JP4000845B2

JP4000845B2 - Novel protein and its DNA

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Publication number: JP4000845B2
Application number: JP2001378421A
Authority: JP
Inventors: 竹彦内山; 徹秋山; 敬史三和; 尚子柴山
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2001-12-12
Filing date: 2001-12-12
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2021-12-12
Also published as: JP2003174886A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)由来のスーパー抗原性を有する新規タンパク質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般抗原は、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌ；以下，ＡＰＣと呼ぶ）内でプロセッシングを受けペプチド断片に分解された後、主要組織適合抗原複合体（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙａｎｔｉｇｅｎｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略す）クラスII分子と複合体を形成して細胞表面に提示される。このときＴ細胞受容体（Ｔｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｅｒ；以下、ＴＣＲと略す）は超可変部の相補性決定領域を用いてＭＨＣクラスII分子−ペプチド複合体を認識するため、活性化されるＴ細胞は限定される。一方、スーパー抗原はＡＰＣによるプロセッシングを受けずにＭＨＣクラスII分子とＴＣＲのβ鎖可変領域部分（以下、Ｖβと呼ぶ）の外側に結合する。すなわちスーパー抗原はＶβの中でも多様性に乏しい部分を認識するため、特定のＶβを持つＴ細胞をその特異性に関係なく大量に活性化させる。Ｔ細胞の過剰な活性化に伴い、単球、マクロファージの活性化、サイトカインの大量放出が起こり、血圧低下、発熱などの症状が引き起こされると考えられている。
【０００３】
スーパー抗原は細菌性、ウイルス性、植物性の３系統に分類できるが、中でも細菌性スーパー抗原はヒトの感染症と深く関連している。細菌性スーパー抗原として、黄色ブドウ球菌が産生する腸管毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ（ＳｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ；以下順に、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、ＳＥＥと呼ぶ）や、トキシックショックシンドロームトキシン−１（ｔｏｘｉｃｓｈｏｃｋｓｙｎｄｒｏｍｔｏｘｉｎ−１；以下、ＴＳＳＴ−１と略す）、Ａ群溶血性連鎖球菌が産生する外毒素Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｐｙｒｏｇｅｎｉｃｅｘｏｔｏｘｉｎＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ；以下順に、ＳＰＥＡ、ＳＰＥＣ、ＳＰＥＦ、ＳＰＥＧ、ＳＰＥＨと呼ぶ）、エルシニア菌が産生する外毒素（Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−ｄｅｒｉｖｅｄｍｉｔｏｇｅｎ；以下、ＹＰＭと略す）が同定されている。
【０００４】
スーパー抗原が関与している疾患としては、ＴＳＳＴ−１に起因する毒素性ショック症候群（ｔｏｘｉｃｓｈｏｃｋｓｙｎｄｒｏｍ；以下，ＴＳＳと略す）や新生児ＴＳＳ様発疹症（ＮｅｏｎａｔａｌＴＳＳ−ｌｉｋｅｅｘａｎｔｈｅｍａｔｏｕｓｄｉｓｅａｓｅ；以下、ＮＴＥＤと略す）、ＹＰＭが原因の全身エルシニア菌感染症などがある。さらに、猩紅熱や劇症型Ａ群連鎖球菌感染症、急性全身性血管炎である川崎病にも、スーパー抗原の関与が示唆されているが、原因毒素は未だ明確になっていない。また、劇症型Ａ群連鎖球菌感染症と類似の症例においてＣ群連鎖球菌であるストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)が検出されたという報告もあるが、ストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)はウシの乳房炎の原因菌としてしばしば検出されるもののヒトからの採取例が少ないため、これまで臨床的にあまり着目されていなかった。よって、ストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)が産生する新たなスーパー抗原（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅｍｉｔｏｇｅｎ；以下、ＳＤＭと略す）の同定は、未知のスーパー抗原が関与している可能性がある疾患の発症機序を解明し、予防、あるいは治療法を確立するために必要であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なスーパー抗原を提供することを目的としている。より詳細には、ストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)由来の、スーパー抗原性を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、および該タンパク質の精製法の提供を目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために下記の構成を有する。
（１）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列と同じ、もしくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつスーパー抗原としての機能を有することを特徴とするタンパク質またはその塩。
（２）（１）記載のタンパク質Ｎ末端に、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列と同じ、もしくは９０％以上の同一性を有するシグナルペプチドが結合していることを特徴とするタンパク質またはその塩。
【０００７】
（３）（１）もしくは（２）記載のタンパク質または（２）記載のシグナルペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【０００８】
（５）形質転換した微生物を培養することにより生成し、これを採取することを特徴とする（１）もしくは（３）記載のタンパク質もしくははその塩または（２）記載のシグナルペプチドもしくはその塩の製造法。
（６）ストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)を培養し、培養培地から（１）もしくは（３）記載のタンパク質もしくはその塩または（２）記載のシグナルペプチドもしくはその塩を採取することを特徴とする該タンパク質もしくはその塩または該シグナルペプチドもしくはその塩の製造法
【０００９】
【発明実施の形態】
本発明の配列番号２で表されるアミノ酸配列は、同定されたＳＤＭのものである。本発明の配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつスーパー抗原としての機能を有するタンパク質は、ストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)に由来するタンパク質であってもよく、組み換えタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【００１０】
本発明による新規タンパク質には、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつスーパー抗原としての機能を有するタンパク質またはその塩も含まれる。本発明の配列番号２と９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質またはその塩などが好ましい（以下、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつスーパー抗原としての機能を有するタンパク質を、本発明によるタンパク質または本発明による新規タンパク質あるいは新規タンパク質と称することがある）。実質的に同質の性質としては、例えばヒト末梢血リンパ球に対するマイトジェン活性やＶβの選択性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が定性的に同質であることを示す。従って、ヒト末梢血リンパ球に対するマイトジェン活性やＶβの選択性が同等であることが好ましいが、これらの性質の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００１１】
本発明によるシグナルペプチドには、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、およびその塩が含まれ、配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。より具体的には、配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シグナルペプチドとしての機能を発揮できるペプチドであれば特に限定されず、分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００１２】
また、本発明のタンパク質としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有し、かつスーパー抗原としての機能を有するタンパク質のＮ末端に、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するシグナルペプチドが結合したタンパク質なども挙げられる。例えば、配列番号４で表されるシグナルペプチドを有するタンパク質は、本発明のタンパク質を製造するための中間体として有用である。
【００１３】
また、本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチド、または本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質としては、糖鎖が結合した複合タンパク質なども含まれる。
【００１４】
本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチド、または本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸、有機酸）や塩基（例えば、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩が用いられる。このような塩としては、例えば、無機酸との塩、あるいは有機酸との塩などが用いられる。無機酸としては例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などを用いることができ、また有機酸としては例えば、酢酸、蟻酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、しゅう酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを用いることができる。
【００１５】
本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質は、ストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)から製造することもできるし、本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
【００１６】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号１で表されるＤＮＡと厳しい条件下でハイブリッドを形成する塩基配列を有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。厳しい条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭであり、温度が６０〜６５℃である条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合がさらに好ましい。配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡと厳しい条件下でハイブリッドを形成できるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列と９０％以上さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００１７】
本発明のシグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号３で表されるＤＮＡと厳しい条件下でハイブリッドを形成する塩基配列を有し、本発明のシグナルペプチドと実質的に同質の性質を有するシグナルペプチドをコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡと厳しい条件下でハイブリッドを形成できるＤＮＡとしては、例えば、配列番号３で表される塩基配列と９０％以上さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００１８】
本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質をコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチド、または本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質をコードし、スーパー抗原性を有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細菌由来のｃＤＮＡ、前記した細菌由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。また、５’末端側の翻訳終止コドンの塩基としては、ＴＡＡ、ＴＧＡ、ＴＡＧのいずれでもよい。
【００１９】
本発明は、前記タンパク質、前記シグナルペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有し当該タンパク質を発現しうるプラスミドおよびこのプラスミドを有する宿主細胞を提供する。宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、肺炎双球菌、連鎖球菌などの原核細胞宿主、酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、３Ｔ３細胞、３Ｔ６細胞、Ｌｔｋ−細胞などの真核細胞宿主など、遺伝子組換え技術分野において通常用いられるすべての宿主細胞を用いることができる。本発明のプラスミドとしては、用いる宿主に対応して適切なプラスミドであればいかなるものでもよい。プラスミドとしては、例えば、通常の発現用プラスミド／ウイルスベクターを用いればよく、原核細胞宿主を用いる場合には、例えば、ＥＴ−３ａ−ｄ、ｐＥＴ−５ａ−ｃ、ｐＥＴ−９ａ−ｄ、ｐＥＴ−１１ａ−ｄ、ｐＥＴ−１２ａ−ｃなどのベクターを用いることができる。本発明は、ストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)または上記宿主細胞を培養することを特徴とする前記タンパク質、前記シグナルペプチドもしくは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質またはそれらの塩の製造法を提供する。本発明のタンパク質またはシグナルペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質を発現しうるストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)または宿主細胞は、細胞の性質に応じて通常の方法で培養することができる。培養培地はストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)または宿主細胞の培養に適した培地であれば限定されない。培養培地から該タンパク質を得るためには、イオン交換クロマトグラフィーと硫安分画を必要回繰り返し、必要に応じてヒドロキシアパタイトカラム、ゲル濾過などを行うことにより単離精製することができる。
【００２０】
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するにためには、培養後、公知の方法で菌体または細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離や濾過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などを用いることができる。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を得る。上記の方法で得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。分離、精製法としては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。タンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組み替え体が産生するタンパク質を精製前または精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００２１】
本発明のタンパク質は、公知の合成法に従っても製造することができる。タンパク質の合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法を用いることができ、本発明のタンパク質を構成しうる部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の１〜５に記載された方法が挙げられる。
１．Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６６年）
２．ＳｃｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ＴｈｅＰｅｐｔｉｄ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５年）
３．泉屋信夫他，ペプチド合成の基礎と実験丸善（株）（１９７５年）
４．矢島冶明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学IV、２０５、（１９７７年）
５．矢島冶明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて、本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチドもしくは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質またはそれらの塩を精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドもしくはタンパク質が遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２２】
本発明に係るタンパク質、本発明に係るシグナルペプチドもしくは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質、またはそれらをコードするＤＮＡは、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドが関与している疾患の診断に用いることができる。その診断方法としては例えば酵素免疫測定法があり、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドを用いて該タンパク質もしくは該ペプチドに対する抗体価を測定することができるし、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドを動物に免疫して得られた抗体を用いて、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドの濃度を測定することもできる。さらに、該タンパク質もしくは該シグナルペプチド、またはそれらをコードするＤＮＡは、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドが関与している疾患の治療や治療法の開発に用いることができる。治療としては例えば、該タンパク質を失活させたり該タンパク質による免疫系の活性化を抑制するための医薬品や、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドを吸着除去できるカラム、または該タンパク質に対する抗体を用いて、該タンパク質が関与している疾患に対する治療を行うことができるし、感染症患者において分離された感染菌のＤＮＡを解析することでも該タンパク質を産生する菌を判別することができるため、感染症疾患の治療につなげることもできる。
【００２３】
【実施例】
実施例１：新規タンパク質の精製
透析により高分子成分を除去したＤｉｆｃｏ社製Ｂｒａｉｎ−ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ液体培地でストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)を３７℃、５％二酸化炭素インキュベーター中で終夜静置培養した。遠心分離およびフィルターろ過により菌体を除去した培養液を水で５倍に希釈後、リン酸添加によりｐＨ４．５に調製した。この培養上清にあらかじめクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したアマシャムファルマシア社製ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５を添加することにより培養上清中から活性タンパク質をゲルに吸着させた。このＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５をカラムに充填しクエン酸−リン酸緩衝液で洗浄後、１ＭＮａＣｌを含む緩衝液で溶出させた。得られた溶出液に７５％飽和硫酸アンモニウム溶液を添加して沈殿させた後蒸留水に溶解し、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）に対して透析を行った。これをあらかじめ２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で平衡化したＴｏｓｏｈ製ＳＰ−５ＰＷ陽イオン交換カラムに添加し、０．４Ｍまでの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により溶出した。溶出液の各分画の活性は、ヒト末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣと呼ぶ）に対するマイトジェン活性により測定した。すなわち、常法によりＰＢＭＣを調整しこれに各分画液を希釈して添加後、実施例２に記載の方法でマイトジェン活性の測定を行った。活性分画を１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムにかけ、０．２Ｍまでのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の直線的勾配により溶出した。得られた活性分画をアマシャムファルマシア社製Ｓｕｐｅｒｄｅｘｐｇ７５ゲル濾過カラムにより展開した。得られた活性タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で３３ｋＤａの分子量であった（図１）。本法により１０Ｌの培養から５０μｇ程度の新規タンパク質が精製できた。
【００２４】
実施例２：新規タンパク質の活性およびその作用機序
（１）Ｔ細胞活性化能
ヒツジ赤血球とのロゼット形成法によってヒト末梢血リンパ球をＴ細胞分画と非Ｔ細胞分画に分け、（ａ）Ｔ細胞分画単独、（ｂ）非Ｔ細胞分画単独、（ｃ）Ｔ細胞分画と非Ｔ細胞分画を１対１の割合で混合したもの、の３種類の細胞懸濁液を用意した。各細胞懸濁液を細胞数が１×１０５／ｗｅｌｌとなるよう９６穴のマイクロプレートに添加し、これにＳＤＭを１ｐｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの各濃度で添加して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。
【００２５】
この培養上清を希釈し、上清中に含まれるインターロイキン２（以下、ＩＬ−２と略す）の量を、ＩＬ−２に依存して増殖するＣＴＬＬ−２細胞を用いたバイオアッセイにより測定した。（ｃ）のサンプルでＩＬ−２の産生が認められた（表１）ことから、ＳＤＭにはマイトジェン活性があることが示された。さらに、Ｔ細胞単独（（ｂ）のサンプル）ではＩＬ−２が産生されず、Ｔ細胞と非Ｔ細胞が共存している場合にのみ、ＩＬ−２の産生が起こった。ＳＤＭによるＴ細胞活性化にはＴ細胞以外の細胞も必要であることが示された。
【００２６】
【表１】

【００２７】
（表１）Ｔ細胞／非Ｔ細胞分画混合懸濁液へのＳＤＭ刺激によるＩＬ−２産生性（Ｕ／ｍｌ）
（２）Ｔ細胞活性化能のＭＨＣクラスII依存性
マウス繊維芽細胞であるＬ細胞にＭＨＣクラスIIの亜型であるヒト白血球抗原−ＤＲ（ｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ−ＤＲ；以下、ヒトＨＬＡ−ＤＲと呼ぶ）を形質転換した細胞（以下、８１２４細胞と呼ぶ）に対し、マイトマイシンＣ処理およびＸ線照射を行い、増殖能を失わせた。この細胞と実施例２（１）の方法で分画したＴ細胞をそれぞれ１×１０５／ｗｅｌｌ、５×１０５／ｗｅｌｌになるよう４８穴のマイクロプレートに混合して播種した。これに１０ｎｇ／ｍｌのＳＤＭを添加し、２日間培養した後、上清を採取してＩＬ−２濃度を測定した。この実験を、ＨＬＡ−ＤＲで形質転換していないＬ細胞についても行った。８１２４細胞とＴ細胞が共存する場合にのみＩＬ−２産生が認められたことから、ＳＤＭはＭＨＣクラスII依存性にＴ細胞を活性化することが示された。
【００２８】
（３）Ｔ細胞活性化におけるプロセッシング依存性
８１２４細胞を１％パラホルムアルデヒドで３７℃、５分間の処理を行うことで固定化し、細胞の抗原プロセッシング能を失わせた。この細胞および実施例２（１）の方法で分画したＴ細胞をそれぞれ１×１０５／ｗｅｌｌ、５×１０５／ｗｅｌｌになるよう４８穴のマイクロプレートに混合して播種した。１０ｎｇ／ｍｌのＳＤＭを添加し、２日間培養した後、上清を採取してＩＬ−２濃度を測定した。この実験を、パラホルムアルデヒド処理をしていない８１２４細胞についても行った。
【００２９】
プロセッシング能のない細胞でもＩＬ−２産生が認められたことから、ＳＤＭによるＴ細胞活性化にはプロセッシング過程は不必要であることが確認できた。
【００３１】
以上、実施例２（１）〜（３）で述べたように、ＳＤＭはＴ細胞の活性化能を有すること、またその活性化能は、ＭＨＣクラスII依存性であり、プロセッシング非依存性であり、ＴＣＲのＶβ１、またはＶβ８に特異的であることが確認できた。これらのことより、ＳＤＭはスーパー抗原であることが明らかとなった。
【００３２】
実施例３：新規タンパク質のアミノ酸配列および新規タンパク質をコードするＤＮＡ配列の解析
図２は本発明の新規タンパク質のアミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡの塩基配列とを対応させたものである。図２においてアミノ酸配列については１〜２６がシグナルペプチドであり、塩基配列については１〜３が開始コドン、７１５〜７１７が終止コドンである。
【００３３】
（１）新規タンパク質のアミノ酸配列解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦにブロッティングし目的タンパク質のみのバンドとしたサンプルについて、ヒューレットパッカー社製Ｇ１００５ＡＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍを用いて末端から３６アミノ酸残基分のアミノ酸配列を同定した。
【００３４】
（２）新規タンパク質をコードするＤＮＡ配列の解析
以下のＰＣＲではＳｉｇｍａ社製ＡｃｃＴａｑＬＡを用いた。得られたアミノ酸配列の内部に２カ所のプライマーを設定し、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を得、これをクローニングして両プライマー間の内部の塩基配列情報を得た。さらにこの塩基配列部分に相当するセンス側（以下、ｐｒｉｍｅｒ１と称す）、アンチセンス側（以下、ｐｒｉｍｅｒ２と称す）のプライマーを設計した。
【００３５】
また、ストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)のゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトへｌｉｇａｔｉｏｎした。これをテンプレートし、ｐｒｉｍｅｒ１、ｐｒｉｍｅｒ２とｐＵＣ１８上のマルチクローニングサイトの両外側に設定されたプライマー（以下それぞれ，ｐｒｉｍｅｒ３、ｐｒｉｍｅｒ４と称す）を使ってｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ３、ｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ４、ｐｒｉｍｅｒ２とｐｒｉｍｅｒ３、ｐｒｉｍｅｒ２とｐｒｉｍｅｒ４の４通りの組み合わせでＰＣＲを行った。得られた断片について、一部はクローニング後、残りの部分はｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ２を用いた直接シーケンシングによって塩基配列情報を得た。
【００３６】
最終的な配列を確認するために、得られた塩基配列情報を元にして配列の両末端部分に近い部位にプライマーを設定し、それらを用いてＰＣＲで増幅した。得られた断片について、シーケンス用試薬としてＡＢＩのＢｉｇＤｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、解析システムとしてＡＢＩの３１０Ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｚｅｒを使用し、直接シーケンシングによって配列を同定した。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、Ｃ群溶血性連鎖球菌であるストレプトコッカスディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)由来のスーパー抗原性を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは該タンパク質の精製法を提供することができる。製造された新規タンパク質は、該タンパク質のかかわる疾病のメカニズム研究、該タンパク質を用いる疾病の診断および診断キット、該タンパク質のかかわる疾病の治療、治療法の開発ならびに治療薬の開発に役立てることができる。
【００３８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２】本発明の新規タンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３】ＳＤＭ刺激に対する各Ｖβ領域の増幅度を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel protein having superantigenicity derived from Streptococcus dysgalactiae.
[0002]
[Prior art]
The general antigen is processed in an antigen presenting cell (hereinafter referred to as APC) and decomposed into peptide fragments, and then a major histocompatibility antigen complex (hereinafter abbreviated as MHC) class. It forms a complex with the II molecule and is presented on the cell surface. At this time, since the T cell receptor (hereinafter abbreviated as TCR) recognizes the MHC class II molecule-peptide complex using the complementarity determining region of the hypervariable region, the activated T cells are limited. The On the other hand, the superantigen binds to the outside of the MHC class II molecule and the TCR β chain variable region (hereinafter referred to as Vβ) without being processed by APC. That is, since the superantigen recognizes a portion of Vβ that lacks diversity, it activates a large amount of T cells having a specific Vβ regardless of its specificity. It is believed that along with excessive activation of T cells, monocytes and macrophages are activated and cytokines are released in large quantities, causing symptoms such as decreased blood pressure and fever.
[0003]
Superantigens can be classified into three strains, bacterial, viral, and plant. Among them, bacterial superantigens are closely related to human infections. Enteric toxins A, B, C, D, E produced by Staphylococcus aureus as bacterial superantigens (Staphylococcus aureus A, B, C, D, E; hereinafter referred to as SEA, SEB, SEC, SED, SEE) ), Toxic shock syndrome toxin-1 (hereinafter abbreviated as TSST-1), exotoxins A, C, F, G, and H produced by group A hemolytic streptococci (streptococcal pyrogenic exotoxin) A, C, F, G, H; hereinafter referred to as SPEA, SPEC, SPEF, SPEG, SPEH), exotoxin produced by Yersinia (Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen; hereinafter abbreviated as YPM) It has been determined.
[0004]
Diseases involving superantigens include toxic shock syndrome (hereinafter abbreviated as TSS) caused by TSST-1 and neonatal TSS-like exanthematous disease (hereinafter referred to as NTED). Abbreviated), systemic Yersinia infections caused by YPM, and the like. In addition, super antigens have been implicated in scarlet fever, fulminant group A streptococcal infection, and Kawasaki disease, which is acute systemic vasculitis, but the causative toxin has not been clarified yet. There is also a report that Streptococcus dysgalactiae (Streptococcus dysgalactiae), a group C streptococcus, has been detected in a case similar to fulminant group A streptococcal infection, but Streptococcus dysgalactiae Although it is often detected as a causative agent of bovine mastitis, there have been few cases of collection from humans, and so far, it has not received much clinical attention. Therefore, the identification of a new superantigen (Streptococcus dysgalactiae mitogen; hereinafter abbreviated as SDM) produced by Streptococcus dysgalactiae is a pathogenesis of a disease in which an unknown superantigen may be involved. It was necessary to elucidate the introduction and establish prevention or treatment.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel superantigen. More specifically, it is intended to provide a novel protein having superantigenicity derived from Streptococcus dysgalactiae, DNA encoding the protein, and a method for purifying the protein.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has the following configuration in order to solve the above problems.
(1) Same as or more than 90% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Same A protein or a salt thereof, comprising an amino acid sequence having sex and having a function as a superantigen.
(2) The N-terminal of the protein described in (1) is the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, or 90% or more Same A protein or a salt thereof, wherein a signal peptide having sex is bound thereto.
[0007]
( 3 ) (1) or ( 2 DNA containing the DNA characterized in that it encodes the protein described in 1) or the signal peptide described in 2).
[0008]
(5) The protein or the salt thereof according to (1) or (3) or the signal peptide or the salt thereof according to (2), which is produced by culturing a transformed microorganism and collected. Manufacturing method.
(6) It is characterized by culturing Streptococcus dysgalactiae and collecting the protein or salt thereof described in (1) or (3) or the signal peptide or salt thereof described in (2) from the culture medium. For producing the protein or salt thereof or the signal peptide or salt thereof
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention is that of the identified SDM. 90% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention Same The protein containing the amino acid sequence having the property and having the function as a superantigen may be a protein derived from Streptococcus dysgalactiae, a recombinant protein, or a synthetic protein. There may be.
[0010]
The novel protein according to the present invention includes 90% or more, more preferably about 95% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Same A protein having a sex and having a function as a superantigen or a salt thereof is also included. 90% or more of SEQ ID NO: 2 of the present invention, more preferably about 95% or more Same Examples of the protein containing the amino acid sequence having the property or a salt thereof include 90% or more, more preferably about 95% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Same A protein having a property that is substantially the same as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a salt thereof (hereinafter referred to as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2). Same or 90% or more, more preferably about 95% or more Same A protein containing an amino acid sequence having sex and having a function as a superantigen may be referred to as a protein according to the present invention, a novel protein according to the present invention, or a novel protein). The substantially homogeneous properties include, for example, mitogenic activity against human peripheral blood lymphocytes and Vβ selectivity. “Substantially homogeneous” means that these properties are qualitatively homogeneous. Therefore, it is preferable that the mitogenic activity and Vβ selectivity for human peripheral blood lymphocytes are equivalent, but quantitative factors such as the degree of these properties and the molecular weight of the protein may be different.
[0011]
The signal peptide according to the present invention includes a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and a salt thereof, and 90% or more, more preferably about 95% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 %More than Same And amino acid sequences having properties. More specifically, it is 90% or more, more preferably about 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. Same The peptide is not particularly limited as long as it has an amino acid sequence having a property and can exhibit a function as a signal peptide, and quantitative elements such as molecular weight may be different.
[0012]
The protein of the present invention contains, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And has a function as a superantigen Examples also include a protein in which a signal peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is bound to the N-terminus of the protein. For example, a protein having a signal peptide represented by SEQ ID NO: 4 is useful as an intermediate for producing the protein of the present invention.
[0013]
Moreover, the protein of the present invention, the signal peptide of the present invention, or the protein having the signal peptide of the present invention bound to the N-terminus of the protein of the present invention includes a complex protein having a sugar chain bound thereto.
[0014]
As a protein salt of the present invention, a signal peptide of the present invention, or a protein salt in which the signal peptide of the present invention is bound to the N-terminus of the protein of the present invention, physiologically acceptable acids (for example, inorganic acids, organic acids) Or a salt with a base (for example, alkali metal salt) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is preferably used. As such a salt, for example, a salt with an inorganic acid or a salt with an organic acid is used. Examples of the inorganic acid include hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, and the like. Examples of the organic acid include acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid. Acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like can be used.
[0015]
The protein of the present invention, the signal peptide of the present invention or the protein having the signal peptide of the present invention bound to the N-terminus of the protein of the present invention can be produced from Streptococcus dysgalactiae, It can also be produced by culturing a transformant containing a protein, a signal peptide of the present invention or a DNA encoding a protein in which the signal peptide of the present invention is bound to the N-terminus of the protein of the present invention.
[0016]
The DNA encoding the protein of the present invention has, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a base sequence that forms a hybrid with the DNA represented by SEQ ID NO: 1 under severe conditions, Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as the protein of the present invention. Strict conditions indicate, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is 60 to 65 ° C. In particular, it is more preferable that the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. Examples of the DNA that can form a hybrid under severe conditions with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 include 90% or more, more preferably about 95% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Same A DNA containing a nucleotide sequence having a property is used.
[0017]
The DNA encoding the signal peptide of the present invention has, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a base sequence that forms a hybrid under severe conditions with the DNA represented by SEQ ID NO: 3. Any DNA may be used as long as it encodes a signal peptide having substantially the same properties as the signal peptide of the present invention. Examples of the DNA that can form a hybrid under severe conditions with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 are 90% or more, more preferably about 95% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. Same A DNA containing a nucleotide sequence having a property is used.
[0018]
Examples of the DNA encoding the protein of the present invention, the signal peptide of the present invention or the protein having the signal peptide of the present invention bound to the N-terminus of the protein of the present invention include the protein of the present invention, the signal peptide of the present invention, or the present invention. Any protein may be used as long as it encodes a protein in which the signal peptide of the present invention is bound to the N-terminus of the protein of the present invention and has superantigenicity. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned bacteria, cDNA library derived from the above-mentioned bacteria, and synthetic DNA may be used. Moreover, any of TAA, TGA, and TAG may be used as the base of the translation termination codon on the 5 ′ end side.
[0019]
The present invention has the above-mentioned protein, the above-mentioned signal peptide, or a DNA encoding a protein in which the signal peptide of the present invention is bound to the N-terminus of the protein of the present invention, the plasmid having the DNA and capable of expressing the protein, and the plasmid A host cell is provided. Examples of host cells include prokaryotic hosts such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus, and eukaryotic hosts such as yeast, COS cells, CHO cells, Hela cells, 3T3 cells, 3T6 cells, and Ltk-cells. Any host cell commonly used in the field of gene recombination technology can be used. The plasmid of the present invention may be any plasmid as long as it is suitable for the host to be used. As the plasmid, for example, a normal expression plasmid / virus vector may be used. When a prokaryotic host is used, for example, ET-3a-d, pET-5a-c, pET-9a-d, pET- Vectors such as 11a-d and pET-12a-c can be used. The present invention relates to Streptococcus dysgalactiae or the above host cell, wherein the protein, the signal peptide or the protein having the signal peptide of the present invention bound to the N-terminus thereof, A method for producing these salts is provided. Streptococcus dysgalactiae or a host cell capable of expressing a protein or signal peptide of the present invention or a protein having the signal peptide of the present invention bound to the N-terminus of the protein of the present invention is usually used depending on the nature of the cell. It can be cultured by the method. The culture medium is not limited as long as it is a medium suitable for culturing Streptococcus dysgalactiae or host cells. In order to obtain the protein from the culture medium, ion exchange chromatography and ammonium sulfate fractionation are repeated as many times as necessary, and isolation and purification can be carried out by performing a hydroxyapatite column, gel filtration or the like as necessary.
[0020]
In order to extract the protein of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme, freeze-thawing, etc. For example, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by the method can be used. When the protein is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the cells or cells and the supernatant are separated by a known method to obtain a supernatant. Purification of the protein contained in the culture supernatant or the extract obtained by the above method can be performed by appropriately combining known separation / purification methods. Separation and purification methods are based on differences in molecular weight such as salting out and solvent precipitation methods, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Method, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method utilizing specific affinity such as affinity chromatography, method utilizing difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography, isoelectric point A method using the difference in isoelectric point such as electrophoresis is used. When the protein is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method similar thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, the free form can be obtained by a method known per se or a method equivalent thereto. Or it can be converted to other salts. The protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification. Examples of the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
[0021]
The protein of the present invention can also be produced according to a known synthesis method. As a protein synthesis method, for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method can be used. A partial peptide or amino acid that can constitute the protein of the present invention is condensed with the remaining portion, and the product has a protecting group. When it has, the target peptide can be produced by removing the protecting group. Examples of known condensation methods and protecting group elimination include the methods described in 1 to 5 below.
1. M.M. Bodanszy and M.S. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
2. Scroeder and Luebke, The Peptid, Academic Press, New York (1965)
3. Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis Maruzen Co., Ltd. (1975)
4). Yajima Yukiaki and Sugawara Shunpei, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
5). Supervised by Yajima Yukiaki, follow-up drug development, Volume 14, Peptide synthesis, Hirokawa Shoten
In addition, after the reaction, the N-terminal of the protein of the present invention, the signal peptide of the present invention or the protein of the present invention can be obtained by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. The protein or the salt thereof to which the signal peptide of the present invention is bound can be purified and isolated. When the peptide or protein obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when obtained as a salt, the known method or It can be converted to a free form or other salt by a similar method.
[0022]
The protein according to the present invention, the signal peptide according to the present invention or the protein in which the signal peptide of the present invention is bound to the N-terminus of the protein of the present invention, or the DNA encoding the same, involves the protein or the signal peptide. It can be used for diagnosis of diseases. As the diagnostic method, for example, there is an enzyme immunoassay, the antibody titer against the protein or the peptide can be measured using the protein or the signal peptide, and an animal is immunized with the protein or the signal peptide. Using the obtained antibody, the concentration of the protein or the signal peptide can also be measured. Furthermore, the protein or the signal peptide, or the DNA encoding them can be used for treatment of a disease involving the protein or the signal peptide or development of a therapeutic method. As the treatment, for example, using a pharmaceutical product for inactivating the protein or suppressing activation of the immune system by the protein, a column capable of adsorbing and removing the protein or the signal peptide, or an antibody against the protein, Since it is possible to treat a disease involving a protein, and by analyzing the DNA of an infectious bacterium isolated in an infectious disease patient, the bacterium producing the protein can be discriminated. It can also lead to treatment.
[0023]
【Example】
Example 1: Purification of a novel protein
Streptococcus dysgalactiae was statically cultured overnight in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. in a Brain-Heart Infusion liquid medium manufactured by Difco from which the high molecular components were removed by dialysis. The culture solution from which the cells were removed by centrifugation and filter filtration was diluted 5 times with water, and then adjusted to pH 4.5 by adding phosphoric acid. To this culture supernatant, SP-Sephadex G25 manufactured by Amersham Pharmacia, which had been equilibrated in advance with a citrate-phosphate buffer (pH 4.5), was added to adsorb the active protein from the culture supernatant to the gel. This SP-Sephadex G25 was packed in a column, washed with a citrate-phosphate buffer, and eluted with a buffer containing 1M NaCl. A 75% saturated ammonium sulfate solution was added to the eluate to be precipitated, dissolved in distilled water, and dialyzed against 25 mM sodium acetate (pH 5.3). This was added to a Tosoh SP-5PW cation exchange column previously equilibrated with 25 mM sodium acetate (pH 5.3) and eluted with a linear concentration gradient of sodium chloride up to 0.4M. The activity of each fraction of the eluate was measured by mitogenic activity on human peripheral blood mononuclear cells (hereinafter referred to as PBMC). That is, PBMC was prepared by a conventional method, each fraction solution was diluted and added thereto, and then the mitogenic activity was measured by the method described in Example 2. The active fraction was applied to a hydroxyapatite column equilibrated with 10 mM Tris-Cl (pH 7.5) and eluted with a linear gradient of sodium phosphate (pH 7.5) to 0.2 M. The obtained active fraction was developed with a Superdex pg75 gel filtration column manufactured by Amersham Pharmacia. The obtained active protein had a molecular weight of 33 kDa on SDS-PAGE (FIG. 1). By this method, about 50 μg of a novel protein could be purified from 10 L of culture.
[0024]
Example 2: Activity of a novel protein and its mechanism of action
(1) T cell activation ability
Human peripheral blood lymphocytes are divided into T cell fraction and non-T cell fraction by rosette formation method with sheep erythrocytes, and (a) T cell fraction alone, (b) non-T cell fraction alone, (c) T Three types of cell suspensions were prepared: a cell fraction and a non-T cell fraction mixed at a ratio of 1: 1. Each cell suspension was added to a 96-well microplate so that the number of cells was 1 × 10 5 / well, and SDM was added thereto at various concentrations from 1 pg / ml to 10 ng / ml at 37 ° C., 5% The cells were cultured for 2 days in a CO2 incubator.
[0025]
The culture supernatant is diluted, and the amount of interleukin 2 (hereinafter abbreviated as IL-2) contained in the supernatant is measured by a bioassay using CTLL-2 cells that proliferate depending on IL-2. did. IL-2 production was observed in the sample of (c) (Table 1), indicating that SDM has mitogenic activity. Furthermore, IL-2 was not produced by T cells alone (sample (b)), and IL-2 production occurred only when T cells and non-T cells coexisted. It was shown that cells other than T cells are required for T cell activation by SDM.
[0026]
[Table 1]

[0027]
(Table 1) IL-2 productivity (U / ml) by SDM stimulation to T cell / non-T cell fraction mixed suspension
(2) MHC class II dependence of T cell activation ability
Mouse leukocyte antigen-DR (hereinafter referred to as human HLA-DR), which is a subtype of MHC class II, is transformed into L cells, which are mouse fibroblasts (hereinafter referred to as 8124 cells). ) Was subjected to mitomycin C treatment and X-ray irradiation to lose the growth ability. These cells and T cells fractionated by the method of Example 2 (1) were mixed and seeded on a 48-well microplate so as to be 1 × 10 5 / well and 5 × 10 5 / well, respectively. To this, 10 ng / ml SDM was added and cultured for 2 days, and then the supernatant was collected to measure the IL-2 concentration. This experiment was also performed on L cells not transformed with HLA-DR. Since IL-2 production was observed only when 8124 cells and T cells coexisted, it was shown that SDM activates T cells in an MHC class II-dependent manner.
[0028]
(3) Processing dependence in T cell activation
8124 cells were fixed by treatment with 1% paraformaldehyde at 37 ° C. for 5 minutes to lose the antigen processing ability of the cells. These cells and T cells fractionated by the method of Example 2 (1) were mixed and seeded in a 48-well microplate so as to be 1 × 10 5 / well and 5 × 10 5 / well, respectively. After adding 10 ng / ml SDM and culturing for 2 days, the supernatant was collected and the IL-2 concentration was measured. This experiment was also performed on 8124 cells not treated with paraformaldehyde.
[0029]
Since IL-2 production was observed even in cells having no processing ability, it was confirmed that the processing process was unnecessary for T cell activation by SDM.
[0031]
As mentioned above, Example 2 (1)-( 3 ), SDM has the ability to activate T cells, and the activation ability is MHC class II-dependent and processing-independent, and is specific to VCR1 or Vβ8 of TCR. It was confirmed that. These facts revealed that SDM is a superantigen.
[0032]
Example 3: Analysis of amino acid sequence of novel protein and DNA sequence encoding novel protein
FIG. 2 shows the correspondence between the amino acid sequence of the novel protein of the present invention and the base sequence of the DNA encoding it. In FIG. 2, 1 to 26 are signal peptides for the amino acid sequence, and 1 to 3 are start codons and 715 to 717 are stop codons for the base sequence.
[0033]
(1) Amino acid sequence analysis of novel proteins
About the sample which blotted to PVDF after SDS-PAGE and made the band only of the target protein, the amino acid sequence for 36 amino acid residues from the terminal was identified using the Hewlett-Packard G1005A Protein Sequencing System.
[0034]
(2) Analysis of DNA sequence encoding novel protein
In the following PCR, AccTaq LA manufactured by Sigma was used. Two primers were set inside the obtained amino acid sequence, a DNA fragment was obtained by PCR, and this was cloned to obtain internal base sequence information between both primers. Furthermore, primers on the sense side (hereinafter referred to as “primer1”) and antisense side (hereinafter referred to as “primer2”) corresponding to this nucleotide sequence portion were designed.
[0035]
In addition, the genomic DNA of Streptococcus dysgalactiae was partially digested with Sau3AI and ligated to the BamHI site of pUC18. This is used as a template, and primers 1 and primer3, primer2 and primer4, primer2 and primer3, and primer2 and primer4 are used with primers (hereinafter referred to as "primer3" and "primer4", respectively) set on both outer sides of the multiple cloning sites on primer1, primer2 and pUC18. PCR was performed with 4 combinations of primer4. Regarding the obtained fragment, part of the fragment was cloned, and the remaining part was obtained by sequencing directly using primer1 and primer2.
[0036]
In order to confirm the final sequence, primers were set at sites close to both ends of the sequence based on the obtained base sequence information and amplified by PCR using them. The sequence of the obtained fragment was identified by direct sequencing using ABI BigDye terminator as a sequencing reagent and ABI 310 Genetic analyzer as an analysis system.
[0037]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel protein having superantigenicity derived from Streptococcus dysgalactiae, which is a group C hemolytic streptococcus, DNA encoding the protein, or a method for purifying the protein can be provided. . The produced novel protein can be used for research on the mechanism of diseases related to the protein, diagnosis and diagnosis kits for diseases using the protein, treatment of diseases related to the protein, development of therapeutic methods, and development of therapeutic agents.
[0038]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
1 shows the results of SDS-PAGE in Example 1. FIG.
FIG. 2 shows the base sequence and amino acid sequence of the novel protein of the present invention.
FIG. 3 shows the degree of amplification of each Vβ region in response to SDM stimulation.

Claims

A protein comprising an amino acid sequence having the same or 90% identity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having a function as a superantigen.

A salt of a protein comprising an amino acid sequence having the same or 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having a function as a superantigen.

A method for producing a novel protein comprising producing the protein according to claim 1 by culturing a transformed microorganism or Streptococcus dysgalactiae, and collecting the protein.

A method for producing a novel protein salt, comprising producing a salt of the protein according to claim 2 by culturing a transformed microorganism or Streptococcus dysgalactiae, and collecting the salt.

A DNA containing a DNA encoding the protein according to claim 1.

6. The DNA according to claim 5, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

A sequence listing at the N-terminus of a protein comprising an amino acid sequence having the same or more than 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having a function as a superantigen A protein characterized by comprising a signal peptide bound to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 comprising the amino acid sequence having the same or 90% or more identity .

A sequence listing at the N-terminus of a protein comprising an amino acid sequence having the same or more than 90% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having a function as a superantigen A protein salt characterized by comprising a signal peptide bound to the amino acid sequence having the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or having an identity of 90% or more.

A method for producing a novel protein, comprising producing the protein according to claim 7 by culturing a transformed microorganism or Streptococcus dysgalactiae, and collecting the protein.

A method for producing a novel protein salt, comprising producing the protein salt according to claim 8 by culturing a transformed microorganism or Streptococcus dysgalactiae, and collecting the protein salt.

The method for producing a protein according to claim 7, wherein the signal peptide is produced by culturing a transformed microorganism or Streptococcus dysgalactiae and collected.

9. The production of a salt of a protein according to claim 8, wherein the signal peptide is produced by culturing a transformed microorganism or Streptococcus dysgalactiae and collected from it. Law.

A DNA containing a DNA encoding the protein according to any one of claims 7 to 11.

The DNA according to claim 13, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.