JP3995733B2

JP3995733B2 - Immunostimulatory composition

Info

Publication number: JP3995733B2
Application number: JP20178695A
Authority: JP
Inventors: 卓三郎海老名; 直子小鎌; 和子村田
Original assignee: Meiji Co Ltd; Meiji Dairies Corp
Current assignee: Meiji Co Ltd; Meiji Dairies Corp
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1995-07-17
Publication date: 2007-10-24
Anticipated expiration: 2015-07-17
Also published as: JPH0930981A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）８７８Ｒの菌体を有効成分として含有する免疫賦活組成物に関するものである。本発明の免疫賦活組成物は、マイトジェン活性、抗腫瘍活性およびＴ細胞増殖活性などの作用を有しており、医薬、栄養食品、特定保健用食品、その他飲食品として有用である。
【０００２】
本発明に係る組成物は、すぐれた抗腫瘍活性を示すが、経口投与と非経口投与とを併用すれば特にすぐれた作用を奏し、本組成物は、それが本来的に有している高い安全性とも相まって特にすぐれた抗腫瘍剤として、腫瘍の予防、治療に大きな貢献をなすものである。
【０００３】
【従来の技術】
乳酸菌および発酵乳の摂取は、健康および栄養上の面で様々な利点をもたらすことが報告されている（伊藤敞敏：ＮｅｗＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１２，ｐ３９（１９９１））。その中でも抗腫瘍作用は、疾病の予防および治療の面で、乳酸菌および発酵乳に最も期待される性質の１つである。しかし、この抗腫瘍作用については宿主免疫系の介在が示唆されているものの、まだ不明な点が多い（Ｃ．Ｆ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓｅｔａｌ．：Ｊ．ＦｏｏｄＰｒｏｔ．，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．８，ｐ７０４（１９９０））。一方、近年、上記したような乳酸菌の生理活性については菌種間あるいは菌株間で大きな差異のあることが明らかにされつつあり（廣田哲二：ＮｅｗＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１０，ｐ９（１９９１））、抗腫瘍作用についても、こうした点からの見直しが必要となっているのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、腫瘍その他の疾病の予防、治療に有効な免疫賦活組成物を新たに開発する目的でなされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは各方面からの検討を行い、免疫賦活組成物としては、有効性と同様に安全性が重要である点に着目した。そこで、免疫賦活組成物としては、化学合成品ではないこと、飲食品としても利用可能であることが好適であるとの観点にたち、広範な検討を行った。
【０００６】
そして、飲食品の製造にも広く利用されている微生物、特に乳酸菌に着目し、本発明者らは、乳酸菌の示す抗腫瘍作用について菌種間および菌株間で鋭意研究を行なったところ、ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）８７８Ｒ株に特に強い活性が認められ、非常に有望な抗腫瘍剤として利用できることを見い出すとともに特に有効な投与方法を発見し、すぐれた安全性も確認し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明者らは、発酵乳のスターターとして用いられる各種乳酸菌菌体について、二重移植腫瘍系（診療と新薬、Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．３，ｐ４４，１９９１）を指標にして検索を行った。
【０００８】
この実験系においては、ＢＲＭ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｍｏｄｉｆｉｅｒ）の抗腫瘍効果が、好中球、マクロファージ、Ｔリンパ球など多くの免疫細胞系とインターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、単球走化活性因子（ＭＣＡＦ）などのサイトカインとが関連した一連の免疫カスケード反応によって起っていることが示唆されている（海老名卓三郎ら：Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ５，Ｎｏ．１３，ｐ１９５１，１９９１）。そして実際には、遠隔再発腫瘍に対する増殖抑制効果を評価することができるため、これまでのＢＲＭの抗腫瘍効果の評価よりも更に実用的なものと考えられる。
【０００９】
この二重移植腫瘍系において、抗腫瘍効果を示す物質としては、これまで担子菌製剤ＰＳＫなどが見出されているが（海老名卓三郎ら：癌と化学療法、Ｖｏｌ１４，Ｎｏ．６，ｐ１８４１，１９８７）、乳酸菌についての検討は全く行われてこなかった。
【００１０】
そこで、一連の乳酸菌の抗腫瘍効果について改めて検討した結果、ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の一菌株が強い抗腫瘍活性を有することを見出した。更にまた、この菌株の抗腫瘍作用は、経口投与でも有効なこと、そして、菌体自身もマイトジェン活性及びＴ細胞増殖活性を有することも併せて確認し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス８７８Ｒ株（以下、８７８Ｒないし８７８Ｒ株ということもある）を含有する免疫賦活組成物を基本的技術思想とするものである。
【００１２】
本発明に係る免疫賦活組成物に用いるラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス８７８Ｒ株の菌体は、生菌および死菌のいずれであってもよく、原料菌体の取得のための培養法および菌体分離法にも制限はない。菌体としては、純粋に分離した菌体（乾燥菌体、湿潤菌体を問わない）のほか、菌体含有物（培養物、懸濁物、ヨーグルト等菌体含有飲食品その他菌体を含有するもの）、処理物（濃縮、乾燥、ペースト化、又は逆に希釈したもの、超音波および高圧破壊処理したもの等各種処理物）を広く包含するものである。
【００１３】
本発明に係る免疫賦活組成物は、８７８Ｒ株、その含有物及び／又はその処理物を有効成分とし、常用される製剤用補助剤を用いて、各種剤型に製剤化し、医薬タイプとして使用することができ、特に本発明においては、非経口投与のほか経口投与できることが確認されたので、経口投与用の医薬に製剤化することが可能となり、きわめて有用である。その際、８７８Ｒ株は、ヨーグルト等発酵食品のスターターとしても利用されるものである故、安全性については問題がない。後記する実施例からも安全性は立証されているところである。現に、マウスを用いた１０日間の急性毒性試験の結果、１０００ｍｇ／ｋｇの経口投与でも死亡例は認められなかった。
【００１４】
本発明に係る免疫賦活組成物は、医薬として投与する場合、症状、投与ルート等によっても異なるが、一般的に成人において、１日当り、静脈投与の場合は後記実施例に係る菌体０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、筋肉投与の場合は同じく０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、経口投与の場合も同じく０．５〜２０００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与するのがよく、経口投与と非経口投与を併用することも可能である。
【００１５】
８７８Ｒ株は、経口投与によって所期の目的を達成しうるので、本発明に係る免疫賦活組成物は、飲食品タイプとして使用することができる。そのためには、８７８Ｒ株、その含有物及び／又はその処理物を各種補助剤や他の飲食品を用いて、ドリンク、錠剤、その他各種の飲食品タイプにしたり、飲食品に直接添加したり、あるいは、これをスターターにしてヨーグルトとする等これを利用して発酵食品にする等、各種の方法を利用することができる。このように飲食品タイプとした本発明組成物は、長期間に亘って摂取することが可能であるので、腫瘍の予防、再発防止等の目的で、通常の飲食品のほか、特定保健用食品、栄養剤、健康食品等として市販に供することができる。
【００１６】
本発明において使用する菌であるラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）８７８Ｒは、工業技術院微生物工業技術研究所（現、生命工学工業技術研究所）に微工研条寄第１２５号（ＦＥＲＭＢＰ−１２５）として寄託されており、有効に使用される。なお、本寄託において寄託者が付した識別のための表示の欄には、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＮｏ．８７８−Ｒと表示されているが、本菌は分類が改正されて、現在は上記のようにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓに分類されている（ＢＥＲＧＥＹ’ＳＭＡＮＵＡＬＯＦＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ２，ｐ１２１９−１２２０）。
【００１７】
ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス８７８Ｒの菌学的性質は、次のとおりである。
形態ＢＬ寒天培地でよく生育し、時に長桿状を呈する桿菌で、若い生育旺盛なカルチャーでは単一層を成す。メチレンブルー染色で顆粒を呈する
コロニー白〜明灰色の通常、表面が粗く（ｒｏｕｇｈ）１〜３ｍｍ径
生育環境嫌気性あるいは通性嫌気性
生育温度１５℃で生育せず、４５℃あるいは５０〜５２℃でも生育
牛乳培養凝固：最終乳酸酸度１．６％
カタラーゼ −
グラム染色性＋
糖の資化性：（ガスの発生はいずれもなし）
アミグダリン −
セロビオース −
フラクトース＋
ガラクトース＋
グルコース＋
ラクトース＋
マルトース −
マンノース −
サリシン −
サッカロース −
トレハロース −
エスクリン −
乳酸の旋光性Ｄ(−)
【００１８】
以下に本発明の実施例を示す。
【００１９】
【実施例１】
発酵乳の製造に用いられるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ８０６（以下、８０６と略す）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ８７８Ｒ（以下、８７８Ｒと略す。ＦＥＲＭＢＰ−１２５）、同２０３８（以下、２０３８と略す）、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１１３１（以下、１１３１と略す）の各菌体を、ＥＧ寒天培地より寒天および馬血液を除いた液体培地に接種し、３７℃の温度で２４時間培養した。培養後、集菌、洗浄（生理食塩水）し、菌体懸濁液５×１０⁹／ｍｌ（ｐＨ７．０滅菌リン酸緩衝液）に調製した。
【００２０】
マウスとしてＢＡＬＢ／ｃマウス（７週令、雄：（株）船橋農場）を使用し、腫瘍としてはＢＡＬＢ／ｃマウスと同系のＭｅｔｈ−Ａ線維芽肉腫細胞を皮下に接種し、固型腫瘍として使用し、上記で得た乳酸菌製剤の抗腫瘍作用について、二重移植腫瘍系（海老名卓三郎：診断と新薬、Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．３，ｐ４４，１９９１）を用いて検討を行った。（実施例１の以上の方法は実施例２以下でも同様に実施した。）
【００２１】
すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹皮内に１０⁶個、左側腹皮内に２×１０⁵個のＭｅｔｈ−Ａ細胞を同時に移植し、右側の大きな腫瘍（原発巣と想定）が指で触れるようになる３日目より腫瘍内に乳酸菌製剤を３日間投与することにより治療し、治療していない左側の遠隔腫瘍（転移巣と想定）の退縮を観察した。
【００２２】
抗腫瘍効果の評価は、腫瘍接種後経日的に腫瘍径を測定し、√(長径×短径)（ｍｍ）で腫瘍の大きさを表わし、２１日目の腫瘍重量（ｇ）とともに判定した。治癒率の比較にはｘ²検定を、腫瘍の大きさ並びに腫瘍重量の比較にはｔ検定を行った。得られた結果を下記表１に示す。
【００２３】
【表１】

【００２４】
上記結果から明らかなように、４種の乳酸菌製剤をそれぞれ０．５ｍｇずつ腫瘍移植後３日目から３、４、５日目の３回右側腫瘍に投与したところ、上記に示すように右側腫瘍ではほとんどが治癒し、著明な抗腫瘍効果が認められた。一方左側腫瘍では８０６株と８７８Ｒ株に腫瘍の増殖抑制が観察された。すなわち両乳酸桿菌には免疫賦活作用があることが認められた。コントロールとしては滅菌生理食塩水を同量、３日間投与した。
【００２５】
【実施例２】
実施例１に記載した二重移植腫瘍系に更にそれぞれの乳酸菌製剤をマウス用飼料Ｆ２（（株）船橋農場）に２％ずつ配合したペレタイザー成形飼料をａｄｌｉｂに与えて、その抗腫瘍効果を比較した。コントロールとしては、マウス用飼料Ｆ２そのものを与えた。得られた結果を下記表２に示す。
【００２６】
【表２】

【００２７】
上記結果から明らかなように、８７８Ｒ株だけに左右腫瘍に対し抗腫瘍効果が認められた。以上の結果から、８７８Ｒ株が腫瘍内投与による右側腫瘍の治癒並びに左側腫瘍の増殖抑制と経口投与（飼料による）による抗腫瘍効果が認められ、最も興味深い乳酸桿菌と考えられた。
【００２８】
【実施例３】
最も抗腫瘍効果にすぐれていることが上記によって立証された８７８Ｒ株について、更に以下のような確認を行った。
【００２９】
（１）抗腫瘍効果の用量応答
二重移植腫瘍系において、８７８Ｒ製剤の用量応答（ｄｏｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅ）を調査し、下記表３の結果を得た。
【００３０】
【表３】

【００３１】
上記結果から明らかなように、８７８Ｒ製剤は、０．５ｍｇ３回投与が最も効果があり、０．０５ｍｇ３回投与でも左右腫瘍の著明な抗腫瘍効果が認められた。以上の結果は今迄調べたＢＲＭ中最も効果のある担子菌製剤ＰＳＫに比しても濃度が１００分の１でも効果があることから有望な抗腫瘍剤であることが確認されたので、次のその作用機作について解明を加えた。
【００３２】
（２）養子免疫細胞移入
二重移植腫瘍系において、８７８Ｒ製剤０．０５ｍｇの３回右側腫瘍内投与により、左側腫瘍まで治癒する機序を解析するため、８７８Ｒ株免疫脾細胞を採取し、その２×１０⁷個を別のマウスの腫瘍内に投与する養子免疫細胞移入（ａｄｏｐｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｅｒ）の実験を行った。すなわち、担癌１４日目のマウスの脾細胞を採取し、２×１０⁷細胞を３日目のＭｅｔｈ−Ａ腫瘍内にｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒＴ細胞の機能を抑制するｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（ＣＹ）を２ｍｇ／マウス静脈内注射して一時間後移入するａｄｏｐｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｅｒの実験を行った。得られた結果を下記表４及び図１に示す。
【００３３】
【表４】

【００３４】
上記結果から明らかなように、マウス６匹中５匹で完全治癒が確認された。正常マウスの脾細胞には抗腫瘍効果がないことから８７８Ｒ製剤投与により脾細胞中にＭｅｔｈ−Ａ腫瘍を殺す能力を持ったリンパ球を増加させていることが確認された。
【００３５】
（３）腫瘍組織内でのＮＣＦ及びＭＣＦの産生
８７８Ｒ株投与により二重移植腫瘍系の左右腫瘍内においてどのようなことが起っているか調べるため、８７８Ｒ製剤投与後１日目の腫瘍組織を採取し、１０％胎児牛血清加ＲＰＭＩ培地で２４時間培養し、その培養上清のＮＣＦ（好中球走化因子）並びにＭＣＦ（マクロファージ走化因子）活性を測定した。
【００３６】
すなわち、これらの走化活性は、ケモタキセル（クラボウ社製）により２４穴マイクロプレートを使って測定した。ＮＣＦ（好中球走化因子）活性には標的細胞として３％ｐｒｏｔｅｏｓｅｐｅｐｔｏｎｅ１ｍｌを１４時間前に腹腔内接種したマウスの腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）中の好中球を使用した。ＭＣＦ（マクロファージ走化因子）活性には標的細胞として３％ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ１ｍｌを３日前に腹腔内接種したマウスのＰＥＣ中のマクロファージを使用した。
【００３７】
方法は２４穴マイクロプレートの外筒に左右の腫瘍組織の培養上清を５００μｌ入れ、内筒に２×１０⁵個のＰＥＣを２００μｌ入れ、ＣＯ₂培養器で９０分〜３時間培養した後、内筒の底にある５μｍのフィルターを介して走化してきた好中球ならびにマクロファージ数をＭａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色により４００〜１，０００倍油浸顕微鏡で算定した。得られた結果を下記表５に示す。
【００３８】
【表５】

【００３９】
上記から明らかなように、８７８Ｒ製剤の右側腫瘍内投与により、右側腫瘍内にＮＣＦ活性が有意に増加しており、ＮＣＦ産生が以下の免疫カスケード反応の引き金になっていることが認められた。
【００４０】
（４）血清ＩＡＰの誘導
ＢＡＬＢ／ｃマウスに８７８Ｒ製剤を皮内注射したときに血清ＩＡＰ（免疫抑制酸性蛋白質）値をｓｉｎｇｌｅｒａｄｉａｌｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ（ＳＲＩＤ）法を用い、測定した。結果を図２に示す。
【００４１】
前記のように、８７８Ｒ株投与によりＮＣＦが誘導されることにより、腫瘍内に好中球が浸潤し、抗腫瘍効果が誘起されることが充分に示唆されたので、活性化好中球並びにマクロファージが産生することが知られている免疫抑制酸性蛋白質ＩＡＰの産生に関して検討した。８７８Ｒ製剤０．０５ｍｇずつ３日間皮内投与したときの血清ＩＡＰ値を調べた結果、図２に示すように一過性のＩＡＰ値の増加が認められた。
【００４２】
【作用】
上記したところから明らかなように、本発明において使用する乳酸桿菌８７８Ｒ株の抗腫瘍効果は、細菌製剤であるＢＣＧやＯＫ−４３２と同じ結果を示した。また、ＮＣＦ、ＭＣＦ誘導能の測定結果から、右側腫瘍でＮＣＦ活性の誘導が認められたが、この結果はＢＣＧと全く同じ結果であった。更に好中球とマクロファージが活性化した指標としての血清ＩＡＰの誘導も認められ、これもＢＣＧやＯＫ−４３２と同じ挙動である。
【００４３】
以上の結果をまとめると、８７８Ｒの抗腫瘍活性の詳細なメカニズムは後の研究にまかせねばならないが、現時点では一応次のように考えられる。
【００４４】
すなわち、乳酸桿菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ８７８Ｒを原発腫瘍内に投与すると、ＮＣＦが誘導され好中球が浸潤し、更に好中球、マクロファージが活性化してＩＡＰが誘導され、右側原発腫瘍が退縮に働く。
次に活性化マクロファージと腫瘍細胞との反応によりＩＬ−１が産生され、脾臓中に抗腫瘍作用を持ったリンパ球が誘導される。このリンパ球が血流を介して左側遠隔腫瘍に達すると腫瘍細胞を認識し、遠隔腫瘍の増殖を抑制するものと考えられる。
【００４５】
更に本発明において特徴的なことは８７８Ｒ株腫瘍内投与に飼料による経口投与を加えることにより抗腫瘍効果が増強されることで、このことは担子菌製剤ＰＳＫの腫瘍内投与にＰＳＫの経口投与を併用すると切除免疫を増強することや手術前に腫瘍内投与し、手術後経口投与しておくと、再接種腫瘍の増殖を有意に抑制することと符合する。
【００４６】
すなわち、８７８Ｒ株を一度腫瘍内に投与しておくとマクロファージ・リンパ球系が記憶しており、経口投与により腸管内のマクロファージに８７８Ｒ株が取り込まれることによりマクロファージの認識記憶機構が働き、活性化し、抗腫瘍効果の増強に働くものと思われる。すなわち、８７８Ｒ株は宿主の免疫増強作用を持った抗腫瘍薬剤となることを示したもので、今後更にその作用機作の詳細な解明が期待される。
【００４７】
【発明の効果】
本発明に係る免疫賦活組成物は、ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカスに属する菌株の中から特に抗腫瘍作用の高い菌株を選択し、これを有効成分とするものである。抗腫瘍作用は、経口的に投与された場合にも認められ、更に、菌体そのものが各種免疫賦活活性を有することも確認されているので、本免疫賦活剤は薬剤の形態で用いることはもちろん、それ以外に発酵乳などの食品の形態で生体に投与されれば、腫瘍に関する疾病の予防および治療に対して著しい効果を発揮するものである。
【００４８】
また本発明に係る免疫賦活組成物は、局所投与といった非経口投与と経口投与とを併用することにより、更にすぐれた抗腫瘍効果を奏するという卓越した特徴も有するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ８７８Ｒ菌体で免疫した脾細胞の抗腫瘍作用を示す。
【図２】同菌体の皮内投与後の血清ＩＡＰの産生を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to an immunostimulatory composition comprising a bacterial body of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus 878R as an active ingredient. The immunostimulatory composition of the present invention has actions such as mitogenic activity, antitumor activity, and T cell proliferation activity, and is useful as a medicine, nutritional food, food for specified health use, and other food and drink.
[0002]
Although the composition according to the present invention exhibits excellent antitumor activity, it exhibits particularly excellent effects when combined with oral administration and parenteral administration, and this composition is inherently high. As an excellent antitumor agent combined with safety, it makes a great contribution to the prevention and treatment of tumors.
[0003]
[Prior art]
Ingestion of lactic acid bacteria and fermented milk has been reported to bring various benefits in terms of health and nutrition (Satoshi Ito: New Food Industry, Vol. 33, No. 12, p39 (1991)). Among them, the antitumor action is one of the most promising properties for lactic acid bacteria and fermented milk in terms of disease prevention and treatment. However, although the host immune system intervention has been suggested for this anti-tumor effect, there are still many unclear points (CF Fernandes et al .: J. Food Prot., Vol. 53, No. 8, p704 (1990)). On the other hand, in recent years, it has been clarified that there is a large difference in the physiological activity of lactic acid bacteria as described above between bacterial species or strains (Tetsuji Hamada: New Food Industry, Vol. 32, No. 10, p9 ( 1991)), the current situation is that the anti-tumor action needs to be reviewed from this point.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made for the purpose of newly developing an immunostimulatory composition effective for the prevention and treatment of tumors and other diseases.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventors have studied from various directions, and have focused on the importance of safety as well as effectiveness as an immunostimulatory composition. Therefore, extensive studies have been conducted from the viewpoint that the immunostimulatory composition is not a chemically synthesized product and can be used as a food or drink.
[0006]
Then, paying attention to microorganisms widely used in the production of food and drink, particularly lactic acid bacteria, the present inventors conducted extensive research on the antitumor activity exhibited by lactic acid bacteria between bacterial species and strains. Lactobacillus debrueckii subsp. Bulgaricus 878R strain has particularly strong activity, and it has been found that it can be used as a very promising antitumor agent. The present invention has been completed.
[0007]
That is, the present inventors search for various lactic acid bacteria used as a starter of fermented milk using a double transplant tumor system (medical care and new drug, Vol. 28, No. 3, p44, 1991) as an index. It was.
[0008]
In this experimental system, the anti-tumor effect of BRM (biological response modifier) is related to many immune cell systems such as neutrophils, macrophages, T lymphocytes, interleukin 1 (IL-1), and interleukin 8 (IL-8). ), Which is suggested to be caused by a series of immune cascade reactions involving cytokines such as monocyte chemotactic factor (MCAF) (Takusaburo Ebina et al .: Biotherapy, Vol 5, No. 13, p1951, 1991). ). And in fact, since the growth inhibitory effect with respect to a remote recurrence tumor can be evaluated, it is thought that it is still more practical than evaluation of the antitumor effect of BRM until now.
[0009]
In this double transplanted tumor system, basidiomycete preparations PSK and the like have been found so far as substances exhibiting antitumor effects (Takuzaburo Ebina et al .: Cancer and Chemotherapy, Vol 14, No. 6, p1841, 1987). ) No studies have been conducted on lactic acid bacteria.
[0010]
Thus, as a result of reconsidering the antitumor effect of a series of lactic acid bacteria, it was found that one strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus has strong antitumor activity. Furthermore, it was confirmed that the antitumor action of this strain was effective even by oral administration, and that the cells themselves had mitogenic activity and T cell proliferation activity, and the present invention was completed.
[0011]
That is, the present invention has a basic technical idea of an immunostimulatory composition containing the Lactobacillus delbrikki subsp. Bulgaricus 878R strain (hereinafter sometimes referred to as 878R to 878R strain).
[0012]
The cells of Lactobacillus delbrikki subsp. Bulgaricus 878R strain used in the immunostimulatory composition according to the present invention may be either live or dead, and a culture method and cell separation for obtaining raw material cells There are no restrictions on the law. In addition to purely isolated cells (regardless of dry cells or wet cells), the cells contain cells (cultured products, suspensions, yoghurt-containing foods and drinks and other cells) And processed products (concentrated, dried, pasted, or inversely diluted, various processed products such as ultrasonic and high pressure fracture processed).
[0013]
The immunostimulatory composition according to the present invention uses the 878R strain, its inclusions and / or its processed products as active ingredients, is formulated into various dosage forms using commonly used formulation adjuvants, and is used as a pharmaceutical type In particular, in the present invention, since it has been confirmed that it can be administered orally in addition to parenteral administration, it can be formulated into a pharmaceutical for oral administration and is extremely useful. In that case, since the 878R strain is also used as a starter for fermented foods such as yogurt, there is no problem with regard to safety. Safety is also proved from the examples described later. In fact, as a result of a 10-day acute toxicity test using mice, no death was observed even after oral administration of 1000 mg / kg.
[0014]
When administered as a pharmaceutical, the immunostimulatory composition according to the present invention varies depending on symptoms, administration routes, and the like, but generally, in adults, per day, when administered intravenously, the bacterial cells according to Examples described later 0.01 -1000 mg, preferably 0.1-100 mg / kg, also for intramuscular administration, 0.01-1000 mg, preferably 0.1-100 mg / kg, also for oral administration, 0.5-2000 mg, preferably 1 It is good to administer within the range of -1000 mg / kg, and oral administration and parenteral administration can be used in combination.
[0015]
Since the 878R strain can achieve its intended purpose by oral administration, the immunostimulatory composition according to the present invention can be used as a food and drink product type. For that purpose, the 878R strain, its contents and / or its processed products can be made into drinks, tablets, other various food and drink types using various adjuvants and other foods and drinks, or directly added to food and drinks, Alternatively, various methods can be used such as using this as a starter to make yogurt and using it as a fermented food. Since the composition of the present invention in the form of food and drink as described above can be ingested over a long period of time, in addition to normal food and drink, food for specified health use for the purpose of preventing tumors and preventing recurrence. It can be used as a nutrient, health food, etc.
[0016]
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus 878R, which is a bacterium used in the present invention, is supplied by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (presently, Biotechnology Institute of Technology) 125 No. (FERM BP-125) and is used effectively. In the column of the display for identification given by the depositor in this deposit, Lactobacillus bulgaricus No. Although 878-R is displayed, the classification of this bacterium has been revised, and as described above, Lactobacillus delbrueckisubsp. bulgaricus (BERGEY'S MANUAL OF Systemic Bacteriology, volume 2, p1219-1220).
[0017]
The mycological properties of Lactobacillus delbrikki subspecies Bulgaricus 878R are as follows.
Morphology Bacilli that grow well on BL agar, sometimes in the form of long rods, form a single layer in young, vigorous cultures. Colonies presenting granules with methylene blue staining White to light gray, usually rough, 1 to 3 mm diameter growth environment Anaerobic or facultative anaerobic growth temperature No growth at 15 ° C, even at 45 ° C or 50-52 ° C Growing milk culture Coagulation: Final lactate 1.6%
Catalase −
Gram staining +
Utilization of sugar: (No gas is generated)
Amygdalin −
Cellobiose −
Fructose +
Galactose +
Glucose +
Lactose +
Maltose −
Mannose −
Salicin −
Saccharose −
Trehalose −
Esculin −
Optical rotation of lactic acid D (-)
[0018]
Examples of the present invention are shown below.
[0019]
[Example 1]
Lactobacillus helveticus 806 (hereinafter abbreviated as 806), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 878R (hereinafter abbreviated as 878R. FERM BP-125), 2038 (hereinafter abbreviated as 2038), and Streptococcus salivarius subsp. Each cell of thermophilus 1131 (hereinafter abbreviated as 1131) was inoculated into a liquid medium obtained by removing agar and horse blood from an EG agar medium, and cultured at a temperature of 37 ° C. for 24 hours. After culturing, the cells were collected and washed (saline) to prepare a cell suspension 5 × 10 ^{9 /} ml (pH 7.0 sterile phosphate buffer).
[0020]
BALB / c mice (7 weeks old, male: Funabashi Farm Co., Ltd.) were used as mice, and Meth-A fibroblastoma cells syngeneic with BALB / c mice were inoculated subcutaneously as tumors. The anti-tumor action of the lactic acid bacteria preparation obtained above was examined using a double transplant tumor system (Takusaburo Ebina: Diagnosis and New Drug, Vol. 28, No. 3, p44, 1991). (The above method of Example 1 was similarly carried out in Example 2 and below.)
[0021]
That is, 106 ⁶ Meth-A cells were transplanted simultaneously into the right flank of BALB / c mice and 2 × 10 ⁵ meth-A cells into the left flank, and the large tumor on the right (assumed to be the primary lesion) was touched with a finger. From the third day, the tumor was treated by administering the lactic acid bacteria preparation into the tumor for 3 days, and the regression of the left untreated tumor (assuming metastasis) was observed.
[0022]
Evaluation of the antitumor effect was carried out by measuring the tumor diameter on a daily basis after tumor inoculation, representing the size of the tumor with √ (major axis × minor axis) (mm), and judging with the tumor weight (g) on the 21st day. . An x ² test was performed for comparison of the cure rate, and a t test was performed for comparison of tumor size and tumor weight. The obtained results are shown in Table 1 below.
[0023]
[Table 1]

[0024]
As is apparent from the above results, 0.5 mg of each of the four types of lactic acid bacteria preparations was administered to the right tumor three times from the third day to the third, fourth, and fifth days after tumor implantation. In most cases, healed and a marked antitumor effect was observed. On the other hand, in the left tumor, suppression of tumor growth was observed in strains 806 and 878R. That is, both lactobacilli were found to have an immunostimulatory effect. As a control, the same amount of sterile physiological saline was administered for 3 days.
[0025]
[Example 2]
The pelleted diet prepared by adding 2% each of the lactic acid bacteria preparations to the mouse feed F2 (Funabashi Farm Co., Ltd.) to the double transplanted tumor system described in Example 1 was given to the ad lib, and its antitumor effect was demonstrated. Compared. As a control, mouse feed F2 itself was given. The obtained results are shown in Table 2 below.
[0026]
[Table 2]

[0027]
As is clear from the above results, only the 878R strain had an antitumor effect on the left and right tumors. From the above results, the 878R strain was considered to be the most interesting lactobacilli, because the right tumor was cured by intratumoral administration, the growth of the left tumor was inhibited, and the antitumor effect by oral administration (by feed) was observed.
[0028]
[Example 3]
The following confirmation was further performed on the 878R strain, which was proved by the above to have the best antitumor effect.
[0029]
(1) Dose response of anti-tumor effect In the double transplant tumor system, the dose response of the 878R formulation was investigated and the results in Table 3 below were obtained.
[0030]
[Table 3]

[0031]
As is clear from the above results, the 878R preparation was most effective when administered 0.5 mg three times, and a remarkable antitumor effect on left and right tumors was observed even when administered 0.05 mg three times. The above results were confirmed to be a promising antitumor agent since it was effective even at a concentration of 1/100 compared with the most effective basidiomycete preparation PSK in BRM examined so far. Clarified the mechanism of action.
[0032]
(2) In an adoptive immune cell transfer double transplant tumor system, 878R strain immune spleen cells were collected in order to analyze the mechanism of healing to the left tumor by three administrations of 0.05 mg of 878R preparation into the right tumor. Adoptive transfer experiments were conducted in which 2 × 10 ⁷ cells were administered into the tumor of another mouse. That is, the spleen cells of mice on day 14 of tumor bearing were collected, and 2 × 10 ⁷ cells were injected into Meth-A tumor on day 3 with 2 mg / cyclophosphamide (CY) that suppresses the function of suppressor T cells. An experiment of an adhesive transfer that was transferred one hour after injection was performed. The obtained results are shown in Table 4 below and FIG.
[0033]
[Table 4]

[0034]
As is clear from the above results, complete healing was confirmed in 5 out of 6 mice. Since spleen cells of normal mice have no antitumor effect, it was confirmed that lymphocytes having the ability to kill Meth-A tumors were increased in spleen cells by administration of the 878R preparation.
[0035]
(3) Production of NCF and MCF in the tumor tissue In order to examine what happens in the left and right tumors of the double transplant tumor system by administration of the 878R strain, the tumor tissue on the first day after administration of the 878R preparation They were collected and cultured in RPMI medium supplemented with 10% fetal bovine serum for 24 hours, and NCF (neutrophil chemotactic factor) and MCF (macrophage chemotactic factor) activities of the culture supernatant were measured.
[0036]
That is, these chemotaxis activities were measured with a chemotaxel (Kurabo) using a 24-well microplate. For NCF (neutrophil chemotactic factor) activity, neutrophils in peritoneal exudate cells (PEC) of mice inoculated intraperitoneally with 1 ml of 3% protease peptide were used as target cells for 14 hours. For the MCF (macrophage chemotactic factor) activity, macrophages in PEC of mice inoculated intraperitoneally with 1 ml of 3% thioglycolate 3 days ago as target cells were used.
[0037]
In the method, the culture supernatant of left and right tumor tissues was put in 500 μl in the outer cylinder of a 24-well microplate, 2 × 10 ⁵ PECs were put in 200 μl in the inner cylinder, and cultured in a CO ₂ incubator for 90 minutes to 3 hours. The numbers of neutrophils and macrophages that had migrated through the 5 μm filter at the bottom of the inner cylinder were calculated by May-Giemsa staining with a 400 to 1,000 times oil immersion microscope. The obtained results are shown in Table 5 below.
[0038]
[Table 5]

[0039]
As is apparent from the above, it was confirmed that NCF activity was significantly increased in the right tumor by administration of the 878R preparation into the right tumor, and that NCF production was triggered by the following immune cascade reaction.
[0040]
(4) Induction of serum IAP When the 878R preparation was intradermally injected into BALB / c mice, the serum IAP (immunosuppressive acidic protein) value was measured using the single radial immunodiffusion (SRID) method. The results are shown in FIG.
[0041]
As described above, it was sufficiently suggested that NCF was induced by administration of the 878R strain, so that neutrophils infiltrated into the tumor and induced an antitumor effect. The production of immunosuppressive acidic protein IAP, which is known to be produced, was examined. As a result of examining the serum IAP level when 0.05 mg of the 878R preparation was administered intradermally for 3 days, a transient increase in the IAP value was observed as shown in FIG.
[0042]
[Action]
As is clear from the above, the antitumor effect of the Lactobacillus 878R strain used in the present invention showed the same results as BCG and OK-432, which are bacterial preparations. In addition, from the measurement results of NCF and MCF inducibility, NCF activity was induced in the right tumor, and this result was exactly the same as BCG. Furthermore, induction of serum IAP as an index of activation of neutrophils and macrophages was also observed, which is the same behavior as BCG and OK-432.
[0043]
To summarize the above results, the detailed mechanism of the antitumor activity of 878R must be left to later studies, but at the present time, it is considered as follows.
[0044]
That is, Lactobacillus Lactobacillus delbrueckii subsp. When Bulgaricus 878R is administered into the primary tumor, NCF is induced and neutrophils infiltrate, and neutrophils and macrophages are activated to induce IAP, causing the right primary tumor to regress.
Next, IL-1 is produced by the reaction between activated macrophages and tumor cells, and lymphocytes having antitumor action are induced in the spleen. When this lymphocyte reaches the left distant tumor via the bloodstream, it is thought that it recognizes tumor cells and suppresses the growth of the distant tumor.
[0045]
Further, the present invention is characterized in that the antitumor effect is enhanced by adding oral administration by feed to 878R strain intratumoral administration, which means that oral administration of PSK to intratumoral administration of basidiomycete preparation PSK. When used in combination, enhancing excision immunity, intra-tumor administration before surgery, and oral administration after surgery are consistent with significantly inhibiting the growth of re-inoculated tumors.
[0046]
That is, once the 878 R strain is administered into the tumor, the macrophage / lymphocyte system is memorized, and when the 878 R strain is taken into the macrophages in the intestinal tract by oral administration, the macrophage recognition and memory mechanism works, It seems to be activated and work to enhance the antitumor effect. In other words, the 878 R strain has been shown to be an antitumor drug having a host immunity enhancing action, and further detailed elucidation of its action mechanism is expected in the future.
[0047]
【The invention's effect】
The immunostimulatory composition according to the present invention selects a strain having a particularly high antitumor action from among strains belonging to Lactobacillus delbrikki subsp. Bulgaricus and uses this as an active ingredient. The antitumor action is also observed when administered orally, and since it has also been confirmed that the cells themselves have various immunostimulatory activities, the immunostimulant can of course be used in the form of a drug. In addition, if administered to a living body in the form of food such as fermented milk, it exerts a remarkable effect on the prevention and treatment of diseases related to tumors.
[0048]
In addition, the immunostimulatory composition according to the present invention also has an excellent feature that an excellent antitumor effect is exhibited by combining parenteral administration such as topical administration and oral administration.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 Lactobacillus delbrueckii subsp. The antitumor effect | action of the spleen cell immunized with bulgaricus 878R microbial cell is shown.
FIG. 2 shows the production of serum IAP after intradermal administration of the same cells.

Claims

(1) Lactobacillus debrucicki subsp. Bulgaricus (Lactobacillus delbruecki subsp. Bulgaricus) 878R (Accession No. FERM BP-125) and (2) Administration site by combining oral administration and parenteral administration An antitumor agent characterized by retreating not only tumors but also distant tumors.

The antitumor agent according to claim 1, wherein parenteral administration is intratumoral administration.

(1) Lactobacillus debrucicki subsp. Bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) 878R (Accession No. FERM BP-125) and (2) only the tumor at the administration site by three or more parenteral administration An antitumor agent characterized by reducing remote tumors as well.

The antitumor agent according to claim 3, wherein the parenteral administration is intratumoral administration.