JP3973169B2

JP3973169B2 - Transferrin-transferrin receptor complex measuring reagent and measuring method

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Publication number: JP3973169B2
Application number: JP27191795A
Authority: JP
Inventors: 明久樋川; 康博野又
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1995-09-26
Filing date: 1995-09-26
Publication date: 2007-09-12
Anticipated expiration: 2015-09-26
Also published as: JPH0989895A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト体液中のトランスフェリンレセプター（以下ＴｆＲと省略する）濃度に基づいて各種疾病の診断に利用するための測定試薬と、この試薬によるＴｆＲの測定方法に関する。ＴｆＲは各種細胞の表層に存在し、鉄輸送蛋白トランスフェリン（以下Ｔｆと省略する）と結合する役割を担っている。ＴｆＲとＴｆの親和性は約１０^-9と抗原抗体反応に匹敵するほど強く、そのうえ一般には血中のＴｆがＴｆＲの１０³倍も多量に存在することから、血中においてはほとんどのＴｆＲがＴｆと結合した型で存在する。血中ＴｆＲ濃度は、癌や造血機能等の指標として有用であることが知られている。
【０００２】
【従来の技術】
体液中のＴｆＲを測定する方法としては、癌診断を目的として標識免疫測定法を応用した報告（特開昭６２−６１６９）があった。この報告で採用されている酵素免疫測定法（以下ＥＩＡと省略する）に代表される標識物質を利用した免疫測定法は、一般的には感度を上げる場合に用いられる方法である。標識物質としてしばしば用いられる物としては、¹²⁵Ｉのような放射性同位元素や、ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと省略する）、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素が挙げられる。放射性同位元素を標識物質として用いる免疫測定法をＲＩＡ法、酵素を標識物質として用いる免疫測定法をＥＩＡ法と呼んでいる。ＲＩＡ法は、標識物質として放射性同位元素を用いるために特別な施設や装置を求められるので簡易であるとは言い難い。またＥＩＡ法は、免疫反応の他に標識物質である酵素を特定の基質に反応させる酵素反応のステップがあるため、反応様式や試薬構成が複雑となる。またいずれの方法においても、不均一系の反応原理を採用する限りは結合相と遊離相との分離（Ｂ／Ｆ分離）が要求され、自動化や迅速化の障害となりやすい。
【０００３】
更にＲＩＡ法、ＥＩＡ法ともに測定の感度を上げる方向で発達してきた経緯があるため、検体である体液中に測定対象である物質が測定可能範囲の上限を越えて多量に存在する場合には検体を希釈するステップが必要となる。ＴｆＲは血中に比較的高い濃度で存在するので、ＥＩＡ法のような標識法による測定技術ではしばしば検体の希釈を要求される。
【０００４】
ところでＴｆＲは先に紹介した癌の診断マーカーとしての用途の他に造血機能のマーカーとなることも指摘されている(Clin.Chem.41/7,1053-1064;1995)。造血機能のマーカーとしてＴｆＲを測定するときには、癌マーカーとして測定する場合に比べてより高い水準のＴｆＲ値を測定することが多くなる。そのためこれまでに知られているような高い感度を追求した測定系ではしばしば測定範囲を越える試料が出現することになり、希釈操作が要求される。つまりこれまでに報告されているＴｆＲの測定技術の測定濃度域は、実際に要求される濃度域をカバーできていないのである。したがって造血機能障害を疑う患者の機能検査に用いることのできる簡便なＴｆＲ測定技術の提供が望まれている。
また標識法による測定技術においては、高い感度を得やすいように反応時間を長く取る場合が少なくない。このような背景から、より簡便な操作で迅速な測定を実現するＴｆＲ測定技術の提供が待たれている。
【０００５】
更に従来のＴｆＲ測定技術は、標準物質についての問題も持っていた。つまり、ＴｆＲの精製物を入手することはできるものの遊離した状態では安定性に問題が有った。具体的には、精製ＴｆＲを放置しておくと不溶性のアグリゲートもしくはオリゴマーの形成が観察されるのである。精製ＴｆＲがアグリゲートを形成していることはＧ３０００によるゲルろ過のパターンで確認できる。またアグリゲートを解離させるために界面活性剤処理すると、反応性が約２倍に上がるケースが有ることも確認した。このような不安定な標準物質に基づいて得られた測定値の信頼性には限界が有る。
加えて精製ＴｆＲと血中に存在するＴｆ−ＴｆＲコンプレックスとでは同じ抗体に対する反応性に差の出ることがある。発明者らの知見によれば、血清から精製したＴｆ−ＴｆＲコンプレックスは精製ＴｆＲに比べて４倍も高い反応性を示した。たとえば今までの報告ではＴｆＲとして正常値が約５０００ng/ml、また測定範囲として１０００〜５００００ng/mlとある。しかしこれは用いた標準が組織由来の精製ＴｆＲであるためその値の信頼性は低いと言える。
したがってＴｆＲの測定技術を一般に普及させるには、測定のための標準物質を安定な状態で流通させるための配慮が求められる。そのうえ先に述べたように高い濃度域の測定を行うには、目的とする濃度域に応じた高濃度の標準が求められる。しかし従来はこのような条件を満足する標準物質は提供されていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は鉄と造血機能との関連から、鉄輸送蛋白Ｔｆの受容体である体液中のＴｆＲ濃度を測定することの意義が大きいと考えた。そしてそのためには、より簡易に測定でき、しかも自動化しやすい測定系と、より適切な測定濃度域を持つ試薬が必要である。すなわち本発明は、従来のＴｆＲ測定技術では試料の希釈を要求されるような高濃度域であっても、低濃度域と同じ条件で測定可能な広い測定レンジを実現する新しいＴｆＲの測定技術の提供を課題とするものである。更には、この新しい測定技術をサポートする、安定性と信頼性に優れる新規な標準物質を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の課題は、ＴｆＲ親和性物質を固定した不溶性粒子、またはＴｆＲ親和性物質とＴｆ親和性物質とを個別にまたは混合して固定した不溶性粒子で構成されるＴｆ−ＴｆＲコンプレックス測定試薬、ならびにこの試薬を用いた測定方法によって解決される。
【０００８】
本発明におけるＴｆＲ親和性物質の代表的なものは、抗ＴｆＲ抗体や抗Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックス抗体などの抗体である。またＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを測定対象としているので、抗Ｔｆ抗体も親和性物質として挙げることができる。Ｔｆを介してＴｆＲと特異的に結合すると考えられるためである。親和性物質として抗体を用いる場合は、充分抗体価の高い抗体を選びさえすれば検体となる生体体液中に親和性の点で競合するものがなく有利である。抗体としては通常の方法によりマウス、ラット、家兎、山羊などを免疫して得たポリクローナル抗体を利用できる。もちろん、モノクローナル抗体も使用できることは言うまでもない。
ＴｆＲに対する抗体は、これまでにいくつか報告されている。これら公知の抗体は、ポリクローナル抗体であれ、モノクローナル抗体であれ、不溶性粒子に感作した状態でＴｆＲと反応して凝集しうる親和性と特異性を備えているものであれば本発明に利用することができる。
【０００９】
中でもポリクローナル抗体は、次のような背景から好ましい抗体として示すことができる。まず凝集反応の反応原理から考えると、粒子に固定する親和性物質と被検物質との結合部位の数が多いほうが一般的に有利である。つまり結合部位が制限されるモノクローナル抗体よりも多数の結合部位を認識するポリクローナル抗体の方が有利となる。更にＴｆとコンプレックスを形成したＴｆＲを測定するために、ＴｆＲ上のＴｆ結合部位はＴｆにカバーされてしまっている。このようなコンプレックスでは、Ｔｆ結合部位を認識する抗体はもはや結合することができない。これらの理由からポリクローナル抗体が好ましい抗体として挙げられるのである。
【００１０】
より高い特異性を期待するとき、あるいは免疫原としてのＴｆＲやＴｆの消費量を少なくしたいときには、抗体としてモノクローナル抗体を利用しても良い。ただしモノクローナル抗体を利用するときには先に述べたような事情を考慮して、より有利な結合親和性を持つクローンを選択するべきである。たとえば、ＴｆＲのＴｆ結合部位を認識するような抗体は、Ｔｆによって結合部位をブロックされてしまうので選択すべきではない。したがってモノクローナル抗体の結合部位として、ＴｆＲのＴｆ結合部位以外に存在する抗原決定基、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスに特異的に存在する抗原決定基、Ｔｆに特異的な抗原決定基等を利用するのが好ましい。特にＴｆＲのＴｆ結合部位以外に存在する抗原決定基とＴｆに特異的な抗原決定基とを認識するモノクローナル抗体の組合せは、血液中でコンプレックスを形成しているＴｆＲを確実に測定することができる好ましい組合せである。
これらのモノクローナル抗体を固定した不溶性粒子を混合するか、あるいはモノクローナル抗体の混合物を不溶性粒子に固定することにより本発明による試薬を得ることができる。抗Ｔｆモノクローナル抗体で構成した本発明による試薬は、遊離のＴｆにも結合するものの架橋構造を構成できないので凝集反応にはつながらない。つまりＴｆ−ＴｆＲコンプレックスが存在する時にだけ特異的に凝集を起こす高い精度を備えた試薬となることから、モノクローナル抗体の採用が有利となる態様として示すことができる。またモノクローナル抗体をポリクローナル抗体に組み合せて用いることも可能である。
【００１１】
Ｔｆに対するモノクローナル抗体を利用する場合、Ｔｆ−ＴｆＲに比較して血中に多量に存在する遊離のＴｆがこのモノクローナル抗体に競合するので十分な粒子凝集を期待できない場合が予想される。このような場合には、粒子に固定したものと同じＴｆに対するモノクローナル抗体を粒子に固定しない状態で加え、その共存下で反応させると良い。
【００１２】
本発明に用いる抗体は、Ｆｃ部位を取り除くことによって補体やリウマチ因子等による非特異反応の影響を受けにくくすることができる。Ｆｃ部位を除去する方法は、各種蛋白分解酵素を作用させる方法が公知である。
【００１３】
抗体以外の親和性物質としてはＴｆＲに対するα−１アンチトリプシンなどが想定できる。これらの親和性物質には、各々生体体液中に親和性の点でＴｆＲと競合する物質が存在するので、できるだけＴｆＲへの親和性の方が大きくなる条件のもとで反応させるのが好ましい。
あるいは競合物質との結合サイトをブロックする方法も有効である。たとえばα−１アンチトリプシンを利用する時には、トリプシンを結合した粒子を用意しこれにトリプシンを介してα−１アンチトリプシンを間接的に結合させると良い。この方法によって、α−１アンチトリプシンのトリプシン結合サイトはブロックされ、ＴｆＲとの結合活性が粒子上に存在する形となる。
【００１４】
本発明に利用する不溶性粒子としては、動物の赤血球、金属ゾル、ラテックス、ゼラチン、あるいは顔料のような免疫学の分野で常用されているものが考えられるが、これらに限られるものではない。中でもポリスチレン等の合成樹脂製ラテックス粒子は既に広く利用されているので入手し易く安価であり、動物赤血球よりは質的に均一な点で有利である。ポリスチレンラテックスとしては平均粒径０．０２−１．０μm、好ましくは０．０４−０．６μmのものを示すことができる。
【００１５】
本発明の親和性粒子を分散させる分散溶液は、免疫反応に必要なｐＨを提供する緩衝液に分散剤、界面活性剤、非特異反応を防ぐ物質、少量の防腐剤等を添加して用いる。これらの添加物質や濃度の選択は固定する親和性物質およびその量、不溶性粒子の種類などに応じて適宜に調整する。たとえばゼラチンやウシ血清アルブミンのような不活性蛋白質は、凝集反応の安定化や非特異反応の防止に有効である。
具体的には親和性物質として抗体を固定したポリスチレンラテックスを分散させるとき、リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと省略する）やＨＥＰＥＳのような中性域を与える緩衝液に、ＢＳＡや正常動物血清等を加える。
【００１６】
本発明は、前記Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックス測定試薬によってＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを測定する方法をも提供する。本発明の試薬とＴｆ−ＴｆＲコンプレックスとの反応は、凝集程度を観察することで追跡可能である。凝集反応を観察する方法としては、肉眼による方法および光学的装置により散乱光または透過光の量の変化として計測する方法がある。一般的に、肉眼で観察する方法は、検体を数段階の濃度に希釈しその各々を観察することによってしか定量的な測定ができない。光学的方法においては適切な検量曲線を予めまたは測定時に作成することにより検体の濃度を数段階取ることなく定量的測定ができるので、本発明の具現例としてはより好ましいものである。
【００１７】
このときに血液材料に由来するＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを標準物質として用いると良い。細胞から血中に遊離したＴｆＲは組織から抽出したＴｆＲとは構造が違うことから、精製ＴｆＲを標準とする方法では反応性の違いのために正確な結果を期待できない可能性が有る。実際、血中に遊離したＴｆＲは組織に存在する完全なＴｆＲに比べてＮ末端側の１００残基のアミノ酸が欠損している。また血中ＴｆＲの大部分がＴｆとコンプレックスとなっていることから考えて、血中ＴｆＲの値を得るにはＴｆ−ＴｆＲコンプレックスとして測定すべきである。なお血中のＴｆとコンプレックスを形成していない遊離のＴｆＲを測定するのであれば、フリーのＴｆＲを標準として用いる。
【００１８】
本発明のＴｆＲ測定試薬は従来に無い広い濃度範囲の測定を実現する。この特徴によって、本発明は大部分の血清試料を希釈操作無しで測定するＴｆ−ＴｆＲコンプレックス測定方法を提供する。なおここで言う希釈操作を必要としない測定とは、低濃度試料と高濃度試料とを同一の反応条件で測定可能であることを意味する。つまり、測定可能な濃度範囲が狭い従来の測定方法においては、高濃度試料の測定にあたっては低濃度試料とは違う希釈条件が必要であった。一方本発明では、たとえ高濃度試料であっても低濃度試料と同じ条件で測定が可能となる。
【００１９】
本発明によって得られたＴｆ−ＴｆＲコンプレックスの測定値は、ＴｆＲ値に換算することも可能である。ＴｆＲとＴｆとは１：１で結合するので両者のモル比は１：１となる。血中のＴｆＲの大部分がＴｆと結合した状態で存在していることから、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスの測定値に占めるＴｆＲの蛋白量の比をかければＴｆＲ値となる。この値は実施例で示すように４７%であり、本発明による測定値に対して４７%をかければＴｆＲ値に換算できるということである。
【００２０】
本発明は、ＴｆＲ親和性物質を固定した不溶性粒子で構成されるＴｆ−ＴｆＲコンプレックス測定試薬によるＴｆ−ＴｆＲコンプレックスの測定に有用な標準物質をも提案する。本発明が提供する標準物質とは、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスを含むＴｆ−ＴｆＲコンプレックス測定用標準物質である。Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスは、ＴｆＲ高値の血清を原料として精製することができる。血中のＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを測定するのであれば、試薬との反応性を共通とするためにも標準物質も血中から精製したものを用いるのが有利である。血清からＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを精製するには、血清の硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィー、免疫吸着クロマトグラフィー等の精製ステップにより容易に行うことができる。こうして精製したＴｆ−ＴｆＲコンプレックスは、適当な緩衝液に希釈するか、あるいはＴｆＲフリーとした血清に添加して濃度を検定し標準物質とすることができる。本発明の標準物質は、造血機能の診断をも可能とする広い濃度域にわたって標準物質として利用できるよう１４０００〜７００００ng/ml程度の高い濃度を備えたものが有用である。
【００２１】
【作用】
本発明におけるＴｆＲ親和性物質を固定した不溶性粒子は、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスと結合してその分析を可能とする。
本発明は、従来ＴｆＲの測定に利用されていた高感度を実現するための測定技術に換えて、より簡便な操作で実施可能な粒子凝集反応を応用した点において新規である。粒子凝集反応の応用によって、試料を希釈することなく低濃度域の測定と同じ条件のもとで、高い濃度までを十分な精度で測定することが可能となる。更に均一系反応である粒子凝集反応では、標識による測定で要求されるＢ／Ｆ分離が不要となり自動化が容易である。更に迅速化にも貢献するものである。
【００２２】
他方本発明の標準物質は、ＴｆＲをＴｆ−ＴｆＲコンプレックスとしてとらえ、これを測定対象としうる広い濃度域をカバーする測定技術をサポートするものである。従来用いられていたＴｆＲを基礎とする標準では血中に存在するＴｆ−ＴｆＲコンプレックスとは異なる物質を標準としていたことになる。本発明の標準物質は、従来の標準ではカバーすることが困難な高い濃度域までを保証すると同時に、精製ＴｆＲの安定性の問題を解決するものである。
本発明によるＴｆ−ＴｆＲコンプレックス測定技術によれば広い濃度範囲のＴｆＲを測定することが可能である。そのため従来のような濃度既知の血清を適当に希釈して標準とする方法では、測定可能範囲の上限まで完全に測定値を保証することができない。
ＴｆＲ含有血清の他、精製ＴｆＲを希釈して標準とする方法も考えられる。しかし本発明者らの知見によれば、公知の方法でたとえば胎盤等から精製したＴｆＲの測定値は血清のＴｆＲ測定値と必ずしも一致しないのである。この理由の一つには先に述べたような構造的な違いも挙げられる。つまり、公知の精製ＴｆＲでは信頼できる標準物質とすることができないのである。このような背景から、本発明によって新たに提案された測定技術をサポートする新規な標準物質が必要となるのである。
【００２３】
【発明の効果】
本発明は、操作性に優れた粒子凝集反応によるＴｆ−ＴｆＲコンプレックスの測定を可能とする。本発明によってＴｆＲの測定範囲が拡大し、試料を希釈すること無く広い濃度範囲を測定することができる。測定範囲の拡大は、特に造血機能の診断マーカーとしてＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを測定する場合に有効である。更に本発明によれば、標識技術を利用した高感度測定法に比べて容易に迅速化、自動化を実現することができる。
また本発明は、新たに提案された測定技術の広い濃度範囲をカバーする新規な標準物質をも提供する。以下に本発明の実施例を示す。
【００２４】
また本発明の標準物質は、Ｔｆ−ＴｆＲ測定値の信頼性を高める。まず従来の測定技術ではカバーできなかった高濃度域の標準を提供しうる点で信頼性の向上をもたらず。更に、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスとして提供したことによって保存中の安定性を改善し、結果として信頼性の向上に貢献する。
【００２５】
【実施例】
１．試薬の調製
抗ＴｆＲ抗体の作成：公知の方法(J.Biol.Chem.,263,8318-8325,1988)で胎盤から精製したヒトＴｆＲをフロイントのコンプリート・アジュバントと等量混合し、充分乳化した後、家兎フットパットに初回の免疫を行い、４週毎に背部皮内に２回の追加免疫を行った。精製ヒトＴｆＲとのオクテロニー法により抗体価の上昇を確認して、最終免疫後２週目に採血を行い抗血清を分離した。抗血清をＤＥＡＥ−セルロース・イオン交換クロマトグラフィーで精製し、そのＩｇＧ分画をもって抗ＴｆＲ抗体とした。
本発明試薬の調製例：抗ＴｆＲ抗体をポリスチレンラテックス（平均粒径０．１０４μm）と混和し３７℃１時間反応させた。３，０００×Ｇ、１５分遠心によりラテックス粒子を分離した後、１%ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液に懸濁して０.５%ラテックス乳液を得、本発明の測定試薬とした。
【００２６】
参考試薬の調製例：上記抗ＴｆＲ抗体をＰＢＳ緩衝液で１０mg/lとし９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）のウエルに０．１ml宛分注後、３７℃１時間静置し、更にプレートを生理食塩液で洗浄後ＢＳＡによるブロック操作をほどこしてＥＬＩＳＡ用固相プレートとした。また抗ＴｆＲ抗体を過ヨウ素酸架橋法にてＰＯＤ標識し、ＥＬＩＳＡ用標識抗体とした。
【００２７】
標準物質の調製：血清を４５〜７０%飽和硫安で分画後、２０mMトリス塩酸（ｐＨ８．６）の緩衝液で透析し、陰イオン交換カラム（Ｑ−セファロース、ファルマシア社）にアプライした。０．５MのＮａＣｌを含む２０mMのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）でリニアグラジエントに溶出した。ＥＬＩＳＡによってＴｆＲ濃度を追跡してＴｆＲに富む分画をプールし、抗Ｔｆ抗体を固定化したアフィニティーカラムにかけた。カラムはまず０．１MのＮａＣｌを含む５０mMのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、次いで１００mMのＮａＣｌと１mMの desferroxamine mesilateを含む５０mMのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．９）でこのカラムを洗浄してＴｆから鉄を遊離させた。再び０．１MのＮａＣｌを含む５０mMのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、３MのＫＣｌを含む５０mMのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で鉄の遊離によってＴｆとの結合性の低下したＴｆＲを溶出した。
アフィニティーカラムの溶出物は、過剰量の鉄飽和Ｔｆと反応させて完全にＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを形成させ２０mMトリス塩酸（ｐＨ８．６）の緩衝液で透析した後、さらにゲルろ過カラム及び陰イオン交換カラム（リソース−Ｑ、ファルマシア社）を用いて、精製Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスを得た。この方法によるコンプレックスの収率は約５０%であった（２０００ng/mlのＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを含む血清２Lから約２．０mgのＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを回収）。
【００２８】
精製物は、非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約８５kDaと６５kDaの２つのバンドが認められた。還元状態では、Ｔｆは分子内ＳＳ結合がはずれて見かけの分子量が大きくなるので、２つのバンドが近接する。
ＰＶＤＦ膜へブロッティング後それぞれの蛋白についてアミノ酸配列分析を行ったところ、８５kDaはＴｆＲの１０１番目からの配列と一致し、６５kDaはＴｆのＮ末端からの配列と一致することが確認できた。ＴｆＲとＴｆの組成比率は、染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトグラムからほぼ４７％対５３％であり、アミノ酸残基数がＴｆＲが６６０、Ｔｆが７１９の比と一致した。つまりモル比として１対１であったと考えられる。蛋白量にＴｆＲの濃度比（４７％）を乗じた値を精製したコンプレックス中のＴｆＲ量として決定した。なお精製Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスの蛋白量は、ＢＣＡ蛋白定量法により決定した。
この精製Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスを１%のＢＳＡ、０．１%のＴｆを含むＰＢＳで希釈して１次標準として使用した。ＥＬＩＳＡでは血清を適宜希釈したものの凍結乾燥品を、ラテックス凝集法では、血清からＴｆ−ＴｆＲコンプレックスをイオン交換カラムにより部分的に精製濃縮した物の凍結乾燥品をそれぞれ１次標準で検定し、２次標準として用いた。従って、この標準を用いた測定によって得られる濃度値は、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスの濃度である。
【００２９】
２．本発明の測定試薬と参考試薬の検量線比較：
１で作成した本発明の測定試薬を用い試料液（検量線の場合は標準希釈濃度液、一般測定の場合は検体液）３０μl、と本試薬乳液３００μlを測定セルに分注して混和し、２５秒後および３００秒後に散乱光（波長６６０nm）を測定し散乱光の強度の差を求めた。標準希釈液は部分精製ヒトＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを１６０００ng/mlより順次２倍希釈した５段階の各々を用いて測定し検量曲線を作成した。測定には全自動免疫化学分析装置ＬＸ−３０００（栄研化学・アナリテイカルインスツルメント社製、商品名）を用いた。
【００３０】
対照として、１で作成した参考試薬によるＥＬＩＳＡ法の検量線を作成した。測定は固相プレートにウエル当たり１００μlの試料液を分注し３７℃で１時間反応後０．１%のＴｗｅｅｎ２０加ＰＢＳで洗浄、標識抗体を１００μlを加え３７℃３０分反応させ洗浄、ＴＭＢ（テトラメチルベンチジン）で発色させ波長４５０nmでの吸光度を測定、という操作によって行った。
標準希釈濃度液はＴｆ−ＴｆＲコンプレックス値既知の血清を７８．０ng/mlより順次２倍希釈した５段階の各々を用いて測定し検量曲線を作成した。この標準物質の濃度は、予備的に行った実験で確認した実用的な精度で測定が可能な濃度範囲に基づいて設定したものである。
結果は図１および図２に示した。本発明の測定試薬では測定範囲が５００〜１６０００ng/mlである（図１）のに対し、参考例ＥＬＩＳＡ法（図２）では２．４４〜７８．０ng/mlである。つまりＥＬＩＳＡ法で本発明の測定試薬と同じ測定範囲を得るには試料を予め２００倍に希釈する必要があることが確認された。
【００３１】
３．本発明によるラテックス凝集法とＥＬＩＳＡ法の相関：
様々な濃度のＴｆ−ＴｆＲコンプレックス値を持つ血清検体８０検体を１で調製した本発明によるラテックス凝集反応試薬と、参考試薬であるＥＬＩＳＡ試薬により測定し測定値の相関を調査した。ＥＬＩＳＡ法では直接測定できない高値検体は適宜希釈して測定した。
結果は図３に示すとおりである。本発明による測定値とＥＬＩＳＡによる測定値とは良好な相関を示し高精度な測定が可能なことが確認された。
【００３２】
４．本発明の測定試薬による測定例：
２に示した本発明の測定試薬により、健常者１５名、鉄欠乏性貧血症患者１０名、安定期透析患者１５名、鉄欠乏を伴う透析患者１０名、多血症患者２名、腎移植患者２名の血清についてＴｆ−ＴｆＲコンプレックス値を測定した。結果は表１に示した。鉄欠乏性貧血症、多血症等の患者血清中のＴｆＲ値は異常に高く、本発明によるＴｆＲの測定が造血機能の診断マーカーとして有用なことが確認された。このような高い値は、ＥＬＩＳＡ法の測定可能範囲を越えている。
【００３３】
【表１】

【００３４】
４．本発明の測定試薬による測定例
ＴｆＲのＴｆ結合部位以外を認識するモノクローナル抗体と、Ｔｆを認識するモノクローナルにより本発明の測定試薬を構成した。特開昭６２−６１６９に記載された方法にしたがって前記モノクローナル抗体を調製し、これをそれぞれ不溶性粒子に固定した後に混合した。具体的な操作は次のとおりである。
１で用いたのと同じ精製ＴｆＲをフロイントのコンプリート・アジュバントと等量混合しＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に免疫した。２週間おきに免疫をくり返し、４回の免疫の後に５０μgのＴｆＲを腹腔内に免疫した。最終免疫の３日後に抗体価の上昇していることを確認して脾臓を摘出し、常法(Harada.NらProc.Natl.Acad.Sci. USA 84:4581-4585,1987)によってマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８．６５３と細胞融合させた。
【００３５】
ハイブリドーマは精製ＴｆＲを抗原とするイムノブロッティングアッセイによって、まずＴｆＲに特異的な抗体についてスクリーニングした。ＴｆＲを認識するモノクローナル抗体を産生するクローンは、更にＴｆＲとＴｆを用いたインヒビションアッセイによりスクリーニングしてＴｆ結合部位以外の部分に存在する抗原決定基を認識するモノクローナル抗体を産生するものをセレクションした。こうしてＴｆＲのＴｆ結合部位以外を認識するモノクローナル抗体を得た。
一方Ｔｆを認識するモノクローナル抗体については、免疫原をＴｆとすること、またスクリーニングを単にＴｆについて行うこと以外はほぼ同じ操作によって得た。
【００３６】
こうして得た２種類のモノクローナル抗体（ＩｇＧ、０．１１mg/ml）をそれぞれ粒径０．１０４μmのポリスチレンラテックスに３７℃で１時間物理吸着させた。ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄後、１%のＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液に粒子濃度０．５%となるように等量分散させてモノクローナル抗体で構成された本発明の試薬とした。
【００３７】
モノクローナル抗体で構成された本発明による試薬は、２と同じ操作によって精製Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスと反応させた時、光学測定が可能な凝集を定量的に生じることを確認した。この凝集は精製したＴｆやＴｆＲでは観察できず、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスに特異的であることが明らかであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定試薬を用い、免疫学的ラテックス凝集反応法によって得られた標準曲線。図中、縦軸は６６０nmにおける散乱光強度の変化量（ＤＬＳＥ）を、横軸はＴｆ−ＴｆＲコンプレックス濃度（ng/ml）を示す。
【図２】参考試薬を用いＥＬＩＳＡ法によって得られた標準曲線。図中、縦軸は４５０nmにおける吸光度を、横軸はＴｆ−ＴｆＲコンプレックス濃度（ng/ml）を示す。
【図３】本発明によるラテックス凝集反応試薬（ＬＡ法)による測定値（ng/ml、横軸）、ＥＬＩＳＡ試薬による測定値（ng/ml、縦軸）の相関を示すグラフ。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a measuring reagent for use in diagnosis of various diseases based on the transferrin receptor (hereinafter abbreviated as TfR) concentration in human body fluid, and a method for measuring TfR using this reagent. TfR is present on the surface layer of various cells and plays a role of binding to iron transport protein transferrin (hereinafter abbreviated as Tf). The affinity between TfR and Tf is about 10 ^-9 In addition, the Tf in the blood is generally 10% of the TfR. ^Three Since it is twice as much, most TfR is present in the blood in a form bound to Tf. The blood TfR concentration is known to be useful as an indicator of cancer, hematopoietic function and the like.
[0002]
[Prior art]
As a method for measuring TfR in body fluid, there has been a report (Japanese Patent Laid-Open No. 62-6169) in which a labeled immunoassay is applied for the purpose of cancer diagnosis. An immunoassay method using a labeling substance typified by an enzyme immunoassay method (hereinafter abbreviated as EIA) employed in this report is a method generally used for increasing sensitivity. As a thing often used as a labeling substance, ¹²⁵ Examples include radioisotopes such as I, and enzymes such as peroxidase (hereinafter abbreviated as POD), β-galactosidase, and alkaline phosphatase. An immunoassay using a radioisotope as a labeling substance is called an RIA method, and an immunoassay using an enzyme as a labeling substance is called an EIA method. The RIA method is difficult to say because it requires a special facility or apparatus for using a radioisotope as a labeling substance. In addition to the immune reaction, the EIA method has an enzyme reaction step in which an enzyme, which is a labeling substance, reacts with a specific substrate, so that the reaction mode and reagent configuration are complicated. In any method, as long as the heterogeneous reaction principle is adopted, separation of the bonded phase and the free phase (B / F separation) is required, which tends to be an obstacle to automation and speedup.
[0003]
Furthermore, since both the RIA method and the EIA method have been developed in the direction of increasing the sensitivity of the measurement, if the substance to be measured exists in a large amount exceeding the upper limit of the measurable range in the body fluid that is the sample, The step of diluting is required. Since TfR is present in blood at a relatively high concentration, a measurement technique using a labeling method such as the EIA method often requires dilution of the specimen.
[0004]
By the way, it has been pointed out that TfR can be a marker of hematopoietic function in addition to the use as a diagnostic marker for cancer introduced above (Clin. Chem. 41/7, 1053-1064; 1995). When measuring TfR as a marker of hematopoietic function, a higher level of TfR value is often measured as compared to when measuring as a cancer marker. Therefore, in a measurement system in which high sensitivity has been pursued so far, a sample exceeding the measurement range often appears, and a dilution operation is required. That is, the measured concentration range of the TfR measurement technique reported so far cannot cover the actually required concentration range. Therefore, it is desired to provide a simple TfR measurement technique that can be used for functional tests of patients suspected of hematopoietic dysfunction.
Moreover, in the measurement technique using the labeling method, it is often the case that a long reaction time is used so that high sensitivity is easily obtained. Against this background, provision of a TfR measurement technique that realizes quick measurement with a simpler operation is awaited.
[0005]
Further, the conventional TfR measurement technique has a problem with reference materials. That is, although a purified product of TfR can be obtained, there is a problem in stability in the free state. Specifically, when the purified TfR is allowed to stand, the formation of insoluble aggregates or oligomers is observed. It can be confirmed by the gel filtration pattern by G3000 that the purified TfR forms an aggregate. It was also confirmed that when the surfactant treatment was used to dissociate the aggregate, there was a case where the reactivity increased by about 2 times. There is a limit to the reliability of measurements obtained based on such unstable standards.
In addition, there may be a difference in the reactivity to the same antibody between purified TfR and Tf-TfR complex present in the blood. According to the knowledge of the inventors, the Tf-TfR complex purified from serum showed a reactivity four times higher than that of purified TfR. For example, in the previous reports, the normal value of TfR is about 5000 ng / ml, and the measurement range is 1000 to 50000 ng / ml. However, since the standard used is purified TfR derived from tissue, it can be said that the reliability of the value is low.
Therefore, in order to disseminate the TfR measurement technique in general, consideration is required for distributing a standard substance for measurement in a stable state. In addition, as described above, in order to perform measurement in a high concentration range, a high concentration standard corresponding to the target concentration range is required. Conventionally, however, no standard material satisfying such conditions has been provided.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventor considered that the significance of measuring the TfR concentration in a body fluid that is a receptor for the iron transport protein Tf was significant from the relationship between iron and the hematopoietic function. For this purpose, a measurement system that can be measured more easily and easily automated, and a reagent having a more appropriate measurement concentration range are required. That is, the present invention is a new TfR measurement technique that realizes a wide measurement range that can be measured under the same conditions as the low concentration range even in the high concentration range where the dilution of the sample is required in the conventional TfR measurement technology. Providing is an issue. Furthermore, it is an object to provide a new reference material that supports this new measurement technique and has excellent stability and reliability.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
An object of the present invention is to provide a Tf-TfR complex measuring reagent composed of insoluble particles to which a TfR affinity substance is immobilized, or insoluble particles to which a TfR affinity substance and a Tf affinity substance are immobilized individually or mixed, and This can be solved by a measuring method using this reagent.
[0008]
A typical TfR affinity substance in the present invention is an antibody such as an anti-TfR antibody or an anti-Tf-TfR complex antibody. In addition, since the Tf-TfR complex is an object to be measured, anti-Tf antibodies can also be mentioned as affinity substances. This is because it is considered to bind specifically to TfR via Tf. In the case of using an antibody as an affinity substance, it is advantageous to select an antibody having a sufficiently high antibody titer because there is no competing in terms of affinity in the biological fluid as a specimen. As the antibody, a polyclonal antibody obtained by immunizing mice, rats, rabbits, goats and the like by a usual method can be used. Of course, it goes without saying that monoclonal antibodies can also be used.
Several antibodies against TfR have been reported so far. These known antibodies, whether polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, are used in the present invention as long as they have affinity and specificity capable of aggregating by reacting with TfR in a state sensitized to insoluble particles. be able to.
[0009]
Among them, the polyclonal antibody can be shown as a preferable antibody from the following background. First, considering the reaction principle of the agglutination reaction, it is generally more advantageous that the number of binding sites between the affinity substance immobilized on the particle and the test substance is larger. That is, a polyclonal antibody that recognizes a large number of binding sites is more advantageous than a monoclonal antibody in which binding sites are limited. Furthermore, in order to measure TfR that forms a complex with Tf, the Tf binding site on TfR is covered by Tf. In such a complex, an antibody that recognizes the Tf binding site can no longer bind. For these reasons, polyclonal antibodies are preferred antibodies.
[0010]
When higher specificity is expected or when it is desired to reduce the consumption of TfR or Tf as an immunogen, a monoclonal antibody may be used as the antibody. However, when using a monoclonal antibody, a clone having a more advantageous binding affinity should be selected in consideration of the circumstances described above. For example, an antibody that recognizes the Tf binding site of TfR should not be selected because the binding site is blocked by Tf. Therefore, it is preferable to use an antigenic determinant existing outside the Tf binding site of TfR, an antigenic determinant specifically present in the Tf-TfR complex, an antigenic determinant specific to Tf, etc. as the binding site of the monoclonal antibody. . In particular, the combination of a monoclonal antibody that recognizes an antigenic determinant other than the Tf-binding site of TfR and an antigenic determinant specific to Tf can reliably measure TfR forming a complex in blood. A preferred combination.
The reagent according to the present invention can be obtained by mixing insoluble particles to which these monoclonal antibodies are immobilized, or by immobilizing the mixture of monoclonal antibodies to insoluble particles. The reagent according to the present invention composed of an anti-Tf monoclonal antibody binds to free Tf but cannot form a cross-linked structure, so it does not lead to an agglutination reaction. That is, since the reagent has high accuracy that causes aggregation specifically only when the Tf-TfR complex is present, it can be shown as an embodiment in which the use of a monoclonal antibody is advantageous. Monoclonal antibodies can also be used in combination with polyclonal antibodies.
[0011]
When using a monoclonal antibody against Tf, it is expected that sufficient particle aggregation cannot be expected because free Tf present in the blood in a large amount compared to Tf-TfR competes with this monoclonal antibody. In such a case, a monoclonal antibody against the same Tf as that immobilized on the particles is added without being immobilized on the particles, and the reaction may be performed in the coexistence thereof.
[0012]
The antibody used in the present invention can be made less susceptible to non-specific reactions such as complement and rheumatoid factor by removing the Fc site. As a method for removing the Fc site, a method in which various proteolytic enzymes are allowed to act is known.
[0013]
As an affinity substance other than an antibody, α-1 antitrypsin for TfR can be assumed. Since these affinity substances each have a substance that competes with TfR in terms of affinity in biological fluids, it is preferable to carry out the reaction under conditions where the affinity for TfR is as large as possible.
Alternatively, a method of blocking a binding site with a competitor is also effective. For example, when α-1 antitrypsin is used, it is preferable to prepare particles to which trypsin is bound and to indirectly bind α-1 antitrypsin to the particles via trypsin. By this method, the trypsin binding site of α-1 antitrypsin is blocked, and the binding activity with TfR is present on the particles.
[0014]
The insoluble particles used in the present invention may be those commonly used in the field of immunology such as animal erythrocytes, metal sols, latex, gelatin, or pigments, but are not limited thereto. Among them, latex particles made of synthetic resin such as polystyrene are already widely used and thus are easily available and inexpensive, and are advantageous in terms of qualitative uniformity compared to animal erythrocytes. The polystyrene latex may have an average particle size of 0.02-1.0 μm, preferably 0.04-0.6 μm.
[0015]
The dispersion solution for dispersing the affinity particles of the present invention is used by adding a dispersant, a surfactant, a substance that prevents non-specific reactions, a small amount of a preservative, and the like to a buffer that provides a pH necessary for an immune reaction. The selection of these additive substances and concentrations is appropriately adjusted according to the affinity substance to be immobilized, the amount thereof, the type of insoluble particles, and the like. For example, inactive proteins such as gelatin and bovine serum albumin are effective in stabilizing the aggregation reaction and preventing nonspecific reactions.
Specifically, when dispersing polystyrene latex immobilized with an antibody as an affinity substance, phosphate buffer (hereinafter abbreviated as PBS) or buffer that gives a neutral region such as HEPES, BSA, normal animal serum, etc. Add
[0016]
The present invention also provides a method for measuring a Tf-TfR complex using the Tf-TfR complex measurement reagent. The reaction between the reagent of the present invention and the Tf-TfR complex can be followed by observing the degree of aggregation. As a method for observing the agglutination reaction, there are a method using the naked eye and a method of measuring the change in the amount of scattered light or transmitted light using an optical device. In general, the method of observing with the naked eye can be quantitatively measured only by diluting the specimen to several levels and observing each of them. The optical method is more preferable as an embodiment of the present invention because an appropriate calibration curve can be prepared in advance or at the time of measurement, so that quantitative measurement can be performed without taking several concentrations of the sample.
[0017]
At this time, a Tf-TfR complex derived from a blood material may be used as a standard substance. Since TfR released into the blood from cells has a different structure from TfR extracted from tissue, there is a possibility that an accurate result cannot be expected by the method using purified TfR as a standard due to a difference in reactivity. In fact, TfR released in the blood lacks 100 amino acids on the N-terminal side compared to complete TfR present in the tissue. Considering that most of TfR in blood is complex with Tf, in order to obtain the value of TfR in blood, it should be measured as Tf-TfR complex. If free TfR that does not form a complex with Tf in blood is measured, free TfR is used as a standard.
[0018]
The TfR measurement reagent of the present invention realizes measurement in a wide concentration range that has not been conventionally available. Due to this feature, the present invention provides a Tf-TfR complex measurement method in which most serum samples are measured without dilution. In addition, the measurement which does not require dilution operation said here means that a low concentration sample and a high concentration sample can be measured on the same reaction conditions. That is, in the conventional measurement method in which the measurable concentration range is narrow, dilution conditions different from those for the low concentration sample are necessary for the measurement of the high concentration sample. On the other hand, in the present invention, even a high concentration sample can be measured under the same conditions as a low concentration sample.
[0019]
The measured value of the Tf-TfR complex obtained by the present invention can be converted into a TfR value. Since TfR and Tf are bonded at a ratio of 1: 1, the molar ratio between the two becomes 1: 1. Since most of TfR in blood exists in a state of being bound to Tf, the ratio of the amount of TfR protein to the measured value of Tf-TfR complex gives the TfR value. This value is 47% as shown in the examples, and it can be converted to a TfR value by applying 47% to the measured value according to the present invention.
[0020]
The present invention also proposes a standard substance useful for measurement of Tf-TfR complex using a Tf-TfR complex measurement reagent composed of insoluble particles having a TfR affinity substance immobilized thereon. The standard substance provided by the present invention is a standard substance for measuring a Tf-TfR complex including a Tf-TfR complex. The Tf-TfR complex can be purified using serum with a high TfR value as a raw material. When measuring the Tf-TfR complex in the blood, it is advantageous to use a standard substance purified from the blood in order to make the reactivity with the reagent common. Purification of the Tf-TfR complex from serum can be easily performed by purification steps such as serum ammonium sulfate fractionation, anion exchange chromatography, and immunoadsorption chromatography. The purified Tf-TfR complex can be diluted in an appropriate buffer solution or added to TfR-free serum to test the concentration and use it as a standard substance. As the standard substance of the present invention, a substance having a high concentration of about 14,000 to 70000 ng / ml is useful so that it can be used as a standard substance over a wide concentration range that can also diagnose the hematopoietic function.
[0021]
[Action]
The insoluble particles to which the TfR affinity substance in the present invention is immobilized bind to the Tf-TfR complex and enable analysis thereof.
The present invention is novel in that a particle agglutination reaction that can be carried out with a simpler operation is applied in place of a measurement technique for realizing high sensitivity that has been conventionally used for measuring TfR. By applying the particle agglutination reaction, it is possible to measure up to a high concentration with sufficient accuracy under the same conditions as those in a low concentration region without diluting the sample. Furthermore, in the particle agglutination reaction which is a homogeneous reaction, the B / F separation required for the measurement by the label is unnecessary, and automation is easy. It also contributes to speeding up.
[0022]
On the other hand, the reference material of the present invention supports TmR as a Tf-TfR complex and supports a measurement technique that covers a wide concentration range in which this can be measured. In the standard based on TfR used conventionally, the substance different from the Tf-TfR complex which exists in the blood was used as the standard. The reference material of the present invention guarantees a high concentration range that is difficult to cover with conventional standards, and at the same time solves the stability problem of purified TfR.
According to the Tf-TfR complex measurement technique of the present invention, it is possible to measure TfR in a wide concentration range. For this reason, the conventional method of appropriately diluting serum with a known concentration to make a standard cannot guarantee the measured value completely up to the upper limit of the measurable range.
In addition to TfR-containing serum, a method of diluting purified TfR as a standard is also conceivable. However, according to the knowledge of the present inventors, the measured value of TfR purified from the placenta, for example, by a known method does not necessarily match the measured value of serum TfR. One of the reasons for this is the structural difference described above. That is, the known purified TfR cannot be used as a reliable standard substance. From such a background, a new reference material that supports the measurement technique newly proposed by the present invention is required.
[0023]
【The invention's effect】
The present invention enables measurement of a Tf-TfR complex by a particle agglutination reaction having excellent operability. According to the present invention, the measurement range of TfR is expanded, and a wide concentration range can be measured without diluting the sample. Expansion of the measurement range is particularly effective when measuring the Tf-TfR complex as a diagnostic marker for hematopoietic function. Furthermore, according to the present invention, speeding up and automation can be easily realized as compared with a high-sensitivity measurement method using a labeling technique.
The present invention also provides a new standard that covers a wide concentration range of the newly proposed measurement technique. Examples of the present invention are shown below.
[0024]
In addition, the reference material of the present invention increases the reliability of the Tf-TfR measurement value. First, it does not improve reliability in that it can provide a standard in a high concentration range that could not be covered by conventional measurement technology. Furthermore, providing as a Tf-TfR complex improves stability during storage, and as a result contributes to an increase in reliability.
[0025]
【Example】
1. Reagent preparation
Preparation of anti-TfR antibody: Human TfR purified from placenta by a known method (J. Biol. Chem., 263, 8318-8325, 1988) was mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant and thoroughly emulsified. The pupa footpad was immunized for the first time and boosted twice in the back skin every 4 weeks. The increase in antibody titer was confirmed by the octellony method with purified human TfR, and blood was collected 2 weeks after the final immunization to separate the antiserum. Antiserum was purified by DEAE-cellulose ion exchange chromatography, and the IgG fraction was used as an anti-TfR antibody.
Preparation Example of Reagent of the Present Invention: Anti-TfR antibody was mixed with polystyrene latex (average particle size 0.104 μm) and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Latex particles were separated by centrifugation at 3,000 × G for 15 minutes, and then suspended in a PBS buffer containing 1% BSA to obtain a 0.5% latex emulsion, which was used as the measurement reagent of the present invention.
[0026]
Example of preparation of reference reagent: The above anti-TfR antibody was adjusted to 10 mg / l with PBS buffer and dispensed to a 0.1-ml well in a 96-well microtiter plate (manufactured by Nunk). After washing with physiological saline, a block operation with BSA was applied to obtain a solid phase plate for ELISA. Further, the anti-TfR antibody was POD-labeled by the periodate crosslinking method to obtain a labeled antibody for ELISA.
[0027]
Preparation of standard substance: Serum was fractionated with 45-70% saturated ammonium sulfate, dialyzed with a buffer of 20 mM Tris-HCl (pH 8.6), and applied to an anion exchange column (Q-Sepharose, Pharmacia). Elution was performed with a linear gradient using 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6) containing 0.5 M NaCl. Fractions rich in TfR were pooled by following the TfR concentration by ELISA and applied to an affinity column to which an anti-Tf antibody was immobilized. The column was first washed with 50 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 0.1 M NaCl, and then with 50 mM citrate buffer (pH 4.9) containing 100 mM NaCl and 1 mM desferroxamine mesilate. Iron was released from Tf. After washing with 50 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 0.1 M NaCl again, the binding to Tf was reduced by the release of iron in 50 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 3 M KCl. TfR was eluted.
The eluate of the affinity column was reacted with an excess amount of iron-saturated Tf to form a complete Tf-TfR complex, dialyzed against a buffer of 20 mM Tris-HCl (pH 8.6), and further subjected to gel filtration column and anion exchange. A purified Tf-TfR complex was obtained using a column (Resource-Q, Pharmacia). The yield of the complex by this method was about 50% (recovering about 2.0 mg of Tf-TfR complex from 2 L of serum containing 2000 ng / ml of Tf-TfR complex).
[0028]
In the purified product, two bands having a molecular weight of about 85 kDa and 65 kDa were observed by SDS-PAGE in a non-reducing state. In the reduced state, Tf is dissociated from the intramolecular SS bond and the apparent molecular weight increases, so the two bands are close to each other.
When amino acid sequence analysis was performed on each protein after blotting to the PVDF membrane, it was confirmed that 85 kDa coincided with the sequence from the 101st position of TfR, and 65 kDa coincided with the sequence from the N-terminus of TfR. The composition ratio of TfR and Tf was approximately 47% to 53% from the densitogram of the stained SDS-PAGE gel, and the number of amino acid residues coincided with the ratio of 660 for TfR and 719 for Tf. That is, it is considered that the molar ratio was 1: 1. A value obtained by multiplying the amount of protein by the concentration ratio of TfR (47%) was determined as the amount of TfR in the purified complex. The protein amount of the purified Tf-TfR complex was determined by the BCA protein quantification method.
This purified Tf-TfR complex was diluted with PBS containing 1% BSA and 0.1% Tf and used as a primary standard. In the ELISA, lyophilized products obtained by appropriately diluting serum were assayed by the primary standard, and in the latex agglutination method, lyophilized products obtained by partially purifying and concentrating the Tf-TfR complex from the serum using an ion exchange column were tested with the primary standard. Used as the next standard. Therefore, the concentration value obtained by measurement using this standard is the concentration of the Tf-TfR complex.
[0029]
2. Comparison of calibration curves of the measurement reagent of the present invention and the reference reagent:
Using the measurement reagent of the present invention prepared in 1 above, 30 μl of sample solution (standard diluted concentration solution for calibration curve, sample solution for general measurement) and 300 μl of this reagent emulsion are dispensed and mixed in a measurement cell, Scattered light (wavelength 660 nm) was measured after 25 seconds and 300 seconds to determine the difference in intensity of the scattered light. The standard dilution was measured using each of the five steps obtained by sequentially diluting partially purified human Tf-TfR complex twice from 16000 ng / ml to prepare a calibration curve. For the measurement, a fully automatic immunochemical analyzer LX-3000 (trade name, manufactured by Eiken Chemical and Analytical Instruments) was used.
[0030]
As a control, a calibration curve for the ELISA method using the reference reagent prepared in 1 was prepared. For measurement, 100 μl of sample solution was dispensed per well on a solid phase plate, reacted at 37 ° C. for 1 hour, washed with 0.1% Tween 20-added PBS, added with 100 μl of labeled antibody, reacted at 37 ° C. for 30 minutes, washed, and TMB ( The color was developed with tetramethylbenzidine) and the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured.
The standard dilution concentration solution was measured using each of the five stages obtained by serially diluting a serum having a known Tf-TfR complex value from 78.0 ng / ml, and a calibration curve was prepared. The concentration of the standard substance is set based on a concentration range that can be measured with practical accuracy confirmed in a preliminary experiment.
The results are shown in FIG. 1 and FIG. In the measurement reagent of the present invention, the measurement range is 500 to 16000 ng / ml (FIG. 1), whereas in the reference example ELISA method (FIG. 2), it is 2.44 to 78.0 ng / ml. That is, it was confirmed that it was necessary to dilute the sample 200 times in advance to obtain the same measurement range as the measurement reagent of the present invention by ELISA.
[0031]
3. Correlation between latex agglutination method and ELISA method according to the present invention:
80 serum samples having various Tf-TfR complex values at various concentrations were measured with the latex agglutination reagent according to the present invention prepared in 1 and the ELISA reagent as a reference reagent, and the correlation between the measured values was investigated. High-value specimens that cannot be directly measured by the ELISA method were measured after dilution as appropriate.
The results are as shown in FIG. It was confirmed that the measurement value according to the present invention and the measurement value by ELISA showed a good correlation and high-precision measurement was possible.
[0032]
4). Measurement example using the measurement reagent of the present invention:
By the measurement reagent of the present invention shown in FIG. 2, 15 healthy subjects, 10 iron deficiency anemia patients, 15 stable dialysis patients, 10 dialysis patients with iron deficiency, 2 polycythemia patients, kidney transplantation Tf-TfR complex values were measured for sera from two patients. The results are shown in Table 1. The TfR value in the serum of patients with iron deficiency anemia, polycythemia, etc. was abnormally high, and it was confirmed that the measurement of TfR according to the present invention is useful as a diagnostic marker for hematopoietic function. Such a high value is beyond the measurable range of the ELISA method.
[0033]
[Table 1]

[0034]
4). Example of measurement using the measurement reagent of the present invention
The measurement reagent of the present invention was composed of a monoclonal antibody that recognizes other than the Tf binding site of TfR and a monoclonal antibody that recognizes Tf. The monoclonal antibody was prepared according to the method described in JP-A-62-2169, and each was fixed to insoluble particles and then mixed. The specific operation is as follows.
The same amount of purified TfR used in 1 was mixed with Freund's complete adjuvant and immunized subcutaneously in Balb / c mice. Immunization was repeated every 2 weeks, and after 4 immunizations, 50 μg of TfR was immunized intraperitoneally. Three days after the final immunization, it was confirmed that the antibody titer had increased, and the spleen was removed and mouse myeloma was obtained by a conventional method (Harada. N et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4581-4585, 1987). Cells were fused with cells P3-X63Ag8.653.
[0035]
Hybridomas were first screened for antibodies specific for TfR by immunoblotting assay using purified TfR as antigen. Clones producing monoclonal antibodies recognizing TfR are further screened by an inhibition assay using TfR and Tf and selected to produce monoclonal antibodies that recognize antigenic determinants present at portions other than the Tf binding site. did. Thus, a monoclonal antibody that recognizes other than the Tf binding site of TfR was obtained.
On the other hand, the monoclonal antibody recognizing Tf was obtained by substantially the same operation except that Tf was used as the immunogen and screening was simply performed on Tf.
[0036]
The two monoclonal antibodies (IgG, 0.11 mg / ml) thus obtained were physically adsorbed on polystyrene latex having a particle size of 0.104 μm at 37 ° C. for 1 hour. After washing with HEPES buffer, the reagent of the present invention comprising a monoclonal antibody was dispersed in HEPES buffer containing 1% BSA in an equal amount so that the particle concentration would be 0.5%.
[0037]
It was confirmed that the reagent according to the present invention composed of a monoclonal antibody quantitatively produces an optically measurable aggregate when reacted with the purified Tf-TfR complex by the same procedure as 2. This aggregation was not observable with purified Tf or TfR and was clearly specific for the Tf-TfR complex.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a standard curve obtained by an immunological latex agglutination reaction method using the measurement reagent of the present invention. In the figure, the vertical axis represents the amount of change in scattered light intensity (DLSE) at 660 nm, and the horizontal axis represents the Tf-TfR complex concentration (ng / ml).
FIG. 2 is a standard curve obtained by an ELISA method using a reference reagent. In the figure, the vertical axis represents absorbance at 450 nm, and the horizontal axis represents Tf-TfR complex concentration (ng / ml).
FIG. 3 is a graph showing the correlation between the measured value (ng / ml, horizontal axis) of the latex agglutination reagent (LA method) according to the present invention and the measured value (ng / ml, vertical axis) of the ELISA reagent.

Claims

Method of measuring transferrin-transferrin receptor complex in human body fluid by reacting insoluble particles immobilized with transferrin receptor affinity substance with transferrin-transferrin receptor complex and using aggregation of insoluble particles as an indicator

2. The method for measuring transferrin-transferrin receptor complex in human body fluid according to claim 1, wherein aggregation of insoluble particles is tracked using optical measurement.

The method for measuring transferrin-transferrin receptor complex according to claim 1-2, wherein undiluted serum is used as a sample.

Method of measuring transferrin-transferrin receptor complex using transferrin-transferrin receptor complex purified from serum as standard substance

A method of measuring transferrin receptor in a human body fluid by reacting insoluble particles immobilized with a transferrin receptor affinity substance with transferrin receptor and using aggregation of the insoluble particles as an index, and transferrin that does not form a complex with transferrin as a standard substance Measuring method using receptor

Reference material for measuring transferrin-transferrin receptor complex, including transferrin-transferrin receptor complex purified from serum

7. The standard of claim 6, comprising at least 14000 ng / ml of transferrin-transferrin receptor complex.