JP3989060B2

JP3989060B2 - New polyphenol compounds

Info

Publication number: JP3989060B2
Application number: JP23647397A
Authority: JP
Inventors: 康次郎森光; 忍小池; 由美子鈴木; 充克佐藤; 俊彦大澤
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 1997-08-19
Filing date: 1997-08-19
Publication date: 2007-10-10
Anticipated expiration: 2017-08-19
Also published as: JPH1160591A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性酸素消去作用および血小板凝集阻害作用を有する新規なポリフェノール化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動物性脂肪の摂取量と虚血性心疾患による死亡率には、正の相関関係がある。しかしフランス人は、高脂肪、高カロリーの食事をとっているにもかかわらず同様の食事をとっている他の諸国民に比べ虚血性心疾患による死亡率が低いことが疫学的に知られている。この所謂「フレンチ・パラドックス（Ｆｒｅｎｃｈｐａｒａｄｏｘ）」といわれる現象は、ＷＨＯによる大規模な調査によっても裏付けられたが、その後、動物性脂肪の摂取量からワインの消費量にある係数をかけて差し引いてみると、フランス人の場合を含めて極めて高い相関関係があることが明らかにされた［Ｌａｎｃｅｔ，３３９，１５２３〜２６（１９９２）］。すなわち、多量の動物性脂肪を摂取してもワインを飲んでいれば、虚血性心疾患のリスクが低減されるということである。その後、作用機序に関する研究が進み、ワイン中に含まれるポリフェノール類の優れた活性酸素消去能および血小板凝集抑制作用がその大きな要因となっていることが明らかにされてきている。しかし、天然界に数多くあるポリフェノール類のうち、どの分子種が強い活性を有しているかはあまり明らかにされていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、活性酸素消去能および血小板凝集阻害能を有する新規なポリフェノール化合物を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、フレンチ・パラドックスに寄与している物質を化学的に解明するため、赤ワイン中の色素、特に色素の発酵および熟成過程での変化に着目し、赤ワイン中の成分を単純化したモデルワイン溶液を用いてその成分変化について検討を加えた。
【０００５】
本発明者らが検討に用いたモデルワイン溶液は、下記式（ＩＩ）で示されるマルビジン３−グルコシド（ｍａｌｖｉｄｉｎ３−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）トリフルオロ酢酸塩、下記式（ＩＩＩ）で示される（−）−エピカテキン（ｅｐｉｃａｔｈｅｃｈｉｎ）、およびアセトアルデヒドを含む１２％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液（ｐＨ３．２）である。本発明者らは、この溶液を室温において靜置しておくと、下記の条件下で高速液体クロマトグラフィーにより分析したときに保持時間が２４．５分および２６．３分に新たなピークが現れることを見出した。
【０００６】
【化２】

【０００７】
【化３】

【０００８】
（条件）
カラム：ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＯＤＳ−５（８φ×２５０ｍｍ、野村化学製）
移動相：１７％アセトニトリル水溶液（０．２５％トリフルオロ酢酸含有）
流速：０．８ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
【０００９】
さらにこれらのピークに対応する物質を単離して構造を決定したところ、これらの物質は、マルビジン３−グルコシドと（−）−エピカテキンがアセトアルデヒドを介して結合した互いに立体異性の関係にある新規なポリフェノール化合物であること、しかもそれらの化合物が優れた活性酸素消去能および血小板凝集阻害能を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明により提供される活性酸素消去能および血小板凝集阻害能を示す新規物質は、下記式（Ｉ）［式中、Ｘ^-は酸のアニオンを示す］で示されるポリフェノール化合物である。
【化４】

【００１１】
式（Ｉ）で示されるポリフェノール化合物のうち、前記の条件下で高速液体クロマトグラフィーにより分析したときに保持時間が２４．５分を示す化合物（以下、ピーク１というときがある）のトリフルオロ酢酸塩の物理化学的性質は、以下のとおりである。
（１）色および形状：赤色粉末
（２）酸性、塩基性、中性の区別：酸性
（３）マススペクトル：（ＦＡＢ−ＭＳ、マトリックス：ＮＢＡ）：ｍ／ｚ８０９（Ｍ⁺）
【００１２】
（４）紫外部吸収吸収スペクトル：
（４−１）５０％メタノール水溶液（塩酸でｐＨ１．０に調整）中で測定した結果は下記のとおりである。
λｍａｘ（ｎｍ）：４２７（ｓｈ）、５１８
（４−２）１２％エタノール水溶液（５ｇ／ｌの酒石酸を含み、塩酸でｐＨ１．６に調整）中で測定した結果は下記のとおりである。
λｍａｘ（ｎｍ）：４５３（ｓｈ）、５３４
（４−３）１２％エタノール水溶液（５ｇ／ｌの酒石酸を含み、塩酸でｐＨ３．２に調整）中で測定した結果は下記のとおりである。
λｍａｘ（ｎｍ）：４５３（ｓｈ）、５３８
（４−４）１２％エタノール水溶液（５ｇ／ｌの酒石酸を含み、塩酸でｐＨ４．８に調整）中で測定した結果は下記のとおりである。
λｍａｘ（ｎｍ）：４５３（ｓｈ）、５５３
【００１３】
（５）溶解性：メタノール、アセトニトリルに易溶。水に可溶。酢酸エチルに難溶。クロロホルム、ヘキサンに不溶。
【００１４】
（６）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：重メタノール）
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：８．８０（１Ｈ，ｓ）、６．６７（１Ｈ，ｓ）、７．８８（１Ｈ，ｓ）、７．８８（１Ｈ，ｓ）、３．８８（１Ｈ，ｓ）、３．８８（１Ｈ，ｓ）、５．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、４．３６（１Ｈ，ｓ）、２．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，４．４Ｈｚ）、２．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，２．６Ｈｚ）、６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）、６．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、６．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、５．３１（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，７．３Ｈｚ）、１．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、３．５〜４．０（６Ｈ,ｍ）
【００１５】
（１１）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：重メタノール）
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：７５．２（ｄ），７８．３（ｄ），７１．０（ｄ），７８．６（ｄ），６２．２（ｔ），１０３．４（ｄ），１６２．３（ｓ），１４５．０（ｓ），１３５．１（ｄ），１１３．３（ｓ），１５６．５（ｓ），１０３．４（ｄ），１６７．８（ｓ），１１５．７（ｓ），１２０．３（ｓ），１１０．４（ｄ），１４９．４（ｓ），１４５．９（ｓ），５７．１（ｑ），２０．２（ｑ），２７．３（ｄ），８０．５（ｄ），６６．２（ｄ），３０．０（ｔ），１００．６（ｓ），１５６．１（ｓ），１０９．８（ｄ），１５５．６（ｓ），１１４．２（ｓ），１５５．１（ｓ），１３１．３（ｓ），１１５．３（ｄ），１４５．５（ｓ），１４５．６（ｓ），１１６．１（ｄ），１２０．０（ｄ）
【００１６】
また式（Ｉ）で示されるポリフェノール化合物のうち、前記の条件下で高速液体クロマトグラフィーにより分析したときに保持時間が２６．３分を示す化合物（以下、ピーク２というときがある）のトリフルオロ酢酸塩の物理化学的性質は、以下のとおりである。
（１）色および形状：赤色粉末
（２）酸性、塩基性、中性の区別：酸性
（３）マススペクトル：（ＦＡＢ−ＭＳ、マトリックス：ＮＢＡ）：ｍ／ｚ８０９（Ｍ⁺）
【００１７】
（４）紫外部吸収吸収スペクトル：
（４−１）５０％メタノール水溶液（塩酸でｐＨ１．０に調整）中で測定した結果は下記のとおりである。
λｍａｘ（ｎｍ）：４３６（ｓｈ）、５１９
（４−２）１２％エタノール水溶液（５ｇ／ｌの酒石酸を含み、塩酸でｐＨ１．６に調整）中で測定した結果は下記のとおりである。
λｍａｘ（ｎｍ）：４５３（ｓｈ）、５３６
（４−３）１２％エタノール水溶液（５ｇ／ｌの酒石酸を含み、塩酸でｐＨ３．２に調整）中で測定した結果は下記のとおりである。
λｍａｘ（ｎｍ）：４５３（ｓｈ）、５４５
（４−４）１２％エタノール水溶液（５ｇ／ｌの酒石酸を含み、塩酸でｐＨ４．８に調整）中で測定した結果は下記のとおりである。
λｍａｘ（ｎｍ）：４５３（ｓｈ）、５５９
【００１８】
（５）溶解性：メタノール、アセトニトリルに易溶。水に可溶。酢酸エチルに難溶。クロロホルム、ヘキサンに不溶。
【００１９】
（６）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：重メタノール）
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：８．９０（１Ｈ，ｓ）、６．６１（１Ｈ，ｓ）、７．８５（１Ｈ，ｓ）、７．８５（１Ｈ，ｓ）、３．９５（１Ｈ，ｓ）、３．９５（１Ｈ，ｓ）、５．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、４．６２（１Ｈ，ｓ）、２．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，４．１Ｈｚ）、２．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，２．３Ｈｚ）、６．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）、６．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、６．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、５．５９（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，７．４Ｈｚ）、１．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、３．５〜４．０（６Ｈ,ｍ）
【００２０】
（１１）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：重メタノール）
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：７５．０（ｄ），７８．２（ｄ），７０．７（ｄ），７８．５（ｄ），６１．９（ｔ），１０２．９（ｄ），１６２．４（ｓ），１４５．４（ｓ），１３４．７（ｄ），１１３．４（ｓ），１５６．７（ｓ），１０４．３（ｄ），１６７．４（ｓ），１１２．７（ｓ），１５３．６（ｓ），１２０．１（ｓ），１１０．４（ｄ），１４９．１（ｓ），１４５．６（ｓ），５６．９（ｑ），１９．３（ｑ），２６．５（ｄ），８１．０（ｄ），６６．５（ｄ），２８．９（ｔ），１０１．０（ｓ），１５６．５（ｓ），９６．２（ｄ），１５５．３（ｓ），１０８．０（ｓ），１５４．８（ｓ），１３１．４（ｓ），１１４．９（ｄ），１４５．０（ｓ），１４５．３（ｓ），１１６．０（ｄ），１１９．３（ｄ）
【００２１】
本発明のポリフェノール化合物は、先に述べたとおり、マルビジン３−グルコシド、（−）−エピカテキンおよびアセトアルデヒドを含むエタノール水溶液を酸性条件下、室温において静置しておくと次第に生成してくる。これらの化合物の生成反応は、上述した条件にて高速液体クロマトグラフィーを行うことにより追跡することができる。
【００２２】
図１は以下に示す組成のモデルワイン溶液を室温にて静置したときの各成分の経時変化を示した図である。
（モデルワイン溶液の組成）
マルビジン３−グルコシドトリフルオロ酢酸塩０．３ｍＭ
（−）−エピカテキン２ｍＭ
アセトアルデヒド３５．８ｍＭ
酒石酸５ｇ／ｌ
エタノール１２％（Ｖ／Ｖ）
ｐＨ３．２
【００２３】
図１から明らかなように本発明の化合物の生成量はピーク１およびピーク２いずれについても１５〜２０日後に最大になり、以降は徐々に減少する。このため本発明のポリフェノール化合物を効率的に取得するためには反応開始後１５〜２０日経過した時点で精製に付すことが望ましい。
【００２４】
本発明のポリフェノール化合物の精製は、反応溶液をあらかじめ濃縮し、分取高速液体クロマトグラフィーを繰返し用いて精製し、最終的に上述した条件で高速液体クロマトグラフィーを行うことにより目的物を純粋に得ることができる。
【００２５】
本発明のポリフェノール化合物を構成する酸のアニオンは、無毒性のイオンであれば特に制限はないが、好適なものとして塩化物イオン、臭化物イオンなどのハロゲン化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、酢酸イオン、乳酸イオン、クエン酸イオン、マレイン酸イオンなど各種イオンを挙げることができる。これらの酸のアニオンは、イオン交換等の公知手段により相互に交換することができ、目的のポリフェノール化合物を得ることができる。
【００２６】
また本発明のポリフェノール化合物は、ヒポキサンチンオキシダーゼが生産する活性酸素を低濃度で消去するので、活性酸素消去剤として有用である。
（活性酸素消去作用）
いずれも０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解した２．０ｍＭヒポキサンチン溶液５０μｌ、５．５ｍＭＤＴＰＡ（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ”，Ｎ”−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）３５μｌ、９．２ＭＤＭＰＯ（５，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅＮ−ｏｘｉｄｅ）１５μｌおよびキサンチンオキシダーゼ（０．３３Ｕ／ｍｌ）５０μｌを混合し、試験試料５０μｌを加え、室温で１分３０秒反応させた。なお、キサンチンオキシダーゼの１酵素単位（Ｕ）は、ｐＨ７．５、２５℃の条件下で、１分間に１．０μｍｏｌのキサンチンを尿酸に変換する酵素量である。
【００２７】
反応溶液中に存在する活性酸素量はＥＳＲスペクトル（装置：型式ＪＥＳ−ＴＥ２００（日本電子社製）を用い吸収のピークを記録し、ピークの２回積分より面積値を求め、以下の式に従い活性酸素消去活性（％）を算出した。
［１−（試料添加時のピーク面積／試料無添加時のピーク面積）］×１００（％）
【００２８】
本発明のポリフェノール化合物ピーク１およびピーク２のＩＣ₅₀は、それぞれ２０μＭおよび１６μＭであった。同じ条件下で測定したマルビジン３−グルコシドトリフルオロ酢酸塩および（−）−エピカテキンのＩＣ₅₀は、７８μＭおよび１３μＭであった。
【００２９】
また本発明のポリフェノール化合物は、ヒト血液より調製した血小板の凝集を低濃度で阻害するので、血小板凝集阻害剤として有用である。
【００３０】
（ヒト血液由来の血小板凝集阻害作用）
ヒト血液９．０ｍｌに３．８％（Ｗ／Ｖ）クエン酸ナトリウムを１．０ｍｌ加え、よく混合した後、１０００ｒｐｍ（７００ｇ）で１０分間遠心分離し、多血小板血漿（ＰＲＰ）を調製した。ＰＲＰ２００μｌに測定試料（メタノール溶液）１μｌを加え、３７℃で３分間のプレインキュベーションの後、凝集惹起剤（インデューサー）として、アラキドン酸（最終濃度：１ｍＭ）またはＡＤＰ（アデノシン二リン酸、最終濃度：１０μＭ）を２０μｌ添加し、血小板凝集計（ヘマトレーサー、日立バイオサイエンス社製）にて凝集曲線を記録させた。コントロール（試料無添加時）の最大凝集率を１００％とし、測定試料の血小板凝集阻害率を求めた。
【００３１】
本発明のポリフェノール化合物ピーク１およびピーク２、マルビジン３−グルコシドトリフルオロ酢酸塩および（−）−エピカテキンのＩＣ₅₀は、以下のとおりである。
【００３２】
【表１】

【００３３】
以上述べたとおり本発明のポリフェノール化合物は、ヒポキサンチンオキシダーゼの酵素反応により生成する活性酸素を低濃度で消去するので、活性酸素が原因となって引き起こされる疾患、すなわち動脈硬化、肝機能障害、がんなどの予防あるいは治療に適用されることが期待できる。また同様に本発明のポリフェノール化合物は、アラキドン酸またはアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）により誘発される血小板凝集反応を低濃度で阻害するので、血小板の異常凝集が原因となって引き起こされる疾患、すなわち血栓、脳梗塞、心筋梗塞などの予防あるいは治療に適用されることが期待できる。
【００３４】
【実施例】
参考例マルビジン３−グルコシドの製造
乾燥したぶどう果皮８０ｇに１０％ギ酸−メタノール溶液５００ｍｌを加え、可溶物を抽出し、果皮を濾過にて除いた後、減圧濃縮して体積を約１／４まで濃縮した。これに蒸留水を加え、総量５００ｍｌとした後、酢酸エチル５００ｍｌを用いて抽出した。水層を分取し、さらにイソアミルアルコール５００ｍｌを用いて抽出した。有機層を分取し、これに５倍量のベンゼンと水をそれぞれ加え、撹拌、抽出した。水層を分取後、約１００ｍｌまで減圧濃縮し、得られたアントシアニン単量体混合物を下記の条件による高速液体クロマトグラフィーに付し、保持時間２１．０分に溶出するマルビジン３−グルコシドトリフルオロ酢酸塩を約２００ｍｇ得た。
【００３５】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８（ウォーターズ社製）
移動相：１７％アセトニトリル水溶液（０．２５％トリフルオロ酢酸を含む）
【００３６】
実施例１
１２％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液５００ｍｌにマルビジン３−グルコシドトリフルオロ酢酸塩０．３ｍＭ、アセトアルデヒド３５．８ｍＭ、（−）−エピカテキン２ｍＭおよび酒石酸５ｇ／ｌとなるように各成分を溶解し、２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を用いてｐＨを３．２に調整し、モデルワイン溶液を調製した。
【００３７】
室温中、暗所で１５日間放置後、減圧濃縮し、液量を約５０mlとした。これをＳｅｐ−ＰａｋＣ１８カラム（ウォーターズ社製）にチャージし、水５０ｍｌで洗浄後、１７％アセトニトリル水溶液（０．２５％トリフルオロ酢酸含有）で溶出する画分を集めた。減圧濃縮した上記画分を高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＯＤＳ−５（８φ×２５０ｍｍ、野村化学製）、移動相：１７％アセトニトリル水溶液（０．２５％トリフルオロ酢酸含有）、流速：０．８ｍｌ／分、検出：ＵＶ２８０ｎｍ］にて繰り返し分取し、最終的にピーク１を２．０ｍｇ、ピーク２を１０．０ｍｇ得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】モデルワイン溶液を室温にて静置したときの各成分の経時変化を示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel polyphenol compound having an active oxygen scavenging action and a platelet aggregation inhibiting action.
[0002]
[Prior art]
There is a positive correlation between animal fat intake and mortality from ischemic heart disease. However, French people are epidemiologically known to have a lower mortality from ischemic heart disease than other nations who have a similar diet despite having a high-fat, high-calorie diet. Yes. This so-called “French paradox” phenomenon was supported by a large-scale survey by WHO, but after that, the amount of animal fat consumed was subtracted by a factor in wine consumption. When it sees, it became clear that there is a very high correlation including the case of French [Lancet, 339, 1523-26 (1992)]. That is, even if a large amount of animal fat is ingested, drinking wine will reduce the risk of ischemic heart disease. Since then, research on the mechanism of action has progressed, and it has been clarified that the excellent active oxygen scavenging ability and the platelet aggregation inhibitory action of polyphenols contained in wine are the major factors. However, of the many polyphenols in nature, it has not been clarified which molecular species have strong activity.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a novel polyphenol compound having an ability to eliminate active oxygen and an ability to inhibit platelet aggregation.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In order to chemically elucidate substances contributing to the French paradox, the present inventors have focused on pigments in red wine, particularly changes in the fermentation and ripening process of pigments, and simplified the components in red wine. The change of the component was examined using the model wine solution.
[0005]
The model wine solution used for the study by the present inventors is malvidin 3-glucoside trifluoroacetate salt represented by the following formula (II), and (−)-epi represented by the following formula (III). It is a 12% (V / V) aqueous ethanol solution (pH 3.2) containing catechin (epicathechin) and acetaldehyde. When the inventors left this solution at room temperature, new peaks appeared at retention times of 24.5 minutes and 26.3 minutes when analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions. I found out.
[0006]
[Chemical 2]

[0007]
[Chemical 3]

[0008]
(conditions)
Column: Develosil ODS-5 (8φ × 250 mm, manufactured by Nomura Chemical)
Mobile phase: 17% acetonitrile aqueous solution (containing 0.25% trifluoroacetic acid)
Flow rate: 0.8 ml / min Detection: UV 280 nm
[0009]
Further, when substances corresponding to these peaks were isolated and their structures were determined, these substances were found to be novel with a stereoisomeric relationship with malvidin 3-glucoside and (-)-epicatechin bound via acetaldehyde. The present inventors have found that the compounds are polyphenol compounds, and that these compounds have excellent active oxygen scavenging ability and platelet aggregation inhibiting ability.
[0010]
The novel substance exhibiting the ability to eliminate active oxygen and the ability to inhibit platelet aggregation provided by the present invention is a polyphenol compound represented by the following formula (I) [wherein X ⁻ represents an anion of an acid].
[Formula 4]

[0011]
Among the polyphenol compounds represented by the formula (I), trifluoroacetic acid which is a compound (hereinafter sometimes referred to as peak 1) showing a retention time of 24.5 minutes when analyzed by high performance liquid chromatography under the above conditions The physicochemical properties of the salt are as follows.
(1) Color and shape: red powder (2) Distinguishing between acidic, basic, and neutral: acidic (3) Mass spectrum: (FAB-MS, matrix: NBA): m / z 809 (M ⁺ )
[0012]
(4) UV absorption absorption spectrum:
(4-1) The results of measurement in a 50% aqueous methanol solution (adjusted to pH 1.0 with hydrochloric acid) are as follows.
λmax (nm): 427 (sh), 518
(4-2) The results of measurement in a 12% aqueous ethanol solution (containing 5 g / l tartaric acid and adjusted to pH 1.6 with hydrochloric acid) are as follows.
λmax (nm): 453 (sh), 534
(4-3) The results of measurement in a 12% aqueous ethanol solution (containing 5 g / l tartaric acid and adjusted to pH 3.2 with hydrochloric acid) are as follows.
λmax (nm): 453 (sh), 538
(4-4) The results of measurement in a 12% aqueous ethanol solution (containing 5 g / l tartaric acid and adjusted to pH 4.8 with hydrochloric acid) are as follows.
λmax (nm): 453 (sh), 553
[0013]
(5) Solubility: Easily soluble in methanol and acetonitrile. Soluble in water. Insoluble in ethyl acetate. Insoluble in chloroform and hexane.
[0014]
(6) ¹ H-NMR spectrum (solvent: deuterated methanol)
δTMS (ppm): 8.80 (1H, s), 6.67 (1H, s), 7.88 (1H, s), 7.88 (1H, s), 3.88 (1H, s), 3.88 (1H, s), 5.28 (1H, d, J = 7.6 Hz), 4.36 (1H, s), 2.80 (1H, dd, J = 16.8 Hz, 4.4 Hz) ), 2.69 (1H, dd, J = 16.8 Hz, 2.6 Hz), 6.08 (1H, d, J = 5.7 Hz), 6.34 (1H, d, J = 8.0 Hz) 6.16 (1H, d, J = 8.0 Hz), 5.31 (1H, q, J = 14.9 Hz, 7.3 Hz), 1.81 (3H, d, J = 7.6 Hz), 3.5-4.0 (6H, m)
[0015]
(11) ¹³ C-NMR spectrum (solvent: deuterated methanol)
δTMS (ppm): 75.2 (d), 78.3 (d), 71.0 (d), 78.6 (d), 62.2 (t), 103.4 (d), 162.3 (S), 145.0 (s), 135.1 (d), 113.3 (s), 156.5 (s), 103.4 (d), 167.8 (s), 115.7 ( s), 120.3 (s), 110.4 (d), 149.4 (s), 145.9 (s), 57.1 (q), 20.2 (q), 27.3 (d) ), 80.5 (d), 66.2 (d), 30.0 (t), 100.6 (s), 156.1 (s), 109.8 (d), 155.6 (s) , 114.2 (s), 155.1 (s), 131.3 (s), 115.3 (d), 145.5 (s), 145.6 (s), 116.1 (d), 120.0 (d)
[0016]
Of the polyphenol compounds represented by the formula (I), trifluoro of a compound (hereinafter sometimes referred to as peak 2) having a retention time of 26.3 minutes when analyzed by high performance liquid chromatography under the above conditions. The physicochemical properties of acetate are as follows.
(1) Color and shape: red powder (2) Distinguishing between acidic, basic, and neutral: acidic (3) Mass spectrum: (FAB-MS, matrix: NBA): m / z 809 (M ⁺ )
[0017]
(4) UV absorption absorption spectrum:
(4-1) The results of measurement in a 50% aqueous methanol solution (adjusted to pH 1.0 with hydrochloric acid) are as follows.
λmax (nm): 436 (sh), 519
(4-2) The results of measurement in a 12% aqueous ethanol solution (containing 5 g / l tartaric acid and adjusted to pH 1.6 with hydrochloric acid) are as follows.
λmax (nm): 453 (sh), 536
(4-3) The results of measurement in a 12% aqueous ethanol solution (containing 5 g / l tartaric acid and adjusted to pH 3.2 with hydrochloric acid) are as follows.
λmax (nm): 453 (sh), 545
(4-4) The results of measurement in a 12% aqueous ethanol solution (containing 5 g / l tartaric acid and adjusted to pH 4.8 with hydrochloric acid) are as follows.
λmax (nm): 453 (sh), 559
[0018]
(5) Solubility: Easily soluble in methanol and acetonitrile. Soluble in water. Insoluble in ethyl acetate. Insoluble in chloroform and hexane.
[0019]
(6) ¹ H-NMR spectrum (solvent: deuterated methanol)
δTMS (ppm): 8.90 (1H, s), 6.61 (1H, s), 7.85 (1H, s), 7.85 (1H, s), 3.95 (1H, s), 3.95 (1H, s), 5.38 (1H, d, J = 7.6 Hz), 4.62 (1H, s), 2.81 (1H, dd, J = 16.8 Hz, 4.1 Hz) ), 2.72 (1H, dd, J = 16.7 Hz, 2.3 Hz), 6.11 (1H, d, J = 5.7 Hz), 6.26 (1H, d, J = 8.0 Hz) 6.02 (1H, d, J = 8.0 Hz), 5.59 (1H, q, J = 15.2 Hz, 7.4 Hz), 1.77 (3H, d, J = 7.7 Hz), 3.5-4.0 (6H, m)
[0020]
(11) ¹³ C-NMR spectrum (solvent: deuterated methanol)
δTMS (ppm): 75.0 (d), 78.2 (d), 70.7 (d), 78.5 (d), 61.9 (t), 102.9 (d), 162.4 (S), 145.4 (s), 134.7 (d), 113.4 (s), 156.7 (s), 104.3 (d), 167.4 (s), 112.7 ( s), 153.6 (s), 120.1 (s), 110.4 (d), 149.1 (s), 145.6 (s), 56.9 (q), 19.3 (q ), 26.5 (d), 81.0 (d), 66.5 (d), 28.9 (t), 101.0 (s), 156.5 (s), 96.2 (d) , 155.3 (s), 108.0 (s), 154.8 (s), 131.4 (s), 114.9 (d), 145.0 (s), 145.3 (s), 116.0 (d), 119.3 (d)
[0021]
As described above, the polyphenol compound of the present invention is gradually formed when an aqueous ethanol solution containing malvidin 3-glucoside, (−)-epicatechin and acetaldehyde is allowed to stand at room temperature under acidic conditions. The production reaction of these compounds can be followed by performing high performance liquid chromatography under the above-mentioned conditions.
[0022]
FIG. 1 is a diagram showing the change over time of each component when a model wine solution having the following composition is allowed to stand at room temperature.
(Composition of model wine solution)
Malvidin 3-glucoside trifluoroacetate 0.3 mM
(−)-Epicatechin 2 mM
Acetaldehyde 35.8 mM
Tartaric acid 5g / l
Ethanol 12% (V / V)
pH 3.2
[0023]
As is apparent from FIG. 1, the amount of the compound of the present invention is maximized after 15 to 20 days for both peak 1 and peak 2, and gradually decreases thereafter. For this reason, in order to efficiently obtain the polyphenol compound of the present invention, it is desirable to carry out purification when 15 to 20 days have elapsed after the start of the reaction.
[0024]
The polyphenol compound of the present invention is purified by concentrating the reaction solution in advance, purifying by repeatedly using preparative high performance liquid chromatography, and finally performing high performance liquid chromatography under the above-mentioned conditions to obtain the target product purely. be able to.
[0025]
The anion of the acid constituting the polyphenol compound of the present invention is not particularly limited as long as it is a non-toxic ion. However, halide ions such as chloride ion and bromide ion, sulfate ion, nitrate ion, and phosphoric acid are preferable. Various ions such as ions, acetate ions, lactate ions, citrate ions and maleate ions can be mentioned. These acid anions can be exchanged with each other by known means such as ion exchange to obtain the desired polyphenol compound.
[0026]
The polyphenol compound of the present invention is useful as an active oxygen scavenger because it eliminates the active oxygen produced by hypoxanthine oxidase at a low concentration.
(Reactive oxygen scavenging action)
All are 50 μl of 2.0 mM hypoxanthine solution dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.8), 35 μl of 5.5 mM DTPA (diethylethyleneamine-N, N, N ′, N ″, N ″ -pentaacetic acid), 9.2 M DMPO (5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide) 15 μl and xanthine oxidase (0.33 U / ml) 50 μl were mixed, test sample 50 μl was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 minute 30 seconds. One enzyme unit (U) of xanthine oxidase is the amount of enzyme that converts 1.0 μmol of xanthine to uric acid per minute under the conditions of pH 7.5 and 25 ° C.
[0027]
The amount of active oxygen present in the reaction solution is recorded as an absorption peak using an ESR spectrum (apparatus: model JES-TE200 (manufactured by JEOL Ltd.), and an area value is obtained by integrating the peak twice. The oxygen scavenging activity (%) was calculated.
[1- (peak area when sample is added / peak area when sample is not added)] × 100 (%)
[0028]
The IC ₅₀ of polyphenol compound peak 1 and peak 2 of the present invention were 20 μM and 16 μM, respectively. The IC ₅₀ of malvidin 3-glucoside trifluoroacetate and (−)-epicatechin measured under the same conditions was 78 μM and 13 μM.
[0029]
The polyphenol compound of the present invention is useful as a platelet aggregation inhibitor because it inhibits aggregation of platelets prepared from human blood at a low concentration.
[0030]
(Inhibition of human blood-derived platelet aggregation)
1.0 ml of 3.8% (W / V) sodium citrate was added to 9.0 ml of human blood, mixed well, and then centrifuged at 1000 rpm (700 g) for 10 minutes to prepare platelet-rich plasma (PRP). 1 μl of a measurement sample (methanol solution) is added to 200 μl of PRP, and after preincubation at 37 ° C. for 3 minutes, arachidonic acid (final concentration: 1 mM) or ADP (adenosine diphosphate, final concentration) is used as an inducing agent (inducer). : 10 μM) was added, and the aggregation curve was recorded with a platelet aggregometer (Hematracer, manufactured by Hitachi Bioscience). The maximum aggregation rate of the control (when no sample was added) was 100%, and the platelet aggregation inhibition rate of the measurement sample was determined.
[0031]
The IC ₅₀ of polyphenol compound peak 1 and peak 2, malvidin 3-glucoside trifluoroacetate salt and (−)-epicatechin of the present invention is as follows.
[0032]
[Table 1]

[0033]
As described above, since the polyphenol compound of the present invention eliminates the active oxygen produced by the enzyme reaction of hypoxanthine oxidase at a low concentration, diseases caused by the active oxygen, that is, arteriosclerosis, liver dysfunction, It can be expected to be applied to the prevention or treatment of cancer. Similarly, since the polyphenol compound of the present invention inhibits the platelet aggregation reaction induced by arachidonic acid or adenosine diphosphate (ADP) at a low concentration, a disease caused by abnormal platelet aggregation, ie, thrombus It can be expected to be applied to the prevention or treatment of cerebral infarction, myocardial infarction and the like.
[0034]
【Example】
Reference Example Manufacture of Malvidin 3-Glucoside To 80 g of dried grape skin, 500 ml of 10% formic acid-methanol solution was added to extract soluble matter, the skin was removed by filtration, and concentrated under reduced pressure to reduce the volume to about 1/4. Until concentrated. Distilled water was added thereto to make a total volume of 500 ml, followed by extraction with 500 ml of ethyl acetate. The aqueous layer was separated and extracted with 500 ml of isoamyl alcohol. The organic layer was separated, 5 times the amount of benzene and water were added thereto, and the mixture was stirred and extracted. The aqueous layer is collected and concentrated to about 100 ml under reduced pressure. The resulting anthocyanin monomer mixture is subjected to high performance liquid chromatography under the following conditions, and malvidin 3-glucoside trifluoro eluted at a retention time of 21.0 minutes. About 200 mg of acetate was obtained.
[0035]
(HPLC conditions)
Column: Sep-Pak C18 (manufactured by Waters)
Mobile phase: 17% acetonitrile aqueous solution (containing 0.25% trifluoroacetic acid)
[0036]
Example 1
Each component was dissolved in 500 ml of 12% (V / V) aqueous ethanol solution so that malvidin 3-glucoside trifluoroacetate 0.3 mM, acetaldehyde 35.8 mM, (−)-epicatechin 2 mM and tartaric acid 5 g / l, The pH was adjusted to 3.2 using 2M trifluoroacetic acid aqueous solution to prepare a model wine solution.
[0037]
After standing at room temperature in a dark place for 15 days, the solution was concentrated under reduced pressure to make the liquid volume about 50 ml. This was charged into a Sep-Pak C18 column (manufactured by Waters), washed with 50 ml of water, and fractions eluted with a 17% acetonitrile aqueous solution (containing 0.25% trifluoroacetic acid) were collected. The fractions concentrated under reduced pressure were subjected to high-performance liquid chromatography [column: Develosil ODS-5 (8φ × 250 mm, manufactured by Nomura Chemical), mobile phase: 17% acetonitrile aqueous solution (containing 0.25% trifluoroacetic acid), flow rate: 0. 8 ml / min, detection: UV 280 nm] repeatedly, and finally 2.0 mg of peak 1 and 10.0 mg of peak 2 were obtained.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing changes with time of each component when a model wine solution is allowed to stand at room temperature.

Claims

Formula (I) wherein, X ^- represents an anion of an acid] platelet aggregation inhibitor comprising as an active ingredient a polyphenol compound represented by the.