JP2018025486A - Method for separately measuring serum albumin of oxidation type and reduction type - Google Patents
Method for separately measuring serum albumin of oxidation type and reduction type Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018025486A JP2018025486A JP2016157970A JP2016157970A JP2018025486A JP 2018025486 A JP2018025486 A JP 2018025486A JP 2016157970 A JP2016157970 A JP 2016157970A JP 2016157970 A JP2016157970 A JP 2016157970A JP 2018025486 A JP2018025486 A JP 2018025486A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- albumin
- reagent
- triton
- bcp
- amount
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
本発明は、血清アルブミンの酸化型及び還元型の分別測定法に関する。 The present invention relates to a method for fractional measurement of oxidized and reduced forms of serum albumin.
ヒト血清アルブミン（human serum albumin : HSA）は、585個のアミノ酸残基から成る分子量約66.5 kDaの糖鎖を持たない単純タンパク質である。HSAはその分子中に35個のシステイン残基（SH基）を有しているが、そのうち17対は分子内ジスルフィド結合を形成し、９つのループの構築やHSAの構造安定化に大きく寄与している1)。 HSAには2種類の存在様式が知られており、N末端より34番目システインのSH基が遊離している還元型アルブミン（human mercaptalbumin :HMA）、遊離SH基が酸化された酸化型アルブミン（human nonmercaptalbumin : HNA）が生体中に存在している。HNAはさらに２種類に区別され、含硫アミノ酸とジスルフィド結合を形成し、可逆的に酸化されたアルブミンをHNA-1、活性酸素種（ROS）などによりSH基が-SOH、-SO2H、-SO3Hへと不可逆的に酸化されたものをHNA-2という。通常、SH基は細胞内環境を還元状態に保つ重要な働きをしており、グルタチオン、ビタミンCやEなどの低分子化合物とともに、全身の細部外環境において強力な抗酸化作用を示している2)。HSAは生体中で最も総量が多いタンパク質のため、HSAの酸化還元比の経時的な測定は、全身の酸化還元状態を反映する良い指標であるといえる2) 3)。また、加齢4)や各種疾患5)においてHNAの増加が報告されていることから、HSAの測定においては、生体中のアルブミン量を測定するのみならず、酸化還元状態といった質も評価することが重要となってきている。 Human serum albumin (HSA) is a simple protein consisting of 585 amino acid residues and having no sugar chain with a molecular weight of about 66.5 kDa. HSA has 35 cysteine residues (SH groups) in its molecule, of which 17 pairs form intramolecular disulfide bonds, greatly contributing to the construction of nine loops and the structural stability of HSA. 1) . There are two known types of HSA, reduced albumin (human mercaptalbumin: HMA) in which the SH group of the 34th cysteine is released from the N-terminus, and oxidized albumin in which the free SH group is oxidized (human nonmercaptalbumin (HNA) is present in the living body. HNA is further classified into two types, which form disulfide bonds with sulfur-containing amino acids, and reversibly oxidized albumin is converted to HNA-1, reactive oxygen species (ROS), etc., so that the SH group is —SOH, —SO 2 H, What is irreversibly oxidized to -SO 3 H is called HNA-2. In general, SH groups play an important role in maintaining the intracellular environment in a reduced state, and together with low molecular weight compounds such as glutathione and vitamins C and E, they have a strong antioxidant effect in the whole body outside the details 2 ) Since HSA is the highest amount of protein in the body, measuring the redox ratio of HSA over time is a good indicator that reflects the systemic redox state 2) 3) . In addition, since HNA increases have been reported in aging4 ) and various diseases5 ) , in measuring HSA, not only the amount of albumin in the body but also the quality such as the redox state should be evaluated. Has become important.
これまでHSAの測定は、タンパク質に色素が結合するとpH変化がなくても吸収スペクトルが変化するメタクロマジーを利用した6)、ブロムクレゾールグリーン（BCG）法およびブロムクレゾールパープル（BCP）法が代表的であった。BCG法ではアルブミン以外にグロブリン分画、特に急性相反応物質との交差反応性が知られており、BCP法ではアルブミンに対して特異的に反応するがHMAとHNAとの反応性に差があることが知られていた。この問題を改善するため、BCP法では全てのアルブミンのSH基を酸化させ、HMAとHNAの反応性を一定にした改良BCP法が開発された7)。改良BCP法では第１試薬に酸化剤であるSDSおよびジスルフィド結合を形成するためにDTNBが添加されている。 Until now, HSA measurements have been based on metachromology, which changes the absorption spectrum even when there is no pH change when the dye is bound to the protein6 ) , bromcresol green (BCG) method and bromcresol purple (BCP) method. there were. The BCG method is known to have cross-reactivity with globulin fractions, especially acute phase reactants, in addition to albumin. The BCP method specifically reacts with albumin, but there is a difference in reactivity between HMA and HNA. It was known. In order to remedy this problem, an improved BCP method was developed in which the SH group of all albumins was oxidized in the BCP method, and the reactivity of HMA and HNA was kept constant7 ) . In the improved BCP method, SDS as an oxidizing agent and DTNB are added to the first reagent to form a disulfide bond.
従来のアルブミンの測定方法として、タンパク質変性剤及び/又はSH試薬の存在下、BCPの吸光度変化に基づいて測定を行う方法（特許第3266079号：特許文献１）、還元型アルブミン及び酸化型アルブミンの存在量又は存在比を、質量分析又は液体クロマトグラフィーを用いて分析する方法（特許第5024044号：特許文献２）が知られている。
しかしながら、従来のBCP法では、酸化型アルブミンに反応が強く、また、アルブミン中の酸化型（HNA）と還元型（HMA）を測定するには、上記のとおり高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等が用いられているが、これらの方法では分析に時間がかかり、アルブミン画分の安定性が悪いなど、改良すべき点があった。
As a conventional method for measuring albumin, a method of measuring based on a change in absorbance of BCP in the presence of a protein denaturant and / or SH reagent (Patent No. 3266079: Patent Document 1), reduced albumin and oxidized albumin A method of analyzing the abundance or abundance ratio using mass spectrometry or liquid chromatography (Patent No. 5024044: Patent Document 2) is known.
However, the conventional BCP method has a strong reaction to oxidized albumin, and high-performance liquid chromatography (HPLC) or the like is used to measure oxidized (HNA) and reduced (HMA) in albumin as described above. Although these methods are used, there are points to be improved such as time-consuming analysis and poor stability of the albumin fraction.
本発明は、アルブミンの酸化還元型の分別、酸化ストレスの簡易測定、酸化ストレスマーカーの評価などを目的とした血清アルブミンの測定方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for measuring serum albumin for the purpose of fractionating redox forms of albumin, simple measurement of oxidative stress, evaluation of oxidative stress markers, and the like.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、タンパク質変性剤及びSH試薬の存在下でBCP法（BCP改良法）により測定した総アルブミン量（酸化型アルブミン＋還元型アルブミン）から、タンパク質変性剤及びSH試薬非存在下でBCP法により測定した酸化型アルブミン（HNA）を差し引くことにより、還元型アルブミン（HMA）を推定すること（酸化型アルブミンと還元型アルブミンの割合を推定すること）に成功し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has determined that the total amount of albumin (oxidized albumin + reduced albumin) measured by the BCP method (BCP improvement method) in the presence of a protein denaturant and an SH reagent ) To estimate reduced albumin (HMA) by subtracting oxidized albumin (HNA) measured by the BCP method in the absence of protein denaturant and SH reagent (the ratio of oxidized albumin to reduced albumin) The present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）被検試料において、タンパク質変性剤及びSH試薬から選ばれる少なくとも１種の存在下でブロムクレゾールパープルの吸光度に基づいて測定した総アルブミン量から、タンパク質変性剤及びSH試薬の非存在下でブロムクレゾールパープルの吸光度に基づいて測定した酸化型アルブミン量を差し引くことにより、前記被検試料中の還元型アルブミンの量を算出することを特徴とするアルブミンの測定方法。
（２）総アルブミン量の測定試薬、酸化型アルブミン量の測定試薬、又は両者の測定試薬中に、さらにタンパク質非変性界面活性剤を含む、（１）に記載の方法。
（３）タンパク質非変性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である（２）に記載の方法。
（４）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の最終濃度が、０．２−０．３％である、（３）に記載の方法。
（５）タンパク質変性剤がラウリル硫酸ナトリウムである、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）ラウリル硫酸ナトリウムの最終濃度が０．０３％以下である、（５）に記載の方法。
（７）被検試料において、タンパク質変性剤及びSH試薬から選ばれる少なくとも１種の存在下でブロムクレゾールパープルの吸光度に基づいて測定した総アルブミン量から、タンパク質変性剤及びSH試薬の非存在下でブロムクレゾールパープルの吸光度に基づいて測定した酸化型アルブミン量を差し引くことにより得られた還元型アルブミンの量と、タンパク質変性剤及びSH試薬の非存在下でブロムクレゾールパープルの吸光度に基づいて測定した酸化型アルブミン量との量比を算出することを特徴とするアルブミンの測定方法。
（８）総アルブミン量の測定試薬、酸化型アルブミン量の測定試薬、又は両者の測定試薬中に、さらにタンパク質非変性界面活性剤を含む、（７）に記載の方法。
（９）タンパク質非変性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である（８）に記載の方法。
（１０）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の最終濃度が、０．２−０．３％である、（９）に記載の方法。
（１１）タンパク質変性剤がラウリル硫酸ナトリウムである、（６）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）ラウリル硫酸ナトリウムの最終濃度が０．０３％以下である、（１１）に記載の方法。
（１３）ブロムクレゾールパープルを含む第一の試薬と、タンパク質変性剤及びSH試薬から選ばれる少なくとも１種並びにブロムクレゾールパープルを含む第二の試薬とを含む、アルブミン測定用キット。
（１４） 第一の試薬、第二の試薬又はその両者に、さらに緩衝液を含む、（１３）に記載のキット。
（１５）第一の試薬、第二の試薬又はその両者に、さらにタンパク質非変性界面活性剤を含む、（１３）又は（１４）に記載のキット。
（１６）タンパク質非変性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である（１５）に記載のキット。
（１７）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の最終濃度が、０．２−０．３％である、（１６）に記載のキット。
（１８）タンパク質変性剤がラウリル硫酸ナトリウムである、（１３）〜（１７）のいずれか１項に記載のキット。
（１９）ラウリル硫酸ナトリウムの最終濃度が０．０３％以下である、（１８）に記載のキット。
That is, the present invention is as follows.
(1) In the test sample, from the total amount of albumin measured based on the absorbance of bromocresol purple in the presence of at least one selected from a protein denaturant and SH reagent, in the absence of the protein denaturant and SH reagent. A method for measuring albumin, wherein the amount of reduced albumin in the test sample is calculated by subtracting the amount of oxidized albumin measured based on the absorbance of bromcresol purple.
(2) The method according to (1), further comprising a protein non-denaturing surfactant in the measurement reagent for the total albumin amount, the measurement reagent for the oxidized albumin amount, or both measurement reagents.
(3) The method according to (2), wherein the protein non-denaturing surfactant is Triton X-405 or Triton X-100.
(4) The method according to (3), wherein the final concentration of Triton X-405 or Triton X-100 is 0.2-0.3%.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the protein denaturant is sodium lauryl sulfate.
(6) The method according to (5), wherein the final concentration of sodium lauryl sulfate is 0.03% or less.
(7) From the total amount of albumin measured in the test sample based on the absorbance of bromocresol purple in the presence of at least one selected from a protein denaturant and an SH reagent, in the absence of the protein denaturant and the SH reagent. The amount of reduced albumin obtained by subtracting the amount of oxidized albumin measured based on the absorbance of bromcresol purple and the oxidation measured based on the absorbance of bromcresol purple in the absence of protein denaturant and SH reagent A method for measuring albumin, comprising calculating a quantitative ratio with the amount of type albumin.
(8) The method according to (7), further comprising a protein non-denaturing surfactant in the measurement reagent for the total albumin amount, the measurement reagent for the oxidized albumin amount, or both measurement reagents.
(9) The method according to (8), wherein the protein non-denaturing surfactant is Triton X-405 or Triton X-100.
(10) The method according to (9), wherein the final concentration of Triton X-405 or Triton X-100 is 0.2-0.3%.
(11) The method according to any one of (6) to (9), wherein the protein denaturant is sodium lauryl sulfate.
(12) The method according to (11), wherein the final concentration of sodium lauryl sulfate is 0.03% or less.
(13) An albumin measurement kit comprising a first reagent containing bromocresol purple, at least one selected from a protein denaturant and an SH reagent, and a second reagent containing bromocresol purple.
(14) The kit according to (13), further comprising a buffer solution in the first reagent, the second reagent, or both.
(15) The kit according to (13) or (14), further comprising a protein non-denaturing surfactant in the first reagent, the second reagent, or both.
(16) The kit according to (15), wherein the protein non-denaturing surfactant is Triton X-405 or Triton X-100.
(17) The kit according to (16), wherein the final concentration of Triton X-405 or Triton X-100 is 0.2-0.3%.
(18) The kit according to any one of (13) to (17), wherein the protein denaturant is sodium lauryl sulfate.
(19) The kit according to (18), wherein the final concentration of sodium lauryl sulfate is 0.03% or less.
本発明においてBCP法とBCP改良法を用いることにより、総アルブミン中の酸化型アルブミンと還元型アルブミンの割合を推定することが可能となった。本発明の方法によれば、アルブミンを迅速、簡便かつ大量に測定可能であることから、全身状態のモニタリングや治療の効果判定などの日常診療、あるいは各種疾患の臨床検査に有用である。 By using the BCP method and the improved BCP method in the present invention, it becomes possible to estimate the ratio of oxidized albumin and reduced albumin in total albumin. According to the method of the present invention, albumin can be measured quickly, simply, and in large quantities, so that it is useful for daily medical care such as monitoring of the general condition and determination of the effect of treatment, or clinical examination of various diseases.
本発明は、タンパク質変性剤及び／又はSH試薬の存在下でBCP法により測定した総アルブミン量（酸化型アルブミン＋還元型アルブミン）から、タンパク質変性剤及びSH試薬の非存在下でBCP法により測定した酸化型アルブミン（HNA）を差し引くことにより、還元型アルブミン（HMA）量を推定する方法に関する。すなわち、本発明は、タンパク質変性剤及びSH試薬の存在下で測定された総アルブミン（HMA+HNA）から、タンパク質変性剤及びSH試薬の無添加系の測定値であるHNA量を差し引いて、HMA量を求めるというものである。従って、本発明により酸化型アルブミンと還元型アルブミンの割合をも推定することができる。 In the present invention, the total amount of albumin (oxidized albumin + reduced albumin) measured by the BCP method in the presence of a protein denaturant and / or SH reagent is measured by the BCP method in the absence of the protein denaturant and SH reagent. The present invention relates to a method for estimating the amount of reduced albumin (HMA) by subtracting the oxidized albumin (HNA). That is, the present invention subtracts the amount of HNA, which is a measurement value of the protein denaturant and SH reagent-free system, from the total albumin (HMA + HNA) measured in the presence of the protein denaturant and SH reagent. It is to ask for quantity. Therefore, the ratio of oxidized albumin and reduced albumin can also be estimated according to the present invention.
ヒト血清アルブミン (HSA) には還元型アルブミン（HMA）と酸化型アルブミン（HNA）の２種類の状態が知られており、加齢、各種疾患による酸化ストレスによりHSAの酸化還元比の経時的な割合が増加することから、HSAの酸化還元比は酸化ストレスマーカーとして利用されている。しかし、HSAの酸化還元状態の安定性が悪く、HPLC法など限られた条件での測定のため広く普及していなかった。 Human serum albumin (HSA) is known to have two states, reduced albumin (HMA) and oxidized albumin (HNA), and the HSA redox ratio over time is affected by aging and oxidative stress caused by various diseases. Since the ratio increases, the redox ratio of HSA is used as an oxidative stress marker. However, the stability of the redox state of HSA was poor, and it was not widely used because of measurement under limited conditions such as HPLC.
アルブミン測定法であるブロムクレゾールパープル（BCP）法は、HMAとHNAに対する反応性の違いが指摘されている。BCP法において、タンパク質変性剤（SDS等）およびSH試薬（DTNB等）を加えることで反応性を改善したBCP法が開発された。本発明においては、この改善したBCP法を「BCP改良法」と呼び、本発明は、BCP法とBCP改良法とを組み合わせて用いることで、生体中のHMAの割合を簡易的に算出する測定法を新たに開発した。本発明の方法と従来から行われているHPLC法とを比較すると、相関係数は0.92と良好な相関が得られた。本発明の方法を用いることで、アルブミン測定と同時に酸化ストレスを推定することが可能となり、治療の効果判定や状態管理など、アルブミンの量のみならず質の評価をも行うことが可能となった。 It has been pointed out that the bromocresol purple (BCP) method, which is an albumin measurement method, has a difference in reactivity to HMA and HNA. In the BCP method, a BCP method having improved reactivity by adding a protein denaturant (SDS or the like) and an SH reagent (DTNB or the like) has been developed. In the present invention, this improved BCP method is referred to as "BCP improvement method", and the present invention uses a combination of the BCP method and the BCP improvement method to easily calculate the proportion of HMA in the living body. A new law was developed. When the method of the present invention was compared with the conventional HPLC method, the correlation coefficient was 0.92, and a good correlation was obtained. By using the method of the present invention, it is possible to estimate oxidative stress at the same time as albumin measurement, and it is possible to evaluate not only the amount of albumin but also the quality, such as judgment of treatment effect and state management. .
１．BCP法及びBCP改良法における総アルブミン量の測定
総アルブミン量とは、酸化型アルブミンと還元型アルブミンとの和であり、この総アルブミンをタンパク質変性剤及び/又はSH試薬の存在下で測定する。
1. Measurement of total albumin amount in BCP method and BCP improved method Total albumin amount is the sum of oxidized albumin and reduced albumin, and this total albumin is measured in the presence of a protein denaturant and / or SH reagent.
本発明に使用されるタンパク質変性剤としては、その変性作用を有するものであって、アルブミンの測定値に影響を与えないものであれば特に限定されるものではない。例えば、尿素、グアニジン塩類（グアニジン塩酸塩，グアニジン硫酸塩等）、無機塩類（フッ化ナトリウム、アジ化ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等）、塩類（例えばチオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム等）、界面活性剤（例えば陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性界面活性剤等）等が挙げられ、中でも界面活性剤、特に陰イオン界面活性剤が好ましく用いられる。また、これらは単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。 The protein denaturing agent used in the present invention is not particularly limited as long as it has the denaturing action and does not affect the measured value of albumin. For example, urea, guanidine salts (guanidine hydrochloride, guanidine sulfate, etc.), inorganic salts (sodium fluoride, sodium azide, sodium chloride, potassium chloride, etc.), salts (eg, ammonium thiocyanate, potassium thiocyanate, sodium thiocyanate) Etc.), surfactants (for example, anionic surfactants, nonionic surfactants, amphoteric surfactants, etc.), etc., among which surfactants, particularly anionic surfactants, are preferably used. These can be used alone or in appropriate combination.
陰イオン界面活性剤としては、アルキル硫酸エステル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。これらの界面活性剤の例を以下に示す。これらは単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
アルキル硫酸エステル系界面活性剤：ラウリル硫酸ナトリウム（Sodium Lauryl Sulfate(SDS)）、セチル硫酸ナトリウム等
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩：ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸ナトリウム等
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩：ポリオキシエチレンアルキルエ ーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸トリエタノールアミン塩等
アルキルベンゼンスルホン酸塩：ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、セチルベンゼンスルホン酸ナトリウム等
Examples of the anionic surfactants include alkyl sulfate ester surfactants, polyoxyethylene alkylphenyl ether sulfate salts, polyoxyethylene alkyl ether sulfate salts, and alkylbenzene sulfonate salts. Examples of these surfactants are shown below. These can be used alone or in appropriate combination.
Alkyl sulfate ester surfactants: Sodium lauryl sulfate (Sodium Lauryl Sulfate (SDS)), sodium cetyl sulfate, etc. Polyoxyethylene alkylphenyl ether sulfates: Polyoxyethylene alkylphenyl ether sodium sulfate, etc. Polyoxyethylene alkyl ether sulfates Salt: Sodium polyoxyethylene alkyl ether sulfate, polyoxyethylene alkyl ether sulfate triethanolamine salt, etc. Alkylbenzene sulfonate: Sodium laurylbenzene sulfonate, sodium cetylbenzene sulfonate, etc.
本発明においては、上記陰イオン界面活性剤のうちラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム等が好ましい。
本発明において、タンパク質変性剤の使用濃度は、変性剤の種類及び処理する試料により適宜変更することができるが、試料及び標準品中に含まれる共存物質の影響を防止し、かつアルブミンの測定値に影響を与えない濃度であれば特に限定されることなく選択することができる。
例えば、アルブミン測定時の濃度は、通常0.001〜10 w/w％、好ましくは0.01〜１ w/w％、より好ましくは0.02〜0.3 w/w％であるが、本発明においては、0.03 w/w％以下、例えば0.001〜0.03 w/w％とすることもできる。
In the present invention, among the anionic surfactants, sodium lauryl sulfate (SDS), sodium lauryl benzene sulfonate and the like are preferable.
In the present invention, the use concentration of the protein denaturant can be appropriately changed depending on the type of denaturant and the sample to be treated, but it prevents the influence of coexisting substances contained in the sample and the standard product, and the measured value of albumin The concentration can be selected without particular limitation as long as it does not affect the above.
For example, the concentration at the time of albumin measurement is usually 0.001 to 10 w / w%, preferably 0.01 to 1 w / w%, more preferably 0.02 to 0.3 w / w%. In the present invention, the concentration is 0.03 w / w%. It can also be made into w% or less, for example, 0.001-0.03 w / w%.
本発明において使用されるSH試薬（スルフヒドリル試薬）としては、ジスルフィド体、酸化剤、アルキル化剤、マレイミド及びその誘導体、並びにチオフタルイミド等が挙げられ、これらを単独で、又は適宜組み合わせて使用することができる。これらのSH試薬の例を以下に示す。 Examples of the SH reagent (sulfhydryl reagent) used in the present invention include disulfide compounds, oxidizing agents, alkylating agents, maleimides and derivatives thereof, and thiophthalimide. These may be used alone or in appropriate combination. Can do. Examples of these SH reagents are shown below.
ジスルフィド体：5, 5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)(NPDS)、2,2'-ジチオジピリジン（2-PDS）、4,4'-ジチオジピリジン（4-PDS）、4, 4'-ジチオビス(1-アジドベンゼン)(DTBPA)、酸化型グルタチオン等
酸化剤：ヨウ素、フェリシアン化物、ヨードソ安息香酸、ヨウ素酸塩、亜塩素酸塩類、水銀、亜鉛等
アルキル化剤：ヨード酢酸、クロロ酢酸、ヨードアセトアミド、クロロアセトフェノン等
マレイミド及びその誘導体：マレイミド、N-メチルマレイミド、N-エチルマレイミド、N,N'-p-フェニレンジマレイミド等
チオフタルイミド等
Disulfide: 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), 2,2′-dithiobis (5-nitropyridine) (NPDS), 2,2′-dithiodipyridine (2-PDS), 4,4'-dithiodipyridine (4-PDS), 4,4'-dithiobis (1-azidobenzene) (DTBPA), oxidized glutathione, etc. Oxidizing agents: iodine, ferricyanide, iodosobenzoic acid, iodate Alkylating agents: iodoacetic acid, chloroacetic acid, iodoacetamide, chloroacetophenone, etc. Maleimide and its derivatives: maleimide, N-methylmaleimide, N-ethylmaleimide, N, N'-p- Phenylene dimaleimide, etc.
これらの中でも、特にDTNB、2-PDS、4-PDS等のジスルフィド体、マレイミド、N-エチルマレイミド等のマレイミド誘導体等が好ましく用いられる。また、これらは単独で用いても、適宜組み合わせて用いてもよい。
SH試薬の使用濃度は、SH試薬の種類や処理する試料により異なり、試料及び標準品中に含まれる共存物質の影響を防止し、かつアルブミンの測定値に影響を与えない濃度であれば特に限定されることなく設定できる。例えば、アルブミン測定時の濃度として、通常0. 001〜１mM、好ましくは0.01〜0.5 mMとなるように適宜選択して用いられる。
Among these, disulfides such as DTNB, 2-PDS and 4-PDS, and maleimide derivatives such as maleimide and N-ethylmaleimide are particularly preferably used. These may be used alone or in appropriate combination.
The concentration of SH reagent used varies depending on the type of SH reagent and the sample to be processed, and it is particularly limited as long as it does not affect the coexisting substances contained in the sample and standard and does not affect the measured value of albumin. Can be set without being done. For example, the concentration at the time of albumin measurement is appropriately selected to be normally 0.001 to 1 mM, preferably 0.01 to 0.5 mM.
本発明において使用されるBCPとしては、通常市販されているものを用いることができ、その使用濃度は、アルブミン測定時の濃度として、通常0.02〜0.20 mM、好ましくは0.03〜0.10 mMとなるように適宜選択して用いられる。 As the BCP used in the present invention, commercially available products can be used, and the concentration used is usually 0.02 to 0.20 mM, preferably 0.03 to 0.10 mM, as the concentration during albumin measurement. It is appropriately selected and used.
本発明の方法において測定の対象となる試料は生体試料（特に血清）であるが、血漿、輸血用アルブミン製剤などを用いることもできる。 The sample to be measured in the method of the present invention is a biological sample (particularly serum), but plasma, albumin preparation for transfusion, and the like can also be used.
本発明においてBCP法によりアルブミンを測定する際、測定時の溶液中には、BCP以外に、当分野で通常用いられる試薬類、例えば緩衝剤、防腐剤、タンパク質変性作用を有さない界面活性剤（タンパク質非変性界面活性剤という）等を含めることができる。これらの試薬類の使用濃度としては、当分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
タンパク質非変性界面活性剤は、タンパク質変性作用を有さないあるいは緩和なため、前記タンパク質変性剤として使用される界面活性剤とは異なる。この界面活性剤の例としては、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などが挙げられる。これらの試薬の最終濃度は、例えば０．２−０．３％である。
When measuring albumin by the BCP method in the present invention, in the solution at the time of measurement, in addition to BCP, reagents usually used in the art, such as buffers, preservatives, surfactants having no protein denaturing action (Referred to as protein non-denaturing surfactant) and the like. The concentration of these reagents used may be appropriately selected from a concentration range usually used in this field.
Protein non-denaturing surfactants are different from surfactants used as protein denaturing agents because they have no protein denaturing action or are mild. Examples of this surfactant include Triton X-405 or Triton X-100. The final concentration of these reagents is, for example, 0.2-0.3%.
本発明においてBCP改良法によりアルブミンを測定する際には、測定時の溶液中には、BCP、タンパク質変性剤及び／又はSH試薬以外に、当分野で通常用いられる試薬類、例えば緩衝剤、防腐剤、タンパク質非変性界面活性剤等を含めることができる。これらの試薬類の使用濃度としては、当分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。また、BCP改良法に使用されるタンパク質変性剤及びSH試薬は、いずれか一方のみを反応系に含めてもよいが、両者を含めることが好ましい。
BCP改良法においても、BCP法と同様に、当分野で通常用いられる試薬類、例えば緩衝剤、防腐剤、タンパク質非変性界面活性剤等を含めることができる。
In the present invention, when albumin is measured by the improved BCP method, in the solution at the time of measurement, in addition to BCP, a protein denaturant and / or an SH reagent, reagents usually used in the art, such as a buffer, an antiseptic, Agents, protein non-denaturing surfactants, and the like. The concentration of these reagents used may be appropriately selected from a concentration range usually used in this field. Further, only one of the protein denaturant and SH reagent used in the BCP improvement method may be included in the reaction system, but it is preferable to include both.
Also in the improved BCP method, as in the BCP method, reagents usually used in this field, for example, a buffer, a preservative, a protein non-denaturing surfactant and the like can be included.
本発明において使用可能な緩衝剤としては特に限定されるものではなく、任意に選択することができる、例えば酢酸塩、グリシン、クエン酸塩、リン酸塩、ベロナール、ホウ酸塩、コハク酸塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（Tris）、グッド緩衝剤（例えば3-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES），3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸（MOPS）等）が挙げられる。
緩衝剤のpHは、BCP法の場合は3.5〜5.5、好ましくは4.4〜5.0の範囲から適宜選択され、BCP改良法の場合は、3.5〜5.5、好ましくは4.4〜5.0の範囲から適宜選択される。
The buffer that can be used in the present invention is not particularly limited, and can be arbitrarily selected. For example, acetate, glycine, citrate, phosphate, veronal, borate, succinate, Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris), Good buffer (for example, 3- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES), 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS), etc.) can be mentioned.
The pH of the buffer is appropriately selected from the range of 3.5 to 5.5, preferably 4.4 to 5.0 in the case of the BCP method, and is appropriately selected from the range of 3.5 to 5.5, preferably 4.4 to 5.0 in the case of the BCP improvement method. .
本発明の方法によりアルブミンの測定方法を以下に示す。
下記表に示す組成の試薬を調製し、試料と、前記試料とを混合して発色させ、適当な時間経過後に570〜660 nmの範囲から適宜選択された波長における吸光度を測定する。測定時の温度は、例えば15〜37℃であり、好ましくは37℃である。本発明においては、アルブミン測定は自動分析機等を用いて行うことも可能である。
A method for measuring albumin by the method of the present invention is shown below.
A reagent having the composition shown in the following table is prepared, and the sample and the sample are mixed to develop a color. After an appropriate time has elapsed, the absorbance at a wavelength appropriately selected from the range of 570 to 660 nm is measured. The temperature at the time of measurement is, for example, 15 to 37 ° C, preferably 37 ° C. In the present invention, albumin measurement can also be performed using an automatic analyzer or the like.
本発明においては、BCP法及びBCP改良法のいずれも、一方にはBCPが含まれる試薬（R1)、他方にはBCPが含まれない試薬（BCP改良法では変性剤及びSH試薬を含む）(R2)を別々に調製し（表２）、R1とR2とを混合する形態とすることもできる。 In the present invention, both of the BCP method and the improved BCP method include a reagent (R1) containing BCP on one side and a reagent not containing BCP on the other side (in the BCP improved method, a denaturant and an SH reagent are included) ( R2) can be prepared separately (Table 2), and R1 and R2 can be mixed.
２．還元型アルブミンの推定
本発明においては、BCP改良法により測定した総アルブミン量から、タンパク質変性剤及びSH試薬非存在下でBCP法により測定した酸化型アルブミン（HNA）を差し引くことにより、還元型アルブミン（HMA）を推定する。
2. Estimation of reduced albumin In the present invention, reduced albumin is obtained by subtracting oxidized albumin (HNA) measured by the BCP method in the absence of a protein denaturant and SH reagent from the total albumin amount measured by the improved BCP method. Estimate (HMA).
本発明の方法では、BCP改良法による総アルブミン量からBCP法によるアルブミン量を差し引くことにより還元型アルブミン量が算出される。これを還元型アルブミン(1)とする。また、BCP法により、酸化型アルブミン量を得ることができる。これを酸化型アルブミン(2)とする。
本発明では、上記の通り算出された還元型アルブミン(1)と、BCP法により測定された酸化型アルブミン量(2)とを用いて、両者の量比を求めることもできる。比を求める際の分母及び分子は、目的に応じて一方を分母、他方を分子となればよく、限定されるものではない。
In the method of the present invention, the amount of reduced albumin is calculated by subtracting the amount of albumin by the BCP method from the total amount of albumin by the BCP improvement method. This is reduced albumin (1). Moreover, the amount of oxidized albumin can be obtained by the BCP method. This is designated as oxidized albumin (2).
In the present invention, the reduced albumin (1) calculated as described above and the oxidized albumin amount (2) measured by the BCP method can be used to determine the quantity ratio between them. The denominator and numerator for determining the ratio are not limited as long as one is the denominator and the other is the numerator according to the purpose.
３．キット
本発明においては、BCPを含む第一の試薬と、タンパク質変性剤及び／又はSH試薬並びにBCPを含む第二の試薬とを含む、アルブミンの測定用キットを提供する。当該第一の試薬は、BCP法により酸化型アルブミン量を測定するための試薬であり、当該第二の試薬は、BCP改良法により総アルブミン量を測定するための試薬である。
本発明においては、第一の試薬、第二の試薬又はその両者に、さらに緩衝液及び／又は界面活性剤をさらに含めることができる。タンパク質変性剤、SH試薬、界面活性剤、緩衝液は、前記したものを利用することができる。例えば、第一及び第二の試薬は、それぞれ、前記表１及び表２に記載の「BCP試薬」、「BCP改良法試薬」の欄に記載の成分を使用することが好ましい。
3. Kit In the present invention, there is provided an albumin measurement kit comprising a first reagent containing BCP and a protein denaturant and / or SH reagent and a second reagent containing BCP. The first reagent is a reagent for measuring the amount of oxidized albumin by the BCP method, and the second reagent is a reagent for measuring the total albumin amount by the BCP improved method.
In the present invention, the first reagent, the second reagent, or both may further contain a buffer and / or a surfactant. As the protein denaturant, SH reagent, surfactant, and buffer, those described above can be used. For example, as the first and second reagents, it is preferable to use the components described in the columns of “BCP reagent” and “BCP improved method reagent” described in Tables 1 and 2, respectively.
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited by these examples.
１．材料
健常な成人男女から採血し，遠心分離によって得られた新鮮血清を，直ちに-80℃で保存し検討に用いた。HSAは室温に放置することで，HMAが酸化されHNAに変化していくことが知られているため5)，-80℃の保存血清を一部室温にて保存し，HNAの割合が増加した血清として使用した。また，健常な成人血清でのHNAの変動は小さいため，血清に還元剤である10 mmol/L システイン塩酸塩25μLを血清225μLに添加し，HNAの割合を大きく減少させた模擬血清を作製した。一方，システインを添加しても時間経過とともに酸化されHNAの割合が増加することから，37℃で長時間（最大48時間）反応させHNAの割合を大きく増加させた模擬血清を作製した。
1. Materials Blood samples were collected from healthy adult males and females, and fresh serum obtained by centrifugation was immediately stored at -80 ° C for use. Since HSA is known to be oxidized to HNA by leaving it at room temperature 5) , some of the serum stored at -80 ° C was stored at room temperature, and the proportion of HNA increased. Used as serum. In addition, since fluctuations in HNA in healthy adult sera are small, 25 μL of 10 mmol / L cysteine hydrochloride, which is a reducing agent, was added to 225 μL of serum to produce a simulated serum with a greatly reduced HNA ratio. On the other hand, even when cysteine was added, the percentage of HNA increased due to oxidation over time, so a simulated serum with a large increase in the ratio of HNA was prepared by reaction at 37 ° C for a long time (up to 48 hours).
２．試薬
1) 125 mmol/Lコハク酸溶液
コハク酸（和光純薬工業株式会社，和光特級）7.38 gを精製水500 mLに溶解し，125 mmol/Lコハク酸溶液とした。
2) 125 mmol/Lコハク酸二ナトリウム溶液
コハク酸二ナトリウム（和光純薬工業株式会社，和光特級）10.12 gを精製水500 mLに溶解し，125 mmol/Lコハク酸二ナトリウム溶液とした。
3) 125 mmol/Lコハク酸緩衝液
試薬1，2を分取し混合させ125 mmol/Lコハク酸緩衝液とした。pHはpHメーター（HORIBA）を用い，確認しながら調製を行った。
2. reagent
1) 125 mmol / L succinic acid solution 7.38 g of succinic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Wako Special Grade) was dissolved in 500 mL of purified water to obtain a 125 mmol / L succinic acid solution.
2) 125 mmol / L disodium succinate solution 10.12 g of disodium succinate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Wako Special Grade) was dissolved in 500 mL of purified water to prepare a 125 mmol / L disodium succinate solution.
3) 125 mmol / L succinic acid buffer Reagents 1 and 2 were separated and mixed to obtain a 125 mmol / L succinic acid buffer. The pH was adjusted while confirming using a pH meter (HORIBA).
4) 30 mmol/L BCP液
BCP（和光純薬工業株式会社，試薬特級）1.62 gをエタノール（ナカライテスク株式会社）100 mLに溶解し，30 mmol/L BCP液とした。
4) 30 mmol / L BCP solution
1.62 g of BCP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., reagent grade) was dissolved in 100 mL of ethanol (Nacalai Tesque) to prepare a 30 mmol / L BCP solution.
5) 10 % Triton X-100液
Polyoxyethylene (10) Octylphenyl Ether（Triton X-100）（和光純薬工業株式会社，生化学用）10 gに精製水を加え100 gに調製，10 % Triton X-100液とした。
6) 10 % Triton X-405液
α-[4-(1,1,3,3-Tetramethyl-Butyl)Phenyl]-w-Hydroxy-Poly(Oxy-1,2-Ethanediyl)（Triton X-405）70 %溶液（SIGMA-ALPRICH）10 gに精製水を加え100 gに調製，10 % Triton X-405液とした。
5) 10% Triton X-100 solution
Purified water was added to 10 g of Polyoxyethylene (10) Octylphenyl Ether (Triton X-100) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for biochemistry) to prepare 100 g, and a 10% Triton X-100 solution was prepared.
6) 10% Triton X-405 solution α- [4- (1,1,3,3-Tetramethyl-Butyl) Phenyl] -w-Hydroxy-Poly (Oxy-1,2-Ethanediyl) (Triton X-405) Purified water was added to 10 g of 70% solution (SIGMA-ALPRICH) to prepare 100 g, which was used as 10% Triton X-405 solution.
7) 10 % Brij 35液
Polyoxyethylene (23) Laury Ether（Brij 35）（和光純薬工業株式会社）10 gに精製水を加え100 gに調製し，10 % Brij 35液とした。
8) 10 mmol/L DTNB液
5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) （DTNB）（和光純薬工業株式会社）396 mgを50 mmol/Lリン酸緩衝液（pH 7.0）100 mLに溶解し，10 mmol/L DTNB液とした。
7) 10% Brij 35 solution
Purified water was added to 10 g of Polyoxyethylene (23) Laury Ether (Brij 35) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to prepare a 100% solution.
8) 10 mmol / L DTNB solution
Dissolve 396 mg of 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 100 mL of 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0), and add 10 mmol / L DTNB solution It was.
9) 10 % SDS液
Sodium Lauryl Sulfate（SDS）（和光純薬工業株式会社）5 gに精製水を加え50 mLとし，10 % SDS液とした。
10) BCP試薬
第１試薬：界面活性剤
125 mmol/Lコハク酸緩衝液
第２試薬：界面活性剤
125 mmol/Lコハク酸緩衝液
30 mmol/L BCP
9) 10% SDS solution
Purified water was added to 5 g of Sodium Lauryl Sulfate (SDS) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to make 50 mL, resulting in a 10% SDS solution.
10) BCP reagent 1st reagent: Surfactant
125 mmol / L succinate buffer 2nd reagent: Surfactant
125 mmol / L succinate buffer
30 mmol / L BCP
11) 改良BCP試薬
第１試薬：界面活性剤
125 mmol/Lコハク酸緩衝液
DTNB
SDS
第２試薬：界面活性剤
125 mmol/Lコハク酸緩衝液
30 mmol/L BCP
12) 10 mmol/L システイン塩酸塩
L-システイン塩酸塩（和光純薬工業株式会社）0.176 gを精製水100 mLに溶解し，10 mmol/L システイン塩酸塩とした。
11) Improved BCP reagent 1st reagent: Surfactant
125 mmol / L succinate buffer
DTNB
SDS
Second reagent: Surfactant
125 mmol / L succinate buffer
30 mmol / L BCP
12) 10 mmol / L cysteine hydrochloride
L-cysteine hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.176 g was dissolved in 100 mL of purified water to obtain 10 mmol / L cysteine hydrochloride.
３．測定方法
生化学自動分析装置H7600（日立ハイテクフィールディング）を用い測定を行った。BCP法およびBCP改良法は同一の測定条件であり，血清8μLに第１試薬180μLを添加，攪拌後37℃で5分間反応させた後，第２試薬90μLを添加した。攪拌後37℃で5分間反応させ，主波長605nmにて吸光度測定を行った。副波長は660 nmとした。
3. Measurement method Measurement was performed using a biochemical automatic analyzer H7600 (Hitachi High-Tech Fielding). The BCP method and the improved BCP method were under the same measurement conditions. 180 μL of the first reagent was added to 8 μL of serum, and after stirring, the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and then 90 μL of the second reagent was added. After stirring, the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and absorbance was measured at a dominant wavelength of 605 nm. The subwavelength was 660 nm.
４．最適BCP試薬の検索
（１）最適界面活性剤濃度の検索（BCP法）
HNAに対する反応性が最も高い界面活性剤及び濃度を決定するため，コハク酸緩衝液pH 5.6において，Triton X-405，Triton X-100，Brij 35の3種類の界面活性剤を用い-80℃保存血清，室温保存血清をそれぞれ測定した。室温保存血清は-80℃保存血清と比べHNAの割合が増加していることから，-80℃保存血清と室温保存血清の反応性の差が最大となる試薬がHNAに強く反応する試薬と考えられる。このため以下の式を設定した。
4). Search for optimal BCP reagent (1) Search for optimal surfactant concentration (BCP method)
To determine the most reactive surfactant and concentration for HNA, store at -80 ° C using three types of surfactants: Triton X-405, Triton X-100, and Brij 35 in succinate buffer pH 5.6 Serum and room temperature storage serum were measured respectively. Since the ratio of HNA in serum stored at room temperature is higher than that stored at -80 ° C, the reagent with the largest difference in reactivity between serum stored at -80 ° C and serum stored at room temperature is considered to be a reagent that reacts strongly with HNA. It is done. Therefore, the following formula was set.
Day(0)は採血した直後に-80℃で保存した血清を測定した時の吸光度，Day(x)は採血からx日室温にて保存し，測定した時の吸光度，Blankは生理食塩水を測定した時の吸光度をそれぞれ示している。分母であるDay(0)-BlankはBCP法における血清中のアルブミンに対する感度を示しており，分子のDay(x)-Day(0)はx日室温に保存した状態でのHNA増加を示している。すなわち，この式における値AはアルブミンにおけるHNAの感度を示しており，この値が高いほど，HNA増加の程度をより鋭敏に反映していると考えられる。今回の検討では室温にて6日間保存した血清を用いた。検討の結果，最も高い反応性を示したのはTriton X-405 0.1%であり，次いでTriton X-405 0.2%であった（図1）。また，全ての界面活性剤において，界面活性剤の濃度が高くなるに従い，HNAに対する反応性の低下が認められた。 このため，界面活性剤の濃度が低い程HNAに対する反応性が良くなるが，界面活性剤の濃度が低い程，試薬とアルブミンの反応安定性が悪く，測定時の再現性が低下するため，今回使用する界面活性剤はTriton X-405 0.2%とした。 Day (0) is the absorbance when measuring serum stored at -80 ° C immediately after blood collection, Day (x) is the absorbance measured at room temperature for x days after blood collection, and Blank is physiological saline. The absorbance when measured is shown. Day (0) -Blank, the denominator, shows the sensitivity to serum albumin in the BCP method, and Day (x) -Day (0) of the molecule shows an increase in HNA when stored at room temperature for x days. Yes. That is, the value A in this equation indicates the sensitivity of HNA in albumin, and the higher this value, the more sensitively the degree of increase in HNA is reflected. In this study, serum stored at room temperature for 6 days was used. As a result of the examination, Triton X-405 0.1% showed the highest reactivity, followed by Triton X-405 0.2% (Fig. 1). In all surfactants, the reactivity to HNA decreased with increasing surfactant concentration. Therefore, the lower the surfactant concentration, the better the reactivity to HNA. However, the lower the surfactant concentration, the worse the reaction stability of the reagent and albumin and the lower the reproducibility during measurement. The surfactant used was Triton X-405 0.2%.
（２）最適pHの検索（BCP法）
次にHNAに対する反応性が最も高いpHを決定するため，界面活性剤をTriton X-405 0.2%とし，pH 4.4からpH 5.0まで0.2間隔で試薬を調整，2種類の異なる-80℃保存血清，室温保存血清を用いて測定を行った。その結果，それぞれの検体においてpH 4.8が最も高い反応性を示した（図2）。このことからTriton X-405 0.2%において, pH 4.8を最もHNAに強く反応する試薬とした。以上の結果より，本法で用いるBCP法の界面活性剤はTriton X-405 0.2%，125 mmol/Lコハク酸緩衝液のpHは4.8とした。
(2) Search for optimum pH (BCP method)
Next, in order to determine the pH with the highest reactivity to HNA, the surfactant was Triton X-405 0.2%, the reagent was adjusted at intervals of 0.2 from pH 4.4 to pH 5.0, two different sera stored at -80 ° C, Measurements were made using room temperature stored serum. As a result, each sample showed the highest reactivity at pH 4.8 (Figure 2). Therefore, in Triton X-405 0.2%, pH 4.8 was the most reactive reagent for HNA. Based on the above results, the surfactant of BCP method used in this method was Triton X-405 0.2%, and the pH of 125 mmol / L succinate buffer was 4.8.
５．BCP改良法試薬の検索
BCP改良法はSDS，DTNBを加えることでHNAとHMAの反応性を改善した測定法であるが，本法で用いるHSAの酸化還元状態の推定には，BCP改良法試薬がHSAに高感度に反応する必要がある。このため，HSAに高感度に反応する界面活性剤濃度の検索，およびSDS，DTNBの濃度を検討した。
5. Search for BCP improved reagents
The improved BCP method is a measurement method that improves the reactivity of HNA and HMA by adding SDS and DTNB. However, the BCP improved reagent is highly sensitive to HSA for estimation of the redox state of HSA used in this method. It is necessary to react. For this reason, we investigated the concentration of surfactants that react with HSA with high sensitivity, and examined the concentrations of SDS and DTNB.
（１）最適界面活性剤濃度の検索（BCP改良法）
HSAに対する反応性が最も高い界面活性剤及びその濃度を決定するため，pH 5.6において，Triton X-405，Triton X-100，Brij 35を用いて-80℃保存検体，および生理食塩水をそれぞれ測定した。-80℃保存検体の吸光度から生理食塩水の吸光度を引くことで，それぞれの界面活性剤におけるHSAへの感度とした。その結果，Triton X-100 0.1%，Triton X-405 0.4%がHSAに対する感度が最も高かった（図3）。このことからTriton X-100 0.1%をHSAに最も高感度に反応する界面活性剤とした。
(1) Search for optimum surfactant concentration (BCP improvement method)
To determine the most reactive HSA-reactive surfactant and its concentration, measure -80 ° C specimens and physiological saline using Triton X-405, Triton X-100, and Brij 35 at pH 5.6. did. The sensitivity of each surfactant to HSA was determined by subtracting the absorbance of physiological saline from the absorbance of specimens stored at -80 ℃. As a result, Triton X-100 0.1% and Triton X-405 0.4% had the highest sensitivity to HSA (Figure 3). Based on this, Triton X-100 0.1% was selected as a surfactant that reacts with HSA with the highest sensitivity.
（２）最適DTNB濃度の検索（BCP改良法）
最適なDTNB濃度を決定するため，Triton X-100 0.1%，SDS 0.04%とし，DTNB 0.0 mmol/Lから0.2 mmol/Lまで0.05 mmol/L間隔に試薬を調製し，-80℃保存検体と室温保存検体をそれぞれ測定した。その結果，全ての濃度において，-80℃保存検体と室温保存検体の吸光度に差は認められなかった（図4）。今回の検討では，DTNBの有無に関わらず全てのアルブミンが酸化されていたと考えられるが，アルブミン濃度が高い場合，一部のアルブミンが酸化されない可能性があるため，DTNBを添加する必要がある。このため，今回の最適DTNB濃度は0.1 mmol/Lとした。
(2) Search for optimal DTNB concentration (BCP improvement method)
In order to determine the optimal DTNB concentration, Triton X-100 0.1% and SDS 0.04% were prepared, and reagents were prepared at intervals of 0.05 mmol / L from DTNB 0.0 mmol / L to 0.2 mmol / L. Each preserved specimen was measured. As a result, there was no difference in absorbance between the specimens stored at -80 ° C and room temperature at all concentrations (Figure 4). In this study, it is considered that all albumin was oxidized regardless of the presence or absence of DTNB. However, when albumin concentration is high, some albumin may not be oxidized, so it is necessary to add DTNB. For this reason, the optimal DTNB concentration this time was set to 0.1 mmol / L.
（３）最適SDS濃度の検索（BCP改良法）
最適SDS濃度を決定するためTriton X-100 0.1%，DTNB mmol/Lとし，SDS 0.00%から0.03%まで0.01%間隔に試薬を調製，-80℃保存検体と室温保存検体をそれぞれ測定した。その結果，SDS 0.01%以上において-80℃保存検体と室温保存検体の吸光度差を認めなくなった（図5）。このことから，最適SDS濃度は0.03%とした。
(3) Search for optimum SDS concentration (BCP improvement method)
To determine the optimal SDS concentration, Triton X-100 0.1% and DTNB mmol / L were prepared, and reagents were prepared at intervals of 0.01% from SDS 0.00% to 0.03%, and samples stored at -80 ° C and room temperature were measured. As a result, no difference in absorbance was observed between specimens stored at -80 ° C and room temperature at SDS above 0.01% (Figure 5). For this reason, the optimal SDS concentration was set to 0.03%.
６．HPLC法との相関
作製したBCP試薬，BCP改良法試薬を用いてHPLC法との相関を確認した(図6)。-80℃で保存した血清は健常な成人より得られた血清であったため，多くの血清は典型的な分画を示した（図7）。図ではHPLCでのアルブミン溶出パターンを示しており10分程度で溶出されたピークがHMAを，20分程度で溶出されたピークがHNA-1を，29分程度で溶出されたピークがHNA-2をそれぞれ示している。それぞれの割合はHMA 74.5%，HNA 25.5%であった。健常な血清では酸化還元状態に差が見られなかったため，システインを添加しHNAの割合を大きく減少させた模擬血清（図8）（HMA 85.8%，HNA 14.2%）および，システインを添加後37℃で長時間（最大48時間）反応させHNAの割合を大きく増加させた模擬血清（図9）（HMA 13.9%，HNA 86.1%）を相関に使用した。
6). Correlation with HPLC method Using the prepared BCP reagent and BCP modified reagent, the correlation with HPLC method was confirmed (Fig. 6). Since serum stored at -80 ° C was obtained from healthy adults, many sera showed typical fractions (Figure 7). The figure shows the albumin elution pattern by HPLC. The peak eluted in about 10 minutes is HMA, the peak eluted in about 20 minutes is HNA-1, and the peak eluted in about 29 minutes is HNA-2. Respectively. The respective ratios were HMA 74.5% and HNA 25.5%. There was no difference in the redox state of healthy serum, so mock serum (Fig. 8) (HMA 85.8%, HNA 14.2%) with cysteine added to greatly reduce the HNA ratio and 37 ° C after addition of cysteine And mock serum (Fig. 9) (HMA 13.9%, HNA 86.1%), which was reacted for a long time (maximum 48 hours) and greatly increased the proportion of HNA, was used for correlation.
その結果，相関式はy = 270.1 x - 151.96，相関係数は0.92と非常に良好な正の相関が得られた。以上のことから，本発明の方法を用いることで簡易的にHMAの割合を推定することができた。 As a result, the correlation equation was y = 270.1 x-151.96, and the correlation coefficient was 0.92. From the above, it was possible to easily estimate the HMA ratio by using the method of the present invention.
７．考察
アルブミンは古くから全身栄養状態や腔内・体外への喪失の把握，肝機能障害の検査として利用されてきており，測定には色素結合法が主に用いられていた。本発明の方法ではこれまで使用されてきたBCP法およびBCP改良法を用いることで簡易的にアルブミンの酸化還元状態を推定することを目的とし，HNAにより高感度に反応する試薬開発を目指した。
7). Discussion For a long time, albumin has been used for grasping systemic nutritional status, loss of intracavity and extracorporeal loss, and examination of liver dysfunction, and the dye binding method was mainly used for measurement. The purpose of the method of the present invention was to estimate the redox state of albumin simply by using the BCP method and the improved BCP method used so far, and aimed to develop a reagent that reacts with high sensitivity by HNA.
その結果，界面活性剤はTriton X-405 0.2%，緩衝液は125 mmol/Lコハク酸緩衝液，pH 4.8が最適な濃度であることが明らかとなり，アルブミンと高感度に反応する濃度とは異なる最適濃度が存在することが確認された。BCP法ではHNAとHMAに対する反応性の違いが知られていたが，各条件を変更することで反応時にアルブミンの構造変化が起こり，HNAに高感度に反応する試薬を開発することができたと考えられる。 As a result, it was found that Triton X-405 0.2% surfactant and 125 mmol / L succinate buffer, pH 4.8 are the optimal concentrations, and the concentration that reacts sensitively with albumin is different. It was confirmed that an optimal concentration exists. Although the difference in reactivity to HNA and HMA was known in the BCP method, it was thought that by changing each condition, the structural change of albumin occurred during the reaction, and a reagent that reacts with HNA with high sensitivity could be developed. It is done.
また，本発明の方法とHPLC法との相関では，非常に良好な相関を得ることができ，専用分析装置を用いなくても短時間で大量の処理が可能であり, 多くの検査室で日常検査に利用されている自動分析装置で測定が可能となり，アルブミンの酸化還元状態をより簡易的に推定することが可能となった。 In addition, the correlation between the method of the present invention and the HPLC method can provide a very good correlation and can be processed in a large amount of time in a short time without using a dedicated analyzer. Measurements can be made with an automatic analyzer used for testing, and the oxidation-reduction state of albumin can be estimated more simply.
アルブミンは生体中に最も多く含まれる物質であることから，生体中の酸化還元状態を推定することが可能となり，疾病による酸化ストレスの評価や治療の有効性を相対的に評価するなど様々な応用が期待される。また，臨床の現場では輸血にアルブミン製剤が用いられているが，アルブミン製剤に含まれるアルブミンのHNAの割合は製造販売各社間で大きく異なり，多いもので71%，少ないものでも41%と，健常者の割合に比べHNAの割合が非常に高いことが知られている8)。HMAとHNAではL-Trpやセファゾリンなどの物質結合能が異なることが報告され9)，HNAの増加による薬物動態が健常人とは異なることを示唆しており，これらアルブミン製剤の頻回使用による酸化還元状態の変動が生体もしくは治療に及ぼす影響については現在評価されていない。 Since albumin is the most abundant substance in the living body, it is possible to estimate the oxidation-reduction state in the living body, and various applications such as the evaluation of oxidative stress due to disease and the relative evaluation of the effectiveness of treatment. There is expected. In clinical practice, albumin preparations are used for blood transfusions, but the HNA ratio of albumin contained in albumin preparations varies greatly between manufacturers, with 71% being the largest and 41% being the least. It is known that the proportion of HNA is much higher than the proportion of those who are 8) . It has been reported that HMA and HNA differ in their ability to bind substances such as L-Trp and cefazolin 9) , suggesting that the pharmacokinetics of increased HNA differs from that in healthy individuals. The effect of changes in the redox state on the body or treatment is not currently being evaluated.
本発明の方法を用いることで，HNAの割合の低いアルブミン製剤の選択やアルブミン製剤の品質評価など新たな評価が可能になると考えられる。 By using the method of the present invention, it is considered that new evaluation such as selection of an albumin preparation having a low HNA ratio and quality evaluation of the albumin preparation can be performed.
本実施例は、Triton X-405およびX-100を含む、各種界面活性剤を試した実施例である。
＜材料及び方法＞
各種界面活性剤の所定の濃度に調製した試薬を用い、生化学自動分析装置 (日立7600型) を利用して測定した。測定条件は以下のとおりである。検体量(血清)4μLと第一試薬180μLを加え5分反応させた。その後第二試薬 90μLを加え、主波長600 nm、副波長660 nmの2ポイントエンド法で測光した。反応温度は37℃である。なお、試料は模擬的に作製した酸化型、還元型優位の血清を用いた。図１０、１１にHPLCパターン（それぞれ酸化型、還元型）を示す。HPLCの測定値を表３に示す。
<Materials and methods>
Measurement was performed using a biochemical autoanalyzer (Hitachi 7600 type) using reagents prepared at predetermined concentrations of various surfactants. The measurement conditions are as follows. The sample amount (serum) 4 μL and the first reagent 180 μL were added and reacted for 5 minutes. Thereafter, 90 μL of the second reagent was added, and photometry was performed by a two-point end method with a main wavelength of 600 nm and a sub wavelength of 660 nm. The reaction temperature is 37 ° C. The sample used was a pseudo-produced oxidized and reduced serum. 10 and 11 show HPLC patterns (oxidized and reduced forms, respectively). The measured values of HPLC are shown in Table 3.
また、界面活性剤の濃度と吸光度の関係を調べた結果を図１２(酸化型優位)及び図１３(還元型優位)並びに表４及び５に示す。
これらの結果より、0.3% Triton X-405がもっとも酸化型と還元型試料が示す吸光度の差が大きく、次いで0.1% Tween 20であることが示された。
また、反応に使用する検体量の検討を行った結果、BCPでは2-8 μL、BCP改良法では2-4μLにおいて良好な測定をすることができた（図１４）。
From these results, it was shown that 0.3% Triton X-405 has the largest difference in absorbance between the oxidized and reduced samples, followed by 0.1% Tween 20.
Further, as a result of examining the amount of specimen used for the reaction, it was possible to perform good measurement at 2-8 μL for BCP and 2-4 μL for the improved BCP method (FIG. 14).
参考文献
1) 安楽誠，丸山徹，小田切優樹：血清アルブミンの構造特性と医薬への応用，人工血液．13：22-28，2005.
2) 恵良聖一：各種疾患における酸化型・還元型アルブミンの変動，栄養評価と治療．24(2)：139-143，2007.
3) Anraku M., Victor Tuan Giam Chuang. et al., Redox properties of serum albumin: Biochimica et Biophysica Acta. 1830: 5465-5472, 2013.
3) Era S., Kuwata K., Imai H. et al., Age-related change in redox state of human serum albumin: Biochimica et Biophysica Acta. 1247: 12-16, 1995.
4) Era S., Imai H., Hayashi T. et al., The influence of redox state of human serum albumin: A study of patients under severe oxidative stress: APIACTA. Available from: http://www.apimondiafoundation.org/foundation/xxxviiie.html.
5) 村本良三：血清アルブミン測定法の現状と展望，医学のあゆみ．198：972-976，2001.
6) 村本良三，松下誠，入野勤：正確度を改善したブロムクレゾールパープル法による血清アルブミン定量法の開発，臨床化学．26：38-43，1997.
7) 栢森裕三，片山善章：血清アルブミン測定法の進歩，生物試料分析．24：85-94，2001.
8) 恵良聖一：各種疾患における酸化型・還元型アルブミンの変動，栄養評価と治療．Vol.24 no.2：47-51，2007.
9) 山田尚之，窪田和幸，河上麻美，他：肝疾患マーカー候補としての酸化型アルブミンの構造と機能解析およびその生理学的意義，生物物理化学．52；25-30，2008.
References
1) Makoto Anraku, Toru Maruyama, Yuki Odagiri: Structural characteristics of serum albumin and its application to medicine, artificial blood. 13: 22-28, 2005.
2) Seiichi Era: Variation of oxidized and reduced albumin in various diseases, nutritional evaluation and treatment. 24 (2): 139-143, 2007.
3) Anraku M., Victor Tuan Giam Chuang. Et al., Redox properties of serum albumin: Biochimica et Biophysica Acta. 1830: 5465-5472, 2013.
3) Era S., Kuwata K., Imai H. et al., Age-related change in redox state of human serum albumin: Biochimica et Biophysica Acta. 1247: 12-16, 1995.
4) Era S., Imai H., Hayashi T. et al., The influence of redox state of human serum albumin: A study of patients under severe oxidative stress: APIACTA. Available from: http://www.apimondiafoundation.org /foundation/xxxviiie.html.
5) Muramoto Ryozo: Current status and prospects of serum albumin measurement methods, history of medicine. 198: 972-976, 2001.
6) Ryozo Muramoto, Makoto Matsushita, Tsutomu Irino: Development of serum albumin determination method using bromcresol purple method with improved accuracy, clinical chemistry. 26: 38-43, 1997.
7) Yuzo Hagimori, Yoshiaki Katayama: Advances in serum albumin measurement, biological sample analysis. 24: 85-94, 2001.
8) Seiichi Era: Variation of oxidized and reduced albumin in various diseases, nutritional assessment and treatment. Vol.24 no.2: 47-51, 2007.
9) Naoyuki Yamada, Kazuyuki Kubota, Asami Kawakami, et al .: Structural and functional analysis of oxidized albumin as a candidate liver disease marker and its physiological significance, biophysical chemistry. 52; 25-30, 2008.
Claims (19)
The kit according to claim 18, wherein the final concentration of sodium lauryl sulfate is 0.03% or less.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016157970A JP2018025486A (en) | 2016-08-10 | 2016-08-10 | Method for separately measuring serum albumin of oxidation type and reduction type |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016157970A JP2018025486A (en) | 2016-08-10 | 2016-08-10 | Method for separately measuring serum albumin of oxidation type and reduction type |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018025486A true JP2018025486A (en) | 2018-02-15 |
Family
ID=61195037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016157970A Pending JP2018025486A (en) | 2016-08-10 | 2016-08-10 | Method for separately measuring serum albumin of oxidation type and reduction type |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2018025486A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4006547A1 (en) * | 2020-11-27 | 2022-06-01 | ARKRAY, Inc. | Test piece for albumin measurement |
-
2016
- 2016-08-10 JP JP2016157970A patent/JP2018025486A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4006547A1 (en) * | 2020-11-27 | 2022-06-01 | ARKRAY, Inc. | Test piece for albumin measurement |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI742321B (en) | Analytical method of the components of diluted living samples | |
| Schade et al. | Bound iron and unsaturated iron-binding capacity of serum; rapid and reliable quantitative determination | |
| EP1881328B1 (en) | Method of determining iron concentration | |
| CN102177437B (en) | Reference control for cell by cell analysis | |
| CN107656069A (en) | Full-range C reactive protein quantitative detecting reagent and method in whole blood | |
| Ito et al. | Non-transferrin-bound iron assay system utilizing a conventional automated analyzer | |
| US4393142A (en) | Assay method and reagent for the determination of chloride | |
| WO2016186521A1 (en) | Haemolysis stabilising composition | |
| JP2018025486A (en) | Method for separately measuring serum albumin of oxidation type and reduction type | |
| CN106404686A (en) | Antiheparin serum total bilirubin (vanadate oxidation method) detection kit | |
| CN106443014A (en) | Detection kit for ischemia modified albumin and preparation method of detection kit | |
| JP2018194453A (en) | Oxidation-type albumin formation agent, albumin measuring kit, and method for measuring albumin | |
| JP2007240163A (en) | Measuring method of protein in sample and measuring reagent | |
| JPH0358467B2 (en) | ||
| US20040048386A1 (en) | Method of using cyanide-free lyse solution to emulate a cyanide-containing lyse solution in the measurement of hemoglobin | |
| JP3266079B2 (en) | Method and reagent for measuring albumin | |
| JP2632989B2 (en) | Method for measuring unsaturated iron binding ability | |
| JP2006317247A (en) | Iron concentration measuring method | |
| JP2002189030A (en) | Method and reagent for measurement of unsaturated iron bonding capability | |
| WO1995013544A1 (en) | Reagent for determining unsaturated iron-binding capacity | |
| JP2004258025A (en) | Reagent and method for measuring total protein in sample | |
| RU2159442C1 (en) | Reagent set for determining blood hemoglobin concentration | |
| JPH06109738A (en) | Unsaturated iron combining ability measuring reagent | |
| JP2002284775A (en) | Method for stabilizing ascorbic acid or its salt in solution state, solution containing ascorbic acid or its salt and assay reagent for target substance to be assayed in sample | |
| JP2004271440A (en) | Reagent for and method of measuring substance to be measured in biological sample, and method of avoiding influence of bilirubin contained in biological sample |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20160907 |