JP4025848B2

JP4025848B2 - Decomposition method of cellulose raw material

Info

Publication number: JP4025848B2
Application number: JP2001337382A
Authority: JP
Inventors: 倫山辺; 直之奥田; 健二大内; 一晴鈴木
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Tsukishima Kikai Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Tsukishima Kikai Co Ltd
Priority date: 2001-11-02
Filing date: 2001-11-02
Publication date: 2007-12-26
Anticipated expiration: 2021-11-02
Also published as: JP2003135052A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、極めてセルラーゼ生産能の高い新規なアクレモニウム属に属する微生物を用いたセルロース原料の分解方法および糖化方法、セルラーゼの製造方法、並びにこれら方法に用いる新規なアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）Ｃ１株（ＦＥＲＭＰ−１８５０８）自体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
セルラーゼは、セルロースを、グルコース、セロビオースやセロオリゴトースに加水分解する酵素反応系を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式により、Ｃ_１酵素（アビセラーゼ、セロビオヒドラーゼ、ＦＰアーゼ、エキソ−βーグルカナーゼ等とも呼称されている。）、Ｃｘ酵素（ＣＭＣアーゼ、エンド−β−グルカナーゼともいう。）およびβ−グルコシダーゼ（セロビアーゼともいう。）など種々の名称で呼ばれる酵素が存在する。セルラーゼはこれら酵素の相互作用により、セルロースを最終的にはグルコースまで分解する。
近年、このセルラーゼは、バイオマス資源の有効利用の観点から注目され、さかんに研究されている。特に、オフィスで使用された古紙や段ボール古紙等の古紙類を加水分解してグルコースや還元糖を得るための研究が注目されている。
しかしながら、従来からセルラーゼ生産菌として、よく研究されてきたトリコデルマ・レーゼイ（Trechoderuma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（T. viride）やアスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属等に属する微生物のセルラーゼ生産能は必ずしも十分でなかった。また、セルラーゼ自体の分解力も十分でないため、セルロースを完全にグルコースまで分解することができず、セロビオースやセロオリゴ糖を多量に生成残存する等の問題があった。
【０００３】
かかる問題を解決するため、セルラーゼ生産能が高く、かつ生産するセルラーゼ自体の分解力も高い微生物を、広く自然界から検索する試みがなされてきており、その結果、土穣から分離したアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）に属する微生物が産生するセルラーゼは、セルロースをほとんど完全にグルコースにまで分解できることが見いだされている。さらに、この微生物の突然変異株であるアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）ＴＮ株（ＦＥＲＭＢＰ−６８５）が、セルラーゼ生産能をさらに顕著に増大していることも見出されているが（特公平２−３８号公報）、このＴＮ株の生産するセルラーゼは、ＦＰアーゼ、セロビアーゼ活性において満足できるものではなく、このＴＮ株においては、セルロース原料を加水分解してグルコースや還元糖に変換する実際の能力なそれほど高くはない。
さらに、従来の微生物が生産するセルラーゼは、上記ＣＭＣアーゼ（Ｃｘ酵素）の活性が必ずしも十分でないため、酸やアルカリを用いた薬剤処理や機械的破砕等の前処理を行わなければ、繊維が裁断され難く、流動性が良くならず、このためセルロース原料を高基質濃度で用いる場合、これら薬剤の使用あるいは攪拌動力の削減が困難であるという問題を有していた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を解消しようとするものであり、具体的にはセルラーゼの生産能が高いとともに、生産するセルラーゼ自体活性が高く、かつセルロース原料の加水分解に際して上記酸アルカリ等の薬剤処理を必要とせず、また攪拌動力を削減しうるセルラーゼ生産菌を見いだし、セルロース原料を効率的かつ安価にグルコースや還元糖に分解し得る手段を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、上記アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）ＴＮ株の突然変異株が、該ＴＮ株に比べ特にＦＰアーゼおよびセロビアーゼ活性が２倍以上で、極めて高いセルラーゼ活性および該生産能を有することを見いだすとともに、この突然変異株を使用することにより、極めて効率的かつ安価にセルロース原料をグルコースや還元糖に分解し得るとの知見を待て本発明を完成させたものである。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）からなるものである。
（１）セルロース原料をアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）Ｃ１株（ＦＥＲＭＰ−１８５０８）または該菌株が生産するセルラーゼを用いて分解することを特徴とする、セルロース原料の分解方法。
（２）セルロース原料をアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）Ｃ１株（ＦＥＲＭＰ−１８５０８）または該菌株が生産するセルラーゼを用いて糖化することを特徴とする、糖類の製造方法。
（３）セルロース原料が、古紙類である（１）または（２）に記載の方法。
（４）古紙類が、シュレッデイング処理または解離処理からなる前処理を施されたものである（３）に記載の方法。
（５）古紙類が、乾燥物基準で、有機物比率が９０％以上、リグニン含有率が２０％以下、へミセルロース含有量が２０％以下のものである（３）又は（４）に記載の方法。
（６）古紙類がオフィス古紙又は段ボール古紙である請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
（７）セルラーゼ生産能が高く、かつセロビオースを炭素源として良好な生育を示す、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）Ｃ１株（ＦＥＲＭＰ−１８５０８）。
（８）アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）Ｃ１株（ＦＥＲＭＰ−１８５０８）を培地に培養し、培養物からセルラーゼを採取することを特徴とするセルラーゼの製造方法。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において用いるセルロース原料としては、紙類のほか、バガズ、イネワラ、もみがら等の植物繊維質等が挙げられ、セルロースを含むものであればその種類を問わないが、本発明の有用性が最も効果的に発揮されるのは、オフィス等で使用された古紙あるいは段ボール古紙、古新聞紙等の古紙類である。
また、本発明において使用する微生物は、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）ＴＮ株（ＦＥＲＭＢＰ−６８５）に対しＵＶ照射、ＮＴＧ処理を行って得たものであり、結晶セルロース５０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌを主成分とする培地で７日間培養した培養液のセルラーゼ活性が同じ条件で培養したアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）ＴＮ株（ＦＥＲＭＢＰ−６８５）と比較して、ＦＰアーゼ活性及びセロビアーゼ活性が２倍以上である。
以下に、本発明の使用微生物について詳述する。
【０００７】
（１）本菌株の取得方法
親株として、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）ＴＮ株（ＦＥＲＭＢＰ−６８５）を用い、これをセルロースパウダー４０ｇ／Ｌ、バクトペプトン１０ｇ／Ｌ、硝酸カリウム６ｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ、塩化カリウム１．６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１．２ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム１２ｇ／Ｌを含む培地（ｐＨ４．０）に接種し、３０℃で１０日間好気的に培養した後、生理食塩水で１×１０^−３〜１×１０^−４に希釈し、紫外線照射（東芝殺菌ランプ、距離３０ｃｍ、３０分間）した。処理した菌株をセロビオース１０ｇ／Ｌ、バクトヘプトン１０ｇ／Ｌ、硝酸カリウム６ｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ、塩化カリウム１．６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１．２ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム１２ｇ／Ｌ、Ｌ−（−）ソルボース１０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌを含む平板培地（選択培地Ａとする）に塗布し、３０℃でインキュベートした。５〜１０日間培養後、生育したコロニーから、以下の性質を有する本菌株をスクリーニングした。
【０００８】
（２）培養的・形態的性質
選択培地Ａを含む３種類の培地を用いて、本菌株とＴＮ株を培養し、その形態を観察した。結果を以下に示す。
▲１▼選択培地Ａにより培養した場合
選択培地Ａにおける目視での観測では、ＴＮ株、本菌株のコロニーともに、やや赤みを帯びた茶褐色でゆるく盛り上がり羊毛状を呈しているが、本菌株のコロニーはセロビオースを炭素源とした当培地での生育がＴＮ株より速く、良好で、また、中心部に孔のあるドーナツ状に盛り上がる点で異なっている。すなわち、本菌株のコロニーは三角形に近く、寒天培地への浸潤がＴＮ株より深い。また、盛り上がりも本菌株の方が高く、２ｍｍ程の盛り上がりを示す。径はコロニーによって差があるが、ＴＮ株、本菌株とも、７〜１４日の培養で５〜１０ｍｍになる。裏面からコロニーを観察するとＴＮ株、本菌株とも赤褐色であるが、本菌株は周辺部がより深く浸潤する。
【０００９】
▲２▼選択塔地Ｂを用いた場合
以下の選択培地Ｂで３０℃、７〜１４日間培養した。そのときのコロニー形態は、ＴＮ株が表面に放射線状のくぼみを呈し、選択培地Ａの場合と類似した形態を呈するのに対し、本菌株ではくぼみは見られず、白い羊毛状の菌糸が発達する。
選択培地Ｂ；選択培地Ａの窒素源からバクトペプトン、硝酸カリウム、尿素を除き、代わりにコーンステイープリカー５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌを添加し、さらにセロビオース１０ｇ／Ｌをセルロースパウダーｌ０ｇ／Ｌに替えた培地。
【００１０】
▲３▼ポテトデキストロース寒天培地を用いた場合
ＴＮ株のコロニーは平坦のまま広がり、集落は最初白色で後にやや黄色みをおびるのに対し、本菌株の場合は盛り上がりが大きく、培地下部への浸潤も大きい。しかし、広がりはＴＮ株より小きい。また、本菌株は、１０〜２０日で赤褐色集落上に白色の菌糸束を形成する。
【００１１】
（３）菌糸及び分生糸の形態
菌糸の形態は、ＴＮ株と類似しており、菌糸の直径は０．５〜２．５μｍ、無色で菌糸には隔壁が認められる。また、菌糸表面は滑面である。
本菌株は分生糸形成能がＴＮ株よりやや安定しているものの、本菌株の分生糸はツアペツク寒天およびポテトデキストロース寒天培地による総体培養により消滅しやすい。分生子の形態はＴＮ株と類似しており、分生子柄は気生菌糸側面より突出し、無色である。また、形は亜球形［（２．５〜５μｍ）×（２〜４．５μｍ）］で滑面、無色で連鎖は非常にゆるく分散しやすい。
（４）生理学的性質
本菌株の生育ｐＨ範囲は、ＴＮ株と同様、３．５〜６．０で、最適ｐＨ４付近である。生育温度範囲は１５℃〜４３℃で、最適生育温度は３０℃付近である。
【００１２】
上記菌学的性質について、W. Gams の「 Cephalosporiumartige Schimmelpilge 」 P84 、 G. Fisher （ 1971 年）及び C. H. Dickinson 、 Mycol. Papers 115 P10 （ 1968 年）を参照した結果、本菌株は、アクレモニウム（Acremonium）に属すると認められる。そして、最も類縁の菌株として、アクレモニウム・セルロリティカス（ Acremonium cellulolyticus ）ＴＮ株が挙げられる（特公昭６１−１７４７６号公報）。しかしながら、本菌株は、以下に示すように、セルラーゼ生産能がＴＮ株の２倍以上であること、セロビオースを炭素源とした培地での生育がＴＮ株より良好であること、及び上記▲１▼〜▲３▼の３種類の培地で培養したときのコロニー形態が上記のように異なることから、本菌株は新菌株に属するものであり、アクレモニウム・セルロリティカスＣ１と命名して、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所の特許微生物寄託センターに寄託した（ＦＥＲＭＰ−１８５０８）。
【００１３】
本菌株は、ＦＰアーゼ、ＣＭＣアーゼ、セロビアーゼ等のセルラーゼ生産能が極めて高い。
本発明のアクレモニウム・セルロリティカスＣ１株は、培地に該菌株を接種し、常法に従って培養することができる。培地は、炭素源として結晶性セルロース５０ｇ／Ｌ、窒素源として硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌを含有していることが好ましく、他の資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好ましい。
本発明において、セルロース原料を分解あるいは糖化するためには、上記培養して得た菌体または培養物をセルロース原料含有培地に加えて培養してもよく、また、培養液、下記粗酵素液あるいは精製したセルラーゼ等を、セルロース原料に加えいわゆる酵素法により分解、糖化を行ってもよい。
【００１４】
本発明におけるセルラーゼは、上記アクレモニウム・セルロリティカスＣ１株を上記のように培養して得られた培養物中から一般の酵素の採取法及び精製手段を使用して得ることができる。すなわち、遠心分離又はろ過等の通常の固液分離手段により、菌体を培養液から除去し、粗酵素液を得る。
この粗酵素液は、セルロース原料の分解あるいは糖化にそのまま使用することもできるが、さらに、塩折法、沈殿法、限外ろ過法等の分離手段により粗酵素を得、公知の方法により精製結晶化してセルラーゼを得る。
【００１５】
本発明のセルラーゼは、ＦＰアーゼ、ＣＭＣアーゼおよびセロビアーゼ等からなる複合酵素系を形成しており、これらの酵素学的性質を以下に示す。
Ａ．ＦＰアーゼ
（１）作用
濾紙、セルロース末、アビセル、脱胎線など結晶性の高い不溶性セルロースに作用してグルコース、セロビオース等の還元糖を生成する。
（２）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ
本酵素の作用ｐＨ範囲は２〜８、最適作用ｐＨは約４．５である。
（３）安定ｐＨ
クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で４５℃で２０時間放置したときの安定ｐＨ範囲は約３．５〜約８である。
（４）作用温度範囲及び最適作用温度
本酵素は約９０℃までの高温で作用するが、１％アビセル、０．０５Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．８）の下で１０分間反応させたときの最適作用温度は約６５℃である。
（５）熱安定性
０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ４．８）中、温度を種々変えて１０分間処理した結果、本酵素は約６０℃までの温度ではほとんど失活せず、６５℃、１０分間の加熱で約５０％、７０℃、１０分間の加熱で約８０％それぞれ失活する。
（６）阻害剤
各種重金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀イオンおよび銅イオンにより強く阻害される。
【００１６】
Ｂ．ＣＭＣアーゼ
（１）作用
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等の可溶性セルロース誘導体に作用し、これをグルコース及びセロビオース等に分解する作用を有するが、本発明のＣＭＣアーゼにおいては、ＣＭＣアーゼＩ、II、IIIおよびIVが混在する。なお、ＣＭＣアーゼＩおよびIIは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等の可溶性セルロース誘導体をグルコース及びセロビオース等に分解する作用を有し、ＣＭＣアーゼIIIおよびIVは、グルコースを極くわずかしか生成せずセロビオース以上のオリゴ糖に分解する作用を有する。
（２）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ
ＣＭＣアーゼ複合体の作用ｐＨ範囲は、約２〜８にわたり、最適作用ｐＨは約４．５である。
（３）安定ｐＨ
クエン酸−リン酸塩緩衝液中において２０時間放置したときのＣＭＣアーゼ複合体の安定ｐＨ範囲は約３．５〜６である。
（４）作用温度範囲及び最適作用温度
このＣＭＣアーゼ複合体は約９０℃までの高温で作用するが、１％ＣＭＣ、０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中において１０分間反応させたときの最適作用温度は約６５℃である。
（５）熱安定性
０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中、温度を種々変えて１０分間加熱処理した結果、約６０℃までの温度ではほとんど失活せず、８５℃、１０分間の加熱で約４０％、７０℃、１０分間の加熱で約７０％それぞれ失活する。
（６）阻害剤
各種金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀イオンおよび銅イオンにより強く阻害される。
【００１７】
Ｃ．セロビアーゼ
（１）作用
サリシン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオースのようなセロオリゴ糖に作用して、グルコースに分解する。
また、本酵素はアビセルのような高分子セルロースにも作用するが、ＣＭＣやＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）にはほとんど作用しない。
（２）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ
本酵素の作用ｐＨ範囲は２〜８、最適作用ｐＨは約４．５である。
（３）安定ｐＨ
クエン酸−リン酸緩衝液中で４５℃で２０時間放置したときの安定ｐＨ範囲は約３．５〜５である。
（４）作用温度範囲及び最適作用温度
本酵素は約９０℃までの高温に作用するが、１％セロビオース、０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中において１０分間反応させたときの最適作用温度は約８５℃である。
（５）熱安定性
０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中において、温度を種々変えて１０分間加熱処理した結果、本酵素は約６０℃までの温度ではほとんど失活せず、７０℃、１０分間の加熱で約４０％、８０℃、１０分間の加熱で９０％以上それぞれ失活する。
（６）阻害剤
各種重金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀イオン及び銅イオンにより強く阻害される。
【００１８】
次に、本発明によるセルロース原料の糖化工程について説明する。
本発明においては、セルロース原料の面倒な前処理を特に必要としない。例えば、古紙類の糖化は、以下のようにして行うことができる。
予め、古紙類を前処理しておくが、一般的には、古紙類の前処理には、繊維を切断しない簡単な前処理と、形態を変えたり、繊維を短くするような前処理の２種類がある。
前者には、水を加えて単にミキシングし、繊維をほぐすだけの離解や、裁断のみを行うシュレッデイング等があり、また、後者には、酸、アルカリ等による薬剤処理法、叩解（リフアイニング）法、凍結粉砕、ボールミルやロールミル等による機械的破砕法等がある。
本発明においては、かかるシュレツデイング処理又は解離処理しておくだけで、効率的に古紙類を加水分解、糖化することができる。本発明においては、後者の前処理を行ってもよいが、薬剤、設備、消費電力等に係るコスト増や処理の煩雑さに比して、得られる効果は、上記簡単な前処理法を採用する場合と比べ格別優れるわけではない。このため、本発明において行う前処理は、シュレッデイング処理又は離解処理等の簡単な前処理である方がより有利である。
【００１９】
上記のように前処理された古紙類は、窒素源および補助栄養源を加えた培養槽、あるいは糖化槽に供給し、見かけの粘度を適宜調整した後、培養槽に本発明のアクレモニウム・セルロリティカスＣ１株の菌体あるいはその培養物を加えて培養するか、あるいは糖化槽に該培養液、粗酵素液またはセルラーゼを酵素源として加えて、古紙類の分解、糖化を行う。培養によるときは、培地のｐＨは３．５〜６．０、特にｐＨ４付近、温度は１５℃〜４３℃で、特に３０℃付近に調整するのがよく、酵素法によるときは、緩衝剤として、例えば酢酸ナトリウムと酢酸の混合溶液を０．１ｍｏｌ／Ｌを加えてｐＨ３〜７、温度範囲は３０℃〜９０℃、特に４０〜８０℃に調整するのが好ましい。
前処理をした古紙類に対するセルラーゼの使用量は、２〜３０ＦＰＵ／ｇ（古紙）が好ましく、５〜１０ＦＰＵ／ｇ（古紙）がさらに好ましい。
【００２０】
本発明においては、前処理した古紙類とセルラーゼを間欠的に供給する方法（流加式）、前処理した古紙類とセルラーゼを大量に一括して供給し、反応させる方法（一括法）のいずれでもよい。流加式を採用する場合、前処理した古紙類とセルラーゼを供給する時期として、見かけの粘度状態に応じて供給する方法、見かけの粘度状態にかかわらず、一定時間毎に供給する方法のいずれを採用してもよい。
培養法による場合も、原料あるいは菌体、培養物の添加手段には特に制限はない。
【００２１】
本発明において、セルロース原料として古紙類を用いる場合、乾燥重量基準で、有機物比率が９０％以上、リグニン含有量が２０％以下、ヘミセルロース含有量が２０％以下である場合に、特に効果的である。すなわち、リグニン含有量が２０％以下、ヘミセルロース含有量が２０％以下であると、セルロース成分が多くなるため、前処理として、薬剤処理や機械的破砕処理等を行わなくとも、本発明により、古紙類を十分に分解、糖化することができる。このような組成を有する古紙類の具体例としては、例えばオフィス古紙や段ボール古紙等が挙げられる。また、セルロース原料として、上記の条件を満たすものは、古紙類に限らず極めて効果的に分解、糖化できる。
【００２２】
実施例１
本発明のアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）Ｃ１株とその親株であるアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）ＴＮ株とのセルラーゼ活性を比較した。
結晶性セルロース５０ｇ／Ｌ、コーンステイープリカー１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、尿素３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１．２ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム１２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅１０ｍｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ４．０）を定法により殺菌後、本菌株またはその親株であるＴＮ株を接種し、３０℃で７日間好気的に培養した。培養後、遠心分離して得た上澄み液について、生産されたセルラーゼのＦＰＵ活性（ＦＰアーゼ活性）を測定した。
本菌株のＦＰＵは１７Ｕ／ｍＬであるのに対して、ＴＮ株のＦＰＵは８Ｕ／ｍＬであり、本菌株のセルラーゼ生産能は、親株に比べ、ＦＰＵが約２．１倍に増大していた。
【００２３】
なお、上記酵素活性の測定法は、以下のとおりである。
［セルラーゼ活性測定法］
濾紙洩紙（ワットマンＮｏ．１）５０ｍｇを基質とし、これに酵素液０．５ｍＬとクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８、０．０５Ｍ）１．０ｍＬを加え、５０℃で１．０時間酵素反応を行った後、ジニトロサリチル酸試薬３．０ｍＬを加え、１００℃で５分間加熱し発色させる。冷却後、これにイオン交換水または蒸留水２０ｍＬを加え、５４０ｎｍの波長で比色定量する。１分間に１μｍｏｌのゲルコースに相当する還元糖を生成する酵素基を１ユニット（ＦＰＵ）とした。
【００２４】
実施例２
基質として、乾式粉砕機（大阪ケミカル社製）で離解したオフィス古紙（乾燥重量でセルロース６５％以上、リグニン１５％以下）を用いた。該オフィス古紙２．５ｇに対して、本菌株の５日間培養液を１０ＦＰＵ／ｇ（古紙）相当、及び０．２Ｎ酢酸緩衝液を入れて合計５０ｍＬとし、４５℃で１００ｒｐｍで振とう反応させた。
比較例１として、本菌株の代わりに、トリコデルマ・リーセイＲＵＴＣ−３０の培養液を１０ＦＰＵ／ｇ（古紙）相当使用し、他は実施例１と同様に処理した。反応開始から１時間後、４時間後、２４時間後、４８時間後に得られた還元糖及びグルコースの濃度測定した。実施例２および比較例１の結果を図１に示す。使用した酵素単位量（ＦＰＵ）は同量であったが、実施例２の方が、比較例１よりも還元糖の生成速度が遠く、反応開始４時間後の還元糖生成量が、実施例２は比較例１の約１．５倍であった。また、最終的なグルコース生成量は、実施例２が比較例１の約１．４倍であった。
【００２５】
【発明の効果】
本発明のアクレモニウム・セルロリティカスＣ１株は、セルラーゼ産生能が高く、また得られるセルラーゼは、グルコースや還元糖に分解する活性が非常に高い。したがって、本発明によれば、セルロース原料、特に古紙類から、効率均かつ安価にグルコースや還元糖を得ることができる。
また、本発明のセルロース原料、特に古紙類の分解、糖化に際しては、前処理がシュレッディング処理又は離解処理を施すだけでよく、薬剤処理あるいはより高度な破砕処理等を省略することが可能であり、より効率的、経済的である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本菌株とトリコデルマ・リーセイＲＶＴＣ−３０を用いた場合の反応時間と糖化率との関係を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a cellulose raw material decomposition method and saccharification method using a novel microorganism belonging to the genus Acremonium having a very high cellulase-producing ability, a method for producing cellulase, and a novel Acremonium cellulolyticus (Acremonium for use in these methods) cellulolyticus) C1 strain (FERM P-18508) itself.
[0002]
[Prior art]
Cellulase, cellulose, glucose, is a generic name for enzymes that catalyze the hydrolyzing enzyme reaction system cellobiose and Seroorigotosu by its mode of action, C ₁ enzyme (avicelase, cellobiohydrolase, FP ase, exo - There are enzymes called various names such as β-glucanase, etc.), Cx enzyme (CMCase, also called endo-β-glucanase) and β-glucosidase (also called cellobiase). Cellulase eventually breaks cellulose down to glucose by the interaction of these enzymes.
In recent years, this cellulase has attracted attention and has been studied extensively from the viewpoint of effective utilization of biomass resources. Particularly, research for obtaining glucose and reducing sugar by hydrolyzing used papers such as used paper and corrugated paper used in offices has attracted attention.
However, the cellulase production ability of microorganisms belonging to the genus Trichoderuma reesei, Trichoderma viride, Aspergillus, Penicillium, etc., which have been well studied as cellulase-producing bacteria. Was not always enough. In addition, since the degradability of cellulase itself is not sufficient, there is a problem that cellulose cannot be completely decomposed to glucose, and cellobiose and cellooligosaccharide are produced and remained in large quantities.
[0003]
In order to solve such problems, attempts have been made to search from the natural world for microorganisms that have high cellulase-producing ability and high cellulase-degrading ability. As a result, Acremonium Cellularity separated from soil Cellulase produced by microorganisms belonging to cas (Acremonium cellulolyticus) has been found to be capable of degrading cellulose almost completely into glucose. Furthermore, it has also been found that the mutant strain of this microorganism, Acremonium cellulolyticus TN strain (FERM BP-685), has significantly increased cellulase production ability ( The cellulase produced by this TN strain is not satisfactory in FPase and cellobiase activity, and in this TN strain, the cellulose raw material is hydrolyzed and converted to glucose or reducing sugar. The actual ability is not so high.
Furthermore, since cellulase produced by conventional microorganisms does not necessarily have sufficient activity of the CMCase (Cx enzyme), the fiber is cut unless pretreatment such as chemical treatment or mechanical crushing using acid or alkali is performed. Therefore, when the cellulose raw material is used at a high substrate concentration, there is a problem that it is difficult to use these agents or to reduce the stirring power.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art. Specifically, the cellulase production ability is high, the cellulase to be produced itself has high activity, and the hydrolysis of the cellulose raw material involves the above acid. An object of the present invention is to find a cellulase-producing bacterium that does not require treatment with a chemical agent such as alkali and can reduce stirring power, and to provide a means by which a cellulose raw material can be efficiently and inexpensively decomposed into glucose or reducing sugar.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have found that the mutant strain of the Acremonium cellulolyticus TN strain has twice the FPase and cellobiase activity in particular compared to the TN strain. As described above, while finding that it has extremely high cellulase activity and production ability, it is awaiting the knowledge that by using this mutant strain, cellulose raw material can be decomposed into glucose and reducing sugar very efficiently and at low cost. The present invention has been completed.
That is, this invention consists of the following (1)-(8).
(1) A method for decomposing a cellulose raw material, comprising decomposing the cellulose raw material using Acremonium cellulolyticus C1 strain (FERM P-18508) or cellulase produced by the strain.
(2) A method for producing a saccharide, comprising saccharifying a cellulose raw material using Acremonium cellulolyticus C1 strain (FERM P-18508) or cellulase produced by the strain.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the cellulose raw material is waste paper.
(4) The method according to (3), wherein the used paper is subjected to a pretreatment consisting of a shredding treatment or a dissociation treatment.
(5) As described in (3) or (4), the waste paper is one having an organic matter ratio of 90% or more, a lignin content of 20% or less, and a hemicellulose content of 20% or less on a dry matter basis. Method.
(6) The method according to any one of claims 3 to 5, wherein the waste paper is office waste paper or cardboard waste paper.
(7) Acremonium cellulolyticus C1 strain (FERM P-18508), which has high cellulase production ability and exhibits good growth using cellobiose as a carbon source.
(8) A method for producing cellulase, comprising culturing Acremonium cellulolyticus C1 strain (FERM P-18508) in a medium and collecting cellulase from the culture.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of the cellulose raw material used in the present invention include papers, plant fibers such as bagasse, rice straw, rice husk and the like, and any type of cellulose may be used as long as it contains cellulose. The most effective ones are used paper such as used paper used in offices and the like, or used paper such as corrugated paper and used newspaper.
In addition, the microorganism used in the present invention was obtained by performing UV irradiation and NTG treatment on Acremonium cellulolyticus TN strain (FERM BP-685). Compared with Acremonium cellulolyticus TN strain (FERM BP-685) cultured under the same conditions, the cellulase activity of the culture medium cultured for 7 days in a medium containing 5 g / L of ammonium sulfate as a main component is FP. The ase activity and cellobiase activity are more than twice.
Hereinafter, the microorganism used in the present invention will be described in detail.
[0007]
(1) Method for obtaining this strain As a parent strain, Acremonium cellulolyticus TN strain (FERM BP-685) was used, which was cellulose powder 40 g / L, bactopeptone 10 g / L, potassium nitrate 6 g / L. Inoculated into a medium (pH 4.0) containing urea 2 g / L, potassium chloride 1.6 g / L, magnesium sulfate 1.2 g / L, potassium dihydrogen phosphate 12 g / L, and aerobic at 30 ° C. for 10 days And then diluted with physiological saline to 1 × 10 ⁻³ to 1 × 10 ⁻⁴ and irradiated with ultraviolet rays (Toshiba germicidal lamp, distance 30 cm, 30 minutes). The treated strains were cellobiose 10 g / L, bactoheptone 10 g / L, potassium nitrate 6 g / L, urea 2 g / L, potassium chloride 1.6 g / L, magnesium sulfate 1.2 g / L, potassium dihydrogen phosphate 12 g / L, L -(-) It apply | coated to the plate culture medium (it is set as the selection medium A) containing sorbose 10g / L and agar 20g / L, and incubated at 30 degreeC. After culturing for 5 to 10 days, this strain having the following properties was screened from the grown colonies.
[0008]
(2) Culture and morphological properties Using three types of media including the selective medium A, this strain and the TN strain were cultured, and their morphology was observed. The results are shown below.
(1) When cultured on selective medium A In the visual observation on selective medium A, both the TN strain and the colony of this strain are slightly reddish brown and have a slightly raised wool shape. Is different in that it grows faster in this medium using cellobiose as a carbon source than the TN strain, and it grows like a donut with a hole in the center. That is, the colony of this strain is close to a triangle, and the infiltration into the agar medium is deeper than that of the TN strain. The swell is also higher for this strain, showing a swell of about 2 mm. Although the diameter varies depending on the colony, both the TN strain and the present strain become 5 to 10 mm after culturing for 7 to 14 days. When colonies are observed from the back side, both the TN strain and the present strain are reddish brown, but the peripheral portion of this strain infiltrates deeper.
[0009]
{Circle around (2)} In the case of using the selection tower B The cells were cultured in the following selective medium B at 30 ° C. for 7 to 14 days. The colony morphology at that time shows that the TN strain has a radial dent on the surface, which is similar to that of the selective medium A, whereas this strain does not show any dent, and white wool-like hyphae develop. To do.
Selection medium B: Bactopeptone, potassium nitrate, and urea are removed from the nitrogen source of selection medium A. Instead, corn staple precursor 5 g / L and ammonium sulfate 5 g / L are added, and cellobiose 10 g / L is added to cellulose powder 10 g / L. Changed medium.
[0010]
(3) When potato dextrose agar medium is used, the colony of TN strain spreads flat and the colony is initially white and later slightly yellowish. Is also big. However, the spread is smaller than TN stocks. Moreover, this strain forms a white mycelium bundle on a reddish brown colony in 10 to 20 days.
[0011]
(3) Forms of hyphae and conidial hyphae The form of hyphae is similar to that of the TN strain, the diameter of the hyphae is 0.5 to 2.5 μm, colorless, and the septum is recognized in the hyphae. Moreover, the mycelium surface is a smooth surface.
Although this strain is slightly more stable in forming conidia than the TN strain, the conidia of this strain is likely to disappear by total culture on a Tappek agar and potato dextrose agar medium. The conidia form is similar to the TN strain, and the conidia pattern protrudes from the side of the aerial hyphae and is colorless. The shape is subspherical [(2.5-5 μm) × (2-4.5 μm)], smooth surface, colorless, and the chain is very loose and easy to disperse.
(4) Physiological properties The growth pH range of this strain is 3.5 to 6.0, similar to the TN strain, and is around the optimum pH 4. The growth temperature range is 15 ° C to 43 ° C, and the optimum growth temperature is around 30 ° C.
[0012]
For the bacteriological properties, "Cephalosporiumartige Schimmelpilge" P84 of W. Gams, G. Fisher (1971 years) and CH Dickinson, Mycol. Papers 115 P10 (1968 years) referenced results, this strain, Acremonium (Acremonium ) . And the most as analogous strain, Acremonium cellulolyticus (Acremonium cellulolyticus) TN strain can be mentioned (JP-B 61-17476 Patent Publication). However, as shown below, this strain has a cellulase production ability of 2 times or more that of the TN strain, growth on a medium using cellobiose as a carbon source, and the above (1). Since the colony forms when cultivated in the three types of mediums (1) to (3) are different as described above, this strain belongs to a new strain, and is named Acremonium Cellulolyticus C1. Deposited at the Patent Microorganism Depositary Center of the Research Institute for Biotechnology (FERM P-18508).
[0013]
This strain has an extremely high ability to produce cellulases such as FPase, CMCase, cellobiase and the like.
The Acremonium cellulolyticus C1 strain of the present invention can be cultivated according to a conventional method by inoculating the strain with the strain. The medium preferably contains crystalline cellulose 50 g / L as a carbon source and ammonium sulfate 5 g / L as a nitrogen source, and preferably contains appropriate amounts of other assimilable carbon sources and nitrogen sources.
In the present invention, in order to decompose or saccharify the cellulose raw material, the cells or culture obtained by the above culture may be added to the cellulose raw material-containing medium and cultured, or the culture solution, the following crude enzyme solution or Purified cellulase or the like may be decomposed and saccharified by a so-called enzymatic method in addition to the cellulose raw material.
[0014]
The cellulase in the present invention can be obtained from the culture obtained by culturing the Acremonium cellulolyticus C1 strain as described above using a general enzyme collection method and purification means. That is, the cells are removed from the culture solution by a normal solid-liquid separation means such as centrifugation or filtration to obtain a crude enzyme solution.
This crude enzyme solution can be used as it is for the decomposition or saccharification of the cellulose raw material, but further, the crude enzyme is obtained by separation means such as salt folding, precipitation, ultrafiltration, etc., and purified crystals are obtained by known methods. To obtain cellulase.
[0015]
The cellulase of the present invention forms a complex enzyme system composed of FPase, CMCase, cellobiase and the like, and their enzymological properties are shown below.
A. FPase (1) Action It acts on highly crystalline insoluble cellulose such as filter paper, cellulose powder, Avicel, and sterilization line to produce reducing sugars such as glucose and cellobiose.
(2) Working pH range and optimum working pH
The working pH range of this enzyme is 2-8, and the optimum working pH is about 4.5.
(3) Stable pH
The stable pH range is about 3.5 to about 8 when left at 45 ° C. for 20 hours under citrate-phosphate buffer.
(4) Working temperature range and optimum working temperature This enzyme works at high temperatures up to about 90 ° C, but is optimal when reacted for 10 minutes under 1% Avicel, 0.05M citrate buffer (pH 4.8). The working temperature is about 65 ° C.
(5) Thermostability In 0.05M citrate buffer (PH 4.8), the enzyme was hardly inactivated at temperatures up to about 60 ° C. as a result of various treatments at various temperatures for 10 minutes. It is deactivated by about 50% by heating for 10 minutes and by about 80% by heating at 70 ° C. for 10 minutes.
(6) Inhibitors Among various heavy metal ions, they are strongly inhibited by 1 mM or more of mercury ions and copper ions.
[0016]
B. CMCase (1) action It acts on soluble cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC) and has the action of degrading it into glucose and cellobiose. In the CMCase of the present invention, CMCase I, II, III and IV is mixed. CMCase I and II have an action of degrading soluble cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC) into glucose and cellobiose, etc., and CMCase III and IV produce very little glucose and have a cellobiose or higher. It has the action of decomposing into oligosaccharides.
(2) Working pH range and optimum working pH
The working pH range of the CMCase complex ranges from about 2 to 8, and the optimum working pH is about 4.5.
(3) Stable pH
The stable pH range of the CMCase complex when left in citrate-phosphate buffer for 20 hours is about 3.5-6.
(4) Working temperature range and optimum working temperature This CMCase complex works at high temperatures up to about 90 ° C., but was reacted in 1% CMC, 0.05 M citrate buffer (pH 4.8) for 10 minutes. The optimum working temperature is about 65 ° C.
(5) Thermal stability As a result of heat treatment in 0.05M citrate buffer (pH 4.8) at various temperatures for 10 minutes, almost no inactivation at temperatures up to about 60 ° C, 85 ° C for 10 minutes It is inactivated by about 40% by heating at 70 ° C. and about 70% by heating at 70 ° C. for 10 minutes.
(6) Inhibitors Among the various metal ions, they are strongly inhibited by 1 mM or more of mercury ions and copper ions.
[0017]
C. Cellobiase (1) Action It acts on cellooligosaccharides such as salicin, cellobiose, cellotriose, cellotetraose, cellopentaose and cellohexaose to be decomposed into glucose.
The enzyme also acts on high molecular cellulose such as Avicel, but hardly acts on CMC and HEC (hydroxyethylcellulose).
(2) Working pH range and optimum working pH
The working pH range of this enzyme is 2-8, and the optimum working pH is about 4.5.
(3) Stable pH
The stable pH range when standing in citrate-phosphate buffer at 45 ° C. for 20 hours is about 3.5-5.
(4) Working temperature range and optimum working temperature This enzyme acts at a high temperature up to about 90 ° C, but it is optimum when reacted in 1% cellobiose, 0.05M citrate buffer (pH 4.8) for 10 minutes. The working temperature is about 85 ° C.
(5) Thermostability In the 0.05M citrate buffer (pH 4.8), the enzyme was hardly inactivated at temperatures up to about 60 ° C. as a result of heat treatment for 10 minutes at various temperatures. Deactivate about 40% by heating at 10 ° C. for 10 minutes and 90% or more by heating at 80 ° C. for 10 minutes.
(6) Inhibitors Among various heavy metal ions, they are strongly inhibited by 1 mM or more of mercury ions and copper ions.
[0018]
Next, the saccharification process of the cellulose raw material by this invention is demonstrated.
In the present invention, no troublesome pretreatment of the cellulose raw material is required. For example, saccharification of waste paper can be performed as follows.
Waste paper is pre-treated in advance, but generally, pre-treatment of waste paper includes simple pre-treatment that does not cut the fiber and pre-treatment that changes the form or shortens the fiber. There are types.
The former includes disaggregation by simply mixing with water and loosening the fibers, and shredding that only cuts. The latter includes chemical treatment with acid, alkali, etc., and beating (refining). And mechanical crushing methods such as freeze grinding and ball milling and roll milling.
In the present invention, waste paper can be efficiently hydrolyzed and saccharified simply by performing such a shredding treatment or dissociation treatment. In the present invention, the latter pretreatment may be performed, but the effect obtained is the above simple pretreatment method compared to the increase in cost and complexity of treatment relating to the medicine, equipment, power consumption, etc. It is not exceptionally better than doing it. For this reason, it is more advantageous that the preprocessing performed in the present invention is simple preprocessing such as shredding processing or disaggregation processing.
[0019]
The waste paper pretreated as described above is supplied to a culture tank or a saccharification tank to which a nitrogen source and a supplementary nutrient source have been added, and after adjusting the apparent viscosity as appropriate, the Acremonium cellulose of the present invention is added to the culture tank. The cells of the ritus C1 strain or its culture are added and cultured, or the paper, crude enzyme solution or cellulase is added to the saccharification tank as an enzyme source to decompose and saccharify the waste paper. When culturing, the pH of the medium should be adjusted to 3.5 to 6.0, particularly around pH 4, and the temperature should be adjusted to 15 ° C to 43 ° C, especially around 30 ° C. For example, 0.1 mol / L of a mixed solution of sodium acetate and acetic acid is added to adjust the pH to 3 to 7 and the temperature range to 30 ° C. to 90 ° C., particularly 40 to 80 ° C.
The amount of cellulase used for pretreated waste paper is preferably 2 to 30 FPU / g (waste paper), more preferably 5 to 10 FPU / g (waste paper).
[0020]
In the present invention, either a method of intermittently supplying pretreated waste paper and cellulase (fed-batch type), or a method of supplying pretreated wastepaper and cellulase in bulk and reacting them (collective method) But you can. When adopting the fed-batch method, either the method of supplying according to the apparent viscosity state or the method of supplying at regular intervals, regardless of the apparent viscosity state, as the timing for supplying the pretreated waste paper and cellulase It may be adopted.
Even in the case of the culture method, there are no particular restrictions on the raw material, the fungus body, or the means for adding the culture.
[0021]
In the present invention, when used paper is used as a cellulose raw material, it is particularly effective when the organic matter ratio is 90% or more, the lignin content is 20% or less, and the hemicellulose content is 20% or less on a dry weight basis. . That is, when the lignin content is 20% or less and the hemicellulose content is 20% or less, the cellulose component is increased. Therefore, according to the present invention, the waste paper can be used as a pretreatment without performing chemical treatment or mechanical crushing treatment. Can be sufficiently decomposed and saccharified. Specific examples of waste paper having such a composition include office waste paper and cardboard waste paper. Moreover, what satisfy | fills said conditions as a cellulose raw material can be decomposed | disassembled and saccharified very effectively not only for used papers.
[0022]
Example 1
Cellulase activity was compared between the Acremonium cellulolyticus C1 strain of the present invention and its parent Acremonium cellulolyticus TN strain.
Crystalline cellulose 50 g / L, cornstay precursor 10 g / L, ammonium sulfate 5 g / L, urea 3 g / L, magnesium sulfate 1.2 g / L, potassium dihydrogen phosphate 12 g / L, zinc sulfate 10 mg / L, manganese sulfate A medium consisting of 10 mg / L and 10 mg / L of copper sulfate (pH 4.0) was sterilized by a conventional method, then inoculated with the present strain or its parent strain TN, and aerobically cultured at 30 ° C. for 7 days. After the culture, the FPU activity (FPase activity) of the produced cellulase was measured for the supernatant obtained by centrifugation.
The FPU of this strain was 17 U / mL, whereas the FPU of the TN strain was 8 U / mL, and the cellulase production ability of this strain was about 2.1 times higher than that of the parent strain. .
[0023]
In addition, the measuring method of the said enzyme activity is as follows.
[Cellulase activity measurement method]
50 mg of filter paper leak paper (Whatman No. 1) is used as a substrate, 0.5 mL of enzyme solution and 1.0 mL of citrate buffer (pH 4.8, 0.05 M) are added thereto, and the enzyme reaction is carried out at 50 ° C. for 1.0 hour. Then, 3.0 mL of dinitrosalicylic acid reagent is added and heated at 100 ° C. for 5 minutes to cause color development. After cooling, 20 mL of ion-exchanged water or distilled water is added thereto, and colorimetric determination is performed at a wavelength of 540 nm. One unit (FPU) was defined as an enzyme group that produces a reducing sugar corresponding to 1 μmol of gel course per minute.
[0024]
Example 2
As a substrate, used office paper (with a dry weight of 65% or more and lignin of 15% or less) disaggregated with a dry pulverizer (manufactured by Osaka Chemical Co., Ltd.) was used. A 2.5-day culture of this strain was added to 2.5 g of the office waste paper, and 10 FPU / g (used paper) equivalent and 0.2 N acetic acid buffer were added to make a total of 50 mL, followed by shaking reaction at 45 ° C. and 100 rpm. .
As Comparative Example 1, a Trichoderma reesei RUTC-30 culture solution was used in an amount equivalent to 10 FPU / g (waste paper) instead of this strain, and the other treatments were the same as in Example 1. The concentrations of reducing sugar and glucose obtained after 1 hour, 4 hours, 24 hours and 48 hours from the start of the reaction were measured. The results of Example 2 and Comparative Example 1 are shown in FIG. Although the enzyme unit amount (FPU) used was the same amount, the production rate of reducing sugar in Example 2 was farther than that in Comparative Example 1, and the amount of reducing sugar produced 4 hours after the start of the reaction 2 was about 1.5 times that of Comparative Example 1. The final glucose production amount was about 1.4 times that of Comparative Example 1 in Example 2.
[0025]
【The invention's effect】
The Acremonium cellulolyticus C1 strain of the present invention has a high cellulase production ability, and the resulting cellulase has a very high activity of degrading into glucose and reducing sugar. Therefore, according to the present invention, glucose and reducing sugar can be obtained efficiently and inexpensively from cellulose raw materials, particularly waste paper.
In the decomposition and saccharification of the cellulose raw material of the present invention, particularly waste papers, the pretreatment only needs to be shredding treatment or disaggregation treatment, and chemical treatment or more advanced crushing treatment can be omitted. Is more efficient and economical.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between reaction time and saccharification rate when using this strain and Trichoderma reesei RVTC-30.

Claims

A method for decomposing a cellulose raw material, comprising decomposing the cellulose raw material using Acremonium cellulolyticus C1 strain (FERM P-18508) or cellulase produced by the strain.

A method for producing a saccharide comprising saccharifying a cellulose raw material using Acremonium cellulolyticus C1 strain (FERM P-18508) or cellulase produced by the strain.

The method according to claim 1 or 2, wherein the cellulose raw material is waste paper.

The method according to claim 3, wherein the used paper is subjected to a pretreatment comprising a shredding treatment or a dissociation treatment.

The method according to claim 3 or 4, wherein the waste paper has an organic matter ratio of 90% or more, a lignin content of 20% or less, and a hemicellulose content of 20% or less on a dry matter basis.

The method according to any one of claims 3 to 5, wherein the waste paper is office waste paper or cardboard waste paper.

Acremonium cellulolyticus C1 strain (FERM P-18508), which has high cellulase production ability and exhibits good growth using cellobiose as a carbon source.

A method for producing cellulase, comprising culturing Acremonium cellulolyticus C1 strain (FERM P-18508) in a medium and collecting cellulase from the culture.