JP3965433B2 - Reagent for measuring total protein in sample and measuring method - Google Patents
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Description
本発明は、試料中の総蛋白質を測定するための総蛋白質測定試薬及び測定方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
The present invention relates to a total protein measuring reagent and measuring method for measuring total protein in a sample.
The present invention is particularly useful in fields such as chemistry, life science, analytical chemistry, and clinical testing.
蛋白質は、生体組織を構成する主要な物質であり、細胞の主要構成成分である。また、血中蛋白質には、生体の膠質浸透圧の維持、酸塩基平衡の維持、代謝、栄養素や微量金属等の輸送、筋肉運動、生体防御に働く抗体作用、血液凝固作用など種々の機能のものがあり、生命の維持や活動に重要な役割を果たしている。これら蛋白質の集合体が、総蛋白質であり、血清成分の約７％を占めている。血液中の蛋白質濃度は、蛋白質の吸収異常、腎障害、肝障害、悪性腫瘍等により変動し、その測定は臨床上極めて重要とされている。 Protein is a main substance constituting a living tissue and a main component of cells. In addition, blood protein has various functions such as maintaining the osmotic pressure of the body, maintaining acid-base equilibrium, metabolism, transport of nutrients and trace metals, muscle action, antibody action for body defense, blood coagulation action, etc. There are things that play an important role in life support and activities. The aggregate of these proteins is the total protein and occupies about 7% of the serum component. The protein concentration in blood varies depending on protein absorption abnormality, renal disorder, liver disorder, malignant tumor, etc., and its measurement is extremely important clinically.
総蛋白質の測定方法として使用されている方法としては、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法、屈折計法、比重から算出する方法、ビウレット法がある。Ｋｊｅｌｄａｈｌ法は窒素量を測定して総蛋白質量を算出する方法であり、従来から標準法とされているが、操作が繁雑であり蛋白質の種類による差が大きいという問題がある。また、屈折計法は簡便に使用できるが正確度に問題がある。 As a method for measuring the total protein, there are a Kjeldahl method, a refractometer method, a method of calculating from specific gravity, and a biuret method. The Kjeldahl method is a method for calculating the total protein mass by measuring the amount of nitrogen and has been conventionally used as a standard method, but has a problem that the operation is complicated and the difference depending on the type of protein is large. The refractometer method can be used easily, but has a problem in accuracy.
ビウレット法は、アルカリ溶液中で蛋白質のポリペプチド鎖を形成しているペプチド結合の窒素原子４個が銅イオンと錯体を形成し、赤紫色に発色する反応（ビウレット反応）を利用した方法であり、蛋白質の種類による発色反応に差が少ないため、日常的に広く使用されている。しかしながら、このビウレット法は、試料と１種類の試薬のみを混合して測定を行う１試薬系の方法であるため、溶血試料の影響を受け測定値に正誤差を生じるという問題があった。 The biuret method is a method using a reaction (biuret reaction) in which four nitrogen atoms of peptide bonds forming a polypeptide chain of a protein in an alkaline solution form a complex with copper ions and develop a reddish purple color. Since there is little difference in color reaction depending on the type of protein, it is widely used on a daily basis. However, since this biuret method is a one-reagent system method in which only a sample and one kind of reagent are mixed for measurement, there is a problem that a positive error occurs in the measured value due to the influence of the hemolyzed sample.
このため、最近では、測定に必要な成分を第１試薬と第２試薬に分割して含有させることにより、上記の問題点を解消した２試薬系２波長測定のビウレット法が提案されている。
例えば、試料を銅イオンを含有する試薬（第１試薬）と反応させた後にアルカリ性の試薬（第２試薬）と反応させ、銅イオンと試料中の蛋白質との錯体を形成させ発色させる方法や（例えば、特許文献１参照。）、試料をアルカリ性の試薬（第１試薬）と混合した後に銅イオンを含有する試薬（第２試薬）と反応させ、銅イオンと試料中の蛋白質との錯体を形成させ発色させる方法等が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。
For this reason, recently, a biuret method of two-reagent two-wavelength measurement has been proposed in which the components necessary for measurement are divided into a first reagent and a second reagent and the above problems are eliminated.
For example, a method in which a sample is reacted with a reagent containing copper ions (first reagent) and then reacted with an alkaline reagent (second reagent) to form a complex between the copper ions and the protein in the sample to develop color ( For example, see Patent Document 1.) After mixing the sample with an alkaline reagent (first reagent), the sample is reacted with a reagent containing copper ions (second reagent) to form a complex between the copper ions and the protein in the sample. For example, a method for causing color development is proposed (see, for example, Non-Patent Document 1).
本発明者は、２試薬系のビウレット法において、総蛋白質の測定範囲を広げるために、銅イオンを含有する試薬中の銅イオン濃度を増加させた場合、アルカリ性下では長期保存中に黒色沈殿や濁りが生じ、試薬の劣化が起きてしまうことを確認した。これを回避し長期安定化するためには、銅イオンを含有する試薬を弱アルカリ性〜酸性とすることが必要である。
しかし、ビウレット法においては、アルカリ性下で銅イオンと試料中の蛋白質との錯体を形成させ発色させるため、このように銅イオンを含有する試薬を弱アルカリ性〜酸性とした場合には、もう一方の試薬をアルカリ性にすることが必要となる。
In the biuret method of the two-reagent system, the present inventor has increased the copper ion concentration in a reagent containing copper ions in order to widen the total protein measurement range. It was confirmed that turbidity occurred and the reagent deteriorated. In order to avoid this and stabilize for a long time, it is necessary to make the reagent containing copper ions weakly alkaline to acidic.
However, in the biuret method, a complex is formed by forming a complex of a copper ion and a protein in a sample under alkalinity, so that when the reagent containing copper ion is weakly alkaline to acidic, the other It is necessary to make the reagent alkaline.
ところで、本発明者が銅イオンを含有する弱アルカリ性〜酸性の試薬とアルカリ性の試薬を調製し、これらの試薬を用いて試料中の総蛋白質の測定について検討を行ったところ、測定値に正誤差を生じる場合があることが分かった。
この正誤差が生じた場合の最終反応液を目視で確認すると、沈殿の生成が認められた。この沈殿は、銅イオンを含有する試薬がアルカリ性の試薬と混合された際に形成された、不溶性の銅水酸化物〔Ｃｕ（ＯＨ）２〕であることが分かった。
By the way, the present inventor prepared a weakly alkaline to acidic reagent containing copper ions and an alkaline reagent, and examined the measurement of total protein in the sample using these reagents. It has been found that this may occur.
When the final reaction solution when this positive error occurred was visually confirmed, formation of a precipitate was observed. This precipitate was found to be insoluble copper hydroxide [Cu (OH) 2 ] formed when a reagent containing copper ions was mixed with an alkaline reagent.
したがって、本発明の課題は、ビウレット反応を利用した２試薬系の総蛋白質の測定系において、総蛋白質の測定範囲が広く、そして、測定における第１試薬と第２試薬の混合時にも沈殿が生成して正誤差が生じることを防ぐことができ、再現性を向上させることができ、更に保存時にも測定試薬が劣化することのない、試料中の総蛋白質測定試薬及び試料中の総蛋白質測定方法を提供することである。 Therefore, the object of the present invention is to measure the total protein in a two-reagent system using a biuret reaction, and has a wide measurement range, and a precipitate is generated when the first reagent and the second reagent are mixed in the measurement. Thus, it is possible to prevent the occurrence of positive errors, improve reproducibility, and further prevent the measurement reagent from deteriorating during storage, and the total protein measurement reagent in the sample and the total protein measurement method in the sample Is to provide.
本発明者は、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、ビウレット反応を利用した２試薬系の総蛋白質測定試薬及び測定方法において、アルカリ性の第１試薬、並びに銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬、という組み合わせにすることにより、試料中の総蛋白質を精度良く正確に測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies aimed at solving the above-mentioned problems, the present inventors have found that in the two-reagent-based total protein measurement reagent and measurement method using the biuret reaction, the alkaline first reagent, copper ions and copper ions are added. It has been found that the total protein in the sample can be accurately and accurately measured by combining the second reagent having a chelating ability and a second reagent having a pH of 10 or less, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） アルカリ性の第１試薬、並びに銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬からなる、試料中の総蛋白質測定試薬。
That is, the present invention provides the following inventions.
(1) A reagent for measuring total protein in a sample, comprising an alkaline first reagent, and a second reagent having a pH of 10 or less containing a copper ion and a substance capable of chelating copper ions.
（２） 第２試薬のｐＨが３〜７である、前記（１）記載の試料中の総蛋白質測定試薬。 (2) The reagent for measuring total protein in the sample according to (1), wherein the pH of the second reagent is 3 to 7.
（３） 銅イオンにキレート能力を持つ物質が、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸若しくはエタノールアミン又はその塩よりなる群から選択される物質であることを特徴とする、前記（１）又は前記（２）記載の試料中の総蛋白質測定試薬。 (3) The substance having a chelating ability to copper ions is a substance selected from the group consisting of oxycarboxylic acid, polyaminocarboxylic acid, ethanolamine or a salt thereof, (1) or (2) ) Reagent for measuring total protein in the sample described above.
（４） オキシカルボン酸又はその塩が、クエン酸又はその塩であることを特徴とする、前記（３）記載の試料中の総蛋白質測定試薬。 (4) The reagent for measuring total protein in a sample as described in (3) above, wherein the oxycarboxylic acid or a salt thereof is citric acid or a salt thereof.
（５） 第１試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させることを特徴とする、前記（１）〜前記（４）のいずれか１項に記載の試料中の総蛋白質測定試薬。 (5) The total protein measurement reagent in the sample according to any one of (1) to (4), wherein the first reagent contains a substance having a chelating ability for copper ions.
（６） 銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有し、ｐＨ１０以下である試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。 (6) A second reagent of a total protein measurement reagent in a sample containing copper ions and a substance having a chelating ability to copper ions and having a pH of 10 or less.
（７） ｐＨが３〜７である、前記（６）記載の試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。 (7) The 2nd reagent of the total protein measuring reagent in the sample as described in said (6) whose pH is 3-7.
（８） 銅イオンにキレート能力を持つ物質が、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸若しくはエタノールアミン又はその塩よりなる群から選択される物質であることを特徴とする、前記（６）又は前記（７）記載の試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。 (8) The above-mentioned (6) or (7), wherein the substance having a chelating ability to copper ions is a substance selected from the group consisting of oxycarboxylic acid, polyaminocarboxylic acid, ethanolamine or a salt thereof. ) Second reagent of the total protein measurement reagent in the sample described above.
（９） オキシカルボン酸が、クエン酸又はその塩であることを特徴とする、前記（８）記載の試料中の総蛋白質測定試薬の第２試薬。 (9) The second reagent of the total protein measurement reagent in the sample according to (8), wherein the oxycarboxylic acid is citric acid or a salt thereof.
（１０） 試料中の総蛋白質を測定する方法であって、
ａ）該試料と、アルカリ性の第１試薬とを混合させる工程、
ｂ）前記試料と第１試薬との混合物に、銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬を混合し反応させ、試料中の蛋白質と銅イオンの錯体を形成させる工程、及び
ｃ）前記蛋白質と銅イオンの錯体を比色測定する工程よりなる、試料中の総蛋白質測定方法。
(10) A method for measuring total protein in a sample,
a) mixing the sample with an alkaline first reagent;
b) Mixing and reacting a mixture of the sample and the first reagent with a second reagent having a pH of 10 or less containing a copper ion and a substance having a chelating ability for the copper ion to form a complex of the protein in the sample and the copper ion. And c) a method for measuring the total protein in the sample, comprising the step of colorimetrically measuring the protein and copper ion complex.
（１１） 第２試薬のｐＨが３〜７である、前記（１０）記載の試料中の総蛋白質測定方法。 (11) The method for measuring total protein in a sample according to (10), wherein the second reagent has a pH of 3 to 7.
（１２） 銅イオンにキレート能力を持つ物質が、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸若しくはエタノールアミン又はその塩よりなる群から選択される物質であることを特徴とする、前記（１０）又は前記（１１）記載の試料中の総蛋白質測定方法。 (12) The substance having a chelating ability to copper ions is a substance selected from the group consisting of oxycarboxylic acid, polyaminocarboxylic acid, ethanolamine or a salt thereof, (10) or (11) ) Method for measuring total protein in the sample.
（１３） オキシカルボン酸又はその塩が、クエン酸又はその塩であることを特徴とする、前記（１２）記載の試料中の総蛋白質測定方法。 (13) The method for measuring total protein in a sample according to (12), wherein the oxycarboxylic acid or a salt thereof is citric acid or a salt thereof.
（１４） 第１試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させることを特徴とする、前記（１０）〜前記（１３）のいずれか１項に記載の試料中の総蛋白質測定方法。 (14) The method for measuring total protein in a sample according to any one of (10) to (13), wherein the first reagent contains a substance having a chelating ability for copper ions.
本発明の測定試薬及び測定方法は、ビウレット反応を利用した２試薬系の総蛋白質の測定系において、アルカリ性の第１試薬、並びに銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬、という組み合わせにすることにより、総蛋白質の測定範囲を広くすることができ、そして、測定における第１試薬と第２試薬の混合時にも沈殿が生成して正誤差が生じることを防ぐことができ、再現性を向上させることができ、更に保存時にも測定試薬が劣化することがないので、試料中の総蛋白質を精度良く正確に測定することができるものである。
そして、これにより、疾患の診断等の場において、誤差を含まない、かつ正確な総蛋白質の測定値を提供することができるものである。
The measurement reagent and the measurement method of the present invention are a two-reagent-based total protein measurement system using a biuret reaction, and include an alkaline first reagent and copper ions and a substance having a chelating ability to copper ions, having a pH of 10 or less. By combining the second reagent, the measurement range of the total protein can be widened, and it is possible to prevent the occurrence of a positive error due to the formation of a precipitate when the first reagent and the second reagent are mixed in the measurement. Thus, the reproducibility can be improved, and the measurement reagent does not deteriorate even during storage, so that the total protein in the sample can be measured accurately and accurately.
As a result, it is possible to provide an accurate measurement value of total protein that does not include errors in the field of disease diagnosis and the like.
〔１〕 測定試薬
本発明は、アルカリ性の第１試薬、並びに銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬からなる、試料中の総蛋白質測定試薬である。
[1] Measuring reagent The present invention is a reagent for measuring total protein in a sample, comprising an alkaline first reagent and a second reagent having a pH of 10 or less containing a copper ion and a substance capable of chelating copper ions.
１． 第１試薬
本発明の測定試薬の第１試薬は、アルカリ性の第１試薬である。なお、本発明の測定試薬は、アルカリ性下で銅イオンと試料中の蛋白質との錯体を形成させ発色させるビウレット反応を利用した測定試薬であり、本発明の測定試薬の第２試薬はｐＨ１０以下のものであるので、第１試薬のｐＨは、試料と第１試薬と第２試薬を混合させた最終反応液のｐＨが、ビウレット反応を起こすようなｐＨ範囲にする必要がある。通常、ビウレット反応はｐＨ１３以上で起こるものであるので、本発明の試料中の総蛋白質測定試薬の第１試薬は、ｐＨ１３以上とするのが好ましい。
1. First reagent The first reagent of the measurement reagent of the present invention is an alkaline first reagent. Note that the measurement reagent of the present invention is a measurement reagent using a biuret reaction that forms a complex between a copper ion and a protein in a sample under alkalinity, and the second reagent of the measurement reagent of the present invention has a pH of 10 or less. Therefore, the pH of the first reagent needs to be in a pH range such that the pH of the final reaction solution obtained by mixing the sample, the first reagent, and the second reagent causes a biuret reaction. Since the biuret reaction usually occurs at pH 13 or higher, the first reagent of the total protein measurement reagent in the sample of the present invention is preferably pH 13 or higher.
本発明の測定試薬の第１試薬は、例えば、水酸化ナトリウム等の塩基性物質等を水等の水系溶媒に溶解する等により行うことができる。
ここで、塩基性物質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム等を挙げることができる。
The first reagent of the measurement reagent of the present invention can be performed, for example, by dissolving a basic substance such as sodium hydroxide in an aqueous solvent such as water.
Here, examples of the basic substance include sodium hydroxide, lithium hydroxide, and potassium hydroxide.
また、本発明の測定試薬の第１試薬には、ビリルビンの影響を回避する目的のため、ビリルビンをあらかじめビリベルジンに変化させる物質を含有させても良い。 The first reagent of the measurement reagent of the present invention may contain a substance that changes bilirubin into biliverdin in advance for the purpose of avoiding the influence of bilirubin.
２． 第２試薬
本発明の測定試薬の第２試薬は、銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下のものである。
2. Second reagent The second reagent of the measurement reagent of the present invention is one having a pH of 10 or less containing copper ions and a substance having a chelating ability for copper ions.
（１） 銅イオン
本発明において銅イオンとしては、Ｃｕ２＋等を挙げることができる。本発明の測定試薬の第２試薬には、この銅イオンを含有させる。
この銅イオンを含有させることであるが、例えば、硫酸銅、塩化銅、硝酸銅、ＥＤＴＡ銅等の銅塩を含有させることにより達成できる。
この銅イオンの濃度は、第２試薬中において、４〜３００ｍＭの範囲にあることが好ましく、２０〜１５０ｍＭの範囲が特に好ましい。
また、この銅イオンの濃度は、試料、第１試薬及び第２試薬を混合した最終反応液中において、１〜８０ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜４０ｍＭの範囲が特に好ましい。
(1) Copper ion In this invention, Cu <2+> etc. can be mentioned as a copper ion. The copper reagent is contained in the second reagent of the measurement reagent of the present invention.
The inclusion of this copper ion can be achieved, for example, by containing a copper salt such as copper sulfate, copper chloride, copper nitrate, or EDTA copper.
The concentration of this copper ion is preferably in the range of 4 to 300 mM, particularly preferably in the range of 20 to 150 mM, in the second reagent.
Moreover, it is preferable that the density | concentration of this copper ion exists in the range of 1-80 mM in the final reaction liquid which mixed the sample, the 1st reagent, and the 2nd reagent, and the range of 5-40 mM is especially preferable.
（２） 銅イオンにキレート能力を持つ物質
本発明において、銅イオンにキレート能力を持つ物質とは、銅イオンに配位する多座配位子であって、銅イオンへの配位により銅を含んだ環状構造（キレート環）を形成する物質をいう。
本発明の測定試薬の第２試薬には、銅イオンに加えて、この銅イオンにキレート能力を持つ物質をも含有させる。
(2) Substance having a chelating ability to copper ion In the present invention, a substance having a chelating ability to copper ion is a multidentate ligand coordinated to copper ion, and copper is coordinated by coordination to copper ion. A substance that forms a cyclic structure (chelate ring).
In addition to copper ions, the second reagent of the measurement reagent of the present invention contains a substance having a chelating ability for the copper ions.
ここで、銅イオンにキレート能力を持つ物質としては、例えば、オキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸、若しくはエタノールアミン又はその塩等を挙げることができる。
ここで、オキシカルボン酸又はその塩としては、例えば、クエン酸、イソクエン酸、酒石酸、乳酸、若しくはリンゴ酸又はその塩等を挙げることができる。
また、ポリアミノカルボン酸又はその塩としては、例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレン（トリアミン）五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ビス（ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、若しくはトリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）等及びその塩が挙げられる。
更に、エタノールアミンとしては、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、又はトリエタノールアミン等を挙げることができる。
Here, examples of the substance having a chelating ability for copper ions include oxycarboxylic acid, polyaminocarboxylic acid, ethanolamine or a salt thereof.
Here, examples of the oxycarboxylic acid or a salt thereof include citric acid, isocitric acid, tartaric acid, lactic acid, malic acid or a salt thereof.
Examples of the polyaminocarboxylic acid or a salt thereof include nitrilotriacetic acid (NTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diaminopropanetetraacetic acid (Methyl-EDTA), diaminocyclohexanetetraacetic acid (CyDTA), and glycol ether diamine tetraacetic acid. (GEDTA), hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), dihydroxyethylglycine (DHEG), diaminopropanoltetraacetic acid (DPTA-OH), diethylene (triamine) pentaacetic acid (DTPA), ethylenediaminediacetic acid (EDDA), ethylenediaminedipropion Acid (EDDP), hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (EDTA-OH), bis (hydroxybenzyl) ethylenediaminediacetic acid (HBED), hexamethylenediaminetetraacetic acid (HDT) ), Hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), iminodiacetic acid (IDA), nitrilotriacetic propionic acid (NTP), or triethylenetetraminehexaacetic acid (TTHA) or the like, and salts thereof.
Furthermore, examples of ethanolamine include monoethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine.
なお、本発明の測定試薬の第２試薬は、総蛋白質の測定範囲を広げるために銅イオンの含有濃度を増加させた場合でも、保存中に黒色沈殿や濁りが生じないように、ｐＨ１０以下に設定している。
従って、本発明の測定試薬の第２試薬に含有させる、銅イオンにキレート能力を持つ物質としては、このｐＨ１０以下において銅イオンと容易かつ充分にキレート形成できるものが好ましい。
それは、銅イオンにキレート能力を持つ物質が、充分に銅イオンに配位することにより、銅イオンが安定化し、これにより測定の際の第１試薬と第２試薬の混合時に沈殿が生じることを防ぐことができるからである。
このような理由により、銅イオンにキレート能力を持つ物質として、クエン酸、イソクエン酸、酒石酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、若しくはトリエタノールアミン又はその塩等が好適であり、特にクエン酸又はその塩が好適である。
Note that the second reagent of the measurement reagent of the present invention has a pH of 10 or less so that black precipitation and turbidity do not occur during storage even when the concentration of copper ions is increased to widen the total protein measurement range. It is set.
Therefore, as a substance having a chelating ability for copper ions to be contained in the second reagent of the measurement reagent of the present invention, those capable of easily and sufficiently chelating with copper ions at a pH of 10 or less are preferable.
That is, a substance having a chelating ability to copper ions is sufficiently coordinated to copper ions, so that the copper ions are stabilized, thereby causing precipitation when mixing the first reagent and the second reagent at the time of measurement. This is because it can be prevented.
For these reasons, citric acid, isocitric acid, tartaric acid, nitrilotriacetic acid (NTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diaminopropanetetraacetic acid (Methyl-EDTA), diaminocyclohexane Preferred are tetraacetic acid (CyDTA), glycol ether diamine tetraacetic acid (GEDTA), hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), monoethanolamine, diethanolamine, or triethanolamine, or a salt thereof, and particularly citric acid or a salt thereof. Is preferred.
また、銅イオンにキレート能力を持つ物質の濃度は、キレート環を形成するときの銅イオンとの最適な結合比率によって異なるので、一概には言えないものの、銅イオンにキレート能力を持つ物質を当量以上含有させるのが望ましい。
例えば、銅イオンと銅イオンにキレート能力を持つ物質の比は、通常１：１、１：２又は１：３であるので、前記（１）に記載した銅イオン濃度に対する銅イオンにキレート能力を持つ物質の濃度としては、第２試薬中において、４〜９００ｍＭの範囲にあることが好ましく、２０〜４５０ｍＭの範囲が特に好ましい。
また、この銅イオンにキレート能力を持つ物質の濃度は、試料、第１試薬及び第２試薬を混合した最終反応液中において、１〜２４０ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜１２０ｍＭの範囲が特に好ましい。
In addition, the concentration of a substance having a chelating ability to copper ions varies depending on the optimum binding ratio with the copper ion when forming a chelate ring. It is desirable to contain above.
For example, since the ratio of copper ion to a substance having a chelating ability to copper ion is usually 1: 1, 1: 2 or 1: 3, the chelating ability of copper ion with respect to the copper ion concentration described in (1) above is set. The concentration of the substance possessed is preferably in the range of 4 to 900 mM in the second reagent, and particularly preferably in the range of 20 to 450 mM.
In addition, the concentration of the substance having a chelating ability to the copper ion is preferably in the range of 1 to 240 mM in the final reaction solution in which the sample, the first reagent and the second reagent are mixed, and in the range of 5 to 120 mM. Particularly preferred.
（３） ｐＨ
ａ）第１試薬のｐＨ
本発明の測定試薬の第１試薬は、最終反応液においてビウレット反応が起こるｐＨ範囲にする必要があり、前述の通り第２試薬のｐＨとの関係でｐＨ１３以上であることが好ましい。より具体的には、試料、第１試薬及び第２試薬を混合した最終反応液のｐＨがｐＨ１３以上となるよう、第１試薬のｐＨを、第２試薬のｐＨに応じて適宜調整すればよい。
(3) pH
a) pH of the first reagent
The first reagent of the measurement reagent of the present invention needs to be in a pH range where a biuret reaction occurs in the final reaction solution, and is preferably pH 13 or more in relation to the pH of the second reagent as described above. More specifically, the pH of the first reagent may be adjusted as appropriate according to the pH of the second reagent so that the final reaction liquid in which the sample, the first reagent, and the second reagent are mixed has a pH of 13 or more. .
ｂ）第２試薬のｐＨ
本発明の測定試薬の第２試薬のｐＨは１０以下であり、この範囲のｐＨであれば、第２試薬中の銅イオンを長期間安定に保存することができる。また、同じ理由により、本発明の測定試薬の第２試薬は、ｐＨ３〜７の範囲にあることが好ましい
なお、この第２試薬のｐＨは、銅イオンにキレート能力を持つ物質が銅イオンと容易かつ充分にキレート形成できるｐＨとすることが好ましい。（前記「（２）銅イオンにキレート能力を持つ物質」の項で述べた理由と同じ理由による。）
また、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝剤としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。
このような緩衝剤として第２試薬に使用できるものとしては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、若しくはＴＡＰＳ又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。
b) pH of the second reagent
The pH of the second reagent of the measurement reagent of the present invention is 10 or less. If the pH is within this range, the copper ions in the second reagent can be stably stored for a long period of time. For the same reason, the second reagent of the measurement reagent of the present invention is preferably in the range of pH 3 to 7. Note that the pH of the second reagent is that a substance having a chelating ability to copper ions can be easily separated from copper ions. And it is preferable to set it as pH which can fully chelate-form. (For the same reason as described in the section “(2) Substance having chelating ability to copper ion”)
Moreover, as a buffering agent used so that it may become said pH range, the conventionally well-known buffering agent which has buffer capacity in the said pH range can be used suitably.
Examples of such buffers that can be used in the second reagent include phosphoric acid, tris (hydroxymethyl) aminomethane, imidazole, glycylglycine, MES, Bis-Tris, ADA, ACES, Bis-Tris propane, Examples of the buffer include PIPES, MOPSO, MOPS, BES, HEPES, TES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPS, HEPPSO, Tricine, Bicine, and TAPS, and salts thereof.
ｃ）最終反応液のｐＨ
本発明の測定試薬は、アルカリ性下で銅イオンと試料中の蛋白質との錯体を形成させ発色させるビウレット反応を利用した測定試薬であり、この発色は通常ｐＨ１３以上で起こるものであるため、試料、第１試薬及び第２試薬を混合した最終反応液のｐＨが１３以上であることが必要となる。
c) pH of the final reaction solution
The measurement reagent of the present invention is a measurement reagent using a biuret reaction that forms a complex between a copper ion and a protein in a sample under alkalinity, and this color development usually occurs at a pH of 13 or higher. It is necessary that the pH of the final reaction mixture obtained by mixing the first reagent and the second reagent is 13 or more.
３． 銅イオンにキレート能力を持つ物質の第１試薬への含有
本発明の第１試薬には、銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させてもよい。ここで、銅イオンにキレート能力を持つ物質は、第２試薬に含有させる物質と同じものであっても、異なるものであってもよい。
なお、アルカリ性下で銅イオンにキレート能力を持つ物質であれば、最終反応液中でも銅水酸化物が生じず安定的に測定が行えるので好適である。
ここで、アルカリ性下で銅イオンにキレート能力を持つ物質としては、例えば、酒石酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、若しくはニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）又はその塩等を挙げることができる。
3. Inclusion of a substance having a chelating ability for copper ions in the first reagent The first reagent of the present invention may contain a substance having a chelating ability for copper ions. Here, the substance having a chelating ability for copper ions may be the same as or different from the substance contained in the second reagent.
A substance having a chelating ability to copper ions under alkalinity is preferable because copper hydroxide is not generated even in the final reaction solution and measurement can be performed stably.
Here, as a substance having a chelating ability to copper ions under alkaline conditions, for example, tartaric acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diaminocyclohexanetetraacetic acid (CyDTA), dihydroxyethylglycine (DHEG), ethylenediaminediacetic acid (EDDA), Examples thereof include glycol ether diamine tetraacetic acid (GEDTA), hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), iminodiacetic acid (IDA), nitrilotriacetic acid (NTA), nitrilotripropionic acid (NTP), and salts thereof.
４． 測定試薬等の構成成分
本発明の測定試薬において、第１試薬及び／又は第２試薬には前記の成分の他に、公知の防腐剤、安定化剤、又は界面活性剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
4). Constituent components such as measurement reagent In the measurement reagent of the present invention, the first reagent and / or the second reagent may contain a known preservative, stabilizer, surfactant, or the like, if necessary, in addition to the above components. It can be used as appropriate.
５． 試料
本発明において、試料とは、試料中の総蛋白質濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液等が挙げられる。
5). Sample In the present invention, the sample is a sample for measuring the total protein concentration in the sample, and is not particularly limited as long as it is such.
Examples of such a sample include human or animal blood, serum, plasma, urine, spinal fluid, saliva, sweat, and other body fluids, human or animal kidneys, heart, lung, brain and other organ extracts. Extracts such as skeletal muscle, bone marrow, skin, or nerve tissue; extracts such as hair; human or animal fecal extracts or suspensions; cell extracts and the like.
〔２〕 測定方法
１． 試料中の総蛋白質測定
本発明の試料中の総蛋白質測定方法は、
ａ） 試料と、アルカリ性の第１試薬とを混合させる工程、
ｂ） 前記試料と第１試薬との混合物に、銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬を混合し反応させ、試料中の蛋白質と銅イオンの錯体を形成させる工程、及び
ｃ） 前記蛋白質と銅イオンの錯体を比色測定する工程よりなるものである。
[2] Measuring method Measurement of total protein in sample The method for measuring total protein in a sample of the present invention comprises:
a) mixing a sample with an alkaline first reagent;
b) Mixing and reacting a mixture of the sample and the first reagent with a second reagent having a pH of 10 or less containing a copper ion and a substance having a chelating ability to the copper ion to form a complex of the protein in the sample and the copper ion. And c) a step of colorimetrically measuring the protein and copper ion complex.
なお、本発明の試料中の総蛋白質測定方法における、第１試薬及び第２試薬は前記「〔１〕測定試薬」に記載したとおりである。 In the method for measuring total protein in a sample of the present invention, the first reagent and the second reagent are as described in “[1] Measuring reagent”.
本発明の試料中の総蛋白質測定方法により試料中の総蛋白質を測定する場合の一例をより具体的に説明すると、例えば、試料とアルカリ性の第１試薬とを混合し、この試料とアルカリ性の第１試薬との混合物を、前記銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬と混合すると、アルカリ性下において試料中に含まれる蛋白質と銅イオンが接触し錯体が形成される。 An example of measuring the total protein in the sample by the method for measuring total protein in the sample of the present invention will be described more specifically. For example, the sample and an alkaline first reagent are mixed, and the sample and the alkaline first reagent are mixed. When a mixture with one reagent is mixed with the second reagent having a pH of 10 or less containing the copper ion and the substance having a chelating ability to the copper ion, the protein contained in the sample and the copper ion come into contact with each other under alkalinity to form a complex. Is done.
この蛋白質と銅イオンの錯体が吸収を示す任意の波長において、分光光度計を用いて吸光度などを測定すること等により、蛋白質の量を求め、これより試料中の総蛋白質濃度の算出を行うことができる。 Obtain the amount of protein by measuring the absorbance using a spectrophotometer at an arbitrary wavelength at which the complex of this protein and copper ion shows absorption, and calculate the total protein concentration in the sample from this. Can do.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited by this Example.
（本発明の測定試薬及び測定方法の正確性の確認）
本発明の試料中の総蛋白質測定試薬及び総蛋白質測定方法の測定の正確性を確かめた。
(Confirmation of accuracy of measuring reagent and measuring method of the present invention)
The measurement accuracy of the total protein measurement reagent and the total protein measurement method in the sample of the present invention was confirmed.
１． 測定試薬の調製
（１） 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを１３．５（２０℃）に調整し、総蛋白質測定試薬の第１試薬を調製した。
水酸化ナトリウム ７５ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム ４２．５ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 １１ｍＭ
界面活性剤
1. Preparation of measurement reagent (1) Preparation of first reagent The following reagent components were dissolved in pure water to the respective concentrations described above, the pH was adjusted to 13.5 (20 ° C), and the total protein measurement reagent One reagent was prepared.
Sodium hydroxide 75mM
Sodium potassium tartrate 42.5 mM
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 11 mM
Surfactant
（２） 本発明・第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．８（２０℃）に調整し、総蛋白質測定試薬の第２試薬（本発明・第２試薬）を調製した。
硫酸銅五水和物 １００ｍＭ
クエン酸一水和物 ３００ｍＭ
(2) Preparation of the Second Reagent of the Present Invention The following reagent components are dissolved in pure water so that each concentration is as described, and the pH is adjusted to 5.8 (20 ° C.). A reagent (the present invention / second reagent) was prepared.
（３） 対照・第２試薬の調製
前記（２）の本発明・第２試薬のクエン酸一水和物を含有させないこと以外は、前記（２）の試薬成分及び濃度の通りに第２試薬の調製を行った。（対照・第２試薬）
(3) Preparation of control / second reagent Second reagent as described in (2) above except that it does not contain citric acid monohydrate of the present invention / second reagent of (2) Was prepared. (Control / second reagent)
２． 試料の測定
日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて測定を行った。生理食塩水５μＬを試料とし、これに前記１の（１）で調製した第１試薬２４０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（２）で調製した本発明・第２試薬８０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。第２試薬添加直前と添加５分後の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。この測定を連続して３００回繰り返して行った。また、第２試薬を前記１の（３）で調製した対照・第２試薬に変えて同様に測定を行った。
2. Measurement of sample The measurement was performed with a 7170S type automatic analyzer manufactured by Hitachi, Ltd. Using 5 μL of physiological saline as a sample, add 240 μL of the first reagent prepared in (1) above, and after mixing, react at 37 ° C. for 5 minutes. Then, the book prepared in (2) above Invention: 80 μL of the second reagent was added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. Absorbance at a main wavelength of 546 nm and a subwavelength of 700 nm immediately before and after the addition of the second reagent was measured, and the difference was determined. This measurement was repeated 300 times continuously. Further, the measurement was performed in the same manner by changing the second reagent to the control / second reagent prepared in (1) above.
３． 測定結果
生理食塩水を３００回連続して測定した時の測定結果を図１及び図２に示した。なお、図１は第２試薬として本発明・第２試薬を用いたときのものであり、図２は第２試薬として対照・第２試薬を用いたときのものである。
そして、これらの図において、横軸は測定回数を表し、縦軸は測定値（吸光度差）を１０，０００倍した値を示した。
3. Measurement result The measurement result when measuring
In these figures, the horizontal axis represents the number of measurements, and the vertical axis represents the value obtained by multiplying the measured value (absorbance difference) by 10,000.
図１及び図２から明らかなように、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させていない対照・第２試薬を用いた場合は、測定値（吸光度差）に正誤差が生じていることが分かる。また、この時の最終反応液を目視で確認したところ、最終反応液中に銅水酸化物と思われる青白色の沈殿が生成していることが確認された。
これに対し、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させた本発明・第２試薬を用いた場合は、測定値（吸光度差）に正誤差は生じておらず、測定が正確に行われていることが分かる。
As is clear from FIGS. 1 and 2, when the control / second reagent not containing citric acid monohydrate is used as the second reagent, a positive error occurs in the measured value (absorbance difference). I understand that. Moreover, when the final reaction liquid at this time was confirmed visually, it was confirmed that the blue-white precipitation considered to be a copper hydroxide was producing | generating in the final reaction liquid.
In contrast, when the present invention / second reagent containing citric acid monohydrate in the second reagent was used, no positive error occurred in the measured value (absorbance difference), and the measurement was performed accurately. You can see that
ところで、前記１の（１）で調製した第１試薬には、最終反応液中における銅水酸化物〔Ｃｕ（ＯＨ）２〕の発生を防止する目的で、銅イオンにキレート能力を持つ物質である酒石酸ナトリウムカリウムを含有させている。しかしながら、対照・第２試薬を用いた場合には、最終反応液中に銅水酸化物が形成されており、これが原因となり測定値（吸光度差）に正誤差が生じてしまっている。
このことは、銅イオンを含有する第２試薬とアルカリ性でありかつ酒石酸ナトリウムカリウムを含有する第１試薬が混合された際に、瞬間的に（酒石酸イオンと銅イオンの錯体が形成されるよりも圧倒的に速く）、不溶性の銅水酸化物が形成されたであろうことを示しており、第１試薬に含有された酒石酸ナトリウムカリウムでは瞬間的な銅水酸化物の形成を防止できていないことが分かる。
これに対し、本発明の測定試薬及び測定方法では、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させることで、銅イオンを含有する第２試薬とアルカリ性の第１試薬が混合された際に、不溶性の銅水酸化物が形成するのを防止できていることが分かる。
By the way, the first reagent prepared in (1) above is a substance having a chelating ability to copper ions for the purpose of preventing the generation of copper hydroxide [Cu (OH) 2 ] in the final reaction solution. Contains some potassium sodium tartrate. However, when the control / second reagent is used, copper hydroxide is formed in the final reaction solution, and this causes a positive error in the measured value (absorbance difference).
This is because, when the second reagent containing copper ions and the first reagent that is alkaline and contains sodium potassium tartrate are mixed, instantaneously (rather than the complex of tartrate ions and copper ions is formed. Overwhelmingly fast), indicating that insoluble copper hydroxide would have been formed, and the sodium potassium tartrate contained in the first reagent did not prevent the instantaneous formation of copper hydroxide I understand that.
In contrast, in the measurement reagent and the measurement method of the present invention, when the second reagent contains citric acid monohydrate, the second reagent containing copper ions and the alkaline first reagent are mixed. It can be seen that insoluble copper hydroxide can be prevented from forming.
これらのことより、銅イオンを含有する第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させた本発明の測定試薬及び測定方法は、試料中の総蛋白質を精度良く正確に測定できることが確かめられた。 From these facts, it is confirmed that the measurement reagent and the measurement method of the present invention in which the second reagent containing copper ions contains a substance having a chelating ability to copper ions can accurately and accurately measure the total protein in the sample. It was.
（試料中の総蛋白質の測定）
本発明の試料中の総蛋白質測定試薬及び総蛋白質測定方法により、試料中の総蛋白質濃度を測定した。
(Measurement of total protein in sample)
The total protein concentration in the sample was measured by the total protein measuring reagent and the total protein measuring method in the sample of the present invention.
１． 測定試薬の調製
（１） 第１試薬の調製
実施例１の１の（１）で調製した第１試薬をそのまま使用した。
1. Preparation of measurement reagent (1) Preparation of first reagent The first reagent prepared in (1) of Example 1 was used as it was.
（２） 本発明・第２試薬の調製
実施例１の１の（２）で調製した本発明・第２試薬をそのまま使用した。
(2) Preparation of the present invention / second reagent The present invention / second reagent prepared in (1) of Example 1 was used as it was.
（３） 対照・第２試薬の調製
実施例１の１の（３）で調製した対照・第２試薬をそのまま使用した。
(3) Preparation of Control / Second Reagent The control / second reagent prepared in 1 (3) of Example 1 was used as it was.
２． 試料
（１） ヒト血清〔試料１〕
（２） 市販ヒト由来コントロール血清（アールトコントロール・レベル２Ｈ）〔試料２〕
2. Sample (1) Human serum [Sample 1]
(2) Commercially available human control serum (Aalto control level 2H) [Sample 2]
３． 試料中の総蛋白質の測定
前記２の２種類の試料中の総蛋白質濃度を、前記１で調製した第１試薬及び第２試薬にて測定した。
総蛋白質濃度の測定は、日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて行い、試料５μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬２４０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（２）で調製した本発明・第２試薬８０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。第２試薬添加直前と添加５分後の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。この測定を連続して２０回繰り返して行った。また、第２試薬を前記１の（３）で調製した対照・第２試薬に変えて同様に測定を行った。
3. Measurement of total protein in sample The total protein concentration in the two types of samples was measured with the first reagent and the second reagent prepared in 1 above.
The total protein concentration is measured using a 7170S type automatic analyzer manufactured by Hitachi, Ltd., and 240 μL of the first reagent prepared in (1) above is added to 5 μL of the sample. After mixing, the mixture is reacted at 37 ° C. for 5 minutes. After that, 80 μL of the present invention / second reagent prepared in (1) above was added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. Absorbance at a main wavelength of 546 nm and a subwavelength of 700 nm immediately before and after the addition of the second reagent was measured, and the difference was determined. This measurement was repeated 20 times continuously. Further, the measurement was performed in the same manner by changing the second reagent to the control / second reagent prepared in (1) above.
４． 測定結果
試料を２０回連続して測定した時の測定結果を表１及び表２に示した。なお、表１は試料１を使用した時の測定結果であり、表２は試料２を使用した時の測定結果である。また、表１及び表２に示した値は、測定で得られた吸光度差を１０，０００倍した値である。
4). Measurement results Tables 1 and 2 show the measurement results when the sample was measured 20 times continuously. Table 1 shows the measurement results when the sample 1 was used, and Table 2 shows the measurement results when the
表１及び表２から明らかなように、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させていない対照・第２試薬を用いた場合の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、試料１を試料とした場合は、２．４８％であり、試料２を試料とした場合は、２．３０％であった。
これに対し、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させた本発明・第２試薬を用いた場合の変動係数は、試料１を試料とした場合で１．２２％、試料２を試料とした場合も、１．６２％であり、総蛋白質測定値（吸光度差）のばらつきを示す変動係数が明らかに小さくなっている。
このように、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させることで、測定値（吸光度差）に正誤差が生じることを防止し、再現性を向上させることができることが分かる。
As is apparent from Tables 1 and 2, the coefficient of variation (CV) when using the control / second reagent not containing citric acid monohydrate in the second reagent is as follows. And 2.30% when
On the other hand, the coefficient of variation when the present invention / second reagent containing citric acid monohydrate in the second reagent was used was 1.22% when sample 1 was used as the sample, and
Thus, it can be seen that by including citric acid monohydrate in the second reagent, it is possible to prevent a positive error from occurring in the measurement value (absorbance difference) and improve reproducibility.
これらのことより、銅イオンを含有する第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させた本発明の測定試薬及び測定方法は、試料中の総蛋白質を精度良く正確に測定できることが確かめられた。 From these facts, it is confirmed that the measurement reagent and the measurement method of the present invention in which the second reagent containing copper ions contains a substance having a chelating ability to copper ions can accurately and accurately measure the total protein in the sample. It was.
（試料中の総蛋白質測定における測定範囲の確認）
本発明の試料中の総蛋白質測定試薬及び総蛋白質測定方法において、測定範囲を確かめた。
(Confirmation of measurement range in measuring total protein in sample)
In the total protein measurement reagent and the total protein measurement method in the sample of the present invention, the measurement range was confirmed.
１． 測定試薬の調製
（１） 第１試薬の調製
実施例１の１の（１）で調製した第１試薬をそのまま使用した。
1. Preparation of measurement reagent (1) Preparation of first reagent The first reagent prepared in (1) of Example 1 was used as it was.
（２） 本発明・第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを２．０、３．０、４．０又は５．０（２０℃）に各々調整し、５種類の総蛋白質測定試薬の第２試薬（本発明・第２試薬）を調製した。
硫酸銅五水和物 １００ｍＭ
クエン酸一水和物 １００ｍＭ
(2) Preparation of the present invention / second reagent The following reagent components are dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, respectively, and the pH is 2.0, 3.0, 4.0 or 5.0 (20 ° C. ) To prepare a second reagent (the present invention, second reagent) of five kinds of total protein measuring reagents.
（３） 対照試薬
１試薬系総蛋白質測定試薬である和光純薬工業社製、ＨＡテストワコー・総蛋白ＩＩ−ＨＡテストワコーを使用した。
(3) Control Reagent One reagent-based total protein measuring reagent manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., HA Test Wako / Total Protein II-HA Test Wako was used.
２． 試料の調製
生理食塩水にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度１１．７ｇ／ｄＬの高濃度蛋白溶液を調製した。これを生理食塩水で１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、又は９／１０となるように希釈した９種類の試料及び上記高濃度蛋白質溶液（１０／１０）を試料とした。
2. Sample Preparation Bovine serum albumin (BSA) was added to physiological saline to prepare a high-concentration protein solution having a bovine serum albumin (BSA) concentration of 11.7 g / dL. Nine types diluted with physiological saline to 1/10, 2/10, 3/10, 4/10, 5/10, 6/10, 7/10, 8/10, or 9/10 And the above high-concentration protein solution (10/10) were used as samples.
３． 試料中の総蛋白質の測定
前記２の試料中の蛋白質濃度を、前記１で調製した第１試薬及び４種類のｐＨの本発明・第２試薬、並びに対照試薬の各々の試薬にて測定した。
3. Measurement of total protein in the sample The protein concentration in the two samples was measured using the first reagent prepared in 1 above, the present invention / second reagent of four types of pH, and the control reagent.
本発明の測定試薬における総蛋白質の測定は、日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて行い、試料５μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬２４０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（２）で調製した本発明・第２試薬８０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。第２試薬添加直前と添加５分後の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。この測定を連続して２回繰り返して行い、その平均値を求めた。そして、蛋白質濃度が既知の試料について、前記の通り測定を行い、この測定値（吸光度差）と前記の１０種類の試料の測定値（吸光度差）を比較することにより、前記１０種類の試料中の総蛋白質濃度を求めた。 The total protein in the measurement reagent of the present invention is measured using a 7170S automatic analyzer manufactured by Hitachi, Ltd., and 240 μL of the first reagent prepared in (1) above is added to 5 μL of the sample. Then, 80 μL of the second reagent of the present invention / second reagent prepared in (1) above was added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. Absorbance at a main wavelength of 546 nm and a subwavelength of 700 nm immediately before and after the addition of the second reagent was measured, and the difference was determined. This measurement was repeated twice in succession, and the average value was obtained. Then, the sample having a known protein concentration is measured as described above, and the measured value (absorbance difference) is compared with the measured value (absorbance difference) of the ten types of samples. The total protein concentration was determined.
また、対照試薬における総蛋白質の測定は、日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて行い、試料２．５μＬに前記１の（３）の対照試薬２００μＬを添加して、混和後３７℃で１０分間反応させた。混和１０分後の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定した。この測定を連続して２回繰り返して行い、その平均値を求めた。そして、蛋白質濃度が既知の試料について、前記の通り測定を行い、この測定値（吸光度差）と前記の１０種類の試料の測定値（吸光度差）を比較することにより、前記１０種類の試料中の総蛋白質濃度を求めた。 In addition, the total protein in the control reagent was measured with a 7170S type automatic analyzer manufactured by Hitachi, Ltd., and 200 μL of the control reagent (3) of 1 above was added to 2.5 μL of the sample. Reacted for 1 minute. Absorbance at a main wavelength of 546 nm and a subwavelength of 700 nm was measured 10 minutes after mixing. This measurement was repeated twice in succession, and the average value was obtained. Then, the sample having a known protein concentration is measured as described above, and the measured value (absorbance difference) is compared with the measured value (absorbance difference) of the ten types of samples. The total protein concentration was determined.
４． 測定結果
試料の測定結果を表３及び図３に示した。なお、表３において、かっこ内の数値は、希釈倍率１／１０の試料の測定値を１００％とした時の各試料の測定値の相対比率（百分率）を求めたものである。
4). Measurement Results The measurement results of the samples are shown in Table 3 and FIG. In Table 3, the numerical value in parenthesis is the relative ratio (percentage) of the measured value of each sample when the measured value of the sample having a dilution ratio of 1/10 is taken as 100%.
表３及び図３から明らかなように、対照試薬を用いた場合は、試料中の総蛋白質濃度が高くなるにつれて、本来の総蛋白質濃度（理論値）よりも、得られる測定値（実測値）が低くなっていき、各希釈試料の測定値を示したグラフ（図３）では、総蛋白質濃度が高くなるほど曲がってくることが分かる。
これに対し、第２試薬にクエン酸一水和物を含有させた本発明・第２試薬を用いた場合は、いずれのｐＨの試薬においても、試料中の総蛋白質濃度が高くなっても得られる総蛋白質測定値が低下することなく、高濃度域までの測定範囲が得られていることが分かる。
例えば、対照試薬を用いた場合、希釈倍率１０／１０試料の測定値は、理論値（１／１０の試料の測定値の１０倍の値）に対して、９３．６％と６．４％低下している。
これに対し、本発明・第２試薬を用いた場合の希釈倍率１０／１０の試料の測定値は、理論値に対して、ｐＨ２で１０１．９％、ｐＨ３で９９．５％、ｐＨ４で９９．９％、ｐＨ５で９７．１％であり、ほぼ理論値通りであり、ほとんど低下は見られず、グラフ（図３）においても直線性が得られており、高濃度域までの測定範囲が得られていることが分かる。
As is apparent from Table 3 and FIG. 3, when the control reagent is used, as the total protein concentration in the sample increases, the measured value (actual value) obtained is higher than the original total protein concentration (theoretical value). In the graph showing the measured values of each diluted sample (FIG. 3), it can be seen that the curve becomes bent as the total protein concentration increases.
On the other hand, when the present invention / second reagent containing citric acid monohydrate in the second reagent is used, the reagent of any pH can be obtained even if the total protein concentration in the sample increases. It can be seen that the measurement range up to the high concentration range is obtained without lowering the total protein measurement value.
For example, when the control reagent is used, the measured values of the 10/10 dilution ratio are 93.6% and 6.4% of the theoretical value (10 times the measured value of the 1/10 sample). It is falling.
On the other hand, the measured values of the sample with a dilution ratio of 10/10 when using the second reagent of the present invention are 101.9% at
これらのことより、銅イオンを含有する第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させた本発明の測定試薬及び測定方法は、第２試薬に高い濃度の銅イオンを含有させることができるため、試料中の総蛋白質の測定範囲を広くすることができることが確かめられた。 From these facts, the measuring reagent and measuring method of the present invention in which the second reagent containing copper ions contains a substance having a chelating ability to copper ions can contain a high concentration of copper ions in the second reagent. Therefore, it was confirmed that the measurement range of the total protein in the sample can be widened.
（試料中の総蛋白質測定における沈殿生成防止効果の確認）
本発明の試料中の総蛋白質測定試薬及び総蛋白質測定方法において、第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させることによる、第１試薬と第２試薬混合時の沈殿生成防止効果を確かめた。
(Confirmation of precipitation prevention effect in total protein measurement in samples)
In the total protein measuring reagent and the total protein measuring method in the sample of the present invention, the effect of preventing precipitation when the first reagent and the second reagent are mixed is obtained by adding a substance having a chelating ability to copper ions to the second reagent. I confirmed.
１． 測定試薬の調製
（１） 第１試薬の調製
実施例１の１の（１）で調製した第１試薬をそのまま使用した。
1. Preparation of measurement reagent (1) Preparation of first reagent The first reagent prepared in (1) of Example 1 was used as it was.
（２） 本発明・第２試薬Ａの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．９（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ａを調製した。
硫酸銅五水和物 １００ｍＭ
クエン酸一水和物 ２００ｍＭ
(2) Preparation of the present invention / second reagent A The following reagent components are dissolved in pure water so that each concentration is as described, and the pH is adjusted to 5.9 (20 ° C.). A was prepared.
（３） 本発明・第２試薬Ｂの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを９．４（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｂを調製した。
硫酸銅五水和物 １００ｍＭ
酒石酸ナトリウムカリウム ２００ｍＭ
(3) Preparation of the present invention / second reagent B The following reagent components are dissolved in pure water so that each concentration is as described, and the pH is adjusted to 9.4 (20 ° C.). B was prepared.
（４） 本発明・第２試薬Ｃの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを８．３（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｃを調製した。
硫酸銅五水和物 １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩（ＥＤＴＡ） ２００ｍＭ
(4) Preparation of the present invention / second reagent C The following reagent components are dissolved in pure water so that each concentration is as described, and the pH is adjusted to 8.3 (20 ° C.). C was prepared.
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt (EDTA) 200 mM
（５） 本発明・第２試薬Ｄの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｄを調製した。
硫酸銅五水和物 １００ｍＭ
トリエタノールアミン ２００ｍＭ
(5) Preparation of the present invention / second reagent D The following reagent components are dissolved in pure water so that each concentration is as described, and the pH is adjusted to 6.0 (20 ° C.). D was prepared.
（６） 本発明・第２試薬Ｅの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを９．４（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｅを調製した。
硫酸銅五水和物 ５０ｍＭ
ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ） ５０ｍＭ
(6) Preparation of the present invention / second reagent E The following reagent components are dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH is adjusted to 9.4 (20 ° C.). E was prepared.
Nitrilotriacetic acid (NTA) 50 mM
（７） 本発明・第２試薬Ｆの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを９．０（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｆを調製した。
硫酸銅五水和物 ５０ｍＭ
ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ） ５０ｍＭ
(7) Preparation of the Present Invention / Second Reagent F The following reagent components are dissolved in pure water so that each concentration is as described, and the pH is adjusted to 9.0 (20 ° C.). F was prepared.
Diaminopropanetetraacetic acid (Methyl-EDTA) 50 mM
（８） 本発明・第２試薬Ｇの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを３．６（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｇを調製した。
硫酸銅五水和物 ５０ｍＭ
ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ） ５０ｍＭ
(8) Preparation of the present invention / second reagent G The following reagent components are dissolved in pure water so that each concentration is as described, and the pH is adjusted to 3.6 (20 ° C.). G was prepared.
Diaminocyclohexanetetraacetic acid (CyDTA) 50 mM
（９） 本発明・第２試薬Ｈの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを４．７（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｈを調製した。
硫酸銅五水和物 ５０ｍＭ
グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ） ５０ｍＭ
(9) Preparation of the present invention / second reagent H The following reagent components are dissolved in pure water so that each concentration is as described, and the pH is adjusted to 4.7 (20 ° C.). H was prepared.
Glycol ether diamine tetraacetic acid (GEDTA) 50 mM
（１０） 本発明・第２試薬Ｉの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．９（２０℃）に調整し、本発明・第２試薬Ｉを調製した。
硫酸銅五水和物 ５０ｍＭ
ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ） ５０ｍＭ
(10) Preparation of the present invention / second reagent I The following reagent components are dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH is adjusted to 6.9 (20 ° C.). I was prepared.
Hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA) 50 mM
（１１） 対照・第２試薬の調製
前記（２）の本発明・第２試薬Ａのクエン酸一水和物を含有させないこと以外は、前記（２）の試薬成分及び濃度の通りに第２試薬の調製を行った。（対照・第２試薬）
(11) Preparation of Control / Second Reagent According to the reagent component and concentration in (2) above, except that the citric acid monohydrate of the present invention / second reagent A in (2) above is not included. Reagents were prepared. (Control / second reagent)
２． 実験方法
試験管に前記１の（１）で調製した第１試薬３６００μＬを分注し、ここに前記１の（２）で調製した本発明・第２試薬Ａ１２００μＬを、急激な混合が起こらないように静かに滴下した。また、第２試薬を前記１の（３）〜（１０）で調製した本発明・第２試薬Ｂ〜Ｉ及び前記１の（１１）で調製した対照・第２試薬にそれぞれ変えて同様に実験を行い、試験管内の変化をみた。
2. Experimental Method Dispense 3600 μL of the first reagent prepared in (1) above into a test tube, and add 1200 μL of the present invention / second reagent A 1200 μL prepared in (1) above to prevent rapid mixing. It was dripped gently. Further, the second reagent was changed to the present invention, the second reagent B to I prepared in the above (1) (3) to (10), and the control and the second reagent prepared in the above (1), respectively. And observed changes in the test tube.
３． 沈殿生成の確認
前記２の第１試薬と第２試薬の混合液中に沈殿が生成しているか否かを目視で確認した。また、沈殿の生成状況を表４に示した。
3. Confirmation of precipitate formation It was visually confirmed whether or not a precipitate was formed in the mixed liquid of the first reagent and the second reagent. Table 4 shows the state of precipitate formation.
表４から明らかなように、第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させていない対照・第２試薬を用いた場合は、第１試薬に第２試薬を滴下した後に、試験管内の第１試薬と第２試薬の混合液を目視で確認したところ、混合液中に銅水酸化物と思われる青白色の沈殿が生成していることが確認された。
これに対し、第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させた本発明・第２試薬を用いた場合は、いずれにおいても試験管内の第１試薬と第２試薬の混合液中に沈殿が生成していないことが確認された。
As is apparent from Table 4, when the control / second reagent not containing a substance capable of chelating copper ions was used as the second reagent, the second reagent was dropped into the first reagent, When the liquid mixture of the 1st reagent and 2nd reagent of this was confirmed visually, it was confirmed that the bluish white precipitation considered to be a copper hydroxide was producing | generating in the liquid mixture.
On the other hand, when the present invention / second reagent containing a substance having a chelating ability to copper ions is used in the second reagent, the mixture of the first reagent and the second reagent in the test tube is used in any case. It was confirmed that no precipitate was formed.
ここで、前記１の（１）で調製した第１試薬には、最終反応液中における銅水酸化物〔Ｃｕ（ＯＨ）２〕の発生を防止する目的で、銅イオンにキレート能力を持つ物質である酒石酸ナトリウムカリウムを含有させている。しかしながら、対照・第２試薬を用いた場合には、第１試薬と第２試薬の混合液中に銅水酸化物が生成してしまっている。
このことから、銅イオンを含有する第２試薬とアルカリ性でありかつ酒石酸ナトリウムカリウムを含有する第１試薬が混合された際に、瞬間的に（酒石酸イオンと銅イオンの錯体が形成されるよりも圧倒的に速く）、不溶性の銅水酸化物が形成されたであろうことを示しており、第１試薬に含有された銅イオンにキレート能力を持つ物質（酒石酸ナトリウムカリウム）では瞬間的な銅水酸化物の形成を防止できていないことが分かる。
これに対し、本発明の測定試薬及び測定方法では、第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させることで、銅イオンを含有する第２試薬とアルカリ性の第１試薬が混合された際に、不溶性の銅水酸化物が形成するのを防止できていることが分かる。
Here, the first reagent prepared in the above (1) includes a substance having a chelating ability to copper ions for the purpose of preventing the generation of copper hydroxide [Cu (OH) 2 ] in the final reaction solution. It contains sodium potassium tartrate. However, when the control / second reagent is used, copper hydroxide is generated in the mixed solution of the first reagent and the second reagent.
Therefore, when the second reagent containing copper ions and the first reagent that is alkaline and contains sodium potassium tartrate are mixed, instantaneously (rather than the complex of tartrate ions and copper ions is formed. Overwhelmingly fast) indicates that an insoluble copper hydroxide would have been formed, and a substance that has a chelating ability to the copper ion contained in the first reagent (sodium potassium tartrate) It can be seen that the formation of hydroxide is not prevented.
On the other hand, in the measurement reagent and the measurement method of the present invention, the second reagent containing the copper ion and the alkaline first reagent are mixed by causing the second reagent to contain a substance having a chelating ability for the copper ion. It can be seen that insoluble copper hydroxide can be prevented from forming.
これらのことより、銅イオンを含有する第２試薬に銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させた本発明の測定試薬及び測定方法は、測定における第１試薬と第２試薬の混合時に沈殿が生成して正誤差が生じることを防ぐことができ、試料中の総蛋白質を精度良く正確に測定できることが確かめられた。 From these facts, in the measurement reagent and the measurement method of the present invention in which the second reagent containing copper ions contains a substance having a chelating ability for copper ions, precipitation occurs when the first reagent and the second reagent are mixed in the measurement. It was confirmed that it was possible to prevent a positive error from being generated, and to measure the total protein in the sample accurately and accurately.
Claims (14)
ａ）該試料と、アルカリ性の第１試薬とを混合させる工程、
ｂ）前記試料と第１試薬との混合物に、銅イオン及び銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有するｐＨ１０以下の第２試薬を混合し反応させ、試料中の蛋白質と銅イオンの錯体を形成させる工程、及び
ｃ）前記蛋白質と銅イオンの錯体を比色測定する工程よりなる、試料中の総蛋白質測定方法。 A method for measuring total protein in a sample, comprising:
a) mixing the sample with an alkaline first reagent;
b) Mixing and reacting a mixture of the sample and the first reagent with a second reagent having a pH of 10 or less containing a copper ion and a substance having a chelating ability for the copper ion to form a complex of the protein in the sample and the copper ion. And c) a method for measuring the total protein in the sample, comprising the step of colorimetrically measuring the protein and copper ion complex.
The method for measuring total protein in a sample according to any one of claims 10 to 13, wherein the first reagent contains a substance having a chelating ability for copper ions.
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