present, it is shown to be positive in colorectal cancer diagnosis.
[0097]
Furthermore, the A33 antigen can be used to identify ligands (binding partners) that bind to it. The A33 antigen can be isolated and expressed recombinantly and further utilized to screen biological sources including tissue culture media, tissue extracts, and cell lysates for the presence of binding partners. it can. Once a binding partner is found, it is isolated, purified and sequenced. This can be done in combination with a biosensor and affinity or other chromatographic techniques. Furthermore, the A33 antigen can be tagged to help immobilize the antigen in a specific direction relative to the biosensor surface or affinity carrier. Binding partners can be identified using techniques known to those skilled in the art. For example, Stitt et al.,Cell, Vol.80, pp.661-670 (1995), Nice et al.,J., Chromatography A., Vol. 660, pp. 169-185 (1994) and Bartley et al.,Nature, Vol. 368, p. 558 (1994); Lachmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2523-2527 (1993).
[0098]
In addition, a cDNA encoding the A33 antigen is described herein. This cDNA, including untranslated portions at the 5 ′ and 3 ′ ends, produces double-stranded cDNA molecules of A33 antigen from tissues and cell lines expressing A33 antigen, and A33 from genomic DNA. It is possible to facilitate the production of genomic clones of the antigen. To do this, A33 cDNA is designed as a complementary primer used in RT-PCR (anti-transcriptase-PCR) technology, which is a common process for producing double-stranded cDNA molecules from mRNA templates. It is used for that. Furthermore, A33 cDNA can be used to design complementary primers used in standard PCR reactions for amplifying a portion of the A33 antigen gene from a genomic DNA template.
[0099]
It is possible that the A33 antigen belongs to a novel family of related proteins. The cDNA sequence of A33 described herein is a specific, di-nucleotide sequence that is used in PCR reactions under low stringent conditions to amplify a portion of the cDNA and genomic DNA molecule that encodes a protein related to the A33 antigen. It can be used to design primers for generate oligonucleotides. Furthermore, A33 cDNA can be used to design specific degenerate oligonucleotide probes to identify members of the A33 antigen gene family by Southern analysis of genomic DNA under low stringency conditions.
[0100]
These processes utilizing the A33 cDNA are standard processes known to those skilled in molecular biology. For example, Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2_nd edition, 1989 (Sambrook J, edited by Fritsch EF & Maniatis T) See Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA and Current Protocols in Molecular Biology Volumes I & II, 1989 (Edited by Ausubel, FM) See Grrne Publishing Associates and Wiley-Interscience, USA .
[0101]
Although the present invention has been described with reference to preferred embodiments, these embodiments are merely illustrative of the various features of the present invention and are within the spirit and scope of the present invention. Various changes can be made to the.
[0102]
[Table 7-1]

[0103]
[Table 7-2]

[0104]
[Table 7-3]

[0105]
[Table 8]

[0106]
[Table 9]

[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows cytofluorescence analysis of LIM1215 and Hep-2 cells using A33 monoclonal antibody.
FIG. 2 shows A33 antigen that is undetectable after SDS gel electrophoresis using reducing conditions and is detectable by Western blot after SDS gel electrophoresis using non-reducing conditions. “ME” indicates electrophoresis using non-reducing conditions, “+ −BME” indicates electromigration using reducing conditions.
FIG. 3 shows immunoprecipitation reaction of cell lysate with or without mAb A33.
FIG. 4 shows cell solubilization immunoprecipitation reaction with or without tunica mushrooms.
FIG. 5 shows Western blot analysis of A33 antigen extracted from LIM1215 cells under non-reducing conditions.
FIG. 6: Actin and A33 IgG or A33 F (ab) ′₂Diagram showing biosensor analysis of interactions between fragments
FIG. 7 is a flow chart showing the chromatographic purification protocol used to purify the A33 antigen.
FIG. 8A consists of 8A and FIG. 8B, showing Western blot analysis of Triton X-100 and Triton X-114 extracts of LIM1215 colon cells, respectively.
FIG. 8B shows Western blot analysis of LIM1215 colon cells with Triton X-114 extract.
FIG. 9 shows anion exchange HPLC of A33 antigen.
FIG. 10 shows size-exclusion HPLC of A33 antigen.
FIG. 11A shows micropreparative RP-HPLC information of Superose 12 activity fraction.
FIG. 11B shows biosensor analysis of A33 antigen activity in the HPLC fraction of FIG. 11A.
FIG. 12 shows the amino acid sequence of a peptide fragment in the A33 antigen.
FIG. 13 is a flowchart showing the protocol used for the A33 antigen affinity purification.
FIG. 14 shows Western blot analysis of sera obtained from mice and rabbits immunized with the chemically synthesized peptide SVETPQDVLRASQGKSVTLP (amino acids 2-21 of SEQ ID NO: 1) conjugated to keyhole limpet hemocyanin (KLH).
FIG. 15 shows Western blot analysis of A33 antigen under non-reducing (panel 1) and reducing (panel 2) conditions using anti-peptide IgG made against the N-terminus of A33 antigen.
FIG. 16A shows a 2.6 kb cDNA encoding the A33 antigen.
FIG. 16B is a continuation diagram of FIG. 16A showing a 2.6 kb cDNA encoding the A33 antigen.
FIG. 17 shows a comparison of deduced amino acid sequences of human and mouse A33.
FIG. 18 shows that mAb A33 precipitates labeled A33 antigen after labeling with palmitate.
FIG. 19 shows inhibition of staining when using hydroxylamine.

Claims (13)

An isolated protein-containing molecule comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 or the amino acids 22 to 319 of SEQ ID NO: 22. The isolated protein-containing molecule according to claim 1 , wherein the molecule is recombinant. The isolated protein-containing molecule according to claim 1, wherein cys43 and cys117 are bound by a disulfide bond. An isolated peptide molecule consisting of an antigenic fragment in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, wherein said peptide binds to monoclonal antibody A33. 5. The isolated peptide molecule of claim 4, wherein the peptide consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, and 11. The isolated peptide molecule of claim 4, wherein the peptide is recombinant. An isolated nucleic acid molecule encoding a protein portion of the protein-containing molecule of claim 1. The isolated nucleic acid molecule of claim 7, wherein the molecule has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23. An expression vector having the isolated nucleic acid molecule of claim 7 operably linked to a promoter. A host cell transformed or transfected with the nucleic acid molecule of claim 7. A host cell transformed or transfected with the expression vector according to claim 9. (A) isolating or expressing a molecule comprising an amino acid sequence corresponding to the linear sequence of the amino acid of SEQ ID NO: 22;
(B) screening a biological source using the molecule;
(C) isolating a ligand that binds to the molecule from the biological source;
A method for obtaining a ligand that binds to an A33 antigen. 13. The method of claim 12, wherein the molecule has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 and 22.

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