JP3950481B2 - 高グリコシル化ゴナドトロピンを用いるダウン症候群の出生前のスクリーニング - Google Patents

Description

関連出願データ
本出願は１９９６年９月６日に出願された米国特許出願第６０／０２５，５６８号の優先権を主張する。
技術分野
本発明は出生前女性のダウン症候群のスクリーニングテストに関するものである。
血清中のα−フェトプロテイン、絨毛膜のゴナドトロピン及び非共役エストロゲンの３重のスクリーンがダウン症候群の出生前の診断法として示唆されている（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｃ．，及びＰｌｕｍ，Ｆ．，Ｃｅｃｉｌ’ｓ Ｔｅｘｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６，１６５頁）。しかしながら、この診断法は遺伝的異常をもつ胎児のわずかに６０〜６５％の検出を可能にし、そして５％の間違った陽性結果を与える。またこの診断法は妊娠のセコンドトリメスター（妊娠期間の１５〜２４週）に制限され、かなりの特許料が通常の方法を用いるヒト絨毛膜ゴナドトロピン分析を実施する研究所に支払われるので費用がかかる（Ａｕｘｔｅｒ，Ｓｏ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂｏｒ Ｎｅｗｓ ２３：１−３（１９９７））。
７００人中の１人生産児に影響するダウン症候群を導く胎児の染色体異常の最も信頼できる出生前診断法は典型的にはその代りに３ヵ月間の妊娠期間中に羊水細胞の培養を包含する。この方法は小量の羊水（羊水穿刺）の吸引、この流体中に含有される胎児細胞の培養及びこれらの細胞の核型の決定を包含する。従って妊娠３ヵ月以後の胎児を包含する。染色体異常の検出のためにこの技術の使用の多くの適応は（出産予定の時に３５才の年令以上の全ての母親に通常適用される）妊婦年令、親の染色体異常の存在、又は先の三染色体胎児を身ごもった又は三染色体である核型の胎児を流産した経験のある妊婦に対してである。絨毛膜の絨毛の直接のトランスサービカル吸引（絨毛膜の絨毛のサンプリング又はＣＶＳ）がまた出生前診断法に使用されている。
２つの方法が比較的に安全であり信頼できるものとして示されているが、これらは流産の危険を含むいくつかの危険を包含し、ＣＶＳの場合にはその方法後に生まれた胎児の手足の発育不全の危険を包含する。ダウン症候群に対する妊娠した女性をスクリーニングするための他の方法をもつことが好ましい。特に非侵入性であり且つ感度のよいスクリーンをもつことが好ましい。多くのダウン症候群のケースは若くして妊娠した女性、予定された出産の時が３５才以上のもの、又は大多数の妊娠に生ずる。より少ない身体への侵入のスクリーニングテストは、血清又は尿サンプルを用いることによって羊水穿刺又はＣＶＳの危険を望まないダウン症候群妊娠のために、高い危険度でこれらを同定することを要求される。
本発明の背景
ヒト絨毛膜のゴナドトロピン（ｈＣＧ）は胎盤のトロホブラスト細胞によって比較的多量に分泌されるグリコプロテインホルモンである（Ｍａｓｕｒｅ，Ｈ．Ｒ．，他Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．５３：１０１４−１０２０（１９８１））。ｈＣＧは非共有結合で結合される２つの異なるサブユニット、α（９２アミノ酸及びＮ−結合オリゴ糖類）及びβ（１４５アミノ酸及び２つのＮ−結合及び４つのＯ−結合オリゴ糖類）から構成され、妊娠の血清又は尿中に又はトロホブラスト疾病（水胞形の奇胎及び絢毛癌）をもつものに検出される。遊離のα−及び遊離のβ−サブユニット、及び分離したｈＣＧ及び遊離のβ−サブユニット分子はまた血清及び尿サンプル中に検出される（Ｂｉｒｋｅｎ，Ｓ．，他，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：５７２−５８３（１９８８））。分解した分子はβ−サブユニット残基４７及び４８（又は残基４３及び４４又は４４及び４５の間にこれは通常少ない）の間に各々開裂されたニックを入れた（ｎｉｃｋｅｄ）ｈＣＧ及びニックを入れた遊離のβ−サブユニットを含み、β−サブユニットはＣ−末端配列（β９３−１４５）の全て又は一部を欠失し、及び末端分解生成物は尿サンプル中で主として見出されるジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのフラグメント、β−サブユニット配列６〜４０及び５５−９２からなる（図１）。末端分解生成物はＯ−結合オリゴ糖類及び分解Ｎ−結合オリゴ糖類、１つ又は２つのＮ−結合ペンタ糖類対遊離のβ−サブユニット及びｈＣＧ上に２つのウンデカ糖類をもたない（図２Ａ）。末端分解生成物は、第１にそのサイズが小さいので（〜９，０００ダルトン；ｈＣＧは３７，０００ダルトン）及び第２にｈＣＧβラジオイムノアッセイ又はβ−サブユニットコア抗血清（対Ｃ−末端他）免疫反応性（Ｂｉｒｋｅｎ，他、及びＭａｓｕｒｅ，他、上記で引用）のその保持の故に、β−コアフラグメントと呼ばれる（β−ｃｏｒｅ，Ｂｌｉｔｈｅ；Ｄ．，他，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：１７３〜１８０（１９８８））。妊娠期間のほとんどを通して、β−コアフラグメントは尿サンプル中の主なｈＣＧβ−サブユニット関連分子である。
血清及び尿遊離β−サブユニットは３つの源；トロホブラスト細胞による直接の分泌、循環するｈＣＧの遊離のα−及びβ−サブユニットへの遅い解離、そしてトロホブラスト組織と関連のあるマクロファージ及びニュートロフィル酵素によるｈＣＧのニッキングによる直接分泌、そして循環中のニックを入れられたｈＣＧのより早い解離、に由来する（図１）。遊離β−サブユニットは循環中に酵素をニッキングすることによりニックを入れ得る。尿β−コアフラグメントは腎臓中のニックを入れた遊離のβ−サブユニットの解離から誘導されるように思われる。
１９８０年の終り頃に、上記記載のトリプルマーカーテストがダウン症候群の妊娠に対するスクリーニングのために開発された。それは妊婦の年令をｈＣＧ，α−フェトプロテイン、及び非結合エストリオールと組合せた（Ｂｏｇａｒｔ，Ｍ．Ｈ．，他，Ｐｒｅｎａｔ，Ｄｉａｇｎ．７：６２３−６３０（１９８７）、Ｂｏｇａｒｔ Ｗａｌｄ，Ｎ．Ｊ．他の米国特許第４，８７４，６９３号明細書、Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．９５：３３４−３４１（１９８８）、及びＣａｎｉｃｋ，Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ １３：３０−３３（１９９０））。より最近では、血清遊離β−サブユニットテスト及び遊離β−サブユニット−α−フェトプロテインの組合せが別法のダウン症候群スクリーニング方法として紹介されている（Ｍａｃｒｉ，Ｊ．Ｎ．，他，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１６３；１２４８−１２５３（１９９０）及びＳｐｅｎｃｅｒ，Ｋ．，他，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：３９４−４０１（１９９３））。しかしながら、最良の血清遊離β−サブユニット結合、又は最適のトリプルマーカーテストは５％の間違った陽性割合をもつたった６０〜６５パーセントのダウン症候群ケースを検出するにすぎない。これらの間違った陽性割合及び検出では、ほぼ８０の羊水穿刺がダウン症候群の単一のケースを検出するために実施されることが必要であり、無視できない数のダウン症候群ケースの見落しがある（Ｃｏｌｅ，Ｌ．Ａ．，他，Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ １７：６０７−６１４（１９９７））。出産前スクリーニング方法の改良の必要性がある。
本発明の概要
本発明の目的はダウン症候群妊娠用の出産前スクリーニングテストを提供することにある。
本発明の他１の及びより具体的な目的は妊婦中のダウン症候胎児のための感度の高い、非侵入性（ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ）のテストを提供することである。
本発明のさらなる目的は増加したまちがいのない陽性割合を示すトリプルマーカーテストの改善を提供することである。
これらのそして他の目的は、女性から生物学的テストサンプルを得、そしてこのサンプル中の高グリコシル化ゴナドトロピン（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）の観察によってダウン症候群の存在を決定することからなる、出産前の女性の胎児におけるダウン症候群の存在又は非存在についてスクリーニングする新規な診断法を提供する本発明によって達成される。これは典型的には、テストサンプル中の高グリコシル化ゴナドトロピン、その遊離β−サブユニット、その遊離のα−サブユニット、及び／又はそのβ−コアフラグメントの濃度を測定し、そしてこのテストサンプル母集団（ポピュレーション）中の濃度が通常の高グリコシル化ゴナドトロピン又は遊離のα−サブユニット、遊離のβ−サブユニット、又はβ−コアフラグメント母集団と異なるか、及び／又はダウン症候群母集団と同じか又は類似することを観察することによってダウン症候群の存在を決定することを包含する。好ましい態様では、テストサンプルは尿、唾液、血漿又は血清であり、母集団は高グリコシル化ｈＣＧ，β−コアフラグメント、遊離のα−サブユニット、遊離のβ−サブユニット、及びこれらの混合物からなり、そして通常の及びダウン症候群サンプル中で観察される特性間の違異はグリコポリペプチド及び／又はグリコペプチドの炭水化物含量で観察される相違を反映る。
炭水化物組成又は構造分析、イムノアッセイ及びこれらの方法の組合せは一般に採用されている。ある態様では、高グリコシル化ゴナドトロピンは少なくとも１つの高グリコシル化種、例えば変異体ｈＣＧ、遊離β−サブユニット、遊離α−サブユニット及び／β−コアフラグメントに対する分析によって直接決定される。これらのスクリーニング（又はスクリーン、ｓｃｒｅｅｎｓ）は典型的にはＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等において高グリコシル化又は炭水化物−変異体ｈＣＧ種に対するモノクローナル、ポリクローナル又は融合ファージ抗体を使用する。他の態様では、単糖類（モノサッカライド）の高レベルがダウン症候群に対する陽性サンプル中に観察される。他のスクリーンは炭水化物部分を結合するレクチン、ｈＣＧのグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）変異体を検出するクロマトグラフィー、化学又は電気泳動又は等電点電気泳動テストを使用する。レクチンはイムノアッセイ前に異常型の炭水化物部分をもつｈＣＧ種を分離及び／又は濃縮するためにまた使用される。
図の説明
図１はｈＣＧ関連分子の構造を説明する図解のライン図である。太いラインはペプチドバックボーン、数字はアミノ酸の位置を示す。そして細いラインはジスルフィド結合の部位を示す。文字はオリゴ糖類側鎖の単糖類を示す。Ｓ＝シアル酸；Ｇ＝ガラクトース；Ａ＝Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｍ＝マンノース；及びＬ＝Ｎ−アセチルガラクトサミンである。
図２はＮ−結合オリゴ糖類の図解説明図である。図２Ａの構造は通常の妊娠ｈＣＧ及びその遊離β−サブユニット、及び遊離α−サブユニット上のＮ−結合オリゴ糖類を説明する。図２Ｂの構造は通常の妊娠β−コアフラグメント上の分解されたＮ−結合オリゴ糖類を示す。図２Ｃの構造は通常の妊娠ｈＣＧの遊離β−サブユニットとしてのｈＣＧ上のＯ−結合オリゴ糖類を示す。略語は、Ｍａｎはマンノース、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｆｕｃはフコース及びＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示すものとして使用される。変異性（ｖａｒｉａｂｌｅ）は±で示される。
図３はダウン症候群及び／又は絢毛癌のような関連する異常状態で発見される異常なｈＣＧ種上の高グリコシル化Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖類を説明する。図３Ａは高グリコシル化ゴナドトロピン及びその遊離のβ−サブユニット及び遊離のα−サブユニット上のＮ−結合オリゴ糖類を示す。図３Ｂは高グリコシル化ゴナドトロピンβ−コアフラグメント上のＮ−結合オリゴ糖類を示す。図３Ｃは高グリコシル化ゴナドトロピン及びその遊離のβ−サブユニット上のＯ−結合オリゴ糖類を示す。略語は図２で用いたものと同じである。
図４は１３０人の通常の胎児（●）をもつ妊婦及び９人のダウン症候群の胎児（○）をもつ妊婦から所定の周期的間隔で採收された尿サンプル中の高グリコシル化ｈＣＧについてのイムノアッセイにおけるモノクローナルＢ１５２活性のプロットである。中央値が決定されそしてサンプルが通常の妊娠中央値の倍数として表現された。長いガウスラインは妊娠年令（第５０センチ）に調整された通常の妊娠中央値に対して一致した。第９５センチがまた決定された。
本発明の詳細な記載
本発明は正常な胎児をもつ妊婦からではなくダウン症候群胎児をもつ妊婦の尿又は血清から得られたｈＣＧ種（高グリコシル化ゴナドトロピン）中の異常型炭水化物プロフィールの観察に基づくものである。
本発明の実施において、妊婦の胎児中のダウン症候群の存在又は非存在は女性からの生物学的テストサンプルを得て、そしてそのサンプル中の高グリコシル化ゴナドトロピンを分析することによって決定される。これはテストサンプル中の絨毛膜のゴナドトロピン母集団の組成又は物理特性が通常の絨毛膜ゴナドトロピン母集団を含有する対応する対照サンプルと異なるかどうかの決定を含み、及び／又はそのサンプルがダウン症候群中で観察された高グリコシル化ゴナドトロピン母集団の少なくとも１種の高レベルを含有することの決定を含む。
ここで使用される如く、「絨毛膜ゴナドトロピン母集団（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」は絨毛膜ゴナドトロピン、α−サブユニット、β−サブユニット、β−コアフラグメント、及びこれらの混合物を含み、そして特にダウン症候群ｈＣＧ母集団中に観察されるこれらの如く高グリコシル化される又はオリゴ糖類部分中の異常な単糖類組成物をもつこれらの種の異性体を含有する。用語「高グリコシル化ゴナドトロピン（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）」は、正常レベルに比べて異常型炭水化物プロフィール及び／又は異常型炭水化物レベルを示す高グリコシル化ゴナドトロピン、ニックを入れたゴナドトロピン、α−サブユニット、β−サブユニット、β−コアフラグメント及びこれらの混合物からなる、これらの後者の種を絨毛膜ゴナドトロピン母集団内に一般に包含する。
ｈＣＧ及びβ−コアフラグメントは多くの態様で使用される。本発明の利点は妊娠血清が多量のｈＣＧを含有すること、ｈＣＧが妊娠血清中に全β−免疫反応性の９９％以上を占めていることである。同様に、妊婦の尿は大きい母集団のβ−コアフラグメントをもつ。実際に、β−コア母集団は妊婦の尿中の全β−免疫反応性の７０％と同程度を占める（Ｂｌｉｔｈｅ，他、上記に引用した）。従って、本発明の好ましい態様では、豊富な種、血清中のｈＣＧ及び尿中のβ−コアフラグメント及びイムノアッセイを含む標準的な技術を用いて容易に検出されるもの、ここで説明されるそして上記引用例Ｂｉｒｋｉｎ他、及びＢｌｉｔｈｅ，他によって記載されている同様の臨床測定、又はダウン症候群ｈＣＧ種の炭水化物中に観察される異変異体の故に、炭水化物に特異的なレクチンの使用の如き炭水化物分析、単糖類組成物テストの使用、グリコシル化変異体を検出するための電気泳動又は等電点電気泳動に対するスクリーニング方法を提供する。ダウン症候群及び関連異常妊娠中に観察される種々の変異種は図３に記載され、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｍ．Ｍ．，他，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊ．，７巻（１９９７）に記載される。多くの高グリコシル化ダウン症候群ｈＣＧ種は、ｈＣＧβ−サブユニット中にマンノースコアに結合したシアリルラクトサミン（ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）ビアンテナリー構造の代りに（図２）、追加のシアリルラクトサミンをもつトリアンテナリー構造（図３）をもつ。他の高グリコシル化特性はフコース含有（対フコース遊離）Ｎ−結合オリゴ糖類の増加したレベルを含有し、そしてβ−サブユニットＯ−結合炭化水素部位にヘキサ糖類構造を含有する（図３ｃ）。従って高グリコシル化はダウン症候群ｈＣＧ種中に著しく高められる。
本発明の方法では生物学的サンプルはいずれのものも使用される。次のものを含むがこれらに限定されない。尿、だえき、血清、血漿、なみだ、及び羊膜流体。なみだ、尿、血漿又は血清が好ましい。これらのサンプルは多量に存在し、そしてサンプリングが胎児を傷つけるおそれがない。第１期（第１トリメスター）（一般に約９週〜１３週として定義される）又は第２期（一般に約１４〜２８週）の妊婦から得られる尿がある態様では特に好ましい。本発明の利点は米国特許第４，８７４，６９３号（１８〜２５週）に記載されたもののように胎盤の機能不全を評価する先に記載された方法よりも妊娠においてより早く第１期（第１トリメスター）中に分析することができることである。妊娠期間の１１〜１９週に使用するのに適するスクリーニング方法は、例えば、次の実施例に及び図４に説明される。
本発明のダウン症候群スクリーニング（又はスクリーン）は高グリコシル化ゴナドトロピンの検出用に炭水化物分析、イムノアッセイ、又はこれらの方法の組合せを一般に使用するが、高グリコシル化ゴナドトロピンのサンプル濃度中の変化を通常のレベルから質的又は量的に決定するために機能する、及び／又はサンプル中のゴナドトロピン母集団中の異常な炭水化物ｈＣＧ分部を検出するいずれの分析も本発明の実施に使用できる。変異体ダウン症候群の絨毛膜ゴナドトロピン母集団の少なくとも一員の直接分析が好ましい。あるスクリーンは炭水化物分部を分析するレクチン、クロマトグラフィー、化学的又は電気泳動又は等電点電気泳動テストを使用し、ｈＣＧのグリコシル化変異体、及び／又はグリコシル化又は炭化水素−変異体ｈＣＧに対する抗体を検出する。
イムノアッセイはこれに限定されないが標準方法で生じた高グリコシル化ゴナドトロピンに対する特異的抗体を使用する分析、及び標準的方法を用いてダウン症候群ｈＣＧ又は絢毛癌ｈＣＧをテスト動物へのブラインド注射によって得られる非特異的に限定された抗体を用い分析を包含する。融合ファージの任意のタイプ、モノクローナル又はポリクローナル抗体は、抗体が正常の種を認識することなく変異体ダウン症候群高グリコシル化ｈＣＧ種に対するマーカーとして、又は通常及び変異体母集団中に観察される異なったレベルの測定として再生型で使用できる限り、本発明イムノアッセイで使用でき、又は正常及び変異体母集団中に観察される異なるレベルの測定として使用できるし、そして特にフラグメントの変異体炭化水素部分に対する抗体を包含できる。絢毛癌患者から得られたニックを入れた高グリコシル化ｈＣＧを認識するが正常のｈＣＧを検出しないＢ１５２として示される、抗体は下記記載されるイムノアッセイで使用される。
本発明の典型的なイムノアッセイでは、Ｂ１５２の如き高グリコシル化変異体用の特異的な抗体がｈＣＧ、β−コアフラグメント、α−サブユニット、及び／又はβ−サブユニットに対する第２標識抗体をもつ捕獲用抗体として使用でき、そのポリペプチドの特異性をもつ分析を提供する。第２抗体上のラベルは酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）で使用される任意の化学的、放射性活性、ランタニド、着色顔料又は遺伝子タグからなり、ウエスタンブロット及び周知の方法論を用いる他の高感度且つ特異的なイムノアッセイ及びイムノラジオメトリックアッセイに使用できる。これらは典型的には比色、蛍光、発光物質を用いる容易に測定し得るホースラディシパーオキシターゼ又はアルカリホスファターゼと抗体を結合することからなる。遺伝子ラベルはルシフェラーゼはその基質、ルシフリンとインキュベートされるとき、バイオルミネセンス分子を生成するので使用されるホタルルシフェラーゼを包含する。別の態様は他の抗体の存在を検出するために第三の抗体を用いる。
他の態様は捕獲抗体としてペプチド−特異性抗体を用いる。及び高グリコシル化又は炭水化物−変異体ゴナドトロピン及び／又はその異常な炭水化物部分に対する特異的抗体は上記記載のイムノアッセイのいずれかの第２標識抗体からなる。Ｂ１５２のような抗体を用いる、競合イムノアッセイが高グリコシル化ゴナドトロピンを競合的に検出するためにまた使用され得る。コンカナバリンＡ又は他の炭水化物−特異的レクチンを用いる別の態様は捕獲抗体又は標識抗体の代りに使用できる。ある態様はイムノアッセイ前に炭水化物−変異体ｈＣＧを抽出するためにレクチン又はクロマトグラフィー方法を使用する。
炭水化物分析は下記の実施例に記載する正常及びダウン症候群ｈＣＧ母集団の間の物理的特性の相違の定性的観察を包含する。炭水化物同定は標準レクチンスクリーニング方法によって得られるダウン症候群の変異体炭水化物部分に対して特異的な植物レクチンを使用する。又は他のフィンガープリント技術が定量的又は定性的炭水化物組成物分析を包含する。ｈＣＧの炭水化物部分中の３のマンノース単位に結合する（図２）、固体担体に付着したコンカナバリンＡを用いる例が下記に説明する態様で使用されるが、高グリコシル化対正常ｈＣＧ種の特異的結合を示す任意のレクチンが本発明に包含される方法で使用できる。
一つの態様において、例えば、妊婦の胎児におけるダウン症候群の存在又は非存在は、女性からの尿、だえき、血漿又は血清テストサンプル、好ましくは血清又は尿を得る、テストサンプル中のｈＣＧの炭水化物含量を決定し、得られた炭水化物含量を正常ｈＣＧ母集団を含む対応する対照サンプルの炭水化物含量と比べ、そしてｈＣＧ母集団の炭水化物が対照サンプルと相違することを観察することによってダウン症候群の存在を決定することからなる方法で決定される。少なくとも１つの高グリコシル化種のレベルで少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、の観察増加が好ましい。
図３に記載されているものの如く、正常なｈＣＧサンプル中では全く観察されない異常型種の観察が特に好ましい。
本発明の方法の１つの態様ではダウン症候群の存在は、テストサンプル中の単糖類含量が対照サンプルに比べてたかめられることを観察することによって決定される。これは、下記に述べられる如く、溶離パターンの相違の観察又はＮ−アセチルグルコサミンの分析を含む。少なくとも約５０％の増加が典型的な分析で観察される。
別法として、サンプル中の絨毛膜ゴナドトロピン母集団の特性はｈＣＧのグリコシル化変異体を検出する電気泳動、等電点電気泳動テスト、クロマトグラフィー及びこれらの技術の組合せを用いることによって決定される。クロマトグラフィー法は下記記載するＢｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^▲Ｒ▼を用いる如き、疎水性相互作用又は他のリガンドクロマトグラフィーを使用するものを包含するが、グリコポリペプチド又はグリコペプチドの物理的特性を比べる任意の方法、例えば、溶離パターンが相違する単純な定性的な観察を採用し得る。これらは、しかし限定するものではないが、カラムクロマトグラフィー、被覆ビーズ、被覆テストチューブ又は板、示差結合、抽出液等、及びこれらの技術の組合せを包含する。本発明の利点はβ−コアフラグメントが分析される場合、マーカーは少量で且つ溶解することにある。
本発明の多くのスクリーニングで対照（コントロール）として使用される正常の絨毛膜ゴナドトロピン母集団は正常のカロタイプ胎児をもつ女性から得ることができ又はクローンでき、又は商業的に得ることができる。
ｈＣＧβ−コアフラグメントは、例えば、上記引用されたＢｉｒｋｅｎ，他、によって記載されているＯｒｇａｎｏｎ，Ｄｉｏｓｙｎｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｏｓｓ，Ｈｏｌｌａｎｄ）から得られるｈＣＧ調製剤から抽出することができる。
本発明のスクリーニング方法は単独で、又は他のスクリーニング方法と組合せて使用できる。他のスクリーニング方法は、限定するものではないが、非共役及び／又は共役エストリオール測定法、ｈＣＧ分析、β−コアフラグメント分析、遊離β−サブユニット又は遊離α−サブユニット分析、ＰＡＰＰ−Ａ又はＣＡ１２５分析、α−フェトプロテイン分析、インヒビン分析、血清中の胎児細胞の観察及び超音波を包含する。
本発明の利点は方法が上記記載のトリプルマーカーテストで現在使用されるｈＣＧ決定方法に取り替えることができ、それによってその感度及び信頼性を改善することである。上記の如く、トリプルマーカー又は他のテスト中の通常のｈＣＧ分析の代わりをするものとして本発明の方法を使用することにより、高グリコシル化ｈＣＧスクリーンが第１期（第１トリメスター）で使用できるので、ダウン症候群のより早い分析のさらなる利点を提供する。この高グリコシル化ｈＣＧスクリーンは妊娠の第１期（第１トリメスター）で使用できる。より早い診断によって、女性は最小のモニター又は出生ロスによって、非外科的方法によって妊娠をより早く決定する選択権をもつ。
実施例：
次に本発明の実施例を示すがこれはいかなる観点においても本発明を制限するものではない。
例１：
ダウン症候群と正常な妊娠β−コアフラグメントとの間の識別のために構造的な処理をした。β−コアフラグメントの試料を、３人が正常な核型をもち、３人がダウン症候群第２トリメスター妊娠の計６人の女性の尿から精製し、また２人の正常な核型の患者からの２つの試料を用いた。β−コアフラグメントを２容量のアセトンを用いて４℃で抽出した。このアセトン沈澱を集め、乾燥し、フォスフェートバッファーの生理食塩水（ＰＢＳ）に入れた。これらの試料をＰＢＳで洗浄したブルーデキストランセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、商標）のカラムに付与し、０．６ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ及び次いで１．０ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳで連続的に溶離した。溶離液中のβ−コアフラグメント濃度を測定した。３つのダウン症候群β−コアフラグメント試料のすべてを０．６ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳで上記ブルーデキストランカラムから溶離し、一方５つの正常な核型試料を次の段階で１．０ＭのＮａＣｌをを含有するＰＢＳで同じカラムから溶離した。これはダウン症候群β−コアフラグメントの物理的性質に差があることを示している。
２つの個々ダウン症候群β−コアフラグメント試料、即ち１の個別対照β−コアフラグメント試料とプールされた対象尿から精製した１つのβ−コアフラグメント試料、から得た精製フラグメントについてＮ−末端ペプチドシーケンス分析を行った。精製した試料はいずれも前記のＢｉｒｋｅｎ等が記載しているものと同じＮ−末端ペプチドシーケンスをもたらした。個別試料とプールした対象試料は、他の正常核型β−コアフラグメント試料のために前記のＢｌｉｔｈｅ等が記載しているものと同じ炭水化物組成（マンノース残基５、フコース残基０．５及びＮ−アセチルグルコサミン残基２）をもっていた。（図２Ｂの構造参照。Ｎ−アセチルグルコサミン含量は加水分解生成物、グルコサミンとして測定した。）しかし２個のダウン症候群試料は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基がかなり多いという幾分異なる組成を示した（即ちそれぞれ、マンノース残基３、フコース残基１及びＮ−アセチルグルコサミン残基３、及びマンノース残基３、フコース残基１及びＮ−アセチルグルコサミン残基３、図３Ｂの構造参照）。
図１に示すように、β−コアフラグメントはｈＣＧのβ−サブユニットから誘導される。異なるダウン症候群β−コアフラグメント上の炭水化物部分が追加のＮ−アセチルグルコサミン残基を含有している場合には、β−コアフラグメントが誘導されるｈＣＧのβ−サブユニットに異なる量のＮ−アセチルグルコサミンと同様に増加した量のシアリルアセトサミン触角（ｓｉａｌｙｌｌａｃｅｔｏｓａｍｉｎｅ ａｎｔｅｎｎａｅ）を、サブユニットの分解のしかたに応じて、含有している。ダウン症候群β−コアフラグメントの異常性炭水化物組成はブルーデキストランセファロースからの異常性のある溶出プロフィールを示す。
例２：
尿β−サブユニットのアガロース−結合したコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）への結合を調べた。Ｃｏｎ Ａは正常妊娠ｈＣＧにみられるようにバイアンテナリー型のＮ−結合したオリゴサッカライドでオリゴサッカライドとグリコプロテインに結合している。グリコプロテインは競争阻害剤のα−メチルマンノシドでＣｏｎ Ａから遊離しうる。トリアンテナリーオリゴサッカライド、たとえば過グリコシル化したｈＣＧ、をもつ分子はＣｏｎ Ａとゆるく結合する。それ故Ｃｏｎ Ａ結合をダウン症候群妊娠のスクリーンに用いた。
Ｃｏｎ Ａ−アガロース０．１５ｍｌを１．５ｍｌの円錐形遠心チューブに入れ、０．５ｍｌの尿を加えさらに０．５ｍｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．３バッファを加えた。チューブを１５分間ゆすり、次いで５００ｘｇで回転させゲルを沈降させた。結合していない尿−ＰＢＳを除いた。次いでゲルを１ｍｌ ＢＰＳで洗浄した。洗浄によりゆるやかに結合していたタンパクが分離した。チューブを再びゆすり、回転させ、洗浄を終えた。次にＣｏｎ Ａを０．０５Ｍのα−メチルマンノシドを含有する１ｍｌのＰＢＳで特別に溶離した。再度チューブをゆすり、回転させ溶離液を除いた。次いで免疫検定法により洗液と溶離液の遊離のサブユニットを調べた。
尿のないβ−サブユニットの大部分が結合しており、α−メチルマンノシドで溶離しうるだけだが、少量のしかし異なる成分がゆるやかに結合しておりＰＢＳ洗液に抽出した。フリーのβ−サブユニット（＞０．５ｎｇ／ｍｌ）が１０９（１７％）の対象試料洗液の１８個及び１５（６０％）のダウン症候群試料洗液の９個中に検出された。より高い濃度のフリーのβ−サブユニット（＞１７ｎｇ／ｍｌ）が１０９（８％）の対象試料洗液の９個及び１５（４７％）のダウン症候群試料洗液の７個にみられた。異なる妊娠年齢での対象試料についてメディアン（中央値）を求めた。すべてのメディアンが０（＜０．５ｎｇ／ｍｌ）だったのでフリーのβ−サブユニットと妊娠年齢間に相関のないことが判った。ＲＯＣ分析を用いてカットオフ濃度と独立の測定法の有効性をしらべた。ＲＯＣ曲線の下の領域は０．６８であり、試料間の識別率６８％を示した。洗液ともとの尿試料中のフリーのβ−サブユニット濃度の間の関係をしらべた。相関がないことが観察され（ｒ²＜０．５）、それらが独立の変数であることを示している。結果は、ダウン症候群妊娠における非Ｃｏｎ Ａ結合分子、又はオリゴサッカライド変異分子の割合が高いことを示している。
β−コアフラグメントはＮ−アセチルグルコサミン残基２．０及びフコース残基０．５をマンノース残基３．０用にもつ分解したＮ−結合したオリゴサッカライドをもつ（Ｂｌｉｔｈｅ，Ｄ．Ｌ．等Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２５：２２６７−２２７２（１９８９）及びＥｎｄｏ，Ｔ．等Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０：２０５２−２０５８（１９９２））。アセトン及びエタノール抽出及びゲル濾過、ブルーセパロース及びＤＥＡＥ−セパロースクロマトグラフィー、の組合せを用いてβ−コアフラグメントを２つの第２トリメスターダウン症候群尿と２つの対象調合物から精製した。Ｎ−末端ペプチドシーケンス分析（１５ラウンド）を行った。対象試料はマンノース残基３．０に対しＮ−アセチルグルコサミン残基２．１及び２．０、及びフコース残基０．６及び０．５を含有しており上記のＢｌｉｔｈｅ等及びＥｎｄｏ等が示した組成と一致した。ダウン症候群試料はマンノース残基３．０に対し異なる組成、Ｎ−アセチルグルコサミン残基３．５及び３．２、及びフコース残基０．８及び１．４をもっていた。これはダウン症候群からのβ−コアフラグメント上のオリゴサッカライド構造がより複雑であることを示している。
例３：
この例はダウン症候群妊娠用の免疫検定法を示す。
個々の正常妊娠（６人の女性）、嚢腫型奇胎（３人の女性）及びじゅう毛癌（４人の女性）からのｈＣＧ組成物を前記（Ｋａｒｄａｎａ，Ａ．等Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：１５４１−１５５０（１９９１））したように妊婦の尿から分離し、精製した。簡単にのべると、ｈＣＧをアセトンにより尿から抽出し、次いでエタノールで沈澱させ、セファクリルＳ−２００によるサイズ除去クロマトグラフィー及びＤＥＡＥ−セファロースを用いるイオン交換クロマトグラフィー及びさらに高分解性セファクリルＳ−２００によるサイズ除去クロマトグラフィーを行った。クロマトグラフィーによる操作中すべてのｈＣＧフラクションを回収するように注意した。
種々のｈＣＧ形のペプチドシーケンスとＮ−及びＯ−結合したオリゴサッカライド構造を前記（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｍ．等Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊ．，ｖｏｌ．７，１９９７及びＣｏｌｅ，Ｌ．Ａ．，Ｂｉｒｋｅｎ，Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２：８２５−８３０（１９８８））のようにして求めた。高グリコシル化したＮ−及びＯ−結合したオリゴサッカライド（ｈＣＧバッチＣ５）をもつ非ニックｈＣＧ、インタクトｈＣＧ、フリーβ−サブユニット、β−コアフラグメント及びじゅう毛癌ｈＣＧに対するモノクローナル抗体を上記のｈＣＧ組成物を用いて標準法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，等Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２編，１９９２，ユニット１１）に従ってつくった。簡単に述べると、マウスをｈＣＧ試料で免疫化し、約３週間第２感作を与え、そしてそれらの脾臓をそれらの血液抗体濃度が試料に対し正しい応答を示した後にとった。その細胞を骨髄腫と共に融合しそしてハイブリドーマセルラインを得た。妊娠尿の分析用のそれらのモノクロナールの使用は１９９６年１０月３〜６日の早期妊娠に関する第３回世界会議でアブストラクト番号６６で報告された。
これらのモノクロナールを例２のＣｏｎ Ａレクチン法を用いて分析した尿試料のスクリーンに用いた。高グリコシル化したｈＣＧ分子（ｈＣＧバッチＣ５）に対する１のモノクロナールをＢ１５２として示した。これは正常ｈＣＧの＜１％であり、レクチン法で陽性とされた試料の６０％であった。
次いでＢ１５２モノクロナールを正常な胎児をもつ１３０人の妊婦及びダウン症の胎児をもつ９人の妊婦から得た１３９の尿試料をスクリーンするのに用いた。キャプチャー抗体としてＢ１５２を用い、トレーサーとしてｈＣＧβ、バッチ４００１に対するパーオキシターゼで標識したモノクロナール抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ、カリフォルニア州サンカーロス）を用いて前記した免疫検定法（前記のＥｌｌｉｏｔ，等、及びＣｏｌｅ，Ｌ．，等Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，Ｍｅｔａｂ．７６：７０４−７１０（１９９３））を用いる２段サンドイッチ免疫検定法でしらべた。純粋な高グリコシル化したゴナドトロピン（上記したＣｏｌｅ，等，１９８８紙に記載されているバッチＣ７）をこの分析法を標準化するために用いた。正規のｈＣＧ（ｈＣＧダイマーのすべての形）の濃度を標準としてＮｌＨＣＲ１２７ ｈＣＧを用いる２段サンドイッチ法で求めた。正規ｈＣＧと高グリコシル化したゴナドトロピン濃度値を例１に記載したようにクレアチニン濃度に標準化した。
妊娠の１１〜１９週間に集めた試料からのデータを図４のグラフに示す。ここで●印は正常試料値を示しそして○印はダウン症候群の値を示す。標準統計法を用いて結果を分析した。１３０の対象試料用の妊娠年齢特異的メディアンはすべて、影響のない妊娠とダウン症候群データ（影響のない試料のメディアン、ＭｏＭの倍数で示す）の両方にとって、第５センチルと第９５センチルの間で対数ガウス分布に合致した。スクリーン精度を評価するため、メディアン（中央値）と対数標準偏差（２．５６で割ったｌｏｇ ＭｏＭ値の第１０センチルから第９０センチルの差によって推測）を求め、得た検知率（即ちダウン症候群ケースと影響のない妊娠の第９５センチルをこえるレベルとの比）を記録した。メディアンライン用の式はｙ＝３９０（０．８２６^x）であり、ここでｙはメディアンでありｘは妊娠年齢である。対象試料の対数メディアンは−０．００７であり、対数標準偏差は０．４５である。９つのダウン症候群ケースはいずれも影響のない妊娠の第７０センチルをこえた。ダウン症候群のメディアン高グリコシル化ゴナドトロピン濃度は影響のないメディアン（対数メディアン＝０．０６５）の４．４倍だった。３つの第１トリメスターケースのうちの２つと６つの第２トリメスターケースのうちの４つを含む。９のダウン症候群試料のうちの６つ（６７％）は第９５センチルをこえており、９の試料のうちの３つ（３３％）は影響のない妊娠の第１００センチルをこえていた。
正規ｈＣＧ濃度を求めた。高グリコシル化ゴナドトロピンは正常妊娠において正規ｈＣＧ分子の３．７％を示し（それぞれ平均２９ｎｇ／ｍｇ及び７８１ｎｇ／ｍｇクレアチニン）、そしてダウン症候群妊婦試料において正規ｈＣＧ分子の１１％を示した（それぞれ平均１９３ｎｇ／ｍｇ及び１６９０ｎｇ／ｍｇ）。
結果はモノクロナールＢ１５２がｈＣＧ炭化水素変異を認識しており、本発明の方法における高グリコシル化ｈＣＧ用の免疫検知法に用いうることを示している。
上記の気合は本発明方法をどのように実施するかを当業者に教示する目的でなされており、そこから当業者が理解できることまで詳細に記載することは意図していない。しかし、それらの自明の態様や変形はすべて次の請求の範囲に定めた本発明の範囲に含まれる。前記した文献及び特許はそれらの全体が参考としてここに含まれる。

Claims (18)

1. 妊婦の胎児のダウン症候群の存否をスクリーニングする方法において、妊婦からの生化学試験試料を得、そして試料中の高グリコシル化ゴナドトロピンを観察してダウン症候群の存在を決定することを特徴とする上記方法。
2. 試験試料が尿、血漿又は血清から選ばれる請求項１記載の方法。
3. 試料が妊婦の第１又は第２トリメスター間に得られる請求項１記載の方法。
4. 高グリコシル化ゴナドトロピンの観察がダウン症候群に観察される異常型の炭水化物部分をもつじゅう毛性ゴナドトロピン個体群の少なくとも１の種に対する抗体を用いてなされる請求項１、２又は３記載の方法。
5. 高グリコシル化ゴナドトロピンの炭水化物部分に対して特異的なレクチンが免疫検定法前にじゅう毛性ゴナドトロピンの種を分離するために用いられる請求項４記載の方法。
6. 高グリコシル化ゴナドトロピンの観察がダウン症候群じゅう毛性ゴナドトロピンの炭水化物部分に特異的なレクチンを用いてなされる請求項１記載の方法。
7. 高グリコシル化ゴナドトロピンの観察が試験中のモノサッカライドの分析からなる請求項１記載の方法。
8. レクチンがコンカナバリンＡからなる請求項５、６又は７記載の方法。
9. 試験試料中のじゅう毛性ゴナドトロピン固体群の物理的性質を正常なじゅう毛性ゴナドトロピン個体群を含有する対応する試料と比較することからなる請求項１、２又は３記載の方法。
10. 比較がクロマトグラフィー、電気泳動法、等電点電気泳動法及びそれらの組合せからなる群から選ばれる方法を用いて行われる請求項９記載の方法。
11. 妊婦の胎児のダウン症候群の存否をスクリーニングする方法において、（ａ）妊婦から唾液、尿、血漿及び血清からなる群から選ばれる生化学試験試料を得、（ｂ）該試験試料中の高グリコシル化ゴナドトロピンを炭水化物分析、免疫検定及びそれらの組合せからなる群から選ばれる方法で分析し、そして（ｃ）試料中の高グリコシル化ゴナドトロピンを観察してダウン症候群の存在を決定することを特徴とする上記方法。
12. 該試料が尿又は血清であり、そして高グリコシル化ゴナドトロピンが高グリコシル化ｈＣＧ及びβ−コアフラグメントからなる請求項１１記載の方法。
13. 試料が第１トリメスター中に得られる請求項１１記載の方法。
14. 試料が第２トリメスター中に得られる請求項１１載の方法。
15. ダウン症候群に観察される異常型の炭水化物部分をもつ個体群の少なくとも１の種に対する抗体を用いる請求項１１、１２、１３又は１４記載の方法。
16. ＥＬＩＳＡからなる請求項１５記載の方法。
17. 分析がダウン症候群に観察される異常型の炭水化物部分に特異的なレクチンを用いる請求項１１、１２、１３又は１４記載の方法。
18. 炭水化物分析がクロマトグラフィー、電気泳動法、等電点電気泳動法、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる請求項１１、１２、１３又は１４記載の方法。

Images