JP3994070B2 - Recombinant production of new polyketides - Google Patents

Description

を有するポリケチド化合物に関し、
ここで、
Ｒ^１は、水素および低級アルキルからなる群より選択され、そしてＲ^２は、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択され、あるいはＲ^１およびＲ^２は、任意に１個〜４個のヒドロキシル基または低級アルキル基で置換される低級アルキレン架橋を一緒に形成する；
Ｒ^３およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される；
Ｒ^４は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される；
Ｒ^６は、ハロゲン、低級アルキル、および−ＣＨＲ^７−（ＣＯ）Ｒ^８からなる群より選択され、ここで、Ｒ^７およびＲ^８は、独立して、水素および低級アルキルからなる群より選択される；そして
ｉは、１、２、または３である、ポリケチド化合物である。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１が低級アルキルであり；Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^５が水素であり；Ｒ^６が−ＣＨＲ^７−（ＣＯ）−Ｒ^８であり；そしてｉが０である、上記化合物である。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１がメチルであり、そしてＲ^６が−ＣＨ_２−（ＣＯ）−ＣＨ_３である、上記化合物である。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１およびＲ^６が低級アルキルであり；Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^５が水素であり；そしてｉが０である、上記化合物である。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１およびＲ^６がメチルである、上記化合物である。
【００４８】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１およびＲ^２が、一緒に連結して、低級アルキレン架橋−ＣＨＲ^９−ＣＨＲ^１０を形成し、ここで、Ｒ^９およびＲ^１０は、独立して、水素、ヒドロキシル、および低級アルキルからなる群より選択される、上記化合物である。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１およびＲ^２が、一緒に連結して、低級アルキレン架橋−ＣＨ_２−ＣＨＯＨ−を形成する、上記化合物である。
【００５０】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^３およびＲ^５が水素であり；そしてｉが０である、上記化合物である。
【００５１】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^６が−ＣＨＲ^７−（ＣＯ）−Ｒ^８であり、ここで、Ｒ^８は水素または低級アルキルである、上記化合物である。
【００５２】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^６が−ＣＨ_２−（ＣＯ）−ＣＨ_３である、上記化合物である。
【００５３】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^６が低級アルキルである、上記化合物である。
【００５４】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^６がメチルである、上記化合物である。
【００５５】
１つの局面において、本発明は、以下の構造：
【００５６】
【化１３】

を有する酵素結合ケチドの触媒環化により形成されるポリケチド化合物に関し、ここで、
Ｒ^１１は、メチルおよび−ＣＯＣＨ_３からなる群より選択される；
Ｒ^１２は、−Ｓ−Ｅおよび−（ＣＯ）−Ｓ−Ｅからなる群より選択される；そして
Ｅは、請求項８の遺伝子操作した細胞により産生されるポリケチドシンターゼを表す、ポリケチド化合物である。
【００５７】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１１がメチルであり、そしてＲ^１２が−Ｓ−Ｅである、上記化合物である。
【００５８】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１１がメチルであり、そしてＲ^１２が−（ＣＯ）−Ｓ−Ｅである、上記化合物である。
【００５９】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１１が−ＣＯＣＨ_３であり、そしてＲ^１２が−（ＣＯ）−Ｓ−Ｅである、上記化合物である。
【００６０】
１つの局面において、本発明は、芳香族ポリケチドを生産する方法であって、以下の構造：
【００６１】
【化１４】

を有する酵素結合ケチドの環化を行う工程を包含する方法に関し、
ここで、
Ｒ^１１は、メチルおよび−ＣＯＣＨ_３からなる群より選択される；
Ｒ^１２は、−Ｓ−Ｅおよび−（ＣＯ）−Ｓ−Ｅからなる群より選択される；そして
Ｅは、請求項８の遺伝子操作した細胞により産生されるポリケチドシンターゼを表し、ここで環化はこのポリケチドシンターゼにより誘導される、方法である。
【００６２】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１１がメチルであり、そしてＲ^１２が−Ｓ−Ｅである、上記方法である。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１１がメチルであり、そしてＲ^１２が−（ＣＯ）−Ｓ−Ｅである、上記方法である。
【００６４】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^１１が−ＣＯＣＨ_３であり、そしてＲ^１２が−（ＣＯ）−Ｓ−Ｅである、上記方法である。
【００６５】
１つの局面において、本発明は、以下の構造式：
【００６６】
【化１５】

を有するポリケチド化合物に関し、
ここで、
Ｒ^２部分は、独立して、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択される；
Ｒ^４は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される；そして
ｉは、０、１または２である、ポリケチド化合物である。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^２が水素であり、そしてｉが０である、上記化合物である。
【００６８】
１つの局面において、本発明は、以下の構造式：
【００６９】
【化１６】

を有するポリケチド化合物に関し、
ここで、
Ｒ^２部分は、独立して、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択される；
Ｒ^４は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される；そして
ｉは、０、１または２である、ポリケチド化合物である。
【００７０】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^２が水素であり、そしてｉが０である、上記化合物である。
【００７１】
１つの局面において、本発明は、以下の構造式：
【００７２】
【化１７】

を有するポリケチド化合物に関し、
ここで、
Ｒ^２部分は、独立して、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択される；
Ｒ^４は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される；そして
ｉは、０、１または２である、ポリケチド化合物である。
【００７３】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｒ^２が水素であり、そしてｉが０である、上記化合物である。
【００７４】
１つの局面において、本発明は、以下の構造式：
【００７５】
【化１８】

を有するポリケチド化合物に関する。
【００７６】
１つの局面において、本発明は、以下の構造式：
【００７７】
【化１９】

を有するポリケチド化合物に関する。
【００７８】
１つの局面において、本発明は、以下の構造式：
【００７９】
【化２０】

を有するポリケチド化合物に関する。
【００８０】
【発明の実施の形態】
（発明の要旨）
本発明は、新規ポリケチド、ならびに組換え技術を用いて新しいポリケチドおよび公知のポリケチドの両方を効果的に産生する新規な方法を提供する。さらに特定すると、新規な宿主−ベクター系を用いて、種々のポリケチドの産生を触媒するＰＫＳもまた作製する。このようなポリケチドは、抗生物質、抗腫瘍剤、免疫抑制剤として、および広範な他の薬理学的目的に有用である。
【００８１】
従って、１つの実施態様においては、本発明は、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子クラスターをそのネイティブの非形質転換の状態で発現する、遺伝子操作した細胞に関し、この遺伝子操作した細胞は、実質的にネイティブなＰＫＳ遺伝子クラスター全てを欠いている。
【００８２】
他の実施態様においては、本発明は、上記遺伝子操作した細胞に関し、ここで、この細胞は、
（ａ）ポリケチドの合成を触媒し得るＰＫＳをコードする、置換ＰＫＳ遺伝子クラスター；および
（ｂ）このＰＫＳ遺伝子クラスターと作動可能に連結される１つまたはそれ以上の制御配列であって、これにより、この遺伝子クラスター中の遺伝子は、この遺伝子操作した細胞内で転写および翻訳され得る、制御配列、
但し、この置換ＰＫＳ遺伝子クラスターが全ＰＫＳ遺伝子セットを含むときには、少なくとも１つのＰＫＳ遺伝子または制御要素は、この細胞とは異種である。
【００８３】
特に好ましい実施態様においては、遺伝子操作される細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒであり、この細胞は、実質的にネイティブなアクチノロジンＰＫＳ遺伝子クラスター全体を欠き、そして置換ＰＫＳ遺伝子クラスターは、ＰＫＳケトシンターゼおよびＰＫＳアシルトランスフェラーゼの活性部位（ＫＳ／ＡＴ）をコードする第１の遺伝子、ＰＫＳ鎖長決定因子（ＣＬＦ）をコードする第２の遺伝子、およびＰＫＳアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）をコードする第３の遺伝子を含む。
【００８４】
他の実施態様においては、本発明は、組換えポリケチドを産生するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）上記の細胞の集団を提供する工程；および
（ｂ）この細胞に存在する置換ＰＫＳ遺伝子クラスターが発現される条件下で、細胞の集団を培養する工程。
【００８５】
さらに他の実施態様においては、本発明は、組換えポリケチドを産生するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ．置換ＰＫＳ遺伝子クラスターの第１の部分をドナープラスミドに挿入し、そして置換ＰＫＳ遺伝子クラスターの第２の部分を受容体プラスミドに挿入する工程であって、ここで、この第１および第２の部分は、完全な置換ＰＫＳ遺伝子クラスターを集合的にコードし、さらにここで：
ｉ．このドナープラスミドは、第１の選択マーカーをコードし、第１の許容温度で複製し得、そして第２の非許容温度で複製し得ない遺伝子を発現する；
ｉｉ．この受容体プラスミドは、第２の選択マーカーをコードする遺伝子を発現する；そして
ｉｉｉ．このドナープラスミドは、相同組換えが置換ＰＫＳ遺伝子クラスターの第１の部分と置換遺伝子クラスターの第２の部分との間に起こり得るように、受容体プラスミド中のＤＮＡ領域と相補的なＤＮＡの領域を含み、これにより、完全な置換遺伝子クラスターが産生され得る、工程；
ｂ．このドナープラスミドおよび受容体プラスミドを宿主細胞に形質転換させ、そして第１の許容温度ならびに第１および／または第２の選択マーカーを発現する宿主細胞を成長させる条件下で、形質転換された宿主細胞を培養して、細胞の第１の集団を産生する工程；
ｃ．第２の非許容温度ならびに第１および／または第２の選択マーカーを発現する宿主細胞を成長させる条件下で、この細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を産生する工程であって、この細胞は、完全なＰＫＳ置換遺伝子クラスターを含む組換えプラスミドを含有する宿主細胞を包含する、工程；
ｄ．細胞の第２の集団由来の組換えプラスミドを、請求項１の遺伝子操作した細胞に移入して、形質転換され、遺伝子操作した細胞を産生する工程；および
ｅ．この形質転換され、遺伝子操作した細胞を、細胞中に存在する置換ＰＫＳ遺伝子クラスターが発現される条件下で培養する工程。
【００８６】
さらに他の実施態様においては、本発明は、構造式（Ｉ）を有するポリケチド化合物に関する：
【００８７】
【化２１】

ここで、
Ｒ^１は、水素および低級アルキルからなる群より選択され、そしてＲ^２は、水素、低級アルキルおよび低級アルキルエステルからなる群より選択され、あるいはＲ^１およびＲ^２は、１個〜４個のヒドロキシル基または低級アルキル基で任意に置換される低級アルキレン架橋を一緒に形成する；
Ｒ^３およびＲ^５は、独立して、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノおよびニトロからなる群より選択される；
Ｒ^４は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノおよびニトロからなる群より選択される；
Ｒ^６は、水素、低級アルキル、および−ＣＨＲ^７−（ＣＯ）Ｒ^８からなる群より選択され、ここで、Ｒ^７およびＲ^８は、独立して、水素および低級アルキルからなる群より選択される；そして
ｉは、１、２、または３である。
【００８８】
他の実施態様においては、本発明は、以下の構造を有する新規ポリケチドに関する：
【００８９】
【化２２】

【００９０】
【化２３】

他の実施態様においては、本発明は、構造（ＩＩ）を有する酵素結合ケチドの触媒環化により形成される化合物ポリケチドに関する：
【００９１】
【化２４】

ここで、
Ｒ^１１は、メチル、−ＣＨ_２（ＣＯ）ＣＨ_３および−ＣＨ_２（ＣＯ）ＣＨ_２（ＣＯ）ＣＨ_３からなる群より選択される；
Ｒ^１２は、−Ｓ−Ｅおよび−ＣＨ_２（ＣＯ）−Ｓ−Ｅからなる群より選択され、ここで、Ｅは、上記遺伝子操作した細胞により産生されるポリケチドシンターゼを表す；そして、
Ｒ^１３およびＲ^１４の一方は、水素であり、そして他方は、ヒドロキシルであり、またはＲ^１３およびＲ^１４は共に、カルボニルを表す。
【００９２】
さらに他の実施態様においては、本発明は、芳香族ポリケチドを生成する方法に関し、この方法は、構造（ＩＩ）を有する酵素結合ケチドの環化を行う工程を包含し、ここで、環化はポリケチドシンターゼにより誘導される。
【００９３】
さらなる実施態様においては、本発明は、構造式（ＩＩＩ）を有するポリケチド化合物に関する：
【００９４】
【化２５】

ここで、Ｒ^２およびＲ^４は、上記で定義されたものと同じであり、そしてｉは、０、１または２である。
【００９５】
他の実施態様においては、本発明は、構造式（ＩＶ）を有するポリケチド化合物に関する：
【００９６】
【化２６】

ここで、Ｒ^２、Ｒ^４およびｉは、構造式（ＩＩＩ）についての上記定義と同じである。
【００９７】
さらに他の実施態様においては、本発明は、構造式（Ｖ）を有するポリケチド化合物に関する：
【００９８】
【化２７】

ここで、Ｒ^２、Ｒ^４およびｉは、構造式（ＩＩＩ）について上記で定義されたものと同じである。
【００９９】
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を考慮すると、当業者が容易に行い得るであろう。
【０１００】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に指示がない限り、化学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の当該分野内で慣用の方法を利用する。このような技術は、文献に十分に開示されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（最新版）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、最新版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、最新版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、最新版）を参照のこと。
【０１０１】
前出または後出とは関係なく、本明細書中で引用されている全ての出版物、特許および特許出願は、その全体が本明細書中で参考として援用されている。
【０１０２】
本明細書および添付の請求の範囲で用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈にて他に明らかに指示がない限り、複数形を包含する。それゆえ、例えば、「ポリケチド（ａ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）」との表示は、ポリケチドの混合物を包含し、「ポリケチドシンターゼ（ａ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）」との表示は、ポリケチドシンターゼの混合物を包含する。
【０１０３】
（Ａ．定義）
本発明を記載する際に、次の用語が使用され、そして以下に示すように定義されることが意図される。
【０１０４】
「置換ＰＫＳ遺伝子クラスター」とは、それと共に形質転換された宿主細胞において、以下に定義される１つまたはそれ以上の適合性制御要素の支配下にある場合に、機能性ＰＫＳを産生し得るＰＫＳ遺伝子のあらゆるセットを意味する。機能性ＰＫＳは、ポリケチドの合成を触媒するものである。用語「置換ＰＫＳ遺伝子クラスター」とは、１つまたはそれ以上の、ポリケチドの産生を触媒するために必要とされる種々のタンパク質をコードする遺伝子を含む。「置換ＰＫＳ遺伝子クラスター」は、対応する天然クラスターに見出される全ての遺伝子を包含する必要はない。むしろ、この遺伝子クラスターは、活性ポリケチドの産生を触媒するために必要なＰＫＳ成分をコードすることのみが必要である。それゆえ、以下にさらに説明されるように、この遺伝子クラスターが、例えば、ネイティブ状態で８個の遺伝子を包含し、そしてこれらの遺伝子のうち３個のみが活性ポリケチドを提供するのに必要ならば、これらの３個の遺伝子のみの存在が必要である。さらに、このクラスターは、単一種由来のＰＫＳ遺伝子を包含し得るか、または事実上、例えば、他のポリケチドの合成のためのクラスター由来の対応する遺伝子で置換される、特定のポリケチドの合成のためのクラスター由来の遺伝子を有するハイブリッドであり得る。ハイブリッドクラスターは、タイプＩ ＰＫＳおよびタイプＩＩ ＰＫＳの両方に由来する遺伝子を包含し得る。上記のように、タイプＩ ＰＫＳは、いくかの大型の多機能タンパク質を包含し、これらの間には、炭素鎖のアセンブリおよび修飾の各工程のための別々の活性部位のセットを有する。他方、タイプＩＩ ＰＫＳは、反復して使用される活性部位の単一のセットを有する。これらの分類は周知である。例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．およびＫｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ：ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（１９９２）Ｗｉｌｅｙ Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ（Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １７１）８８−１１２頁；Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８９）８：２７２７；Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８９）８：２７１７；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：１９２７８）；Ｃｏｒｔｅｓ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：１７６；Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２：６７５；ＭａｃＮｅｉｌ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ（１９９２）１１５：１１９。ハイブリッドクラスターは、ここで例示され、そして以下にさらに記載される。遺伝子クラスターに含まれる遺伝子はネイティブな遺伝子である必要はないが、これらの変異体またはアナログであり得る。変異体またはアナログは、コーディング配列の１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により調製され得る。ヌクレオチド配列を改変する技術（例えば、部位特異的変異誘発）は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，第ＩおよびＩＩ巻、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， 前出に記載されている。
【０１０５】
「置換ＰＫＳ遺伝子クラスター」はまた、ＰＫＳにより触媒されるコアポリケチドへの改変をコードする遺伝子を含有し得、これらの遺伝子には、例えば、ヒドロキシラーゼ、メチラーゼまたは他のアルキラーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、グリコトランスフェラーゼ、リアーゼ、エステルシンターゼまたはアミドシンターゼ、および種々のヒドロラーゼ（例えば、エステラーゼおよびアミダーゼ）をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１０６】
以下にさらに説明されるように、置換遺伝子クラスターに含まれる遺伝子は、同じプラスミドに存在する必要がないか、または同じプラスミドに存在するならば、同じまたは異なる制御配列により制御され得る。
【０１０７】
「遺伝子操作した宿主細胞」とは、ネイティブなＰＫＳ遺伝子クラスターが組換えＤＮＡ技術を用いることによって欠失した宿主細胞を意味する。それゆえ、この用語は、自然に起こる変異事象を包含しない。「宿主細胞」は、単細胞統一体として培養される原核微生物または真核細胞株由来の細胞であり、これは、本発明のＰＫＳ遺伝子クラスターを持つ組換えベクターの受容体として使用され得るか、または使用されてきた。この用語は、トランスフェクトされたもとの細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、偶発的または故意の変異のため、その形態学またはゲノムＤＮＡもしくは全ＤＮＡ補体が、必ずしも元の親細胞と完全に同一であり得ないことが理解される。関連の特性（例えば、所望のＰＫＳをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴づけられる親細胞と十分に類似するこの親細胞の子孫は、この定義に含まれ、そして上記用語によりカバーされる。
【０１０８】
用語「異種の」は、これがコーディング配列および制御配列のような核酸配列に関する場合には、通常なら組換え構築物の領域と会合しない配列、および／または、通常なら特定の細胞と会合しない配列を示す。それゆえ、核酸構築物の「異種の」領域は、他の分子と天然に会合している状態で見出されていない他の核酸分子内で、あるいは結合されている核酸の同定可能なセグメントである。例えば、構築物の異種の領域は、コーディング配列と天然に会合している状態で見出されていない配列により隣接されるコーディング配列を包含し得る。異種のコーディング配列の他の例は、このコーディング配列自体（例えば、ネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）が自然には見出されない構築物である。同様に、宿主細胞に通常存在しない構築物で形質転換された宿主細胞は、本発明の目的のための異種であると考えられる。本明細書中で使用されるように、アレル変異または天然に起こる変異事象は、異種ＤＮＡを生成しない。
【０１０９】
「コーディング配列」または特定のＰＫＳを「コードする」配列は、インビトロまたはインビボで、適切な調節配列の制御下に置かれるときに、ポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、そして翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーディング配列は、原核ｍＲＮＡまたは真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核ＤＮＡまたは真核ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえを包含し得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コーディング配列の３’に位置する。
【０１１０】
「核酸」配列は、原核配列、真核ｍＲＮＡ、真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえ包含し得るが、これらに限定されない。この用語はまた、任意のＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基アナログを含む配列を包含する。これらの塩基アナログには、例えば、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（β−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コーディング配列の３’に位置する。
【０１１１】
ＤＮＡ「制御配列」とは、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどを集合的に意味し、これらは、宿主細胞において、コーディング配列の転写および翻訳を集合的に提供する。所望の遺伝子が転写かつ翻訳され得る限り、これらの制御配列の全ては必ずしも組換えベクターに存在する必要がない。
【０１１２】
「作動可能に連結される」とは、要素の配置を意味し、ここで、このように記載される成分がこれらの通常の機能を果たすように配置される。それゆえ、コーディング配列に作動可能に連結される制御配列は、このコーディング配列の発現を行い得る。制御配列は、これらがその発現に直接作用する限り、コーディング配列と隣接する必要はない。それゆえ、例えば、翻訳されていないが転写はされた介在配列がプロモーター配列とコーディング配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コーディング配列に「作動可能に連結されている」と考えられ得る。
【０１１３】
「選択マーカー」とは、マーカーをそのゲノムに持つ細胞の集団を選択するために使用され得る任意の遺伝的マーカーを意味する。選択マーカーの例には、栄養要求性マーカー（このマーカーにより、細胞が、栄養分または補充物（例えば、チミジン、ジアミノピメリン酸またはビオチン）を有するかまたは有しない最少培地で成長する能力により選択される）；代謝マーカー（このマーカーにより、細胞が、唯一の炭素源として適切な糖を含有する最少培地で成長するその能力、あるいは適切な染料または染色基質を含有する染色コロニーを形成する細胞の能力により選択される）；および薬物耐性マーカー（このマーカーにより、細胞が、１種またはそれ以上の適切な薬物（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ストレプトマイシンまたはナリジキシン酸）を含有する培地で成長するこの能力により選択される）が挙げられる。
【０１１４】
「組換え」とは、２つのＤＮＡ分子の間のＤＮＡ配列の区分の再組立である。「相同組換え」は、各ＤＮＡ分子に存在する相同または相補的ヌクレオチド配列によってハイブリダイズする２つのＤＮＡ分子の間に起こる。
【０１１５】
本明細書中で使用される用語「アルキル」とは、１個〜２４個の炭素原子の分枝状または非分枝状の飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラエイコシルなど）を意味する。本明細書中の好ましいアルキル基は、１個〜１２個の炭素原子を含有する。用語「低級アルキル」とは、１個〜６個の炭素原子、好ましくは１個〜４個の炭素原子のアルキル基を意図する。
【０１１６】
本明細書中で使用される用語「アルキレン」とは、１個〜２４個の炭素原子を含有する二官能性の飽和の分枝状または非分枝状の炭化水素鎖を意味し、これには、例えば、メチレン（−ＣＨ_２−）、エチレン（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）、プロピレン（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）、２−メチルプロピレン［−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ）_３−ＣＨ_２−］、へキシレン［−（ＣＨ_２）_６−］などが挙げられる。「低級アルキレン」とは、１個〜６個、より好ましくは１個〜４個の炭素原子のアルキレン基を意味する。
【０１１７】
本明細書中で使用される用語「アルコキシ」とは、単一の末端エーテル結合を介して結合したアルキル基を意図する；すなわち、「アルコキシ」基は、−ＯＲとして定義され得、ここで、Ｒは先に定義されたアルキルである。「低級アルコキシ」基とは、１個〜６個、より好ましくは１個〜４個の炭素原子を含有するアルコキシ基を意図する。
【０１１８】
「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意図し、そして通常、有機化合物中の水素原子のハロ置換に関する。ハロのうち、クロロおよびフルオロが一般に好ましい。
【０１１９】
「任意の」または「任意に」とは、次に記載される事象または情況が起こり得るかまたは起こり得ないこと、および本明細書は上記事象または情況が起こる例および起こらない例を含むことを意味する。例えば、表現「任意に置換されるアルキレン」とは、アルキレン部分が置換され得るかまたは置換され得ないこと、および本明細書は未置換のアルキレンおよび置換を有するアルキレンの両方を包含することを意味する。
【０１２０】
（Ｂ．一般的方法）
本発明の中核は、新規および公知のポリケチドの両方の効果的組換え産生のための宿主−ベクター系の発見である。特に、本発明は、天然に生じるＰＫＳ遺伝子が実質的に欠失した、遺伝子操作した細胞を利用する。これらの宿主細胞は、活性ポリケチドの産生のために、種々のＰＫＳ遺伝子クラスターをコードする組換えベクターで形質転換され得る。本発明は、成長周期の適切な段階で大量の産生物の産生を提供する。このように産生されたポリケチドは、問題のポリケチドのタイプに依存して、治療剤として多くの疾患を治療するために使用され得る。例えば、本方法によって産生されたいくつかのポリケチドは、免疫抑制剤、抗腫瘍剤として、ならびにウイルス、細菌および寄生虫感染の治療のための使用が見出される。ポリケチドを組換えによって産生する能力もまた、ＰＫＳおよびそれらの作用のメカニズムを特徴づける強力な道具を提供する。
【０１２１】
より特定すると、対象のポリケチドの組換え産生のための宿主細胞は、組換えＰＫＳ遺伝子クラスターの宿主となる能力を有するいずれの生物にも由来し得る。それゆえ、本発明の宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれにも由来し得る。しかし、好ましい宿主細胞は、多くのポリケチドの大量生産者である菌糸型細菌の１クラスである放線菌から構築されるものである。本発明の系と共に使用のための特に好ましい属は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである。それゆえ、例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ａｚｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ｃｕｒａｃｏｉ、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ、Ｓ．ｇａｌｉｌａｅｕｓ、Ｓ．ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｐａｒｖｕｌｕｓ、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ、Ｓ．ｒｉｍｏｓｕｓ、Ｓ．ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ他は、本発明に都合の良い宿主細胞を提供し、中でも、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒが好ましい。（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．およびＳｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９０）２４：３７−６６；Ｏ’Ｈａｇａｎ，Ｄ．Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ（Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９１）の種々のポリケチド産生生物およびこれらの天然産生物に関する記載を参照せよ）。
【０１２２】
上記の細胞は、標準の技術（例えば、相同組換えにより）を用いて、この細胞由来の天然に生じるＰＫＳ遺伝子を欠失させることにより、遺伝子操作される。（例えば、Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）６：３２３７を参照せよ）。本明細書中で例示されるのは、遺伝子操作したＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ宿主細胞である。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのネイティブ株は、芳香族ポリケチドアクチノロジン（構造３、図５）の生合成を触媒するＰＫＳを産生する。新規な株であるＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＣＨ９９９（図２Ｃ、そして実施例に記載されている）は、相同組換えによってＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＣＨ１の染色体由来の天然ａｃｔクラスター全てを欠失させることにより構築された（Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）６：３２３７）。この株は、内因性プラスミドを欠き、そして他の着色されたＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ抗生物質であるウンデシルプロジギオシン（ｕｎｄｅｃｙｌｐｒｏｄｉｇｉｏｓｉｎ）の生合成をブロックする安定な変異を有している。
【０１２３】
上記の宿主細胞は、１つまたはそれ以上のベクターで形質転換され得、これにより、機能的なＰＫＳセットを集合的にコードする。このベクターは、ＰＫＳのサブユニットのネイティブまたはハイブリッドの組み合わせまたはその変異体を包含し得る。先に説明されたように、置換遺伝子クラスターは、完全なネイティブ遺伝子クラスターに一致する必要はなく、ポリケチドの産生を触媒する必要なＰＫＳ成分をコードすることのみが必要である。例えば、現在までに研究された各Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ芳香族ＰＫＳでは、炭素鎖アセンブリは、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の生成物を必要とする。ＯＲＦ１は、ケトシンターゼ（ＫＳ）およびアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）の活性部位（ＫＳ／ＡＴ）をコードする；本明細書中で明らかにされるように、ＯＲＦ２は、鎖長決定因子（ＣＬＦ）（ＯＲＦ１生成物と類似したタンパク質）をコードするが、ＫＳおよびＡＴのモチーフを欠く；そしてＯＲＦ３は、別のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）をコードする。いくかの遺伝子クラスターはまた、発生期のポリケチド骨格の環化に関与するケトレダクターゼ（ＫＲ）およびシクラーゼをコードする。（図１の３つのＰＫＳ遺伝子クラスターの概略的図を参照せよ）。しかし、同定可能なポリケチドを産生するためには、ＫＳ／ＡＴ、ＣＬＦ、およびＡＣＰのみが存在する必要があることが見出された。それゆえ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の芳香族ＰＫＳの場合、これらの３つの遺伝子は、ネイティブなクラスターの他の成分無しで、１つまたはそれ以上の組換えベクターに含まれて、「最小」の置換ＰＫＳ遺伝子クラスターを構成し得る。
【０１２４】
さらに、組換えベクターは、単一のＰＫＳ遺伝子クラスター由来の遺伝子を含み得るか、またはハイブリッド置換ＰＫＳ遺伝子クラスターを含有し得、例えば、このクラスターは、１つのクラスターに対する遺伝子が他の遺伝子クラスター由来の対応する遺伝子で置換されている。例えば、ＡＣＰは、産生物の構造に影響することなく、異なるシンターゼの間で容易に互いに交換し得ることが見出された。さらに、所定のＫＲは、異なる鎖長のポリケチド鎖を認識し、そして還元させ得る。従って、これらの遺伝子は、本明細書中に記載される構築物において自由に交換され得る。それゆえ、本発明の置換クラスターは、同定可能なポリケチドを産生するために最終的に機能するＰＫＳ遺伝子セットの任意の組み合わせに由来し得る。
【０１２５】
ハイブリッド置換クラスターの例には、２つまたはそれ以上のａｃｔ遺伝子クラスター、フレノリシン（ｆｒｅｎ）、グラナチシン（ｇｒａ）、テトラセノマイシン（ｔｃｍ）、６−メチルサリチル酸（６−ｍｓａｓ）、オキシテトラサイクリン（ｏｔｃ）、テトラサイクリン（ｔｅｔ）、エリスロマイシン（ｅｒｙ）、グリセウシン（ｇｒｉｓｅｕｓｉｎ）、ナナオマイシン（ｎａｎａｏｍｙｃｉｎ）、メデルマイシン（ｍｅｄｅｒｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、チロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）、カルボマイシン（ｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ）、スピラマイシン（ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）、アベルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、モネンシン（ｍｏｎｅｎｓｉｎ）、ノナクチン（ｎｏｎａｃｔｉｎ）、クラマイシン（ｃｕｒａｍｙｃｉｎ）、リファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）およびカンジシジン（ｃａｎｄｉｃｉｄｉｎ）シンターゼ遺伝子クラスター他に由来する遺伝子を有するクラスターが挙げられる。（種々のＰＫＳの議論については、例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．およびＳｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９０）２４：３７−６６；Ｏ’Ｈａｇａｎ，Ｄ．Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ（Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９１）を参照せよ）。
【０１２６】
より特定すれば、多くのハイブリッド遺伝子クラスターが本明細書で構築され、これらは、表１および２に示されるように、ａｃｔ、ｆｒｅｎ、ｔｃｍおよびｇｒａ遺伝子クラスター由来の成分を有する。いくつかのハイブリッドクラスターは、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＣＨ９９９中で、新規および公知の両ポリケチドを機能的に発現し得た（上記）。しかし、上記のように、他のハイブリッド遺伝子クラスターは、同定可能なポリケチドの産生のために、本明細書の開示を用いて容易に産生されおよびスクリーニングされ得る。例えば、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）のコレクションから、ランダムにクローン化されたＯＲＦ１および２ホモログのライブラリーが構築され得、そして同定可能なポリケチドについてスクリーニングされ得た。より長いポリケチドもまた、正確な長さの鎖を産生するＰＫＳ遺伝子クラスター由来のホモログで、例えば、ａｃｔ、ｇｒａ、ｆｒｅｎまたはｔｃｍシクラーゼ遺伝子を置き換えることにより環状化され得た。最後に、天然に生じる特定の芳香族ＰＫＳ類の間には、非酢酸塩のスターター単位についてかなりの程度の変動が存在する；従って、これらの単位もまた、遺伝子工学により新規なポリケチドを得るために使用され得る。
【０１２７】
さらに、組換えベクターは、モジュールのＰＫＳ遺伝子クラスター由来の遺伝子を含み得る。そのような遺伝子クラスターをさらに詳細に以下に記載する。
【０１２８】
上記の遺伝子クラスターを有する組換えベクターは、当該分野で公知の技術を用いて都合よく生成され得る。例えば、目的のＰＫＳサブユニットは、ＰＫＳサブユニットを発現する生物から、組換え法を用いて、例えばこの遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、またはこの遺伝子を含むことが知られているベクターからこの遺伝子を得ることにより得られ得る。次いで遺伝子は、標準の技術を用いて、単離されそしてその他の所望のＰＫＳサブユニットと組み合わされ得る。問題の遺伝子がすでに、適切な発現ベクター中に存在する場合、それは、例えば、その他のＰＫＳサブユニットとインサイチュで所望のように組み合わされ得る。目的の遺伝子はまた、クローン化よりもむしろ合成的に産生され得る。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に対する適切なコドンを用いて設計され得る。一般に、その配列が発現される目的の宿主に好適なコドンが選択される。標準的な方法により調製された重複するオリゴヌクレオチドから完全な配列がアセンブルされ、そして完全なコーディング配列にアセンブルされる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：１２９９；Ｊａｙら、（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【０１２９】
ネイティブのＰＫＳサブユニット配列に対して変異が作成され得、そしてそのような変異体は、この変異体がその他のＰＫＳサブユニットとともに機能し得、同定可能なポリケチドの合成を集合的に触媒し得る限り、ネイティブの配列の代わりに使用され得る。そのような変異は、例えば、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを調製し、そして制限エンドヌクレアーゼ消化を用いてＰＫＳサブユニットをコードする遺伝子中に変異した配列を挿入することによる従来技術を用いてネイティブな配列に作成され得る。（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）５：７８６を参照）。あるいは、変異は、ミスマッチプライマー（一般に長さ１０〜２０のヌクレオチド）を用いてなされ得、このプライマーは、ミスマッチした二本鎖の融解温度以下の温度で、ネイティブなヌクレオチド配列（一般にＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ）にハイブリダイズする。このプライマーは、プライマーの長さおよび塩基組成を比較的狭い限度内に保つことにより、および変異体塩基を中心に位置させることにより特異的に作製し得る。ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）１００：４６８。プライマー伸長は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われ、生成物はクローン化され、そしてプライマーが伸長した鎖の分離から得た変異ＤＮＡを含むクローンが選択される。選択は、ハイブリダイゼーションプローブとして変異体プライマーを用いてなされ得る。この技術はまた、複数の点変異を生成するために適用し得る。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ（１９８２）７９：６４０９を参照。ＰＣＲ変異誘発もまた、所望の変異を行うための使用を見い出すであろう。
【０１３０】
置換ＰＫＳ遺伝子クラスターを集合的にコードする遺伝子配列は、当業者に公知の方法を用いて１つまたはそれ以上の発現ベクター中に挿入され得る。発現ベクターは、所望のＰＫＳコーディング配列に作動可能に連結された制御配列を含む。本発明に使用するための適切な発現系は、真核生物宿主細胞および原核生物宿主細胞において機能する系を含む。しかし、上記で説明したように、原核生物系が好適であり、そして特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．と適合する系が特に重要である。そのような系で使用するための制御要素は、任意にオペレーター配列を含むプロモーター、およびリボソーム結合部位を含む。特に有用なプロモーターは、１つまたはそれ以上のａｃｔプロモーターのような、ＰＫＳ遺伝子クラスター由来の制御配列を含む。しかし、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）およびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーターのような、その他の細菌プロモーターもまた、本発明の構築物における使用を見い出す。さらなる例は、トリプトファン（ｔｒｐ）、βラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系、バクテリオファージλＰＬ、およびＴ５のような生合成酵素由来のプロモーター配列を含む。さらに、ｔａｃプロモーター（米国特許第４，５５１，４３３号）のような、合成のプロモーターもまた、天然には生じないが、細菌宿主細胞で機能する。
【０１３１】
他の調節配列もまた所望され得、この配列は宿主細胞の成長に相関してＰＫＳ置換配列の発現の調節を可能にする。調節配列は当業者に公知であり、そしてこの例としては、遺伝子の発現を、化学的または物理的刺激（調節化合物の存在を含む）に応答して開始（ｔｕｒｎｏｎ）または停止（ｔｕｒｎｏｆｆ）させる調節配列を含む。その他のタイプの調節要素（例えば、エンハンサー配列）もまたベクター中に存在し得る。
【０１３２】
選択マーカーもまた、組換え発現ベクター中に含まれ得る。形質転換細胞株の選択において有用であり、そして一般に、細胞が適切な選択培地中で生長するとき、その発現が形質転換細胞上の選択可能な表現型を与える遺伝子を含む種々のマーカーが公知である。そのようなマーカーは、例えば、プラスミドに抗生物質の耐性または感受性を付与する遺伝子を含む。あるいは、いくつかのポリケチドは、本来着色されており、この特徴は、本発明の構築物により首尾良く形質転換された細胞を選択するための生来の（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ）マーカーを提供する。
【０１３３】
目的の種々のＰＫＳサブユニットが、別の制御要素とともに、または例えば単一プロモーターの制御下で１個のカセットとして、１つまたはそれ以上の組換えベクター中にクローン化され得る。ＰＫＳサブユニットは、隣接する制限部位を含んで、その他のＰＫＳサブユニットの容易な欠失および挿入を可能にし、その結果、ハイブリッドＰＫＳが生成され得る。そのようなユニークな制限部位の設計は当業者に公知であり、そして部位特異的変異誘発およびＰＣＲのような、上記に記載の技術を用いて達成され得る。
【０１３４】
これらの技術を用いて、本明細書に記載のポリケチドの産生のためのシャトルベクターとして、新規プラスミドｐＲＭ５（図３および実施例２）が構築された。プラスミドｐＲＭ５は、ＰａｃＩ、ＮｓｉＩおよびＸｂａＩ制限部位が隣接する、ＫＳ／ＡＴ（ＯＲＦ１）、ＣＬＦ（ＯＲＦ２）およびＡＣＰ（ＯＲＦ３）ＰＫＳサブユニットをコードするａｃｔ遺伝子を含む。従って、その他のＰＫＳ遺伝子によりコードされる類似の（ａｎｏｌｏｇｏｕｓ）ＰＫＳサブユニットは、存在するａｃｔ遺伝子を容易に置換し得る。（例えば、親プラスミドとしてｐＲＭ５を用いるハイブリッドベクターの構築を記載する実施例４参照）。シャトルプラスミドはまた、ａｃｔＫＲ遺伝子（ａｃｔＩＩＩ）、シクラーゼ遺伝子（ａｃｔＶＩＩ）、および推定のデヒドラターゼ遺伝子（ａｃｔＩＶ）、ならびにＣｏｌＥＩレプリコン（Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換を可能にする）、適切な短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＳＣＰ２^＊（低コピー数）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓレプリコン、およびａｃｔクラスター由来のａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクティベーター遺伝子（栄養菌糸において成長期から定常期への移行の間にａｃｔプロモーターからの転写を誘導する）を含む。ｐＲＭ５は、多様なａｃｔＩ／ａｃｔＩＩＩプロモーターペアを有する。
【０１３５】
本発明の組換えベクターを適切な宿主中に導入する方法は、当業者に公知であり、そして代表的には、ＣａＣｌ_２または２価のカチオンおよびＤＭＳＯのようなその他の薬剤の使用を包含する。ＤＮＡはまた、エレクトロポーレーションにより細菌細胞中に導入され得る。一旦ＰＫＳが発現されると、ポリケチド産生コロニーが同定され得、そして公知の技術を用いて単離され得る。次いで産生されたポリケチドがさらに特徴づけられ得る。
【０１３６】
上記で説明したように、上記の組換え法はまた、大きなモジュールＰＫＳによるポリケチドの触媒的生合成に有用性を見い出す。例えば、６−デオキシエリスロノライドＢシンターゼ（ＤＥＢＳ）は、エリスロマイシンアグリコンである６−デオキシエリスロノライドＢ（１７）の生合成を触媒する。３つのオープンリーディングフレーム（ｅｒｙＡＩ、ｅｒｙＡＩＩ、およびｅｒｙＡＩＩＩ）がＤＥＢＳポリペプチドをコードし、そしてＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａゲノムのｅｒｙクラスター中で３２ｋｂにわたっている。この遺伝子は、それぞれが「モジュール」と称される、６つの繰り返し単位で組織されている。各モジュールは、１セットの活性部位をコードし、この活性部位は、ポリケチド生合成の間に、付加モノマーの成長鎖上への縮合を触媒する。各モジュールは、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、β−ケトアシルキャリアタンパク質シンターゼ（ＫＳ）、およびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、ならびに還元活性部位のサブセット（β−ケトレダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）、エノイルレダクターゼ（ＥＲ））（図９）を含む。モジュール内の還元部位の数は、各縮合サイクルにおけるβケト還元の程度に対応する。モジュールの末端でコードされるチオエステラーゼ（ＴＥ）は、ラクトン形成を触媒するようである。
【０１３７】
ｅｒｙＡＩ、ｅｒｙＡＩＩおよびｅｒｙＡＩＩＩの大きなサイズ、および複数の活性部位の存在のために、これらの遺伝子は、インビボ組換え技術を用いて、ＣＨ９９９のような、遺伝子操作した宿主細胞中での発現に適切なプラスミド中に便利にクローン化され得る。実施例５に記載され、そして図１０に要約されたこの技術は、プラスミドｐＭＡＫ７０５の誘導体（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７）を利用し、温度感受性ドナープラスミド（第１の許容温度で複製し得、そして第２の非許容温度で複製し得ない）と、受容体プラスミドとの間のインビボ組換えを可能にする。このようにクローン化されたｅｒｙＡ遺伝子は、ｐＲＭ５（ＭｃＤａｎｉｅｌら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１５４６）の誘導体ｐＣＫ７を与える。コントロールプラスミドｐＣＫ７ｆを構築してｅｒｙＡＩ中にフレームシフト変異をもたらした。ｐＣＫ７およびｐＣＫ７ｆは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝子操作のためのＣｏｌＥＩレプリコンならびに短縮型ＳＣＰ２^＊（低コピー数）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓレプリコンを有する。これらのプラスミドはまた、多様なａｃｔＩ／ａｃｔＩＩＩプロモーターペアおよびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４（これらプロモーターからの転写に必要であり、そして栄養菌糸において成長期から定常期への移行の間に発現を活性化するアクティベーター遺伝子）を含む。ＰＫＳ遺伝子の高レベル発現は、菌糸成長の定常期の開始の際に起こる；従って、組換え株は、あたかも天然のように、２次代謝物として「レポーター」ポリケチドを産生する。
【０１３８】
大きな、モジュールＰＫＳにより合成されるポリケチドの上記の産生方法を用いて、糖類、βラクタム、脂肪酸、アミノグリコシド、テルペノイド、非リボソームペプチド、プロスタノイドホルモンなどのような２次代謝物として他のポリケチドが産生され得る。
【０１３９】
上記の組換え法を用いて、多くのポリケチドが産生された。これらの化合物は、以下の一般構造（Ｉ）を有する
【０１４０】
【化２８】

ここでＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８およびｉは、上記で規定された通りである。このような化合物の１つの群はここで：Ｒ^１は、低級アルキル、好ましくはメチルであり；Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^６は水素であり；Ｒ^６は、−ＣＨＲ^７−（ＣＯ）−Ｒ^８であり；そしてｉは０である。このような化合物の第２番の群はここで：Ｒ^１およびＲ^６は、低級アルキル、好ましくはメチルであり；Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^５は、水素であり；そしてｉは０である。このような化合物のさらに第３の群はここで：Ｒ^１およびＲ^２は、一緒に連結して低級アルキレン架橋−ＣＨＲ^９−ＣＨＲ^１０を形成し、ここでＲ^９およびＲ^１０は、独立して、水素、ヒドロキシルおよび低級アルキル（例えば、−ＣＨ_２−ＣＨＯＨ−）からなる群より選択され；Ｒ^３およびＲ^５は水素であり；Ｒ^６は、−ＣＨＲ^７−（ＣＯ）−Ｒ^８、ここで、Ｒ^８は、水素または低級アルキル（例えば、−ＣＨ_２−（ＣＯ）−ＣＨ_３）であり；そしてｉは０である。そのような化合物の特定の例は、次のような以下の化合物９、１０および１１を含む：
【０１４１】
【化２９】

本発明の範囲内の他の新規なポリケチドは以下の構造を有する：
【０１４２】
【化３０】

【０１４３】
【化３１】

化合物９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６の調製は、構造（ＩＩ）を有する酵素結合ポリケチドの環化により行われる：
【０１４４】
【化３２】

ここで、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４およびＥは、先に定義されるものと同じである。このような化合物の例には：Ｒ^１１がメチルであり、そしてＲ^１２が−ＣＨ_２（ＣＯ）−Ｓ−Ｅである第１群；Ｒ^１１が−ＣＨ_２（ＣＯ）ＣＨ_３であり、そしてＲ^１２が−Ｓ−Ｅである第２群； Ｒ^１１が−ＣＨ_２（ＣＯ）ＣＨ_３であり、そしてＲ^１２が−ＣＨ_２（ＣＯ）−Ｓ−Ｅである第３群；ならびにＲ^１１が−ＣＨ_２（ＣＯ）ＣＨ_２（ＣＯ）ＣＨ_３であり、そしてＲ^１２が−ＣＨ_２（ＣＯ）−Ｓ−Ｅである第４群が挙げられる（図８の構造の具体例を参照せよ）。
【０１４５】
一般式（Ｉ）に含まれる残りの構造、すなわち、９、１０および１１以外の構造は、有機化学分野の当業者に周知の慣用の有機合成方法を用いて、構造９、１０または１１から調製され得る。これらの方法は、例えば、Ｈ．Ｏ．ＨｏｕｓｅによるＭｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，第２版（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ：Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７２）、またはＪ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 第４版（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）に記載され、これらの開示は、本明細書中で参考として援用されている。代表的には、当業者に理解されるように、芳香族環への置換基の取り込みには、簡単な求電子性芳香族付加反応が含まれる。構造１２および１３は同様の方法で改変されて、ポリケチドを産生し得る。これらのポリケチドもまた、本発明の範囲内にあると意図される。
【０１４６】
さらに、上記組換え方法を用いて、以下の一般式を有するポリケチド化合物が産生された：
一般式（ＩＩＩ）
【０１４７】
【化３３】

一般式（ＩＶ）
【０１４８】
【化３４】

および一般式（Ｖ）
【０１４９】
【化３５】

構造式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）の特に好ましい化合物は、Ｒ^２が水素であり、そしてｉが０であるものである。
【０１５０】
Ｃ．実験
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。これらの実施例は、例示の目的のためだけに提供され、どのような場合においても本発範囲を限定することを意図していない。
【０１５１】
使用される数字（例えば、量、温度など）の正確さを確実にするために努力したが、いくつかの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。
【０１５２】
（材料および方法）
（細菌株、プラスミド、および培養条件）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＣＨ９９９を、全てのプラスミドによる形質転換のための宿主として使用した。この株の構築を以下に説明する。ＤＮＡ操作を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１において行った。プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７（ｄａｍ ｄｃｍ ｈｓｄＳ Ｃｍ^ｒ）（ＭａｃＮｅｉｌ，Ｄ．Ｊ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８８）１７０：５６０７）に通して、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの形質転換の前にメチル化されていないＤＮＡを生成した。Ｅ．ｃｏｌｉ株を標準条件下で成長させた。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ株をＲ２ＹＥ寒天プレート上で成長させた（Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ：Ｎｏｒｗｉｃｈ，１９８５）。
【０１５３】
ＤＮＡおよび微生物の操作。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、酵素製造者によって推薦された条件下でＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用いて行った。標準のインビトロ技術を、ＤＮＡ操作のために使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（最新版））。Ｅ．ｃｏｌｉを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｅ．ｃｏｌｉパルス装置でＢｉｏ−Ｒａｄ．により提供されたプロトコールを用いて形質転換させた。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒを、標準の手順により形質転換させ（Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ：Ｎｏｒｗｉｃｈ，１９８５）、そして形質転換体を、５００ｍｇ／ｍｌチオストレプトンオーバーレイ２ｍｌを用いて選択した。
【０１５４】
組換えＰＫＳを含有するプラスミドの構築。全てのプラスミドは、以下に記載するｐＲＭ５の誘導体である。ｆｒｅｎ ＰＫＳ遺伝子を、この遺伝子に隣接する５’および３’制限部位を用いてＰＣＲにより、ｐＲＭ５のクローニング部位の位置（すなわち、ＯＲＦ１に対するＰａｃＩ−ＮｓｉＩ、ＯＲＦ２に対するＮｓｉＩ−ＸｂａＩ、およびＯＲＦ３に対するＸｂａＩ−ＰｓｔＩ）に従って増幅させた。サブクローニングおよび配列決定に続いて、増幅させたフラグメントをｐＲＭ５中の対応するフラグメントの位置にクローン化して、形質転換のためのプラスミドを生成した。
【０１５５】
ポリケチドの産生および精製。最初のスクリーニングのために、全ての株を、それぞれ約３０ｍｌの寒天培地を含有する１０〜３０プレート上でコンフルエントローンとして、３０℃で６〜８日間成長させた。完全な特徴付けのための十分な材料を得ることが必要とされるので、さらなるプレートを作製した。ＣＨ９９９は、潜在的なポリケチドをスクリーニングする場合のネガティブコントロールであった。寒天を細かく切り、そして酢酸エチル／１％酢酸または酢酸エチル：メタノール（４：１）／１％酢酸で抽出した。次いで、濃縮した抽出物を、シリカゲル（Ｂａｋｅｒ ４０ｍｍ）クロマトグラフィーカラムを通して、酢酸エチル／１％酢酸でフラッシュした。あるいは、抽出物をＦｌｏｒｉｓｉｌカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にかけ、そして酢酸エチル：エタノール：酢酸（１７：２：１）で溶出した。初めの黄色画分を、調製用の逆相（Ｃ−１８）カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ）でアセトニトリル／水／１％酢酸の２０〜６０％グラジエントを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりさらに精製した。２８０ｎｍおよび４１０ｎｍでの吸収をモニターした。一般に、これらの株からの精製産物の収率は、化合物１および２（図４）については約１０ｍｇ／ｌであり、そして化合物７および８（図７）については５ｍｇ／ｌであった。
【０１５６】
ＳＥＫ４（１２）を、以下のように産生および精製した。ＣＨ９９９／ｐＳＥＫ４を、９０寒天プレート（約３４ｍｌ／プレート）上で３０℃で７日間成長させた。この寒天を細切し、そして１％酢酸の存在下で酢酸エチル／メタノール（４／１）（３×１０００ｍｌ）で抽出した。減圧下での溶媒の除去に続いて、１％酢酸を含有する酢酸エチル２００ｍｌを加えた。沈澱物を濾過して廃棄し、そして溶媒を乾燥するまで蒸発させた。生成物の混合物を、Ｆｌｏｒｉｓｉｌカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にかけ、そして３％酢酸を含有する酢酸エチルで溶出した。初めの１００ｍｌ画分を収集し、そして５ｍｌまで濃縮した。メタノール１ｍｌを加え、そして混合物を４℃で一晩保持した。沈殿物を濾過により収集し、そして酢酸エチルで洗浄して、純粋な生成物８５０ｍｇを得た。Ｒ_ｆ＝０．４８（１％酢酸の酢酸エチル）。ＳＥＫ４に関するＮＭＲ分析の結果を表４に示す。ＦＡＢ ＨＲＭＳ（ＮＢＡ）、Ｍ＋^Ｈ＋、計算値ｍ／ｅ ３１９．０８１８、実測値ｍ／ｅ ３１９．０８２０。
【０１５７】
ＳＥＫ１５（１３）およびＳＥＫ１５ｂ（１６）を産生するために、ＣＨ９９９／ｐＳＥＫ１５を９０寒天プレート上で成長させ、そして産生物をＳＥＫ４と同様の方法で抽出した。混合物をＦｌｏｒｉｓｉｌカラム（５％酢酸を有する酢酸エチル）にかけ、主要産物を含有する画分を合わせ、そして乾燥するまで蒸発させた。産生物を、調製用のＣ−１８逆相ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ）（移動相：１％酢酸の存在下のアセトニトリル／水＝１／１０〜３／５のグラジエント）を用いてさらに精製した。ＳＥＫ１５（１３）の収量は２５０ｍｇであった。Ｒ_ｆ＝０．４１（１％酢酸の酢酸エチル）。ＳＥＫ４に関するＮＭＲ分析の結果を表４に示す。ＦＡＢ ＨＲＭＳ（ＮＢＡ）、Ｍ＋Ｈ＋、計算値ｍ／ｅ ３８５．０９２３、実測値ｍ／ｅ ３８５．０９２０。
【０１５８】
［１，２−^１３Ｃ_２］アセテート供給実験。それぞれ改変ＮＭＰ培地（Ｓｔｒａｕｃｈ，Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５：２８９）４００ｍｌを含有する２つの２リットルのフラスコに、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＣＨ９９９／ｐＲＭ１８、ＣＨ９９９／ｐＳＥＫ４またはＣＨ９９９／ｐＳＥＫ１５の胞子を接種し、そして振とう培養装置において３０℃で３００ｒｐｍでインキュベートした。各フラスコに、［１，２−^１３Ｃ_２］酢酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）５０ｍｇを７２時間および９６時間の時点で加えた。１２０時間後、培養物をプールし、そして２回の５００ｍｌ容量の酢酸エチル／１％酢酸で抽出した。有機相を保持し、そして上記のように精製した。^１３Ｃ ＮＭＲデータは、ＣＨ９９９／ｐＲＭ１８産物について約２〜３％の増加；ＳＥＫ４について０．５〜１％の増加およびＳＥＫ１５について１〜２％の増加を示す。
【０１５９】
ＮＭＲスペクトル分析。ＲＭ１８（１０）（図８）のＨＥＴＣＯＲ分析をＮｉｃｏｌｅｔ ＮＴ−３６０で行った以外は，全てのスペクトルをＶａｒｉａｎ ＸＬ−４００で記録した。^１３Ｃスペクトルを、連続的ブロードバンドプロトンデカップリングで得た。ＲＭ１８（１０）のＮＯＥの研究のために、一次元の差をとる方法（ｏｎｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）を利用した。全ての化合物をＤＭＳＯ−ｄ_６（Ｓｉｇｍａ、９９＋原子％Ｄ）に溶解させ、そしてスペクトルを溶媒を内部標準として対照した。ヒドロキシル共鳴を、Ｄ_２Ｏ（Ａｌｄｒｉｃｈ、９９原子％Ｄ）を添加し、そしてシグナルの消失を検査することにより同定した。
【０１６０】
【実施例】
（実施例１：Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＣＨ９９９の生産）
Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ宿主細胞を遺伝子操作してネイティブなａｃｔ遺伝子クラスターを除去し、そしてＣＨ９９９と呼ばれる宿主細胞を、図２に示した戦略を用い、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＣＨ１（Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）６：３２３７）を用いて構築した。
（ＣＨ１は、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＢ３８５（Ｒｕｄｄ，Ｂ．Ａ．Ｍ．ＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＰｉｇｍｅｎｔｅｄＳｅｃｏｎｄａｒｙＭｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（１９７８）博士論文，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＥａｓｔＡｎｇｌｉａ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から得た）。ＣＨ１は、ポリケチド抗生物質アクチノロジンの生合成および分泌（ｅｘｐｏｒｔ）に関与する酵素をコードするａｃｔ遺伝子クラスターを含む。このクラスターは、いくつかのＰＫＳ生合成後の遺伝子（環化、芳香族化、および引き続く化学的改変（図２Ａ）に関与する遺伝子を含む）が隣接するＰＫＳ遺伝子から構成される。ａｃｔ遺伝子の転写活性化を行う遺伝子もまた存在する。ａｃｔ遺伝子クラスターは、Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）６：３２３７に記載されるような相同組換えを用いてＣＨ１から欠失された。
【０１６１】
特に、プラスミドｐＬＲｅｒｍＥＴｓ（図２Ｂ）は、次の特徴を有して構築された：ｐＢＲ３２２由来のＣｏｌＥＩレプリコン、ｐＳＧ５由来の温度感受性レプリコン（Ｍｕｔｈ，Ｇら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）２１９：３４１）、アンピシリンおよびチオストレプトン耐性マーカー、ならびにａｃｔクラスターの５’末端由来の２ｋｂＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメント、１．５ｋｂｅｒｍＥフラグメント（Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）６：３２３７）、およびａｃｔクラスターの３’末端由来の１．９ｋｂＳｐｈＩ／ＰｓｔＩフラグメントを含む分離カセット。５’フラグメントは、ＢａｍＨＩ部位１（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ，Ｆ．およびＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：４６２；Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ，Ｆ．およびＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０５：６６）から下流のＸｈｏＩ部位にまでわたった。３’フラグメントは、ＰｓｔＩ部位２０から上流にＳｐｈＩ部位１９．２にまでわたった（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：１９２７８）。５’および３’フラグメント（図２で斜線で示されるＤＮＡ）は、ａｃｔクラスターにおけるように、同じ相対方向にクローン化された。ＣＨ１は、ｐＬＲｅｒｍＥｔｓで形質転換された。このプラスミドは、引き続いて、３９℃で非選択的に画線することによって候補形質転換体で保存された。リンコマイシン耐性、チオストレプトン感受性であり、かつアクチノロジンを産生し得ないいくつかのコロニーを単離し、そしてサザンブロッティングによりチェックした。それらの１つをＣＨ９９９と称した。
【０１６２】
（実施例２：組換えベクターｐＲＭ５の生産）
ｐＲＭ５（図３）は、ＣＨ９９９でＰＫＳを発現するために用いたシャトルプラスミドであった。それは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて遺伝子操作を可能にするＣｏｌＥＩレプリコン、適切な短縮型のＳＣＰ２^＊（低コピー数）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓレプリコン、および栄養菌糸で増殖期から定常期への移行の間にａｃｔプロモーターからの転写を誘導する、ａｃｔクラスター由来のａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクチベーター遺伝子を含む。図３に示されるように、ｐＲＭ５は、多様なａｃｔＩ／ａｃｔＩＩＩプロモーターペアを有し、同時に、両プロモーターの下流に種々の加工されたＰＫＳ遺伝子の挿入を容易にするために便利なクローニング部位を有する。ｐＲＭ５は、ＳＣＰ２^＊のｐａｒ遺伝子座を欠いている；その結果このプラスミドは、わずかに不安定である（チオストレプトンの非存在下で約２％が損失）。この特徴は、目的の表現型が、このプラスミド由来の変異体ＰＫＳに明確に割り当てられ得ることを、迅速に確認するために、故意に導入された。ｐＲＭ５由来の組換えＰＫＳは、ほぼ、対数増殖期から定常増殖期への移行期に、良好な収率で発現される。
【０１６３】
ｐＲＭ５は以下のように構築された。ｐＩＪ９０３由来の１０．５ｋｂのＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ＳＣＰ２^＊の稔性遺伝子座の部分および複数起点、ならびにｃｏｌＥＩ複製起点およびｐＢＲ３２７由来のβラクタマーゼ遺伝子を含む）（Ｌｙｄｉａｔｅ、Ｄ．Ｊ．Ｇｅｎｅ（１９８５）３５：２２３）を、１．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩｔｓｒ遺伝子カセットと連結しｐＲＭ１を得た。ｐＲＭ５は、ｐＲＭ１のユニークなＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位との間に以下の２つのフラグメントを挿入することにより構築された：ファージｆｄ由来の転写ターミネーター（Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）６：３２３７）を有する０．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｐａＩ（平滑）フラグメント、およびＮｃｏＩ部位（ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクチベーター遺伝子の１ｋｂ上流）（Ｈａｌｌａｍ，Ｓ．Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ（１９８８）７４：３０５；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９１）６６：７６９；Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｊ．Ｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９１）２３０：４０１）からａｃｔＩ−ＶＩＩ−ＩＶ遺伝子（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：１９２７８）の下流のＰｓｔＩ部位まで伸びるａｃｔクラスター由来の１０ｋｂフラグメント。
【０１６４】
ａｃｔＩプロモーター（これはａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４遺伝子産物により活性化される）の制御下にある任意の所望の組換え体ＰＫＳの発現を促進するために、ＰａｃＩ、ＮｓｉＩ、ＸｂａＩ、およびＰｓｔＩに対する制限部位を、シストロン間の位置で、ａｃｔＤＮＡ中に設けた。ｐＲＭ５、および本明細書に記載のすべてのその他のＰＫＳ発現プラスミドでは、ＯＲＦ１、２、および３対立遺伝子が、それら自身のＲＢＳを用いて加工されたカセットとしてこれら部位の間にクローン化された。
【０１６５】
特に、放線菌においては、大部分の天然に存在する芳香族ポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターでは、ＯＲＦ１とＯＲＦ２とは、翻訳共役される。組換えＰＫＳの構築を容易にするために、本明細書で用いられるＯＲＦ１およびＯＲＦ２対立遺伝子は、独立の（共役していない）カセットとしてクローン化された。ａｃｔＯＲＦ１については、以下の配列がｐＲＭ５中に設けられた：ＣＣＡＣＣＧＧＡＣＧＡＡＣＧＣＡＴＣＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＡＴＧ、ここで下線の配列は、ａｃｔＩ領域から上流のＤＮＡに対応し、ＴＴＡＡＴＴＡＡは、ＰａｃＩ認識部位であり、そしてＡＴＧは、ａｃｔＩＯＲＦ１の開始コドンである。以下の配列が、ａｃｔＯＲＦ１とＯＲＦ２との間に設けられた：ＮＴＧＡＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧ、ここでＴＧＡおよびＡＴＧは、それぞれ、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の停止および開始コドンである。ＡＴＧＣＡＴは、ＮｓｉＩ認識部位であり、そしてＮ（ａｃｔＤＮＡではＡ、その他のＰＫＳ由来の対立遺伝子ではＡまたはＧ）のＣによる置換は、翻訳脱共役（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ）を生じる。以下の配列を、ａｃｔＯＲＦ２の下流に設けた：ＴＡＡＴＣＴＡＧＡ、ここでＴＡＡは停止コドン、そしてＴＣＴＡＧＡはＸｂａＩ認識部位である。これにより、ａｃｔＯＲＦ３の上流に設けられたＸｂａＩ部位（Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）６：３２３７）へのａｃｔＯＲＦ１およびＯＲＦ２（上記のように設けられた）の融合を可能にした。コントロールとして、ｐＲＭ５と同一であるが、設けられた任意の配列を欠いているｐＲＭ２が構築された。ｐＲＭ２におけるＯＲＦ１とＯＲＦ２とは翻訳共役する。ＣＨ９９９／ｐＲＭ２およびＣＨ９９９／ｐＲＭ５の生成物プロフィールの比較は、本明細書に記載された脱共役戦略が生成物分布または生成物レベルに対し検出可能な影響がなかったことを示した。
【０１６６】
（実施例３：ｐＲＭ５で形質転換されたＣＨ９９９を用いて産生されたポリケチド）
プラスミドｐＲＭ５を、標準の技術を用いてＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＣＨ９９９中に導入した。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（最新版）を参照）。ｐＲＭ５で形質転換されたＣＨ９９９は、大量の黄褐色物質を産生した。２種の最も豊富な産物を、ＮＭＲおよび質量スペクトル分析により、アロエサポナリンＩＩ（２）（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．らＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：４８１６）およびそのカルボキシル化アナログ、３，８−ジヒドロキシ−１−メチルアントラキノン−２−カルボン酸（１）（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｄ．Ｗ．らＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）７：６９９）（図４）と特徴付けた。２は非酵素的な脱カルボキシル化（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．らＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：４８１６）により１から得られると推定される。化合物１および２は、約１：５のモル比で存在した。約１００ｍｇの混合物が、１リットルの培養から容易に精製され得た。従って、ＣＨ９９９／ｐＲＭ５宿主ベクター系は、予期されたように機能し、顕著な量の安定な、最小限に改変されただけのポリケチド代謝物を産生した。１および２の生産は、アクチノロジン生合成の提案された経路（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．らＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：４８１６）と一致している。両代謝物は、アクチノロジン骨格のように、Ｃ−９における単一のケト還元を有する１６炭素のポリケチドに由来する。
【０１６７】
ＣＨ９９９を、ｐＳＥＫ４（ａｃｔＫＲ遺伝子内の１４０ｂｐ ＳｐｈＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ｐＵＣ１９由来のＳｐｈＩ／ＳａｌＩフラグメントにより置換したことを除いてｐＲＭ５と同一）で形質転換したとき、得られる株は、大量の芳香族ポリケチドＳＥＫ４（１２）を産生した。この産物の正確な構造は、デスオキシエリスロラクシン（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．らＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：４８１６）とはわずかに異なる。しかし、１，２−^１３Ｃ_２−標識アセテートを用いるインビボのアイソトープ標識研究により、ポリケチド骨格が８アセテートに由来することが確認された。さらに、この産物の^１Ｈスペクトルおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルの芳香族領域は、１に類似の３環（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ）構造と一致するが、任意のケト還元を欠いている（表４参照）。
【０１６８】
（実施例４：ハイブリッドポリケチドシンターゼの構築と分析）
（Ａ．ａｃｔ、ｇｒａ、およびｔｃｍＰＫＳ由来の成分を含むハイブリッドＰＫＳの構築）
図１は、相同な推定のＫＳ／ＡＴおよびＡＣＰサブユニット、ならびにＯＲＦ２産物を含む、アクチノロジン（３）、グラナチシン（４）、およびテトラセノマイシン（５）（図５に示された構造）の炭素鎖骨格を合成するためのＰＫＳを示す。ａｃｔＰＫＳおよびｇｒａＰＫＳはまたＫＲを有するが、ｔｃｍＰＫＳでは欠いている。各クラスター由来の対応するタンパク質は、高い程度の配列同一性を示す。３つのクラスターにおける対応するＰＫＳタンパク質間の同一性百分率は、以下のようである：ＫＳ／ＡＴ：ａｃｔ／ｇｒａ７６、ａｃｔ／ｔｃｍ６４、ｇｒａ／ｔｃｍ７０；ＣＬＦ：ａｃｔ／ｇｒａ６０、ａｃｔ／ｔｃｍ５８、ｇｒａ／ｔｃｍ５４；ＡＣＰ：ａｃｔ／ｇｒａ６０、ａｃｔ／ｔｃｍ４３、ｇｒａ／ｔｃｍ４４。ａｃｔＰＫＳおよびｇｒａＰＫＳは、Ｃ−９でケト還元された８アセテート残基（図６）由来の同一の１６個の炭素の骨格を合成する。対照的に、図６中でまた示されるように、ｔｃｍポリケチド骨格は、全体の炭素鎖長が異なり（１６炭素の代わりに２０炭素）、ケト還元されておらず、そして第１の環化の位置特異性は、ａｃｔおよびｇｒａでは炭素７と１２と間である代わりに炭素９と１４との間で起こる。
【０１６９】
特性の範囲が異なる新規ポリケチドを生成し、そして芳香族ＰＫＳをプログラミングする局面を解明する試みにおいて、表１で示されたように、系統的な、最小のＰＫＳ遺伝子クラスターのシリーズを、ａｃｔ、ｇｒａ、およびｔｃｍ遺伝子クラスター由来の、ＯＲＦ１（ＫＳ／ＡＴサブユニットをコードする）、ＯＲＦ２（ＣＬＦサブユニットをコードする）、およびＯＲＦ３（ＡＣＰサブユニットをコードする）遺伝子産物の種々の並べ換えを用いて、存在するａｃｔ遺伝子の代わりにｐＲＭ５中にクローン化した。得られるプラスミドを、上記のように、ＣＨ９９９を形質転換するために用いた。
【０１７０】
ＫＳ／ＡＴ、ＯＲＦ２産物、およびＰＫＳのＡＣＰサブユニットの間の種々の並べ換えを含む組換えＰＫＳ（すべての構築物はまた、ａｃｔＫＲ、シクラーゼ、およびデヒドラターゼ遺伝子を含む）の産物の分析は、シンターゼが３つのカテゴリー：ポリケチドを産生しないグループ；化合物１を産生するグループ（少量の２に加えて）；および新規ポリケチド９（ＲＭ２０と称される）（図６）を産生するグループに、分けられ得る（表１）ことを示した。９の構造は、この分子のポリケチド骨格前駆体がＣ−９位置に１ヶ所ケト還元を有する１０個のアセテート残基に由来することを示唆する。
【０１７１】
異種のポリケチド鎖の還元および環化パターンに対するａｃｔＫＲの影響を調査するために、ｐＳＥＫ１５もまた構築した。これは、ｔｃｍＯＲＦ１〜３を含むが、ａｃｔＫＲは欠いていた。（この構築物のａｃｔＫＲ遺伝子における欠失は、ｐＳＥＫ４における欠失と同一であった。）ＣＨ９９９／ｐＳＥＫ１５の分析は、２０炭素鎖の産物ＳＥＫ１５（１３）は、テトラセノマイシンＣまたはその短絡（ｓｈｕｎｔ）産物と同一ではないが、類似していた。ＮＭＲスペクトル分析もまた、完全に非還元のデカケチド骨格と一致した（表４参照）。
【０１７２】
すべてのａｃｔ／ｇｒａハイブリッドは、推定されるアクチノロジンおよびグラナチシンポリケチドの同一の構造と一致して、化合物１を産生した。各場合において、ｔｃｍ／ａｃｔハイブリッドから産物が単離され得る場合、ポリケチドの鎖長は、ＯＲＦ２の供給源に対応する天然産物の鎖長と同一であった。このことは、ＡＣＰまたはＫＳ／ＡＴではなくＯＲＦ２産物が、炭素鎖長を制御することを示唆する。さらに、本明細書に記載されるハイブリッド（ＫＲを欠いているもの（ＣＨ９９９／ｐＳＥＫ４およびＣＨ９９９／ｐＳＥＫ１５）を除く）により産生されるすべてのポリケチドが、１ヶ所、ケト還元されたので、（ｉ）ＫＲは、ケト還元が起こるために必要でありかつ十分である；（ｉｉ）この還元は、常に、最終ポリケチド骨格中のＣ−９位置（鎖のカルボキシ末端から数えて）で起こる；および（ｉｉｉ）非還元のポリケチドは、ケト還元された未完成ポリケチド鎖においていく通りかの環化パターンで環化され得るが、第１環化の位置化学（ｒｅｇｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、非還元産物においてこの環化がいかにして起こるかにかかわらず、得られるヒドロキシルの位置により指定されることが結論され得る。換言すれば、ｔｃｍＰＫＳは、ケトレダクターゼを含むことにより、新規な環化特異性を示すように加工され得る。
【０１７３】
ＲＭ２０（９）の顕著な特徴は、第１環化後の環化のパターンである。ａｃｔＶＩＩ変異体由来のムタクチン（６）の単離は、ａｃｔＶＩＩ産物およびそのｔｃｍ同族体が、アクチノロジン（３）およびテトラセノマイシン（５）それぞれの生合成において第２の環の環化を触媒することを示唆した（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．らＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９１）４７：６０２９；Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｒ．Ｇ．らＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９２）１７４：１８１０）。ＲＭ２０（９）の環化パターンは、ｐＲＭ２０（９）上のａｃｔＶＩＩ遺伝子の存在にかかわらず、１およびテトラセノマイシンＦ１の環化パターンと異なる。従って、ａｃｔシクラーゼは、より長いポリケチド鎖を環化し得ないようである。
【０１７４】
予期せぬことに、最小のｔｃｍＰＫＳを単独で含む株（ＣＨ９９９／ｐＳＥＫ３３）は、図８で示されるような、２つのポリケチドＳＥＫ１５（１３）およびＳＥＫ１５ｂ（１６）を、ほぼ等しい量で産生した。しかし、化合物（１３）および（１６）はまたＣＨ９９９／ｐＳＥＫ１５からも単離され、化合物（１６）の量より多い量の化合物（１３）が、この構築物から単離された。
【０１７５】
ＳＥＫ１５ｂは新規化合物であり、その構造は、ＮＭＲスペクトル分析、［１，２−^１３Ｃ_２］酢酸ナトリウム供給実験および質量スペクトル分析の組み合わせにより解明された。^１Ｈおよび^１３ＣＮＭＲの結果は、ＳＥＫ１５ｂは、非還元のアントラキノン部分およびピロン部分から構成されていることを示した。［１，２−^１３Ｃ_２］酢酸ナトリウム供給実験は、ＳＥＫ１５ｂの炭素鎖が１０アセテート単位に由来することを証明した。ＳＥＫ１５ｂに富んだ試料の^１３ＣＮＭＲスペクトルから計算されたカップリング定数は、ピーク帰属を容易にした。高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量スペクトル分析は、Ｃ_２０Ｈ_１２Ｏ_８と一致した３８１（Ｍ＋Ｈ^＋）の分子量を与えた。重水素交換を用いてＳＥＫ１５ｂ中の各ヒドロキシルの存在を確認した。
【０１７６】
活性シクラーゼの非存在下で環化するための未完成ポリケチド鎖に対してインビボで利用可能な自由度を同定するために、組換え体Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＣＨ９９９／ｐＲＭ３７により産生されたポリケチド（ＭｃＤａｎｉｅｌら（１９９３）、上述）を分析した。ｐＲＭ３７によりコードされた生合成酵素は、ｔｃｍケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）、ｔｃｍ鎖長決定因子（ＣＬＦ）、ｔｃｍアシルキャリアプロテイン（ＡＣＰ）、およびａｃｔケトレダクターゼ（ＫＲ）である。
【０１７７】
２つの新規化合物ＲＭ２０ｂ（１４）およびＲＭ２０ｃ（１５）（図８）が、先にＲＭ２０（９）を生じたＣＨ９９９／ｐＲＭ３７の培養培地中で発見された。回収された３つの化合物の相対量は、３：７：１（ＲＭ２０：ＲＭ２０ｂ：ＲＭ２０ｃ）であった。（１４）および（１５）の構造は、質量スペクトル分析、ＮＭＲスペクトル分析、およびアイソトープ標識実験の組み合わせにより解明された。^１Ｈおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルは、ＲＭ２０ｂおよびＲＭ２０ｃがそれぞれピロン部分を含むジアステレオマーであることを示唆した。旋光度［α］_Ｄ ^２０は、ＲＭ２０ｂについては＋２１０．８゜（ＥｔＯＨ、０．５５％）、そしてＲＭ２０ｃについては＋７８．０゜（ＥｔＯＨ、０．３３％）であることが見出された。［１，２−^１３Ｃ_２］酢酸ナトリウム供給実験によって、ＲＭ２０ｂ（そして推論によってＲＭ２０ｃ）の炭素鎖が、１０個のアセテート単位に由来することが確認された。重水素交換研究を、ＲＭ２０ｂおよびＲＭ２０ｃの両方の上の可能なヒドロキシル基に対応する^１ＨＮＭＲピークを同定するために実施した。プロトンカップリング定数は、^１ＨＮＭＲおよび１次元デカップリング実験の結果から計算された。特に、スペクトルの高磁場領域におけるカップリングパターンは、中央のカルビノールのメチンプロトンを取り囲む２つのメチレン基の５−プロトンスピン系を示した。高分解能高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量スペクトル分析は、ＲＭ２０ｂについて（５１９．００５６）（Ｍ＝Ｃｓ^＋）、そしてＲＭ２０ｃについて３８７．１０７０（Ｍ＋Ｈ^＋）の分子量を与え、それは、Ｃ_２０Ｈ_１８Ｏ_８（Ｍ＋Ｃｓ^＋、５１９．００５６；Ｍ＋Ｈ^＋、３８７．１０８０）と一致する。これらのデータに基づき、構造（１４）および（１５）（図８）を、それぞれ、ＲＭ２０ｂおよびＲＭ２０ｃに割り当てた。
【０１７８】
^１Ｈおよび^１３ＣＮＭＲからのデータは、Ｈ−９とＣ−８上のジェミカルプロトンとの間のカップリング定数は、ＲＭ２０ｂまたはＲＭ２０ｃについて、それぞれ１２．１または１２．２、および２．５または２．２Ｈｚであることを示した。Ｈ−９とＣ−１０上のジェミカルプロトンとの間のカップリング定数は、Ｒｍ２０ｂまたはＲＭ２０ｃについて、それぞれ９．６または９．７、および５．７または５．８Ｈｚであった。これらの値は、Ｊ_ａ，ａ（Ｊ_{９ａ，８ａ}またはＪ_{９ａ，１０ａ}）およびＪ_ａ，ｅ（Ｊ_{９ａ，８ｅ}またはＪ_{９ａ，１０ｅ}）カップリングパターンに典型的であり、そしてＲＭ２０ｂまたはＲｍ２０ｃの両方においてＨ−９がアキシアル位置であることを示す。対照的に、２つの分子上のＣ−７ヒドロキシルの化学シフトは、ＲＭ２０ｂおよびＲＭ２０ｃについて、それぞれ１６．１８および６．１４ｐｐｍであった。これらの値は、ＲＭ２０ｂにおいて、Ｃ−７ヒドロキシルと適切に位置するアクセプター原子との間に水素結合が存在し、ＲＭ２０ｃには存在しないことを示す。そのような水素結合のための最も可能性の高い候補アクセプター原子は、共役ピロン環系におけるＣ−１３カルボニル酸素、または孤立したピロン環中の架橋酸素である。後者の場合、（１４）と（１５）との間を区別することが不可能であるので、前者でありそうである。さらに、ＲＭ２０ｂおよびＲＭ２０ｃの^１３ＣＮＭＲスペクトルの比較によって、（１４）および（１５）間の最も大きな差異は、共役ピロン環を構成する炭素の化学シフトにあることが明らかとなった（Ｃ−１１、Ｃ−１２、Ｃ−１３、Ｃ−１４、およびＣ−１５のそれぞれについて、＋５．９、−６．１、＋８．９、−７．８、および＋２．０ｐｐｍ）。高磁場および低磁場シフトが交互するこのようなパターンは、Ｃ−７ヒドロキシルが、Ｃ−１３カルボニルに水素結合するという事実により説明され得る。何故なら、水素結合は、Ｃ−１１、Ｃ−１３、およびＣ−１５の周囲の電子密度を減少させるが、Ｃ−１２およびＣ−１４の周囲の電子密度を増加させると予想され得るからである。Ｃ−７／Ｃ−１３水素結合の帰属を確認するために、ＲＭ２０ｂおよびＲＭ２０ｃの交換可能なプロトンを、重水素で置換し（Ｄ_２Ｏの存在下でインキュベートすることにより）、そして試料を^１３ＣＮＭＲにより分析した。ＲＭ２０ｂ中のＣ−１３ピークが、高磁場シフト（１．７ｐｐｍ）し、ＲＭ２０ｃではしなかったことは、水素が重水素で置換された場合のＲＭ２０ｂにおけるより弱いＣ−７／Ｃ−１３非共有結合により説明され得る。Ｃ−１３カルボニルと水素結合を形成するために、ＲＭ２０ｂのＣ−７ヒドロキシルはエカトリアル位置を占めなければならない。従って、Ｃ−７およびＣ−９ヒドロキシルは、主要な異性体（ＲＭ２０ｂ）中で共役環系の同一面（ｓｙｎ）上にあり、その一方、それらは少ない方の異性体（ＲＭ２０ｃ）中では、反対側（ａｎｔｉ）にあると推断され得る。
【０１７９】
ＣＨ９９９／ｐＲＭ１５、／ｐＲＭ３５、および／ｐＲＭ３６中でポリケチドは検出され得なかった。従って、いくつかのＯＲＦ１−ＯＲＦ２組み合わせのみが機能的である。各サブユニットは、少なくとも１つの組換えシンターゼにおいて機能的であったので、タンパク質発現／折り畳み問題は起こりそうもない。代わりに、これらの酵素複合物の異なるサブユニットの間の不完全または抑制の会合、あるいは迅速に分解される（失敗した）短鎖産生物の生合成は、ふさわしい説明である。
【０１８０】
（Ｂ．ａｃｔおよびｆｒｅｎ ＰＫＳ由来の成分を含むハイブリッドＰＫＳの構築）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓは、フレノリシンＢ（７）（Ｉｗａｉ，Ｙら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９７８）３１：９５９）およびナナオマイシンＡ（８）（Ｔｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８６）３９：１３４３）の両方を産生する。１０ｋｂ ＤＮＡフラグメント（以下、ｆｒｅｎ座と呼ぶ）を、Ｓ．ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓのゲノムライブラリー（Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．ら、前出）から、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のａｃｔ ＰＫＳのＫＳ／ＡＴおよびＫＲ成分をコードするＤＮＡをプローブとして用いてクローン化した（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７））３２５：８１８）。（図７の構造図を参照せよ）。ｆｒｅｎ座のＤＮＡ配列決定は、ａｃｔ ＫＳ／ＡＴ、ＣＬＦ、ＡＣＰ、ＫＲ、およびシクラーゼをコードするものと高度の同一性を有する遺伝子の存在を（とりわけ）示した。
【０１８１】
新規ポリケチドを産生するために、ｐＲＭ５に存在するＯＲＦ１、２、および３ａｃｔ遺伝子を、表２に示されるように、対応するｆｒｅｎ遺伝子で置換した。上記のように構築したＳ．ｃｏｅｌｉｌｃｏｌｏｒ ＣＨ９９９を、これらのプラスミドで形質転換した。（ａｃｔ ＫＲおよびａｃｔシクラーゼをコードする遺伝子もまた、これらの遺伝的構築物のそれぞれに存在した。）上記のようにａｃｔおよびｔｃｍ ＰＫＳを用いる同様の実験からの結果に基づいて、ａｃｔＫＲは全ての機能性組換えＰＫＳの産生物を還元させ得るのに対して、第２の環化を触媒するａｃｔシクラーゼの能力は、ｆｒｅｎ ＰＫＳの産生物の鎖長に依存することが予想された。
【０１８２】
表２にまとめた結果は、殆どの形質転換体が、芳香族ポリケチドを産生するそれらの能力によりアッセイされたように、機能性ＰＫＳを発現したことを示す。主産生物の構造的分析は、産生株が２つのカテゴリ：化合物１（より少量のその脱カルボキシル化副生成物（２）と共に）を合成した株、および化合物１、１０、および１１の混合物（約１：２：２の比）を合成した株に分類され得ることを示した。（少量の２もまた、１を産生する全ての株に見出された）。化合物１および２は、天然産生物として以前から分かっており、実施例３に記載されるように、全体的にａｃｔサブユニットからなるＰＫＳによって産生された代謝物であった。化合物１０および１１（それぞれ、ＲＭ１８およびＲＭ１８ｂと称される）は、新規な構造であり、これらの化学合成または天然産生物としての単離は以前に報告されていなかった。
【０１８３】
１０および１１の構造を、質量スペクトル分析、ＮＭＲスペクトル分析、およびアイソトープ標識実験の組み合わせにより明らかにした。^１Ｈおよび^１３Ｃスペクトル帰属を、１０についての［１，２−^１３Ｃ_２］酢酸ナトリウム供給実験（以下に記載される）により得られる^１３Ｃ−^１３Ｃカップリング定数と共に表３に示す。化合物１０の明らかな帰属を、１Ｄ核オーヴァーハウザー効果（ＮＯＥ）およびロングレンジヘテロ核相互作用（ＨＥＴＣＯＲ）研究を用いて樹立した。重水素交換により、化合物１０のＣ−１５および化合物１１のＣ−１３でのヒドロキシルの存在が確認された。２の電界脱離（ｆｉｅｌｄ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）質量分析（ＦＤ−ＭＳ）により、Ｃ_１７Ｈ_１４Ｏ_４（２８２．２９５２）と一致する２８２の分子量を示した。
【０１８４】
先の研究は、２（および、推論による１）のポリケチド骨格（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：４８１６）が８個のアセテート残基の繰り返し縮合とＣ−９での１回のケト還元から誘導されることを示した。また、ナナオマイシン（８）が同一の炭素鎖骨格に由来することも主張され得る。従って、ナナオマイシンがＳ．ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ中のｆｒｅｎ ＰＫＳ遺伝子の産生物であることは非常に可能性が高い。１の形成を導く第１の環化の位置特異性は、ケト還元の位置により導かれ、これに対して、第２の環化の位置特異性は、ａｃｔシクラーゼにより制御される（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）５５：１６８２）。
【０１８５】
ＲＭ１８（１０）炭素鎖骨格を追跡するために、［１，２−^１３Ｃ_２］アセテートを用いるインビボ供給実験を、ＣＨ９９９／ｐＲＭ１８において行い、続いて、標識ＲＭ１８（１０）のＮＭＲ分析を行った。^１３Ｃカップリングデータ（表３にまとめた）は、ＲＭ１８（１０）のポリケチド骨格が９個のアセテート残基から誘導され、続いて、恐らく非酵素的に起こる、末端の脱カルボキシル化（Ｃ−２^１３Ｃ共鳴が強められたシングレットとして現れる）により誘導されることを示す。さらに、Ｃ−９位のヒドロキシル基の非存在は、ケト還元がこの炭素で起こることを示唆する。これらの２つの特徴が推定のフレノリシン（７）骨格に存在すると予想されるので、これらの結果は、ナナオマイシンを合成することに加え、ｆｒｅｎ ＰＫＳ遺伝子がＳ．ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓでフレノリシンの生合成に寄与することを示唆する。これは、鎖長特異性がゆるやかなＰＫＳの初めてのはっきりした例であるようである。しかし、フレノリシンの推定の骨格とは異なり、ＲＭ１８（１０）のＣ−１７カルボニルは還元されない。これは、ｐＲＭ１８由来の特異的ケトレダクターゼ、デヒドラターゼ、およびエノイルレダクターゼ（Ｓ．ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ中のｆｒｅｎ遺伝子クラスターに存在する）の非存在を反映し得るか、またはフレノリシン中の炭素１５〜１８の異なる起源を反映し得る。
【０１８６】
ＲＭ１８（１０）の形成を導く第１の環化の位置特異性は、ケト還元の位置により導かれる；しかし、第２の環化は、７または１とは異なって起こり、そしてＲＭ２０（９）（先に記載される、ｔｃｍ ＰＫＳにより産生されるデカケチド）に見られる環化パターンと類似する。従って、ＲＭ２０（９）の場合のように、ａｃｔシクラーゼはＲＭ１８前駆体の第２の環化を触媒し得ないこと、およびこの続いて起こる環化（恐らく非酵素的に起こる）は、水性環境への未完成のポリケチド鎖の異なる部分の放出の時間的差により制御されることが主張される。１を産生するＣＨ９９９／ｐＲＭ１８（およびＣＨ９９９／ｐＲＭ３４）の能力を考慮すると、シクラーゼがｆｒｅｎ ＰＫＳ（ＫＳ／ＡＴ、ＣＬＦ、およびＡＣＰ）と共同で働き（ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ）得ないという可能性は排除され得る。より適切な解釈は、ａｃｔシクラーゼが鎖長の異なる基質を認識し得ないことである。これはまた、推定のＲＭ２０（９）の生合成スキームと一致する。
【０１８７】
表２に報告されたハイブリッドシンターゼの産生物のプロフィールとａｃｔおよびｔｃｍ ＰＫＳ成分の間の類似のハイブリッドとの比較（表１）は、ＯＲＦ２産生物が鎖長決定因子（ＣＬＦ）であるという仮説を支持する。酵素結合ケチドの環化による化合物９、１０および１１の調製を、図８に概略的に例示する。
【０１８８】
（実施例５：モジュールポリケチドシンターゼの構築および分析）
組換えモジュールＤＥＢＳ ＰＫＳ遺伝子を含む発現プラスミドは、図１０に示すように、温度感受性「ドナー」プラスミド（すなわち、第１の許容温度で複製し得、そして第２の非許容温度で複製し得ないプラスミド）由来の増加するＤＮＡを、二重組換えを行うことによって「受容体」シャトルベクターに移入することにより構築された。完全なｅｒｙＡ遺伝子を含むシャトルプラスミドであるｐＣＫ７（図１１）（これは、ｐＳ１から初めにクローン化された（Ｔｕａｎら（１９９０）Ｇｅｎｅ９０：２１））を、以下のように構築した。ｐＳ１由来の２５．６ｋｂ ＳｐｈＩフラグメントを、ｐＭＡＫ７０５（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７）のＳｐｈＩ部位に挿入して、ｅｒｙＡＩＩ、ｅｒｙＡＩＩＩ、およびｅｒｙＡＩの３’末端を含むドナープラスミドであるｐＣＫ６（Ｃｍ^Ｒ）を得た。この温度感受性ｐＳＣ１０１誘導体の複製が３０℃で起こるが、４４℃で終止する。受容体プラスミドであるｐＣＫ５（Ａｐ^Ｒ、Ｔｃ^Ｒ）は、ｅｒｙＡＩ開始コドン（Ｃａｆｆｒｅｙら、（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０４：２２５）からｅｒｙＡＩＩの始端に近接するＸｃｍＩ部位までの１２．２ｋｂ ｅｒｙＡフラグメント、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃ）をコードする１．４ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢｓｍＩ ｐＢＲ３２２フラグメント、およびｅｒｙＡＩＩＩの終端由来の４．０ｋｂ ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを含む。ＰａｃＩ、Ｎｄｅｌ、およびリボソーム結合部位を、ｐＣＫ５中のｅｒｙＡＩ開始コドンで設計した。ｐＣＫ５は、ｐＲＭ５の誘導体である（ＭｃＤａｎｉｅｌら、（１９９３）、前出）。５’および３’相同領域（図１０、縞模様区域および白抜き区域）は、それぞれ４．１ｋｂおよび４．０ｋｂである。ＭＣ１０６１ Ｅ．ｃｏｌｉを、ｐＣＫ５およびｐＣＫ６で形質転換し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照せよ）、そして３０℃でカルベニシリンおよびクロラムフェニコール選択に供した。次いで、両方のプラスミド（Ａｐ^Ｒ、Ｃｍ^Ｒ）を有するコロニーを、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールプレートにて４４℃で再度画線した。この２つのプラスミドの間の単一の組換え事象により形成された同時組込みだけが見られた。生存コロニーを、カルベニシリンの選択下で３０℃で繁殖させ、第２の組換え事象を通して同時組込みの分解（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を強制した。ｐＣＫ７組換え体を増やすために、コロニーを、カルベニシリンプレートにおいて４４℃で再度画線した。得られたコロニーの約２０％は、所望の表現型（Ａｐ^Ｒ、Ｔｃ^Ｓ、Ｃｍ^Ｓ）を示した。最後のｐＣＫ７候補物を、制限マッピングにより徹底的に検査した。対照プラスミドである、ｅｒｙＡＩでフレームシフト誤差を含むｐＣＫ７ｆを、同様の方法で構築した。ｐＣＫ７およびｐＣＫ７ｆを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７（ＭａｃＮｅｉｌ（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５６０７）に形質転換させて、メチル化されていないプラスミドＤＮＡを生成し、続いて、標準プロトコールを用いてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＣＨ９９９に移入した（Ｈｏｐｗｏｏｄら、（１９８５）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ：Ｎｏｒｗｉｃｈ）。
【０１８９】
Ｒ２ＹＥ培地でのＣＨ９９９／ｐＣＫ７の成長に伴い、微生物は、２つのポリケチド（図Ｘ）を大量に産生した。この成長培地にプロピオネート（３００ｍｇ／Ｌ）を添加することにより、ポリケチド産生物の収率が約２倍増加した。プロピオン酸−１−^１３Ｃ供給実験と共に、プロトンおよび^１３ＣＮＭＲスペクトル分析により、６ｄＥＢ（１７）としての主産生物が確認された（＞４０ｍｇ／Ｌ）。少量の産生物を、８，８ａ−デオキシオレアンドリド（１８）として同定し（＞１０ｍｇ／Ｌ）、これは、６ｄＥＢ生合成経路中のプロピオネートに代わるアセテート開始ユニットに由来するようである。^１３Ｃ_２酢酸ナトリウム供給実験により、（１８）へのアセテートの組込みが確認された。ＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２、およびＤＥＢＳ３であると推定される３つの高分子量タンパク質（＞２００ｋＤａ）（Ｃａｆｆｒｅｙら、（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０４：２２５）もまた、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ＣＨ９９９／ｐＣＫ７の粗抽出物中に確認された。ＣＨ９９９／ｐＣＫ７ｆからは、ポリケチド産生物が確認されなかった。
【０１９０】
それゆえ、新規ポリケチド、およびポリケチドを組換えに産生する方法が開示されている。本発明の好ましい実施態様がやや詳細に記載されているが、明らかな改変は、添付の請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から逸脱するこく行われることが理解される。
【０１９１】
【表１】

【０１９２】
【表２】

【０１９３】
【表３】

【０１９４】
【表４】

【０１９５】
【発明の効果】
本発明は、新規ポリケチド、ならびに組換え技術を用いて新しいポリケチドおよび公知のポリケチドの両方を効果的に生産する。特に、種々のポリケチドの産生を順番に触媒するポリケチドシンターゼを産生するために使用される新規な宿主−ベクター系を得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ａｃｔ、ｇｒａ、およびｔｃｍ ＰＫＳおよびシクラーゼの遺伝子クラスターを示す。
【図２】図２は、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＣＨ９９９を作製するためのストラテジーを示す。図２Ａは、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＣＨ１染色体に存在するａｃｔ遺伝子クラスターの構造を示す。図２Ｂは、ｐＬＲｅｍＥｔｓの構造を示し、そして図２Ｃは、ａｃｔ遺伝子クラスターが欠失したＣＨ９９９染色体の部分を示す。
【図３】図３は、プラスミドｐＲＭ５の図である。
【図４】図４は、実施例３に記載されているアロエサポナリンＩＩ（２）およびそのカルボキシル化アナログである３，８−ジヒドロキシ−１−メチルアントラキノン−２−カルボン酸（１）の形成を概略的に例示する。
【図５】図５は、実施例４で言及されているアクチノロジン（３）、グラナチシン（４）、テトラセノマイシン（５）およびムタクチン（ｍｕｔａｃｔｉｎ）（６）の構造を示す。
【図６】図６は、ポリケチド前駆体の環化による、実施例４のＡ部分に記載されているアロエサポナリンＩＩ（２）、そのカルボキシル化アナログである３，８−ジヒドロキシ−１−メチルアントラキノン−２−カルボン酸（１）、テトラセノマイシン（５）および新規化合物ＲＭ２０（９）の調製を概略的に示す。
【図７】図７は、ポリケチド前駆体の環化による、フレノリシン（７）、ナノマイシン（ｎａｎｏｍｙｃｉｎ）（８）およびアクチノロジン（３）の調製を概略的に示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ポリケチド前駆体の環化による、新規化合物ＲＭ２０（９）、ＲＭ１８（１０）、ＲＭ１８ｂ（１１）、ＳＥＫ４（１２）、ＳＥＫ１５（１３）、ＲＭ２０ｂ（１４）、ＲＭ２０ｃ（１５）およびＳＥＫ１５ｂ（１６）の調製を概略的に示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ポリケチド前駆体の環化による、新規化合物ＲＭ２０（９）、ＲＭ１８（１０）、ＲＭ１８ｂ（１１）、ＳＥＫ４（１２）、ＳＥＫ１５（１３）、ＲＭ２０ｂ（１４）、ＲＭ２０ｃ（１５）およびＳＥＫ１５ｂ（１６）の調製を概略的に示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ポリケチド前駆体の環化による、新規化合物ＲＭ２０（９）、ＲＭ１８（１０）、ＲＭ１８ｂ（１１）、ＳＥＫ４（１２）、ＳＥＫ１５（１３）、ＲＭ２０ｂ（１４）、ＲＭ２０ｃ（１５）およびＳＥＫ１５ｂ（１６）の調製を概略的に示す。
【図９】図９は、６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ（ＤＥＢＳ）の遺伝子モデルを示す。
【図１０】図１０は、組換えモジュールＰＫＳの構築のためのストラテジーを示す。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＣＫ７の図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
(Cross-reference of related applications)
This application is a continuation-in-part of US patent application Ser. No. 08 / 164,301 filed on Dec. 8, 1993, which is dated Sep. 20, 1993. US patent application Ser. No. 08 / 123,732, filed on Nov. 1, 2005, from which priority is claimed under 35 USC 120, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. Incorporated herein by reference.
[0002]
[Prior art]
(Technical field)
The present invention relates generally to polyketides and polyketide synthases. More particularly, the present invention relates to the recombinant production of polyketides using a novel host-vector system.
[0003]
(Background of the Invention)
Polyketides are a large, structurally diverse family of natural products. Polyketides have a wide range of biological activities including antibiotic and pharmacological properties. For example, polyketides are antibiotics such as tetracycline and erythromycin, anticancer agents including daunomycin, immunosuppressive agents (eg, FK506 and rapamycin), and veterinary products (eg, monensin ( monensin) and avermectin). Polyketides are present in most types of microorganisms and are particularly abundant in actinomycetes, a class of mycelial bacteria. This actinomycete produces various polyketides.
[0004]
Polyketide synthase (PKS) is a multifunctional enzyme associated with fatty acid synthase (FAS). PKS catalyzes the biosynthesis of polyketides through repeated Claisen condensation (decarboxylation) between acylthioesters (usually acetyl, propionyl, malonyl or methylmalonyl). Following each condensation, they are produced by catalyzing all or part of the reduction circuit, including keto reduction, dehydration, and enoyl reduction at the β-keto group of the growing polyketide chain, or not at all. Introduce structural changes into organisms. After the carbon chain has grown to the characteristic length of each particular product, it is released from the synthase by thiolysis or acyl transfer. Thus, PKS is composed of a family of enzymes that work together to produce a given polyketide. Contributing to the changes found in naturally occurring polyketides are chain lengths, chain building unit selection, and controlled changes in the reduction circuit, genetically programmed into each PKS.
[0005]
There are two general classes of PKS. One class is known as Type I PKS and is represented by PKS for macrolides such as erythromycin. These “complexes” or “modular” PKSs contain several multifunctional large protein assemblies, between these large proteins for each step of carbon chain assembly and modification. Has a separate set of active sites (Cortes, J. et al., Nature (1990) 348: 176; Donadio, S. et al., Science (1991) 252: 675; MacNeil, DJ et al., Gene (1992) 115 119). Structural diversity arises in this class from changes in the number and type of active sites in these PKSs. This class of PKS shows a one-to-one correlation between the number of active sites in the primary sequence of PKS and the clustering and polyketide backbone.
[0006]
The second class of PKS is called Type II PKS and is represented by synthases for aromatic compounds. Type II PKS has a single set of repetitively used active sites (Bibb, MJ et al., EMBO J. (1989) 8: 2727; Sherman, DH et al., EMBOJ. ( 1989) 8: 2717; Fernandez-Moreno, MA et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278).
[0007]
Streptomyces is an actinomycete that is a mass producer of aromatic polyketides. For each Streptomyces aromatic PKS studied to date, the carbon chain assembly requires the production of three open reading frames (ORFs). ORF1 encodes the active site of ketosynthase (KS) and acyltransferase (AT); ORF2 encodes a protein similar to the product of ORF1, but lacks the KS and AT motifs; Encodes an acyl carrier protein (ACP).
[0008]
Streptomyces coelicolor produces actinorhodin, a blue-colored polyketide. The actinorhodin gene cluster (act) has been cloned (Malpartida, F. and Hopwood, DA Nature (1984) 309: 462; Malpartida, F. and Hopwood, DA Mol. Gen. Genet. 1986) 205: 66) and fully sequenced (Fernandez-Moreno, MA et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278; Hallam, SE et al., Gene (1988). 74: 305; Fernandez-Moreno, MA et al., Cell (1991) 66: 769; Caballero, J. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 230: 401). This cluster specifically activates a series of regulatory enzymes involved in successive modification reactions leading to the PKS enzymes, cyclase and actinorhodin, as well as proteins involved in the export of this antibiotic and transcription of this gene cluster At least one protein to be encoded. Other genes required for the overall control of antibiotic biosynthesis and the supply of polyketide biosynthesis starting material (acetyl-CoA) and extender (malonyl-CoA) units can be found elsewhere in the genome. Located in.
[0009]
S. The act gene cluster derived from Coeliccolor It is used to produce actinorhodin in parvulus. Malpartida, F.M. And Hopwood, D .; A. Nature (1984) 309: 462). Bartel et al. (J. Bacteriol. (1990) 172: 4816-4826) is a S. cerevisiae strain consisting of four loci, actI, actIII, actIV and actVII. S. coli transformed with the coelicolor act gene cluster. gallaeus was used to recombinantly produce aloe saponarin. Hybrid PKS containing the basic act gene but having the ACP genes derived from granaticin, oxytetracycline, tetracenomycin and frenolicin PKS have also been designed, which contain functional synthases. It can be expressed. Khosla, C et al. Bacteriol. (1993) 175: 2197-2204. Hopwood, D.H. A. (Nature (1985) 314: 642-644) describe the production of hybrid polyketides using recombinant techniques. Sherman, D .; H. (J. Bacteriol. (1992) 174: 6184-6190) are trans and S. A variety of S. cerevisiae lacking different components of the act PKS gene cluster using the corresponding granaticin (gra) gene from violaceoruber. Reported transformation of coelicolor mutants.
[0010]
To date, however, recombinant production of polyketides using genetically engineered host cells that lack substantially all of the native PKS gene cluster has not been described.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to effectively produce both new polyketides and known polyketides using new polyketides and recombinant techniques.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
In one aspect, the invention provides a genetically engineered cell that expresses a polyketide synthase (PKS) gene cluster in its native, non-transformed state, wherein the genetically engineered cell is substantially all native. It relates to cells lacking the PKS gene cluster.
[0013]
In a preferred embodiment, the present invention is a genetically engineered cell that is a prokaryotic cell.
[0014]
In a further preferred embodiment, the present invention is the above-described genetically engineered cell which is an actinomycete.
[0015]
In a further preferred embodiment, the present invention is the above genetically engineered cell, which is an actinomycete of the genus Streptomyces.
[0016]
In a further preferred embodiment, the present invention is the above genetically engineered cell, which is a Streptomyces coelicolor.
[0017]
In a further preferred embodiment, the present invention is a genetically engineered cell substantially lacking the entire native actinorhodin PKS gene cluster.
[0018]
In a further preferred embodiment, the present invention is a genetically engineered cell equivalent to the CH999 strain.
[0019]
In a preferred embodiment, the present invention provides any of the genetically engineered cells described above, wherein:
(A) a substituted PKS gene cluster encoding PKS capable of catalyzing the synthesis of polyketides; and
(B) one or more regulatory sequences operably linked to the PKS gene cluster so that the gene in the gene cluster can be transcribed and translated in the genetically engineered cell; A control array,
However, when this replacement PKS gene cluster contains the entire PKS gene set, at least one PKS gene or regulatory component is a cell that is heterologous to this cell.
[0020]
In a further preferred embodiment, the present invention provides that the substituted PKS gene cluster encodes a first gene encoding the active site (KS / AT) of PKS ketosynthase and PKS acyltransferase, PKS chain length determinant (CLF). And a genetically engineered cell comprising a second gene encoding a PKS acyl carrier protein (ACP).
[0021]
In a further preferred embodiment, the present invention is the genetically engineered cell, wherein the replacement PKS gene cluster further comprises a fourth gene encoding PKS ketoreductase (KR).
[0022]
In a further preferred embodiment, the present invention is the genetically engineered cell, wherein the substituted PKS gene cluster further comprises a fifth gene encoding PKS cyclase (CYC).
[0023]
In a further preferred embodiment, the present invention is the genetically engineered cell, wherein the substituted PKS gene cluster further comprises a sixth gene encoding PKS dehydratase.
[0024]
In a more preferred embodiment, the present invention provides that the PKS KS / AT gene is actinorhodin KS / AT gene, granaticin KS / AT gene, tetrasenomycin KS / AT gene, frenolicin B KS / AT gene, oxytetracycline KS / AT The genetically engineered cell derived from a PKS KS / AT gene selected from the group consisting of an AT gene and a glyceucin KS / AT gene.
[0025]
In a further preferred embodiment, the present invention provides that the PKS CLF gene is selected from the group consisting of actinorhodin CLF gene, granaticin CLF gene, tetrasenomycin CLF gene, frenolicin B CLF gene, oxytetracycline CLF gene, and glyceusin CLF gene. The above-described genetically engineered cells derived from the PKS CLF gene.
[0026]
In a further preferred embodiment, the present invention provides that the PKS ACP gene is selected from the group consisting of actinorhodin ACP gene, granaticin ACP gene, tetrasenomycin ACP gene, frenolicin B ACP gene, oxytetracycline ACP gene, and glyceusin ACP gene. The genetically engineered cells derived from the PKS ACP gene.
[0027]
In a further preferred embodiment, the present invention provides that the PKS KR gene is selected from the group consisting of actinorhodin KR gene, granaticin KR gene, tetrasenomycin KR gene, frenolicin B KR gene, oxytetracycline KR gene, and glyceusin KR gene. The above-described genetically engineered cells derived from the PKS KR gene.
[0028]
In a further preferred embodiment, the present invention is the genetically engineered cell, wherein each of the first, second and third genes is contained in a separate expression cassette.
[0029]
In a further preferred embodiment, the present invention is the genetically engineered cell, wherein the additional expression cassette is present in a single vector.
[0030]
In a further preferred embodiment, the invention is the genetically engineered cell, wherein the additional expression cassette is present in two or more vectors.
[0031]
In a further preferred embodiment, the present invention provides that the replacement gene cluster comprises a first gene encoding PKS acyltransferase (AT), a second gene encoding PKS ketoacyl carrier protein synthase (KS), and a PKS acyl carrier. A third gene encoding a protein (ACP), a fourth gene encoding a PKS ketoreductase (KR), a fifth gene encoding a PKS dehydratase (DH), a second gene encoding a PKS enoyl reductase (ER) A genetically engineered cell comprising 6 genes and a seventh gene encoding thioesterase (TE).
[0032]
In a further preferred embodiment, the present invention is the genetically engineered cell, wherein the gene is derived from a 6-deoxyerythronolide B synthase gene cluster.
[0033]
In one aspect, the present invention is a method for producing a recombinant polyketide comprising:
(A) providing a population of any of the above cells; and
(B) culturing the population of cells under conditions that allow the replacement PKS gene cluster present in the cells to be expressed;
The method comprising:
[0034]
In one aspect, the present invention is a method for producing a recombinant polyketide comprising:
a. Inserting a first portion of a replacement PKS gene cluster into a donor plasmid and a second portion of the replacement PKS gene cluster into a receptor plasmid, wherein the first and second portions are Collectively encodes the complete replacement PKS gene cluster, where:
i. The donor plasmid encodes a first selectable marker and expresses a gene that can replicate at a first permissive temperature and cannot replicate at a second non-permissive temperature;
ii. The receptor plasmid expresses a gene encoding a second selectable marker; and
iii. The donor plasmid contains DNA regions in the acceptor plasmid so that homologous recombination can occur between the first part of the replacement PKS gene cluster and the second part of the replacement PKS gene cluster. Including a region of complementary DNA, whereby a complete replacement gene cluster can be generated;
b. Under the conditions that transform the host plasmid with the donor plasmid and the receptor plasmid and grow the host cell expressing the first permissive temperature and the first and / or the second selectable marker, Culturing the transformed host cells to produce a first population of cells;
c. Culturing the first population of cells under conditions that allow the cells that express the first non-permissive temperature and the first and / or the second selectable marker to grow, yield a second population of cells. A step, wherein the cell comprises a host cell comprising a recombinant plasmid comprising a complete PKS replacement gene cluster;
d. Transferring a recombinant plasmid from this second population of cells into the engineered cells of claim 1 to produce transformed, engineered cells; and
e. Culturing the transformed, genetically engineered cell under conditions such that the substituted PKS gene cluster present in the cell is expressed;
It is related with the method of including.
[0035]
In a preferred embodiment, the present invention further comprises culturing the second population of cells after step (c) under conditions that further expand the cells that express the first permissive temperature and the first selectable marker. It is the said method including the process to do.
[0036]
In a preferred embodiment, the present invention is the above method, wherein said first and second portions of said substituted PKS gene cluster are derived from a 6-deoxyerythronolide B synthase gene cluster.
[0037]
In a preferred embodiment, the invention is a polyketide produced by any of the methods described above.
[0038]
In one aspect, the present invention is a recombinant vector comprising the following:
(A) a DNA sequence comprising a module-replaced PKS gene cluster; and
(B) a control element operably linked to the DNA sequence, whereby the DNA sequence can be transcribed and translated in a host cell, and at least one of the control elements is heterologous to the nucleotide sequence. A control element,
And a recombinant vector.
[0039]
In a preferred embodiment, the present invention is the above recombinant vector, wherein the replacement gene cluster is a 6-deoxyerythronolide B synthase gene cluster.
[0040]
In one aspect, the present invention relates to plasmid pCK7.
[0041]
In a preferred embodiment, the present invention is a host cell transformed with any of the vectors described above.
[0042]
In one aspect, the invention provides the following structural formula:
[0043]
Embedded image

A polyketide compound having
here,
R¹Is selected from the group consisting of hydrogen and lower alkyl, and R²Is selected from the group consisting of hydrogen, lower alkyl, and lower alkyl ester, or R¹And R²Together form a lower alkylene bridge optionally substituted with 1 to 4 hydroxyl groups or lower alkyl groups;
R³And R⁵Are independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, lower alkyl, lower alkoxy, amino, lower alkyl mono- or di-substituted amino, and nitro;
R⁴Is selected from the group consisting of halogen, lower alkyl, lower alkoxy, amino, lower alkyl mono- or di-substituted amino, and nitro;
R⁶Is halogen, lower alkyl, and -CHR⁷-(CO) R⁸Wherein R is selected from the group consisting of⁷And R⁸Are independently selected from the group consisting of hydrogen and lower alkyl; and
i is a polyketide compound which is 1, 2 or 3;
[0044]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹Is lower alkyl; R², R³And R⁵Is hydrogen; R⁶Is -CHR⁷-(CO) -R⁸And wherein i is 0.
[0045]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹Is methyl and R⁶Is -CH₂-(CO) -CH₃Is the above compound.
[0046]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹And R⁶Is lower alkyl; R², R³And R⁵Wherein H is hydrogen; and i is 0.
[0047]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹And R⁶Is the above compound, wherein is methyl.
[0048]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹And R²Are linked together to form a lower alkylene bridge —CHR⁹-CHR¹⁰Where R⁹And R¹⁰Are the above compounds independently selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl, and lower alkyl.
[0049]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹And R²Are linked together to form a lower alkylene bridge —CH₂The above compounds that form —CHOH—.
[0050]
In a preferred embodiment, the present invention provides R³And R⁵Wherein H is hydrogen; and i is 0.
[0051]
In a further preferred embodiment, the present invention provides R⁶Is -CHR⁷-(CO) -R⁸Where R⁸Is the above compound, which is hydrogen or lower alkyl.
[0052]
In a further preferred embodiment, the present invention provides R⁶Is -CH₂-(CO) -CH₃Is the above compound.
[0053]
In a further preferred embodiment, the present invention provides R⁶In the above compounds, wherein is lower alkyl.
[0054]
In a further preferred embodiment, the present invention provides R⁶Is the above compound, wherein is methyl.
[0055]
In one aspect, the present invention provides the following structure:
[0056]
Embedded image

A polyketide compound formed by catalytic cyclization of an enzyme-linked ketide having
R¹¹Is methyl and -COCH₃Selected from the group consisting of:
R¹²Is selected from the group consisting of -SE and-(CO) -SE;
E is a polyketide compound representing a polyketide synthase produced by the genetically engineered cell of claim 8.
[0057]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹¹Is methyl and R¹²Are the above compounds wherein is -SE.
[0058]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹¹Is methyl and R¹²Is the above compound wherein-(CO) -SE.
[0059]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹¹-COCH₃And R¹²Is the above compound wherein-(CO) -SE.
[0060]
In one aspect, the present invention is a method for producing an aromatic polyketide having the following structure:
[0061]
Embedded image

A method comprising the step of cyclizing an enzyme-linked ketide having
here,
R¹¹Is methyl and -COCH₃Selected from the group consisting of:
R¹²Is selected from the group consisting of -SE and-(CO) -SE;
E represents a polyketide synthase produced by the genetically engineered cell of claim 8, wherein cyclization is induced by the polyketide synthase.
[0062]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹¹Is methyl and R¹²Is the above method wherein is -SE.
[0063]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹¹Is methyl and R¹²In the above process, wherein-(CO) -SE.
[0064]
In a preferred embodiment, the present invention provides R¹¹-COCH₃And R¹²In the above process, wherein-(CO) -SE.
[0065]
In one aspect, the invention provides the following structural formula:
[0066]
Embedded image

A polyketide compound having
here,
R²The moieties are independently selected from the group consisting of hydrogen, lower alkyl, and lower alkyl esters;
R⁴Is selected from the group consisting of halogen, lower alkyl, lower alkoxy, amino, lower alkyl mono- or di-substituted amino, and nitro; and
i is a polyketide compound which is 0, 1 or 2;
[0067]
In a preferred embodiment, the present invention provides R²In the above compounds, wherein is hydrogen and i is 0.
[0068]
In one aspect, the invention provides the following structural formula:
[0069]
Embedded image

A polyketide compound having
here,
R²The moieties are independently selected from the group consisting of hydrogen, lower alkyl, and lower alkyl esters;
R⁴Is selected from the group consisting of halogen, lower alkyl, lower alkoxy, amino, lower alkyl mono- or di-substituted amino, and nitro; and
i is a polyketide compound which is 0, 1 or 2;
[0070]
In a preferred embodiment, the present invention provides R²In the above compounds, wherein is hydrogen and i is 0.
[0071]
In one aspect, the invention provides the following structural formula:
[0072]
Embedded image

A polyketide compound having
here,
R²The moieties are independently selected from the group consisting of hydrogen, lower alkyl, and lower alkyl esters;
R⁴Is selected from the group consisting of halogen, lower alkyl, lower alkoxy, amino, lower alkyl mono- or di-substituted amino, and nitro; and
i is a polyketide compound which is 0, 1 or 2;
[0073]
In a preferred embodiment, the present invention provides R²In the above compounds, wherein is hydrogen and i is 0.
[0074]
In one aspect, the invention provides the following structural formula:
[0075]
Embedded image

It relates to a polyketide compound having
[0076]
In one aspect, the invention provides the following structural formula:
[0077]
Embedded image

It relates to a polyketide compound having
[0078]
In one aspect, the invention provides the following structural formula:
[0079]
Embedded image

It relates to a polyketide compound having
[0080]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(Summary of the Invention)
The present invention provides novel polyketides and novel methods for effectively producing both new and known polyketides using recombinant techniques. More specifically, PKSs that catalyze the production of various polyketides are also made using a novel host-vector system. Such polyketides are useful as antibiotics, antitumor agents, immunosuppressants, and for a wide variety of other pharmacological purposes.
[0081]
Accordingly, in one embodiment, the present invention relates to a genetically engineered cell that expresses a polyketide synthase (PKS) gene cluster in its native untransformed state, wherein the genetically engineered cell is substantially native. Lacks all the PKS gene clusters.
[0082]
In another embodiment, the present invention relates to the aforementioned genetically engineered cell, wherein said cell is
(A) a substituted PKS gene cluster encoding PKS capable of catalyzing the synthesis of polyketides; and
(B) one or more regulatory sequences operably linked to the PKS gene cluster so that the genes in the gene cluster can be transcribed and translated in the engineered cell; Control array,
However, when the replacement PKS gene cluster includes the entire PKS gene set, at least one PKS gene or regulatory element is heterologous to the cell.
[0083]
In a particularly preferred embodiment, the genetically engineered cell is a Streptomyces coelicolor, which is substantially devoid of the entire native actinorhodin PKS gene cluster, and the replacement PKS gene cluster is a PKS ketosynthase and a PKS acylase. Includes a first gene encoding the active site of a transferase (KS / AT), a second gene encoding a PKS chain length determinant (CLF), and a third gene encoding a PKS acyl carrier protein (ACP) .
[0084]
In another embodiment, the invention relates to a method for producing a recombinant polyketide, which method comprises the following steps:
(A) providing a population of said cells; and
(B) culturing a population of cells under conditions that allow the replacement PKS gene cluster present in the cells to be expressed.
[0085]
In yet another embodiment, the invention relates to a method for producing a recombinant polyketide, which method comprises the following steps:
a. Inserting a first portion of a replacement PKS gene cluster into a donor plasmid and a second portion of the replacement PKS gene cluster into a receptor plasmid, wherein the first and second portions are Collectively encodes the complete replacement PKS gene cluster, where:
i. The donor plasmid encodes a first selectable marker and expresses a gene that can replicate at a first permissive temperature and cannot replicate at a second non-permissive temperature;
ii. The receptor plasmid expresses a gene encoding a second selectable marker; and
iii. This donor plasmid is a region of DNA complementary to the DNA region in the acceptor plasmid so that homologous recombination can occur between the first part of the replacement PKS gene cluster and the second part of the replacement gene cluster. Whereby a complete replacement gene cluster can be produced;
b. A transformed host cell under conditions that transform the donor and acceptor plasmids into the host cell and grow the host cell expressing the first permissive temperature and the first and / or second selectable marker. Culturing the cells to produce a first population of cells;
c. The first population of cells is cultured to produce a second population of cells under conditions that allow growth of host cells that express the second non-permissive temperature and the first and / or second selectable marker. A step, wherein the cell comprises a host cell containing a recombinant plasmid comprising a complete PKS replacement gene cluster;
d. Transferring a recombinant plasmid from a second population of cells into the genetically engineered cells of claim 1 to produce transformed and genetically engineered cells; and
e. Culturing the transformed and genetically engineered cells under conditions that allow the replacement PKS gene cluster present in the cells to be expressed.
[0086]
In yet another embodiment, the present invention relates to a polyketide compound having the structural formula (I):
[0087]
Embedded image

here,
R¹Is selected from the group consisting of hydrogen and lower alkyl, and R²Is selected from the group consisting of hydrogen, lower alkyl and lower alkyl esters, or R¹And R²Together form a lower alkylene bridge optionally substituted with 1 to 4 hydroxyl groups or lower alkyl groups;
R³And R⁵Are independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, lower alkyl, lower alkoxy, amino, lower alkyl mono- or di-substituted amino and nitro;
R⁴Is selected from the group consisting of halogen, lower alkyl, lower alkoxy, amino, lower alkyl mono- or di-substituted amino and nitro;
R⁶Is hydrogen, lower alkyl, and -CHR⁷-(CO) R⁸Wherein R is selected from the group consisting of⁷And R⁸Are independently selected from the group consisting of hydrogen and lower alkyl; and
i is 1, 2 or 3.
[0088]
In another embodiment, the present invention relates to a novel polyketide having the following structure:
[0089]
Embedded image

[0090]
Embedded image

In another embodiment, the present invention relates to a compound polyketide formed by catalytic cyclization of an enzyme linked ketide having structure (II):
[0091]
Embedded image

here,
R¹¹Is methyl, —CH₂(CO) CH₃And -CH₂(CO) CH₂(CO) CH₃Selected from the group consisting of:
R¹²Are -SE and -CH₂Selected from the group consisting of (CO) -SE, where E represents a polyketide synthase produced by the genetically engineered cell; and
R¹³And R¹⁴One is hydrogen and the other is hydroxyl, or R¹³And R¹⁴Both represent carbonyl.
[0092]
In yet another embodiment, the invention relates to a method of producing an aromatic polyketide, the method comprising the step of cyclizing an enzyme-linked ketide having structure (II), wherein the cyclization comprises Induced by polyketide synthase.
[0093]
In a further embodiment, the present invention relates to a polyketide compound having the structural formula (III):
[0094]
Embedded image

Where R²And R⁴Is the same as defined above, and i is 0, 1 or 2.
[0095]
In another embodiment, the invention relates to a polyketide compound having the structural formula (IV):
[0096]
Embedded image

Where R², R⁴And i are as defined above for structural formula (III).
[0097]
In yet another embodiment, the invention relates to a polyketide compound having the structural formula (V):
[0098]
Embedded image

Where R², R⁴And i are the same as defined above for structural formula (III).
[0099]
These and other embodiments of the invention will be readily apparent to those of ordinary skill in the art in view of the disclosure herein.
[0100]
(Detailed description of the invention)
The practice of the present invention utilizes methods conventional within the art of chemistry, microbiology, molecular biology and recombinant DNA technology, unless otherwise indicated. Such techniques are fully disclosed in the literature. For example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (latest edition); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. Glover edition); See B. Hames and S. Higgins, latest edition); Transcribation and Translation (B. Hames and S. Higgins edition, latest edition).
[0101]
All publications, patents and patent applications cited herein, whether cited above or below, are hereby incorporated by reference in their entirety.
[0102]
As used herein and in the appended claims, the singular forms “a”, “an”, and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a polyketide” includes a mixture of polyketides, and the expression “a polyketide synthase” includes a mixture of polyketide synthases.
[0103]
(A. Definition)
In describing the present invention, the following terms are used and are intended to be defined as indicated below.
[0104]
A “replacement PKS gene cluster” is a PKS capable of producing a functional PKS in a host cell transformed therewith under the control of one or more compatibility control elements as defined below. Means every set of genes. Functional PKS catalyzes the synthesis of polyketides. The term “replaced PKS gene cluster” includes genes encoding one or more of the various proteins required to catalyze the production of polyketides. A “replacement PKS gene cluster” need not encompass all genes found in the corresponding natural cluster. Rather, this gene cluster need only encode the PKS components necessary to catalyze the production of active polyketides. Therefore, as described further below, this gene cluster includes, for example, 8 genes in the native state, and only 3 of these genes are necessary to provide active polyketides. Only the presence of these three genes is necessary. In addition, this cluster may include a PKS gene from a single species, or in effect, for example, for the synthesis of a specific polyketide that is replaced with a corresponding gene from a cluster for the synthesis of other polyketides. It may be a hybrid having a gene derived from the cluster. A hybrid cluster may include genes from both type I PKS and type II PKS. As noted above, Type I PKS includes some large multifunctional proteins with a separate set of active sites for each step of carbon chain assembly and modification. On the other hand, Type II PKS has a single set of active sites that are used repeatedly. These classifications are well known. For example, Hopwood, D .; A. And Khosla, C.I. Secondary metabolites: tear function and evolution (1992) Wiley Churcher (Ciba Foundation Symposium 171), pages 88-112; Bibb, M. et al. J. et al. Et al., EMBO J. et al. (1989) 8: 2727; Sherman, D .; H. Et al., EMBO J. et al. (1989) 8: 2717; Fernandez-Moreno, M .; A. Et al. Biol. Chem. (1992) 267: 19278); Cortes, J. et al. Et al., Nature (1990) 348: 176; Donadio, S .; Science (1991) 252: 675; MacNeil, D. et al. J. et al. Et al., Gene (1992) 115: 119. Hybrid clusters are exemplified herein and are further described below. The genes included in the gene cluster need not be native genes, but can be variants or analogs thereof. Variants or analogs can be prepared by deletion, insertion or substitution of one or more nucleotides of the coding sequence. Techniques for modifying nucleotide sequences (eg, site-directed mutagenesis) are described, for example, in Sambrook et al., Supra; DNA Cloning, Volumes I and II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
[0105]
“Substituted PKS gene clusters” may also contain genes encoding modifications to core polyketides catalyzed by PKS, including, for example, hydroxylases, methylases or other alkylases, oxidases, reductases, glycosyls. Examples include genes encoding transferases, lyases, ester or amide synthases, and various hydrolases (eg, esterases and amidases).
[0106]
As described further below, genes included in a replacement gene cluster need not be present on the same plasmid, or can be controlled by the same or different regulatory sequences if present on the same plasmid.
[0107]
“Gene engineered host cell” means a host cell in which the native PKS gene cluster has been deleted using recombinant DNA technology. The term therefore does not encompass naturally occurring mutational events. A “host cell” is a cell derived from a prokaryotic microorganism or eukaryotic cell line that is cultured as a unicellular union, which can be used as a receptor for a recombinant vector having the PKS gene cluster of the present invention, or Have been used. The term encompasses the progeny of the original cell that has been transfected. It is understood that the progeny of a single parent cell may not be completely identical in its morphology or genomic DNA or total DNA complement to the original parent cell due to accidental or deliberate mutations. Descendants of this parent cell that are sufficiently similar to the parent cell characterized by the relevant properties (eg, the presence of a nucleotide sequence encoding the desired PKS) are included in this definition and covered by the term.
[0108]
The term “heterologous” refers to a sequence that is not normally associated with a region of a recombinant construct and / or a sequence that is not normally associated with a particular cell when it relates to nucleic acid sequences such as coding and regulatory sequences. . Thus, a “heterologous” region of a nucleic acid construct is an identifiable segment of nucleic acid that is not found in or associated with other nucleic acid molecules in natural association with other molecules. . For example, a heterologous region of a construct can include a coding sequence that is flanked by sequences that are not found in natural association with the coding sequence. Another example of a heterologous coding sequence is a construct in which the coding sequence itself (eg, a synthetic sequence having a codon different from the native gene) is not found in nature. Similarly, a host cell transformed with a construct not normally present in the host cell is considered heterologous for the purposes of the present invention. As used herein, allelic variations or naturally occurring mutational events do not produce heterologous DNA.
[0109]
A “coding sequence” or a sequence that “encodes” a particular PKS is transcribed (in the case of DNA) and translated into a polypeptide when placed under the control of appropriate regulatory sequences in vitro or in vivo ( In the case of mRNA) a nucleic acid sequence. The boundaries of the coding sequence are determined by a start codon at the 5 '(amino) terminus and a translation stop codon at the 3' (carboxy) terminus. Coding sequences can include, but are not limited to, cDNA from prokaryotic or eukaryotic mRNA, genomic DNA sequences from prokaryotic or eukaryotic DNA, and even synthetic DNA sequences. A transcription termination sequence will usually be located 3 'to the coding sequence.
[0110]
“Nucleic acid” sequences can include, but are not limited to, prokaryotic sequences, eukaryotic mRNA, cDNA from eukaryotic mRNA, genomic DNA sequences from eukaryotic (eg, mammalian) DNA, and even synthetic DNA sequences. The term also encompasses sequences that include known base analogs of any DNA and RNA. These base analogs include, for example, 4-acetylcytosine, 8-hydroxy-N6-methyladenosine, aziridinylcytosine, pseudoisocytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil. 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methyladenine, 1-methylpseudouracil, 1-methylguanine, 1- Methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-methyladenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxy amino Tyl-2-thiouracil, β-D-mannosylqueosine, 5′-methoxycarbonylmethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid Methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid, oxybutoxocin, pseudouracil, queosine, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, N-uracil Examples include, but are not limited to, methyl 5-oxyacetate, uracil-5-oxyacetic acid, pseudouracil, cuocin, 2-thiocytosine, and 2,6-diaminopurine. A transcription termination sequence will usually be located 3 'to the coding sequence.
[0111]
A DNA “control sequence” collectively means a promoter sequence, a ribosome binding site, a polyadenylation signal, a transcription termination sequence, an upstream regulatory domain, an enhancer, etc., which are responsible for transcription and translation of a coding sequence in a host cell. Provide collectively. As long as the desired gene can be transcribed and translated, not all of these regulatory sequences need necessarily be present in the recombinant vector.
[0112]
“Operably linked” means the arrangement of elements, where the components thus described are arranged to perform their normal functions. Thus, a control sequence operably linked to the coding sequence can effect the expression of this coding sequence. The control sequences need not be contiguous with the coding sequence so long as they directly affect its expression. Thus, for example, an untranslated but transcribed intervening sequence may exist between the promoter sequence and the coding sequence, and the promoter sequence is still considered “operably linked” to the coding sequence. Can be.
[0113]
“Selectable marker” means any genetic marker that can be used to select a population of cells having the marker in their genome. Examples of selectable markers include auxotrophic markers, which are selected by the ability of cells to grow in minimal media with or without nutrients or supplements (eg, thymidine, diaminopimelic acid or biotin) A metabolic marker (which allows the cell to be selected by its ability to grow in minimal medium containing the appropriate sugar as the sole carbon source, or the ability of the cell to form a staining colony containing the appropriate dye or staining substrate) And a drug resistance marker (this marker allows cells to select by this ability to grow in media containing one or more appropriate drugs (eg, tetracycline, ampicillin, kanamycin, streptomycin or nalidixic acid) Is).
[0114]
“Recombinant” is the reassembly of a segment of DNA sequence between two DNA molecules. “Homologous recombination” occurs between two DNA molecules that hybridize by homologous or complementary nucleotide sequences present in each DNA molecule.
[0115]
As used herein, the term “alkyl” refers to a branched or unbranched saturated hydrocarbon group of 1 to 24 carbon atoms (eg, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, octyl, decyl, tetradecyl, hexadecyl, eicosyl, tetraeicosyl, etc.). Preferred alkyl groups herein contain 1 to 12 carbon atoms. The term “lower alkyl” intends an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms.
[0116]
The term “alkylene” as used herein means a difunctional saturated branched or unbranched hydrocarbon chain containing 1 to 24 carbon atoms, including Is, for example, methylene (—CH₂-), Ethylene (-CH₂-CH₂-), Propylene (-CH₂-CH₂-CH₂-), 2-methylpropylene [-CH₂-CH (CH)₃-CH₂-], Hexylene [-(CH₂)₆-] And the like. “Lower alkylene” means an alkylene group of 1 to 6, more preferably 1 to 4 carbon atoms.
[0117]
As used herein, the term “alkoxy” intends an alkyl group attached through a single terminal ether linkage; that is, an “alkoxy” group may be defined as —OR, where R is alkyl as defined above. By “lower alkoxy” group is intended an alkoxy group containing 1 to 6, more preferably 1 to 4 carbon atoms.
[0118]
“Halo” or “halogen” intends fluoro, chloro, bromo or iodo and usually relates to halo substitution of a hydrogen atom in an organic compound. Of the halos, chloro and fluoro are generally preferred.
[0119]
“Any” or “optionally” means that the event or situation described below may or may not occur, and the specification includes examples where the event or situation occurs and examples that do not occur means. For example, the expression “optionally substituted alkylene” means that the alkylene moiety may or may not be substituted, and this specification includes both unsubstituted and substituted alkylene. To do.
[0120]
(B. General method)
The core of the present invention is the discovery of a host-vector system for the effective recombinant production of both new and known polyketides. In particular, the present invention utilizes genetically engineered cells in which the naturally occurring PKS gene is substantially deleted. These host cells can be transformed with recombinant vectors encoding various PKS gene clusters for the production of active polyketides. The present invention provides for the production of large quantities of product at the appropriate stage of the growth cycle. The polyketides thus produced can be used to treat many diseases as therapeutic agents, depending on the type of polyketide in question. For example, some polyketides produced by this method find use as immunosuppressants, anti-tumor agents, and for the treatment of viral, bacterial and parasitic infections. The ability to produce polyketides recombinantly also provides a powerful tool to characterize PKS and their mechanism of action.
[0121]
More particularly, a host cell for recombinant production of a subject polyketide can be derived from any organism capable of hosting a recombinant PKS gene cluster. Therefore, the host cells of the present invention can be derived from either prokaryotes or eukaryotes. However, preferred host cells are those constructed from actinomycetes, a class of mycelial bacteria that are mass producers of many polyketides. A particularly preferred genus for use with the system of the present invention is Streptomyces. Thus, for example, S.M. ambfaciens, S .; avermitilis, S. et al. azureus, S .; cinnamonensis, S. et al. coelicolor, S.M. curakoi, S .; erythraeus, S .; fradiae, S .; galilaeus, S .; glacescens, S. et al. hygroscopicus, S.H. lividans, S .; parvulus, S. et al. peucetius, S .; rimousus, S .; rosefulfulus, S. et al. thermotolerans, S. et al. violaceruber et al. provide convenient host cells for the present invention. Coelicolor is preferred. (See, eg, Hopwood, DA and Sherman, DH Ann. Rev. Genet. (1990) 24: 37-66; O'Hagan, D. The Polyketide Metabolites (Ellis Horwood Limited, 1991). (See description of polyketide producing organisms and their natural products).
[0122]
The cells are engineered by deleting the naturally occurring PKS gene from this cell using standard techniques (eg, by homologous recombination). (See, eg, Khosla, C. et al., Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237). Exemplified herein is genetically engineered S. cerevisiae. coelicolor host cells. S. The native strain of coelicolor produces PKS that catalyzes the biosynthesis of the aromatic polyketide actinorosin (Structure 3, FIG. 5). S., a new strain coelicolor CH999 (described in FIG. 2C, and in the examples) was obtained from S. coli by homologous recombination. It was constructed by deleting all natural act clusters from the chromosome of coelicolor CH1 (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237). This strain lacks the endogenous plasmid and other colored S. cerevisiae. It has a stable mutation that blocks the biosynthesis of the coelicolor antibiotic, undecylprodigiosin.
[0123]
The above host cells can be transformed with one or more vectors, thereby collectively encoding a functional PKS set. The vector may include a native or hybrid combination of PKS subunits or variants thereof. As explained above, the replacement gene cluster need not match the complete native gene cluster, but only need to encode the necessary PKS components that catalyze the production of polyketides. For example, for each Streptomyces aromatic PKS studied to date, the carbon chain assembly requires three open reading frame (ORF) products. ORF1 encodes the active site (KS / AT) of ketosynthase (KS) and acyltransferase (AT); as revealed herein, ORF2 is a chain length determinant (CLF) (ORF1 Protein), but lacks the KS and AT motifs; and ORF3 encodes another acyl carrier protein (ACP). Some gene clusters also encode ketoreductases (KR) and cyclases that are involved in cyclization of the nascent polyketide backbone. (See schematic diagram of three PKS gene clusters in FIG. 1). However, it was found that only KS / AT, CLF, and ACP need to be present in order to produce identifiable polyketides. Therefore, in the case of aromatic PKS from Streptomyces, these three genes are contained in one or more recombinant vectors without any other components of the native cluster, and the “minimal” replacement PKS gene. A cluster can be constructed.
[0124]
In addition, the recombinant vector may contain genes from a single PKS gene cluster or may contain a hybrid replacement PKS gene cluster, for example, this cluster may have genes for one cluster from other gene clusters. It has been replaced with the corresponding gene. For example, it has been found that ACPs can be easily exchanged between different synthases without affecting the structure of the product. Furthermore, a given KR can recognize and reduce polyketide chains of different chain lengths. Thus, these genes can be freely exchanged in the constructs described herein. Therefore, the replacement clusters of the present invention can be derived from any combination of PKS gene sets that ultimately function to produce identifiable polyketides.
[0125]
Examples of hybrid substitution clusters include two or more act gene clusters, frenolicin (fren), granaticin (gra), tetrasenomycin (tcm), 6-methylsalicylic acid (6-msas), oxytetracycline (otc) , Tetracycline (tet), erythromycin (ery), glyceusin, nanaomycin, medermycin, daunorubicin, tyrosine, carbomycin, carbomycin, carbomycin Avermectin, monensin, nonactin, kurama Shin (curamycin), include clusters with genes derived from rifamycin (rifamycin) and candicidin (candicidin) synthase gene cluster other. (For a discussion of various PKS, see, for example, Hopwood, DA and Sherman, DH Ann. Rev. Genet. (1990) 24: 37-66; O'Hagan, D. The Polyketide Metabolites (Ellis). See Horwood Limited, 1991)).
[0126]
More specifically, a number of hybrid gene clusters are constructed herein, which have components from the act, fren, tcm and gra gene clusters, as shown in Tables 1 and 2. Some hybrid clusters are Both new and known polyketides could be functionally expressed in coelicolor CH999 (above). However, as noted above, other hybrid gene clusters can be readily produced and screened using the disclosure herein for the production of identifiable polyketides. For example, from a collection of actinomycetes, a library of randomly cloned ORF1 and 2 homologs could be constructed and screened for identifiable polyketides. Longer polyketides could also be circularized by replacing, for example, the act, gra, fren, or tcm cyclase genes with homologs from the PKS gene cluster that produce the correct length chain. Finally, there is a considerable degree of variation in the non-acetate starter units between certain naturally occurring aromatic PKSs; therefore these units are also used to obtain new polyketides by genetic engineering. Can be used.
[0127]
In addition, the recombinant vector may include genes from the modular PKS gene cluster. Such gene clusters are described in further detail below.
[0128]
A recombinant vector having the above gene cluster can be conveniently generated using techniques known in the art. For example, the PKS subunit of interest comprises this gene from an organism that expresses the PKS subunit using recombinant methods, for example, by screening a cDNA or genomic library derived from a cell that expresses the gene. It can be obtained by obtaining this gene from a known vector. The gene can then be isolated and combined with other desired PKS subunits using standard techniques. If the gene in question is already present in a suitable expression vector, it can be combined as desired in situ with other PKS subunits, for example. The gene of interest can also be produced synthetically rather than cloned. Nucleotide sequences can be designed with the appropriate codons for the particular amino acid sequence desired. In general, a codon suitable for the intended host in which the sequence is expressed is selected. The complete sequence is assembled from overlapping oligonucleotides prepared by standard methods and assembled into a complete coding sequence. See, for example, Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J. MoI. Biol. Chem. 259: 6311.
[0129]
Mutations can be made to the native PKS subunit sequence, and such variants can function together with other PKS subunits and collectively catalyze the synthesis of identifiable polyketides. As long as it can be used instead of the native sequence. Such mutations are native using, for example, conventional techniques by preparing synthetic oligonucleotides with mutations and inserting the mutated sequence into the gene encoding the PKS subunit using restriction endonuclease digestion. Can be created into an array. (See, eg, Kunkel, TA Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 448; Geisselsoder et al., BioTechniques (1987) 5: 786). Alternatively, mutations can be made using mismatched primers (generally 10-20 nucleotides in length), which are native nucleotide sequences (typically corresponding to RNA sequences) at temperatures below the melting temperature of the mismatched duplex. To cDNA). This primer can be made specifically by keeping the length and base composition of the primer within relatively narrow limits and by centering the mutant base. Zoller and Smith, Methods Enzymol. (1983) 100: 468. Primer extension is performed using a DNA polymerase, the product is cloned, and a clone is selected that contains the mutated DNA obtained from the separation of the extended strands of the primer. Selection can be done using the mutant primer as a hybridization probe. This technique can also be applied to generate multiple point mutations. See, for example, Dalbie-McFarland et al., Proc. Natl. Acad. See SciUSA (1982) 79: 6409. PCR mutagenesis will also find use for making the desired mutations.
[0130]
Gene sequences that collectively encode a replacement PKS gene cluster can be inserted into one or more expression vectors using methods known to those of skill in the art. The expression vector includes control sequences operably linked to the desired PKS coding sequence. Suitable expression systems for use in the present invention include systems that function in eukaryotic and prokaryotic host cells. However, as explained above, prokaryotic systems are preferred, and in particular, Streptomyces spp. A system compatible with is particularly important. The control elements for use in such a system include a promoter that optionally includes an operator sequence, and a ribosome binding site. Particularly useful promoters include regulatory sequences from the PKS gene cluster, such as one or more act promoters. However, other bacterial promoters, such as promoters derived from sugar metabolizing enzymes such as galactose, lactose (lac) and maltose, will also find use in the constructs of the present invention. Further examples include promoter sequences from tryptophan (trp), β-lactamase (bla) promoter system, bacteriophage λPL, and biosynthetic enzymes such as T5. In addition, synthetic promoters, such as the tac promoter (US Pat. No. 4,551,433), also do not occur in nature but function in bacterial host cells.
[0131]
Other regulatory sequences may also be desired, which allow for regulation of the expression of the PKS replacement sequence relative to the growth of the host cell. Regulatory sequences are known to those skilled in the art, and examples of this are regulation that causes gene expression to turn on or off in response to chemical or physical stimuli, including the presence of regulatory compounds. Contains an array. Other types of regulatory elements (eg, enhancer sequences) may also be present in the vector.
[0132]
A selectable marker can also be included in the recombinant expression vector. Various markers are known which are useful in the selection of transformed cell lines and generally include genes whose expression gives a selectable phenotype on transformed cells when the cells are grown in an appropriate selective medium. is there. Such markers include, for example, genes that confer antibiotic resistance or sensitivity to the plasmid. Alternatively, some polyketides are naturally colored and this feature provides a built-in marker for selecting cells that have been successfully transformed with the constructs of the invention.
[0133]
The various PKS subunits of interest can be cloned into one or more recombinant vectors together with other control elements or as a cassette, for example under the control of a single promoter. The PKS subunit contains flanking restriction sites, allowing easy deletion and insertion of other PKS subunits so that hybrid PKS can be generated. The design of such unique restriction sites is known to those skilled in the art and can be accomplished using the techniques described above, such as site-directed mutagenesis and PCR.
[0134]
Using these techniques, a novel plasmid pRM5 (FIG. 3 and Example 2) was constructed as a shuttle vector for the production of the polyketides described herein. Plasmid pRM5 contains the act gene encoding KS / AT (ORF1), CLF (ORF2) and ACP (ORF3) PKS subunits flanked by PacI, NsiI and XbaI restriction sites. Thus, an analog PKS subunit encoded by other PKS genes can easily replace the existing act gene. (See, eg, Example 4 which describes the construction of a hybrid vector using pRM5 as the parent plasmid). The shuttle plasmid also contains the actKR gene (actIII), the cyclase gene (actVII), and the putative dehydratase gene (actIV), as well as the ColEI replicon (allowing transformation of E. coli), the appropriate truncated SCP2^*(Low copy number) Contains the Streptomyces replicon, and the actII-ORF4 activator gene from the act cluster (which induces transcription from the act promoter during the transition from growth phase to stationary phase in vegetative mycelia). pRM5 has a variety of actI / actIII promoter pairs.
[0135]
Methods for introducing the recombinant vectors of the invention into suitable hosts are known to those of skill in the art and are typically CaCl.₂Or the use of divalent cations and other agents such as DMSO. DNA can also be introduced into bacterial cells by electroporation. Once PKS is expressed, polyketide producing colonies can be identified and isolated using known techniques. The produced polyketide can then be further characterized.
[0136]
As explained above, the above recombinant methods also find utility in the catalytic biosynthesis of polyketides by large modules PKS. For example, 6-deoxyerythronolide B synthase (DEBS) catalyzes the biosynthesis of 6-deoxyerythronolide B (17), an erythromycin aglycone. Three open reading frames (eryAI, eryAII, and eryAIII) encode the DEBS polypeptide and span 32 kb in the ery cluster of the Saccharopolysporaerythrea genome. This gene is organized in six repeating units, each called a “module”. Each module encodes a set of active sites that catalyze the condensation of additional monomers onto the growing chain during polyketide biosynthesis. Each module consists of acyltransferase (AT), β-ketoacyl carrier protein synthase (KS), and acyl carrier protein (ACP), and a subset of reducing active sites (β-ketoreductase (KR), dehydratase (DH), Noyl reductase (ER)) (FIG. 9). The number of reducing sites in the module corresponds to the degree of β-keto reduction in each condensation cycle. The thioesterase (TE) encoded at the end of the module appears to catalyze lactone formation.
[0137]
Due to the large size of eryAI, eryAII and eryAIII, and the presence of multiple active sites, these genes are suitable for expression in genetically engineered host cells, such as CH999, using in vivo recombination techniques. It can be conveniently cloned into a plasmid. This technique described in Example 5 and summarized in FIG. 10 utilizes a derivative of plasmid pMAK705 (Hamilton et al., (1989) J. Bacteriol. 171: 4617) and uses a temperature sensitive donor plasmid (first permissive plasmid). In vivo recombination between the receptor plasmid and the receptor plasmid). The eryA gene thus cloned gives the derivative pCK7 of pRM5 (McDaniel et al. (1993) Science 262: 1546). Control plasmid pCK7f was constructed to introduce a frameshift mutation in eryAI. pCK7 and pCK7f are ColEI replicon for genetic manipulation in E. coli and truncated SCP2^*(Low copy number) Has a Streptomyces replicon. These plasmids also contain various actI / actIII promoter pairs and actII-ORF4 (activator genes that are required for transcription from these promoters and activate expression during the transition from growth phase to stationary phase in vegetative mycelia )including. High level expression of the PKS gene occurs at the beginning of the stationary phase of mycelial growth; thus, the recombinant strain produces the “reporter” polyketide as a secondary metabolite, as if naturally.
[0138]
Other polyketides are produced as secondary metabolites such as saccharides, β-lactams, fatty acids, aminoglycosides, terpenoids, non-ribosomal peptides, prostanoid hormones, etc. using the above-described method for producing large, polyketides synthesized by modular PKS Can be done.
[0139]
A number of polyketides were produced using the recombinant methods described above. These compounds have the following general structure (I)
[0140]
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Where R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸And i are as defined above. One group of such compounds is here: R¹Is lower alkyl, preferably methyl; R², R³And R⁶Is hydrogen; R⁶Is -CHR⁷-(CO) -R⁸And i is 0. A second group of such compounds is here: R¹And R⁶Is lower alkyl, preferably methyl; R², R³And R⁵Is hydrogen; and i is 0. A third group of such compounds is here: R¹And R²Are linked together to form a lower alkylene bridge —CHR⁹-CHR¹⁰Where R⁹And R¹⁰Are independently hydrogen, hydroxyl and lower alkyl (eg, —CH₂Selected from the group consisting of -CHOH-); R³And R⁵Is hydrogen; R⁶Is -CHR⁷-(CO) -R⁸Where R⁸Is hydrogen or lower alkyl (eg, —CH₂-(CO) -CH₃And i is 0. Particular examples of such compounds include the following compounds 9, 10 and 11 as follows:
[0141]
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Other novel polyketides within the scope of the present invention have the following structure:
[0142]
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[0143]
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The preparation of compounds 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 and 16 is performed by cyclization of an enzyme-linked polyketide having structure (II):
[0144]
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Where R¹¹, R¹², R¹³And R¹⁴And E are the same as defined above. Examples of such compounds include: R¹¹Is methyl and R¹²Is -CH₂The first group is (CO) -SE; R¹¹Is -CH₂(CO) CH₃And R¹²The second group wherein is -SE; R¹¹Is -CH₂(CO) CH₃And R¹²Is -CH₂A third group that is (CO) -SE; and R¹¹Is -CH₂(CO) CH₂(CO) CH₃And R¹²Is -CH₂A fourth group is (CO) -SE (see the specific example of the structure of FIG. 8).
[0145]
The remaining structures included in general formula (I), ie structures other than 9, 10 and 11, are prepared from structures 9, 10 or 11 using conventional organic synthesis methods well known to those skilled in the art of organic chemistry. Can be done. These methods are described, for example, in H.H. O. Modern Synthetic Reactions by House, 2nd edition (Menlo Park, CA: The Benjamin / Cummings Publishing Company, 1972), or J. Am. March, Advanced Organic Chemistry: Reaction, Mechanisms and Structure, 4th edition (New York: Wiley-Interscience, 1992), the disclosures of which are incorporated herein by reference. Typically, as will be appreciated by those skilled in the art, incorporation of substituents into the aromatic ring involves a simple electrophilic aromatic addition reaction. Structures 12 and 13 can be modified in a similar manner to produce polyketides. These polyketides are also intended to be within the scope of the present invention.
[0146]
In addition, using the above recombinant methods, polyketide compounds having the following general formula were produced:
Formula (III)
[0147]
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Formula (IV)
[0148]
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And general formula (V)
[0149]
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Particularly preferred compounds of structural formulas (III), (IV) and (V) are R²Is hydrogen and i is 0.
[0150]
C. Experiment
The following are examples of specific embodiments for carrying out the present invention. These examples are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention in any way.
[0151]
Efforts have been made to ensure accuracy of the numbers used (eg amounts, temperature, etc.) but some experimental errors and deviations should of course be allowed for.
[0152]
(Materials and methods)
(Bacterial strains, plasmids, and culture conditions) coelicolor CH999 was used as the host for transformation with all plasmids. The construction of this strain is described below. DNA manipulations were performed in Escherichia coli MC1061. The plasmid was transformed into E. coli. E. coli ET12567 (dam dcm hsdS Cm^r) (MacNeil, DJJ Bacteriol. (1988) 170: 5607). Unmethylated DNA was generated prior to transformation of coelicolor. E. E. coli strains were grown under standard conditions. S. coelicolor strains were grown on R2YE agar plates (Hopwood, DA, et al., Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Inns Foundation, 1983).
[0153]
Manipulation of DNA and microorganisms. Polymerase chain reaction (PCR) was performed using Taq polymerase (Perkin Elmer Cetus) under conditions recommended by the enzyme manufacturer. Standard in vitro techniques were used for DNA manipulation (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (latest edition)). E. coli, Bio-Rad E. coli. in the Bio-Rad. Transformation was performed using the protocol provided by. S. coelicolor was transformed by standard procedures (Hopwood, DA, et al., Genetic manufacture of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation: 500 tons, Transton, 1985) Selected with 2 ml overlay.
[0154]
Construction of plasmid containing recombinant PKS. All plasmids are derivatives of pRM5 described below. The fren PKS gene was obtained by PCR using the 5 ′ and 3 ′ restriction sites flanking this gene (ie, PacI-NsiI for ORF1, NsiI-XbaI for ORF2, and XbaI-PstI for ORF3). ) And amplified. Following subcloning and sequencing, the amplified fragment was cloned into the corresponding fragment in pRM5 to generate a plasmid for transformation.
[0155]
Production and purification of polyketides. For initial screening, all strains were grown for 6-8 days at 30 ° C. as confluent drones on 10-30 plates each containing approximately 30 ml of agar. Additional plates were made as it was required to obtain sufficient material for complete characterization. CH999 was a negative control when screening for potential polyketides. The agar was minced and extracted with ethyl acetate / 1% acetic acid or ethyl acetate: methanol (4: 1) / 1% acetic acid. The concentrated extract was then flushed through a silica gel (Baker 40 mm) chromatography column with ethyl acetate / 1% acetic acid. Alternatively, the extract was applied to a Florisil column (Fisher Scientific) and eluted with ethyl acetate: ethanol: acetic acid (17: 2: 1). The initial yellow fraction was further purified by high performance liquid chromatography (HPLC) using a preparative reverse phase (C-18) column (Beckman) with a 20-60% gradient of acetonitrile / water / 1% acetic acid. Absorption at 280 nm and 410 nm was monitored. In general, the yield of purified product from these strains was about 10 mg / l for compounds 1 and 2 (FIG. 4) and 5 mg / l for compounds 7 and 8 (FIG. 7).
[0156]
SEK4 (12) was produced and purified as follows. CH999 / pSEK4 was grown on 90 agar plates (about 34 ml / plate) at 30 ° C. for 7 days. The agar was minced and extracted with ethyl acetate / methanol (4/1) (3 × 1000 ml) in the presence of 1% acetic acid. Following removal of the solvent under reduced pressure, 200 ml of ethyl acetate containing 1% acetic acid was added. The precipitate was filtered and discarded, and the solvent was evaporated to dryness. The product mixture was applied to a Florisil column (Fisher Scientific) and eluted with ethyl acetate containing 3% acetic acid. The first 100 ml fraction was collected and concentrated to 5 ml. 1 ml of methanol was added and the mixture was kept at 4 ° C. overnight. The precipitate was collected by filtration and washed with ethyl acetate to give 850 mg of pure product. R_f= 0.48 (ethyl acetate in 1% acetic acid). The NMR analysis results for SEK4 are shown in Table 4. FAB HRMS (NBA), M +^H+, Calculated value m / e 319.0818, actual value m / e 319.0820.
[0157]
To produce SEK15 (13) and SEK15b (16), CH999 / pSEK15 was grown on 90 agar plates and the product was extracted in the same manner as SEK4. The mixture was applied to a Florisil column (ethyl acetate with 5% acetic acid), the fractions containing the main product were combined and evaporated to dryness. The product was further purified using preparative C-18 reverse phase HPLC (Beckman) (mobile phase: acetonitrile / water = 1/10 to 3/5 gradient in the presence of 1% acetic acid). The yield of SEK15 (13) was 250 mg. R_f= 0.41 (1% ethyl acetate in acetic acid). The NMR analysis results for SEK4 are shown in Table 4. FAB HRMS (NBA), M + H +, calculated value m / e 385.0923, actual value m / e 385.0920.
[0158]
[1,2-¹³C₂] Acetate supply experiment. Two 2 liter flasks each containing 400 ml of modified NMP medium (Struch, E., et al., Mol. Microbiol. (1991) 5: 289) Coeliclor CH999 / pRM18, CH999 / pSEK4 or CH999 / pSEK15 spores were inoculated and incubated at 30 ° C. and 300 rpm in a shaking culture apparatus. In each flask, [1,2-¹³C₂] 50 mg of sodium acetate (Aldrich) was added at 72 and 96 hours. After 120 hours, the cultures were pooled and extracted with two 500 ml volumes of ethyl acetate / 1% acetic acid. The organic phase was retained and purified as described above.¹³The C NMR data shows an approximately 2-3% increase for the CH999 / pRM18 product; a 0.5-1% increase for SEK4 and a 1-2% increase for SEK15.
[0159]
NMR spectral analysis. All spectra were recorded on a Varian XL-400, except that a HET COR analysis of RM18 (10) (FIG. 8) was performed on a Nicolet NT-360.¹³C spectra were obtained with continuous broadband proton decoupling. For the RM18 (10) NOE study, a one-dimensional difference method was used. All compounds were DMSO-d₆(Sigma, 99+ atomic% D) and spectra were compared with solvent as internal standard. Hydroxyl resonance, D₂O (Aldrich, 99 atomic% D) was added and identified by examining the disappearance of the signal.
[0160]
【Example】
(Example 1: Production of S. coelicolor CH999)
S. Coeliccolor host cells are engineered to remove the native act gene cluster and a host cell called CH999 is obtained using the strategy shown in FIG. It was constructed using coelicolor CH1 (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237).
(CH1 was obtained from S. coelicolor B385 (Rudd, B.A.M. Genetics of Pigmented Secondary Metabolites in Streptomyces coecoloror (1978) Doctoral Dissertation, University of East England, Norw.)). CH1 contains an act gene cluster that encodes enzymes involved in the biosynthesis and secretion of the polyketide antibiotic actinorhodin. This cluster is composed of PKS genes flanked by several post-PKS biosynthetic genes, including those involved in cyclization, aromatization, and subsequent chemical modification (Figure 2A). There are also genes that perform transcriptional activation of the act gene. The act gene cluster is described in Khosla, C .; Et al., Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237 was deleted from CH1 using homologous recombination.
[0161]
In particular, the plasmid pLRermetETs (FIG. 2B) was constructed with the following characteristics: ColEI replicon from pBR322, temperature sensitive replicon from pSG5 (Muth, G et al., Mol. Gen. Genet. (1989) 219: 341), ampicillin and thiostrepton resistance markers, and the 2 kb BamHI / XhoI fragment from the 5 ′ end of the act cluster, the 1.5 kbrmE fragment (Khosla, C. et al., Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237), and act Separation cassette containing a 1.9 kb SphI / PstI fragment from the 3 'end of the cluster. The 5 ′ fragment is the BamHI site 1 (Malpartida, F. and Hopwood, DA Nature (1984) 309: 462; Malpartida, F. and Hopwood, DA Mol. Gen. Genet. (1986) 205: 66) to the downstream XhoI site. The 3 'fragment extended upstream from the PstI site 20 to the SphI site 19.2 (Fernandez-Moreno, MA et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278). The 5 'and 3' fragments (DNA shown with diagonal lines in Figure 2) were cloned in the same relative orientation as in the act cluster. CH1 was transformed with pLRermEts. This plasmid was subsequently stored with the candidate transformants by non-selective streaking at 39 ° C. Several colonies that were resistant to lincomycin, sensitive to thiostrepton, and could not produce actinorhodin were isolated and checked by Southern blotting. One of them was called CH999.
[0162]
(Example 2: Production of recombinant vector pRM5)
pRM5 (FIG. 3) was the shuttle plasmid used to express PKS in CH999. It is an E.I. A ColEI replicon that allows genetic manipulation in E. coli, an appropriate truncated SCP2^*(Low copy number) Streptomyces replicon and actII-ORF4 activator gene from act cluster that induces transcription from act promoter during vegetative hyphae transition from growth phase to stationary phase. As shown in FIG. 3, pRM5 has various actI / actIII promoter pairs and at the same time has convenient cloning sites to facilitate the insertion of various engineered PKS genes downstream of both promoters. . pRM5 is SCP2^*This plasmid is slightly unstable (approximately 2% loss in the absence of thiostrepton). This feature was deliberately introduced to quickly confirm that the phenotype of interest can be clearly assigned to the mutant PKS from this plasmid. Recombinant PKS derived from pRM5 is expressed in good yield at the transition phase from the logarithmic growth phase to the stationary growth phase.
[0163]
pRM5 was constructed as follows. A 10.5 kb SphI / HindIII fragment derived from pIJ903 (SCP2^*Of the fertility locus and multiple origins, and the colEI origin of replication and the β-lactamase gene from pBR327 (Lydiate, DJ Gene (1985) 35: 223), the 1.5 kb HindIII / SphItsr gene PRM1 was obtained by ligation with the cassette. pRM5 was constructed by inserting the following two fragments between the unique HindIII and EcoRI sites of pRM1: a transcription terminator from Phage fd (Khosla, C. et al., Molec. Microbiol. (1992) 6). : 3237), a 0.3 kb HindIII / HpaI (blunt) fragment, and an NcoI site (1 kb upstream of the actII-ORF4 activator gene) (Hallam, SE et al., Gene (1988) 74: 305; Fernandez- Moreno, MA et al., Cell (1991) 66: 769; Caballero, JL Mol. Gen. Genet. (1991) 230: 401) to the actI-VII-IV gene (Fernandez-M . Reno, M.A et al. J.Biol.Chem (1992) 267:. 19278 10kb fragment from the act cluster extending to downstream of the PstI site of).
[0164]
To promote expression of any desired recombinant PKS under the control of the actI promoter (which is activated by the actII-ORF4 gene product), restriction sites for PacI, NsiI, XbaI, and PstI are It was provided in actDNA at a position between cistrons. In pRM5, and all other PKS expression plasmids described herein, the ORF1, 2, and 3 alleles were cloned between these sites as cassettes processed with their own RBS.
[0165]
In particular, in actinomycetes, ORF1 and ORF2 are translationally conjugated in most naturally occurring aromatic polyketide synthase gene clusters. To facilitate the construction of recombinant PKS, the ORF1 and ORF2 alleles used herein were cloned as independent (uncoupled) cassettes. For actORF1, the following sequence was provided in pRM5:CCACCGGACGAACCGCATCGATTAATTAAGGAGGACCCATCATG, where the underlined sequence corresponds to DNA upstream from the actI region, TTAATTAA is the PacI recognition site, and ATG is the start codon for actIORF1. The following sequences were provided between actORF1 and ORF2: NTGAATGCATGGAGGAGCCATCATG, where TGA and ATG are the stop and start codons for ORF1 and ORF2, respectively. ATGCAT is an NsiI recognition site, and replacement of N (A for actDNA, A or G for other PKS-derived alleles) with C results in translational decoupling. The following sequences were provided downstream of actORF2: TAATCTAGA, where TAA is the stop codon and TCTAGA is the XbaI recognition site. This allowed the fusion of actORF1 and ORF2 (provided as described above) to the XbaI site (Khosla, C. et al., Molec. Microbiol. (1992) 6: 3237) located upstream of actORF3. . As a control, pRM2 was constructed that is identical to pRM5 but lacks any provided sequence. ORF1 and ORF2 in pRM2 are translationally conjugated. Comparison of the product profiles of CH999 / pRM2 and CH999 / pRM5 showed that the uncoupling strategy described herein had no detectable effect on product distribution or product level.
[0166]
Example 3: Polyketide produced using CH999 transformed with pRM5
Plasmid pRM5 was obtained from S. cerevisiae using standard techniques. Introduced into coelicolor CH999. (See, eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (latest edition)). CH999 transformed with pRM5 produced large amounts of tan material. The two most abundant products were analyzed by NMR and mass spectral analysis for Aloe Saponarine II (2) (Bartel, PL et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816) and its carboxylated analogs, 3, Characterized as 8-dihydroxy-1-methylanthraquinone-2-carboxylic acid (1) (Cameron, DW et al. Liebigs Ann. Chem. (1989) 7: 699) (FIG. 4). 2 is presumed to be obtained from 1 by non-enzymatic decarboxylation (Bartel, PL et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816). Compounds 1 and 2 were present in a molar ratio of about 1: 5. About 100 mg of the mixture could be easily purified from a 1 liter culture. Thus, the CH999 / pRM5 host vector system functioned as expected and produced a significant amount of stable, minimally modified polyketide metabolites. The production of 1 and 2 is consistent with the proposed pathway for actinorhodin biosynthesis (Bartel, PL et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816). Both metabolites are derived from 16 carbon polyketides with a single keto reduction at C-9, like the actinorhodin skeleton.
[0167]
When CH999 was transformed with pSEK4 (identical to pRM5 except that the 140 bp SphI / SalI fragment in the actKR gene was replaced with a SphI / SalI fragment from pUC19), the resulting strain was a large amount of aromatic polyketide. SEK4 (12) was produced. The exact structure of this product is slightly different from desoxyerythrolacsin (Bartel, PL et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816). However, 1,2-¹³C₂In vivo isotope labeling studies using labeled acetate confirmed that the polyketide backbone was derived from 8 acetate. In addition, this product¹H spectrum and¹³The aromatic region of the CNMR spectrum is consistent with a tricyclic structure similar to 1, but lacks any keto reduction (see Table 4).
[0168]
(Example 4: Construction and analysis of hybrid polyketide synthase)
(Construction of hybrid PKS containing components derived from A. act, gra, and tcmPKS)
FIG. 1 shows the actinorhodin (3), granaticin (4), and tetrasenomycin (5) (structure shown in FIG. 5) containing the homologous putative KS / AT and ACP subunits and the ORF2 product. PKS for synthesizing a carbon chain skeleton is shown. actPKS and graPKS also have KR, but are lacking in tcmPKS. The corresponding protein from each cluster shows a high degree of sequence identity. The percent identity between the corresponding PKS proteins in the three clusters is as follows: KS / AT: act / gra76, act / tcm64, gra / tcm70; CLF: act / gra60, act / tcm58, gra / tcm54 ACP: act / gra60, act / tcm43, gra / tcm44. actPKS and graPKS synthesize the same 16 carbon skeleton from the 8 acetate residue keto reduced at C-9 (FIG. 6). In contrast, as also shown in FIG. 6, the tcm polyketide backbone is different in overall carbon chain length (20 carbons instead of 16 carbons), is not keto-reduced, and the first cyclization Regiospecificity occurs between carbons 9 and 14 instead of between carbons 7 and 12 for act and gra.
[0169]
In an attempt to generate new polyketides with different ranges of properties and to elucidate aspects of programming aromatic PKS, a series of systematic, minimal PKS gene clusters, as shown in Table 1, was expressed as act, gra Using various permutations of the ORF1 (encoding KS / AT subunit), ORF2 (encoding CLF subunit), and ORF3 (encoding ACP subunit) gene products from the tcm gene cluster, It was cloned into pRM5 in place of the existing act gene. The resulting plasmid was used to transform CH999 as described above.
[0170]
Analysis of the product of recombinant PKS (all constructs also include the actKR, cyclase, and dehydratase genes), including various permutations between the KS / AT, ORF2 product, and the AKS subunit of PKS One category can be divided into a group that does not produce polyketides; a group that produces compound 1 (in addition to a small amount of 2); and a group that produces a new polyketide 9 (referred to as RM20) (FIG. 6) (Table 1) It showed that. The structure of 9 suggests that the polyketide backbone precursor of this molecule is derived from 10 acetate residues with one keto reduction at the C-9 position.
[0171]
PSEK15 was also constructed to investigate the effect of actKR on the reduction and cyclization pattern of heterologous polyketide chains. This includes tcmORF1-3 but lacked actKR. (The deletion in the actKR gene of this construct was identical to the deletion in pSEK4.) Analysis of CH999 / pSEK15 showed that the 20 carbon chain product SEK15 (13) was tetrasenomycin C or its shunt. Although not identical to the product, it was similar. NMR spectral analysis was also consistent with a completely non-reduced decaketide skeleton (see Table 4).
[0172]
All act / gra hybrids produced Compound 1 consistent with the identical structure of the putative actinorhodin and granaticin polyketides. In each case, when the product could be isolated from the tcm / act hybrid, the polyketide chain length was identical to that of the natural product corresponding to the source of ORF2. This suggests that the ORF2 product, but not ACP or KS / AT, controls the carbon chain length. Furthermore, since all polyketides produced by the hybrids described herein (except those lacking KR (CH999 / pSEK4 and CH999 / pSEK15)) were keto-reduced in one place (i) KR is necessary and sufficient for keto reduction to occur; (ii) this reduction always occurs at the C-9 position (counting from the carboxy terminus of the chain) in the final polyketide backbone; and (iii) ) Non-reducing polyketides can be cyclized in several cyclization patterns in the keto-reduced unfinished polyketide chain, but the first cyclization regiochemistry is the Regardless of how it occurs, it can be concluded that it is specified by the position of the resulting hydroxyl. In other words, tcmPKS can be engineered to show novel cyclization specificity by including ketoreductase.
[0173]
A prominent feature of RM20 (9) is the cyclization pattern after the first cyclization. Isolation of mutactin (6) from the actVII mutant indicates that the actVII product and its tcm homologue catalyze the cyclization of the second ring in the biosynthesis of actinorhodin (3) and tetrasenomycin (5), respectively. (Sherman, DH et al. Tetrahedron (1991) 47: 6029; Summers, RG et al. J. Bacteriol. (1992) 174: 1810). The cyclization pattern of RM20 (9) differs from that of 1 and tetrasenomycin F1 regardless of the presence of the actVII gene on pRM20 (9). Thus, it appears that act cyclase cannot cyclize longer polyketide chains.
[0174]
Unexpectedly, the strain containing the minimal tcmPKS alone (CH999 / pSEK33) produced two polyketides SEK15 (13) and SEK15b (16) in approximately equal amounts, as shown in FIG. However, compounds (13) and (16) were also isolated from CH999 / pSEK15 and an amount of compound (13) greater than that of compound (16) was isolated from this construct.
[0175]
SEK15b is a novel compound, and its structure is NMR spectrum analysis, [1,2-¹³C₂It was elucidated by a combination of sodium acetate feeding experiment and mass spectral analysis.¹H and¹³CNMR results indicated that SEK15b is composed of a non-reducing anthraquinone moiety and a pyrone moiety. [1,2-¹³C₂Sodium acetate feeding experiments demonstrated that the carbon chain of SEK15b was derived from 10 acetate units. Of sample rich in SEK15b¹³Coupling constants calculated from CNMR spectra facilitated peak assignment. Fast atom bombardment (FAB) mass spectral analysis₂₀H₁₂O₈Matched 381 (M + H⁺) Molecular weight. Deuterium exchange was used to confirm the presence of each hydroxyl in SEK15b.
[0176]
To identify the in vivo available degrees of freedom for unfinished polyketide chains for cyclization in the absence of active cyclase, recombinant Polyketides produced by coelicolor CH999 / pRM37 (McDaniel et al. (1993), supra) were analyzed. The biosynthetic enzymes encoded by pRM37 are tcm ketosynthase / acyltransferase (KS / AT), tcm chain length determinant (CLF), tcm acyl carrier protein (ACP), and act ketoreductase (KR).
[0177]
Two novel compounds RM20b (14) and RM20c (15) (FIG. 8) were discovered in the culture medium of CH999 / pRM37 that previously produced RM20 (9). The relative amount of the three compounds recovered was 3: 7: 1 (RM20: RM20b: RM20c). The structures of (14) and (15) were elucidated by a combination of mass spectral analysis, NMR spectral analysis, and isotope labeling experiments.¹H and¹³CNMR spectra suggested that RM20b and RM20c are diastereomers each containing a pyrone moiety. Optical rotation [α]_D ²⁰Was found to be + 210.8 ° (EtOH, 0.55%) for RM20b and + 78.0 ° (EtOH, 0.33%) for RM20c. [1,2-¹³C₂Sodium acetate feeding experiments confirmed that the carbon chain of RM20b (and by reasoning RM20c) was derived from 10 acetate units. Deuterium exchange studies correspond to possible hydroxyl groups on both RM20b and RM20c¹Performed to identify HNMR peaks. Proton coupling constant is¹Calculated from the results of HNMR and one-dimensional decoupling experiments. In particular, the coupling pattern in the high magnetic field region of the spectrum showed a 5-proton spin system of two methylene groups surrounding the central carbinol methine proton. High resolution fast atom bombardment (FAB) mass spectral analysis was performed for RM20b (519.0056) (M = Cs⁺), And 387.10.70 (M + H) for RM20c⁺), Which is C₂₀H₁₈O₈(M + Cs⁺519.0056; M + H⁺387.1080). Based on these data, structures (14) and (15) (FIG. 8) were assigned to RM20b and RM20c, respectively.
[0178]
¹H and¹³The data from CNMR show that the coupling constant between H-9 and the gemical proton on C-8 is 12.1 or 12.2 and 2.5 or 2.2 Hz for RM20b or RM20c, respectively. It showed that there is. The coupling constant between H-9 and the geminal proton on C-10 was 9.6 or 9.7 and 5.7 or 5.8 Hz for Rm20b or RM20c, respectively. These values are J_{a, a}(J_{9a, 8a}Or J_{9a, 10a}) And J_{a, e}(J_{9a, 8e}Or J_{9a, 10e}) Typical for coupling pattern and indicates that H-9 is in an axial position in both RM20b or Rm20c. In contrast, the chemical shift of the C-7 hydroxyl on the two molecules was 16.18 and 6.14 ppm for RM20b and RM20c, respectively. These values indicate that in RM20b there is a hydrogen bond between the C-7 hydroxyl and the appropriately positioned acceptor atom and not in RM20c. The most likely candidate acceptor atom for such a hydrogen bond is a C-13 carbonyl oxygen in a conjugated pyrone ring system, or a bridging oxygen in an isolated pyrone ring. In the latter case, it is impossible to distinguish between (14) and (15), so the former is likely. Furthermore, RM20b and RM20c¹³Comparison of CNMR spectra revealed that the largest difference between (14) and (15) was in the chemical shift of the carbon constituting the conjugated pyrone ring (C-11, C-12, C-13). , C-14, and C-15, +5.9, -6.1, +8.9, -7.8, and +2.0 ppm), respectively. Such a pattern of alternating high and low field shifts can be explained by the fact that C-7 hydroxyl hydrogen bonds to C-13 carbonyl. Because hydrogen bonding decreases the electron density around C-11, C-13, and C-15, it can be expected to increase the electron density around C-12 and C-14. is there. To confirm the assignment of the C-7 / C-13 hydrogen bond, the exchangeable protons of RM20b and RM20c were replaced with deuterium (D₂By incubating in the presence of O), and the sample¹³Analyzed by CNMR. The C-13 peak in RM20b was high field shifted (1.7 ppm) and not in RM20c, which was a weaker C-7 / C-13 unshared in RM20b when hydrogen was replaced with deuterium. It can be explained by a bond. In order to form a hydrogen bond with C-13 carbonyl, the C-7 hydroxyl of RM20b must occupy an equatorial position. Thus, the C-7 and C-9 hydroxyls are on the same plane (syn) of the conjugated ring system in the major isomer (RM20b), while in the lesser isomer (RM20c), It can be inferred to be on the opposite side (anti).
[0179]
Polyketides could not be detected in CH999 / pRM15, / pRM35, and / pRM36. Therefore, only some ORF1-ORF2 combinations are functional. Since each subunit was functional in at least one recombinant synthase, protein expression / folding problems are unlikely. Instead, incomplete or repressive associations between the different subunits of these enzyme complexes, or biosynthesis of short-chain products that are rapidly degraded (failed) are appropriate explanations.
[0180]
(Construction of hybrid PKS containing components derived from B.act and fren PKS)
Streptomyces roseofulvus is reported in frenolicin B (7) (Iwai, Y et al., J. Antibiot. (1978) 31: 959) and nanaomycin A (8) (Tsuzuki, K. et al., J. Antibiot. (1986) 39: 1343. ) Both. A 10 kb DNA fragment (hereinafter referred to as the fren locus) From the genome library of roseofulvus (Bibb, MJ et al., supra) It was cloned using as a probe DNA encoding the KS / AT and KR components of act PKS of coelicolor A3 (2) (Malpartida, F. et al., Nature (1987)) 325: 818). (See the structural diagram in FIG. 7). DNA sequencing of the fren locus showed (among other things) the presence of genes with a high degree of identity with those encoding act KS / AT, CLF, ACP, KR, and cyclase.
[0181]
In order to produce new polyketides, the ORF1, 2, and 3act genes present in pRM5 were replaced with the corresponding fren genes as shown in Table 2. S. constructed as described above. Coelilcolor CH999 was transformed with these plasmids. (The genes encoding act KR and act cyclase were also present in each of these genetic constructs.) Based on the results from similar experiments using act and tcm PKS as described above, actKR has all functions. The ability of act cyclase to catalyze the second cyclization was expected to depend on the chain length of the fren PKS product, while the product of the sex recombinant PKS could be reduced.
[0182]
The results summarized in Table 2 indicate that most transformants expressed functional PKS as assayed by their ability to produce aromatic polyketides. The structural analysis of the main product showed that the production strain synthesized two categories: compound 1 (with a smaller amount of its decarboxylated byproduct (2)) and a mixture of compounds 1, 10, and 11 ( (Ratio of about 1: 2: 2) has been shown to be classified into synthesized strains. (A small amount of 2 was also found in all strains producing 1). Compounds 1 and 2 were previously known as natural products and were metabolites produced by PKS consisting entirely of act subunits, as described in Example 3. Compounds 10 and 11 (referred to as RM18 and RM18b, respectively) are novel structures and their chemical synthesis or isolation as natural products has not been previously reported.
[0183]
The structures of 10 and 11 were revealed by a combination of mass spectral analysis, NMR spectral analysis, and isotope labeling experiments.¹H and¹³Assign the C spectrum to [1,2-¹³C₂] Obtained by sodium acetate feeding experiment (described below)¹³C-¹³Table 3 shows the C coupling constants. A clear assignment of compound 10 was established using 1D nuclear overhauser effect (NOE) and long range heteronuclear interaction (HETCOR) studies. Deuterium exchange confirmed the presence of hydroxyl at C-15 of compound 10 and C-13 of compound 11. 2 field desorption mass spectrometry (FD-MS), C₁₇H₁₄O₄It showed a molecular weight of 282 consistent with (282.2952).
[0184]
Previous studies have shown that 2 (and inferred 1) polyketide skeletons (Bartel, PL, et al., J. Bacteriol. (1990) 172: 4816) are used to repeat condensation of 8 acetate residues and C-9. It was shown to be derived from a single keto reduction at. It can also be argued that nanaomycin (8) is derived from the same carbon chain skeleton. Therefore, nanaomycin is It is very likely to be the product of the fren PKS gene in rosefulvus. The position specificity of the first cyclization leading to the formation of 1 is guided by the position of keto reduction, whereas the position specificity of the second cyclization is controlled by act cyclase (Zhang, H L. et al., J. Org. Chem. (1990) 55: 1682).
[0185]
To track the RM18 (10) carbon chain skeleton, [1,2-¹³C₂] In vivo feeding experiments with acetate were performed in CH999 / pRM18 followed by NMR analysis of labeled RM18 (10).¹³C coupling data (summarized in Table 3) show that the polyketide backbone of RM18 (10) is derived from 9 acetate residues, followed by terminal decarboxylation (C-2¹³C resonances appear as enhanced singlets). Furthermore, the absence of a hydroxyl group at the C-9 position suggests that keto reduction occurs at this carbon. Since these two features are expected to be present in the putative frenolicin (7) backbone, these results indicate that in addition to synthesizing nanaomycin, the fren PKS gene is S. cerevisiae. It is suggested that rosefulvus contributes to biosynthesis of frenolicin. This appears to be the first clear example of PKS with mild chain length specificity. However, unlike the putative skeleton of frenolicin, the C-17 carbonyl of RM18 (10) is not reduced. This may reflect the absence of specific ketoreductase, dehydratase, and enoyl reductase from pRM18 (present in the fren gene cluster in S. roseofulvus) or different origins of carbons 15-18 in frenolicin Can be reflected.
[0186]
The regiospecificity of the first cyclization leading to the formation of RM18 (10) is guided by the position of keto reduction; however, the second cyclization occurs differently than 7 or 1, and RM20 (9) Similar to the cyclization pattern seen in (decatide produced by tcm PKS, described above). Thus, as in RM20 (9), the act cyclase cannot catalyze the second cyclization of the RM18 precursor, and this subsequent cyclization (possibly non-enzymatic) It is claimed to be controlled by the time difference of the release of different parts of the unfinished polyketide chain. Considering the ability of CH999 / pRM18 (and CH999 / pRM34) to produce 1, the possibility that cyclase cannot associate with fren PKS (KS / AT, CLF, and ACP) can be ruled out . A more appropriate interpretation is that act cyclase cannot recognize substrates with different chain lengths. This is also consistent with the putative RM20 (9) biosynthesis scheme.
[0187]
Comparison of the product profile of the hybrid synthase reported in Table 2 with a similar hybrid between the act and tcm PKS components (Table 1) shows the hypothesis that the ORF2 product is a chain length determinant (CLF). To support. The preparation of compounds 9, 10 and 11 by cyclization of enzyme-linked ketides is schematically illustrated in FIG.
[0188]
Example 5: Construction and analysis of modular polyketide synthase
The expression plasmid containing the recombinant module DEBS PKS gene, as shown in FIG. 10, can replicate at a temperature sensitive “donor” plasmid (ie, at a first permissive temperature and not at a second non-permissive temperature). The increasing DNA from the plasmid) was constructed by transferring it to the “receptor” shuttle vector by performing double recombination. PCK7 (FIG. 11), a shuttle plasmid containing the complete eryA gene (which was originally cloned from pS1 (Tuan et al. (1990) Gene 90:21)) was constructed as follows. A 25.6 kb SphI fragment from pS1 is inserted into the SphI site of pMAK705 (Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol. 171: 4617) and is a donor plasmid containing the 3 ′ ends of eryAII, eryAIII, and eryAI pCK6 (Cm^R) Replication of this temperature sensitive pSC101 derivative occurs at 30 ° C but ends at 44 ° C. The receptor plasmid pCK5 (Ap^R, Tc^R) Is a 1.4 kb EcoRI encoding the 12.2 kb eryA fragment, tetracycline resistance gene (Tc) from the eryAI start codon (Caffrey et al. (1992) FEBS Lett. 304: 225) to the XcmI site close to the beginning of eryAII. -Includes a BsmI pBR322 fragment and a 4.0 kb NotI-EcoRI fragment from the end of eryAIII. PacI, Ndel, and ribosome binding sites were designed with the eryAI start codon in pCK5. pCK5 is a derivative of pRM5 (McDaniel et al. (1993), supra). The 5 'and 3' homologous regions (Figure 10, striped and white areas) are 4.1 kb and 4.0 kb, respectively. MC1061 E.M. E. coli was transformed with pCK5 and pCK6 (see Sambrook et al., supra) and subjected to carbenicillin and chloramphenicol selection at 30 ° C. Then both plasmids (Ap^R, Cm^R) Were streaked again at 44 ° C. on carbenicillin and chloramphenicol plates. Only co-integration formed by a single recombination event between the two plasmids was seen. Surviving colonies were propagated at 30 ° C. under the selection of carbenicillin to force cointegration resolution through a second recombination event. Colonies were re-streaked at 44 ° C. on carbenicillin plates to increase pCK7 recombinants. About 20% of the resulting colonies are of the desired phenotype (Ap^R, Tc^S, Cm^S)showed that. The last pCK7 candidate was thoroughly examined by restriction mapping. A control plasmid, pCK7f containing a frameshift error with eryAI, was constructed in a similar manner. pCK7 and pCK7f were transformed into E. coli. E. coli ET12567 (MacNeil (1988) J. Bacteriol. 170: 5607) to generate unmethylated plasmid DNA, which was subsequently transferred to Streptomyces coelicolor CH999 using standard protocols (Hopwood et al., (1985) Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Inns Foundation: Norwich).
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Along with the growth of CH999 / pCK7 in R2YE medium, the microorganism produced a large amount of two polyketides (Figure X). The addition of propionate (300 mg / L) to this growth medium increased the yield of polyketide product by about 2-fold. Propionic acid-1-¹³Along with C feeding experiment, proton and¹³CNMR spectral analysis confirmed the main product as 6dEB (17) (> 40 mg / L). A small amount of product was identified as 8,8a-deoxyoleandolide (18) (> 10 mg / L), which appears to be derived from an acetate initiation unit that replaces propionate in the 6dEB biosynthetic pathway.¹³C₂Sodium acetate feeding experiments confirmed the incorporation of acetate into (18). Three high molecular weight proteins (> 200 kDa) presumed to be DEBS1, DEBS2, and DEBS3 (Caffrey et al., (1992) FEBS Lett. 304: 225) were also analyzed by CH-999 / pCK7 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. In the crude extract. No polyketide product was confirmed from CH999 / pCK7f.
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Therefore, novel polyketides and methods for producing polyketides recombinantly are disclosed. Although preferred embodiments of the present invention have been described in somewhat detail, it will be understood that obvious modifications may be made that depart from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.
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[Table 1]

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[Table 2]

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[Table 3]

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[Table 4]

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【The invention's effect】
The present invention effectively produces both new and known polyketides using new polyketides and recombinant techniques. In particular, a novel host-vector system is obtained that is used to produce polyketide synthases that in turn catalyze the production of various polyketides.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the gene cluster of act, gra, and tcm PKS and cyclase.
FIG. A strategy for making coelicolor CH999 is shown. FIG. The structure of the act gene cluster which exists in coelicolor CH1 chromosome is shown. FIG. 2B shows the structure of pLRemEts, and FIG. 2C shows the portion of the CH999 chromosome in which the act gene cluster has been deleted.
FIG. 3 is a diagram of plasmid pRM5.
FIG. 4 shows the formation of Aloe Saponarine II (2) and its carboxylated analog 3,8-dihydroxy-1-methylanthraquinone-2-carboxylic acid (1) described in Example 3. Is schematically illustrated.
FIG. 5 shows the structures of actinorhodin (3), granaticin (4), tetrasenomycin (5) and mutactin (6) referred to in Example 4.
FIG. 6 shows Aloe Saponarine II (2), its carboxylated analog 3,8-dihydroxy-1-methyl, described in Part A of Example 4 by cyclization of a polyketide precursor. 1 schematically shows the preparation of anthraquinone-2-carboxylic acid (1), tetrasenomycin (5) and novel compound RM20 (9).
FIG. 7 schematically illustrates the preparation of frenolicin (7), nanomycin (8) and actinorhodin (3) by cyclization of polyketide precursors.
FIG. 8A shows novel compounds RM20 (9), RM18 (10), RM18b (11), SEK4 (12), SEK15 (13), RM20b (14), RM20c (by cyclization of the polyketide precursor). 15) and the preparation of SEK15b (16) is schematically shown.
FIG. 8B shows novel compounds RM20 (9), RM18 (10), RM18b (11), SEK4 (12), SEK15 (13), RM20b (14), RM20c (by cyclization of the polyketide precursor) 15) and the preparation of SEK15b (16) is schematically shown.
FIG. 8C shows novel compounds RM20 (9), RM18 (10), RM18b (11), SEK4 (12), SEK15 (13), RM20b (14), RM20c (by cyclization of the polyketide precursor) 15) and the preparation of SEK15b (16) is schematically shown.
FIG. 9 shows a genetic model of 6-deoxyerythronolide B synthase (DEBS).
FIG. 10 shows a strategy for the construction of the recombination module PKS.
FIG. 11 is a diagram of plasmid pCK7.

Claims (5)

A recombinant plasmid comprising:
A promoter derived from an aromatic polyketide synthase (PKS) gene cluster; and a restriction enzyme site linked to the promoter in an intercistronic region , wherein the promoter encodes at least one module derived from a module PKS cluster. It is the open reading frame (ORF) of heterologous against, viewed contains a restriction enzyme site to be inserted into the restriction enzyme sites under the control of said promoter,
The plasmid further comprises an activator gene ;
Recombinant plasmid. The recombinant plasmid according to claim 1 , wherein the promoter is an act gene cluster promoter. The recombinant plasmid according to any one of claims 1 to 2 , further comprising an ORF site that is heterologous to the promoter , encoding an aromatic PKS . SCP2 ^* Streptomyces origin of replication, SCP2 ^* Streptomyces origin of replication lacking the par locus, and E. coli. The recombinant plasmid according to any one of claims 1 to 3 , further comprising a replication origin selected from the group consisting of E. coli replication origins. Wherein A Kuchibeta gene is actII-ORF4 activator gene, the recombinant plasmid according to any one of claims 1 to 4.

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