JP3949198B2

JP3949198B2 - V-ATPase uncoupled H + pump inhibitor

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Publication number: JP3949198B2
Application number: JP29935996A
Authority: JP
Inventors: 肇平田; 芳則森山; 直之高橋; 慎一中辻; 良成池上; 嘉人横山; 敬子川内
Original assignee: Ako Kasei Co Ltd
Current assignee: Ako Kasei Co Ltd
Priority date: 1996-10-23
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 2007-07-25
Anticipated expiration: 2016-10-23
Also published as: JPH10120562A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｖ- ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ阻害剤に関する。本発明のＶ- ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ阻害剤は、細胞内のオルガネラに存在するＶ−ＡＴＰase (vacuolar ＡＴＰase 、液胞型 H⁺- ＡＴＰase ともいう) の活性を阻害せず、 H⁺（プロトン）ポンプ活性のみを阻害し、その活性によって生ずる骨粗鬆症その他各種の疾病を治療乃至予防することができる。
【０００２】
【従来の技術】
シナプス小胞、ゴルジ体、液胞、リソソームなどの細胞内膜系(central vacuolar system) に属するオルガネラには、一群のプロトンを輸送するＡＴＰase が存在している。このＡＴＰase は、その存在する場所にちなんで、Ｖ−ＡＴＰase (vacuolar ＡＴＰase 、液胞型ＡＴＰase)と称せられている。Ｖ−ＡＴＰase はミトコンドリアなどに存在するＡＴＰ合成酵素であるＦ−ＡＴＰase や、胃粘膜に存在し胃液の酸性化をつかさどっているＰ−ＡＴＰase とは、構造的にも、また各種薬剤に対する感受性の面でも異なった酵素である。
Ｖ−ＡＴＰase の機能は、ＡＴＰの加水分解と共役して H⁺をオルガネラ内部に輸送し、内外に H⁺の電気化学的ポテンシャル差を形成すること、あるいは内部のpHを酸性にすることである。形成された H⁺の電気化学的ポテンシャル差や酸性pHがそれぞれのオルガネラに固有な機能と密接に結びついている。リソソームにおける異物の分解やシナプス小胞内への神経伝達物質の濃縮などが例としてあげられる。また、受容体のリサイクリングや蛋白質のソーティングにも関与しているといわれている。Bowmanらはマクロライド系抗生物質の一種バフィロマインが、Ｖ−ＡＴＰase の強力な阻害剤であることを見出した(Proc. Natl. Acad.Sci. USA.,85, 7972-7976(1988))。
【０００３】
そしてバイフィロマイシンがマクロファージからの酸分泌を阻害することが見出され、原形質膜に存在するＶ−ＡＴＰase が細胞内外のpHを調節していることが示された(J.Biol.Chem.,265, 7645-7654(1990)) 。さらにＶ−ＡＴＰase が破骨細胞からの酸分泌に関係していることも確認された (J. Cell Biol.,111,1305-1311(1990))。すなわち、Ｖ−ＡＴＰase は、顆粒内部を酸性にするだけではなく、原形質膜にも存在し、 H⁺を細胞外に放出し細胞外に局所的に酸性の場を作り出している。特に、Ｖ−ＡＴＰase は破骨細胞の波状縁(ruffled border)と呼ばれる原形質膜に存在し、骨の吸収部位であるハウシップ窩に H⁺を放出し、その部位のpHをおよそ4 にしており、その酸性pHがCa²⁺を骨組織から遊離させやすくし、かつプロテアーゼを活性化してコラーゲンの分解を促進している。
【０００４】
また、バフィロマイシンなどのＶ−ＡＴＰase 阻害剤がコレステロールエステルの蓄積を阻害していることが報告されており(Eur.J.Biochem., 207, 383-389(1992))、Ｖ−ＡＴＰase による酸性オルガネラの酸性化阻害活性をもつ物質を動脈硬化の治療あるいは予防する医薬として利用することが期待されている。
また、癌細胞が同時に複数の制癌剤に耐性になる現象が知られている。これは、癌細胞の原形質膜にＰ糖蛋白質(multidrug resistant factor MDR)とよばれる薬剤排出ポンプが存在し、この薬剤排出機構にＶ−ＡＴＰase が関与しているためであると考えられている(Biochem. Pharmacol.36, 2879-2887(1988))。すなわち、Ｐ糖蛋白質の基質となる抗癌剤のダウノマイシンは、薬剤耐酸性株細胞のリソソームと思われる酸性オルガネラに濃縮され、バフィロマイシンの添加によって、ダウノマイシンが細胞外に排出されにくくなり、同様にダウノマイシンに対する細胞の感受性が増加する(J.Natl, Cancer Inst, 83, 1098-1102(1991))。従って、このことからみて、Ｖ−ＡＴＰase 阻害剤による酸性化オルガネラの酸性化阻害活性は、制癌剤増強作用を有し、医薬としての利用が期待されている。
さらに、ジフテリア毒素は、エンドゾーム内でプロテアーゼによって切断されて活性型となり、細胞質内に侵入し毒性を示すと考えられている。Ｖ−ＡＴＰase 阻害活性のあるバフィロマイシンを培養細胞に添加するとエンドサイトーシスに関与する細胞内膜系のタンパク分解が効率的に阻害され、断片化が生じ、その結果としてジフテリア毒素の毒性が発現しなくなった (J. Biol. Chem. 265, 21940-21945(1990))。また、水泡性口内炎ウィルスやインフルエンザウィルスなどのウィルスは動物細胞表面の受容体に結合した後、エンドソームとして細胞内に侵入することが知られており、この過程にV-ATPaseが関与していることが明らかとなっている (Ｊ.Gen. Virol.75, 2595-2606(1994); J.Virol. 70, 576-579(1996) ）。従って、V-ATPase阻害剤は効果的な抗ウィルス剤として利用することが考えられる。
また、マラリアはマラリア原虫の感染によって引き起こされる疾患であるが、マラリア原虫の宿主肝細胞や赤血球への侵入と増殖の過程に細胞内酸性化が関わっていることが最近明らかにされつつある。さらにマラリア原虫の細胞膜にもV-ATPaseが存在し、感染時にこの活性が関与する可能性も指摘されている。これらのことは適切なV-ATPaseの阻害剤の利用によりマラリア感染を防御することが可能であろう。
シナプス小胞は、神経末端に数多く存在する直径が50nm程度の微小なオルガネラであり、神経の化学伝達に重要である。すなわち、小胞内部に含まれている高濃度の神経伝達物質が、刺激によりシナプス間隙に放出される。Ｖ−ＡＴＰase はシナプス小胞の全タンパク質のうちおよそ10％以上を占めており、内部に H⁺を輸送している(J.Exp.Biol.172,92-99(1992))。形成された H⁺の電気化学的ポテンシャル差が小胞膜に存在する伝達物質の輸送（モノアミン輸送、グルタミン酸輸送、γ−アミノ酪酸、アセチルコリン輸送）を駆動する(Biochem.Biophys.Res.Commun.173,443-448(1991))。Ｖ−ＡＴＰase を阻害すると輸送系も阻害される（同上誌）。従って、Ｖ−ＡＴＰase の H⁺ポンプを阻害することは、鎮静剤として期待できるであろう。
【０００５】
本発明者らは、バフィロマイシンのような新規なＶ−ＡＴＰase 阻害作用をもつ物質を開発するために種々の化合物を用いてＶ−ＡＴＰase 阻害効果を検討したところ、海洋細菌の１種のシュードアルテロモナス・デニトリフィカンス（Pseudoalteromonas denitrificans) AK-1株(FERM P-15771)の産生する赤色物質シクロプロジギオシン塩酸塩が、Ｖ−ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ阻害活性を有することを見出した。そしてこの化合物をＶ−ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ阻害剤の有効成分として用いることについて検討した。また、この化合物から塩化水素をはずした遊離のシクロプロジギオシンについても同様の作用があることを見出した。
従って、本発明は、シクロプロジギオシンあるいは塩類のこのようなＶ−ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ阻害活性を利用して骨粗鬆症治療薬、動脈硬化治療薬、抗生物質、制癌剤増強剤、鎮静剤等の薬剤あるいはオルガネラを中性に誘導する試薬とすることに係るものである。
従来、シクロプロジギオシンが抗菌活性や抗真菌活性を持つことは知られているが（Tetrahedron Letters 30 (13) 1725 (1989))、シクロプロジギオシン及びその塩酸塩の前記したような阻害活性に関しては、全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のことからみて、本発明の課題は、新規なＶ−ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ阻害剤を提供することにある。
さらに、本発明の課題は、シクロプロジギオシン及びその塩類の新規用途を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記の課題を解決するためになされたものであって、シクロプロジギオシン (式I)あるいはシクロプロジギオシン塩酸塩 (式II) その他の塩を有効成分として含有するＶ−ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ阻害剤に関する。
【０００８】
【化１】

【０００９】
【化２】

【００１０】
このような化合物としては、シクロプロジギオシンあるいはシクロプロジギオシン塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、カルボン酸塩 (例えば、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩等) 、ヨウ素酸塩、臭素酸塩、ピクリン酸塩、スルホン酸塩、テトラフルオロボレート塩等を例示することができる。
【００１１】
シクロプロジギオシンは、海洋細菌のアルテロモナスルブラ、(Alteromonas rubra)(Tetrahedron Letters 24 (26),2701-2704(1983))あるいはベネッケアガゾゲネス(Benekea gazogenes) (同上誌 24(27),2797-2798(1983)) から産生される赤い色素であり、また 2- メチルシクロヘキサノンを出発物質として次の工程を経て合成する方法も知られている(Tetrahedron Letters 25,(13) 1387-1388(1984))。
【００１２】
【化３】

【００１３】
シクロプロジギオシン塩酸塩等の前記化合物は、このようにして得られたシクロプロジギオシンを塩の形に変換することによって得ることができる。塩とする手段は、通常の塩形成手段を用いることができる。
しかし、これらの海洋細菌から得られるシクロプロジギオシンは、数種のプロジギオシン類を爽雑物の形で産生しているので、抽出物のなかからシクロプロジギオシン単体を単離するには煩雑な単離操作を必要とした。
また、前記化学合成によってシクロプロジギオシンを製造する方法は多工程にわたる複雑な工程を必要としていた。
【００１４】
本発明者らは、海洋細菌の代謝産物について検討を行なっていたところ、シュードアルテロモナスデニトリフィカンス(Pseudoalteromonas denitrificans) AK-1 株(FERM P-15771)がシクロプロジギオシン塩酸塩を、他のプロジギオシン類の爽雑物を含むことなく産生することを見出した。従って、前記菌体を培養するとシクロプロジギオシン塩酸塩が菌体内及び培地中に大量に生成蓄積されるので、これを高純度で大量に作ることができる。このシクロプロジギオシン塩酸塩は、カラムクロマトグラフィー処理することによって容易に塩化水素をはずし塩酸塩のない遊離のシクロプロジギオシンを得ることができる。そして、この遊離シクロプロジギオシン (シクロプロジギオシン塩酸塩から塩化水素をはずした式(I) で示される化合物をいう) をリン酸、硫酸等の酸で処理することによって前記した塩類とすることができる。
本発明で使用するシクロプロジギオシン塩酸塩その他の塩は、水に可溶性であり、蒸留水等に溶解して使用することができる。従って、注射剤、ドリンク剤等としても用いることができる。
【００１５】
本発明は、シクロプロジギオシンあるいはシクロプロジギオシン塩酸塩その他の塩がＶ−ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ阻害活性を有するということを見出し、この知見に基づいてなされたものである。
【００１６】
本発明によるシクロプロジギオシンあるいはその塩類がＶ−ＡＴＰase 脱共役
H⁺ポンプ阻害作用を有することは次の実験によって確認された。
〔実験１〕
神経成長因子（ＮＧＦ）により分化誘導をしているまたはしていないＰＣ12細胞（ラット副腎髄質細胞）を10％ＨＳ５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で培養を行なった。この細胞にシクロプロジギオシン塩酸塩を50nM添加し１時間培養を行なった。そして細胞の顆粒内のpHの変化をアクリジンオレンジの蓄積を指標にして蛍光顕微鏡（図１及び２）及び位相差顕微鏡（図３及び４）で観察した。その結果を図１〜４に示した。すなわち、まずＰＣ12細胞をＮＧＦにより分化誘導を行なった細胞の状態が図１及び３に示されている。また、分化誘導していない細胞の状態が図２及び４に示されている。そして前記シクロプロジギオシン塩酸塩で処理した細胞の状態がＢ及びＤとして示されている。Ａ及びＣはシクロプロジギオシン塩酸塩処理しない対照である。
対照においては、矢印で示すように、分化して形成された神経末端様の突起がアクリジンオレンジで染まっている。これは酸性小胞であるシナプス小胞と判断される。さらに、細胞の核周辺には比較的大きなリソソームと思われる顆粒が染まっている。これに対し、前記シクロプロジギオシン塩酸塩で処理すると突起部分のアクリジンオレンジの染色がなくなっており、この部分の酸性環境がなくなっていることを示しいる。
【００１７】
一方、リソソームは、シクロプロジギオシン塩酸塩のこの濃度ではあまり影響を受けないが、リソソーム内のアクリジンオレンジの染色もシクロプロジギオシン塩酸塩１μM の濃度にすることによって完全に消失した。
このことからシクロプロジギオシン塩酸塩により、酸性オルガネラであるシナプス小胞内部が中性化され、またリソソーム内部も１μM で中性化されることが判明した。
【００１８】
〔実験２〕
(1) シクロプロジギオシン塩酸塩を図５に示した濃度で用い、リン脂質平面膜法(1992 年７月10日 (株) 東京化学同人発行、 (財) 日本生化学会編新生化学実験講座「生体膜と膜輸送（上）」第181-187 頁) の張合わせ法によりリン脂質単分子膜を張り合わせ、その膜に一定の電圧を負荷し、電流を測定することで比抵抗値を求めた。この比抵抗値が大きくなることは、膜に直接的な傷害を与えることを示す。
また対照として、カルボニルシアニド-P- トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾンを用いた。その結果を図５に示した。図５にみられるように、カルボニルシアニド-P- トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾンはその濃度の増加に伴なっていちじるしく比抵抗が増加するのに対し、シクロプロジギオシン塩酸塩は比抵抗が増加せず、膜に直接的な傷害を与えることが非常に少ない。また、このことは、シクロプロジギオシン塩酸塩は、イオノフォア活性を示さず、毒性がきわめて低いことを示唆している。
【００１９】
(2) ウシ副腎から髄質部分を単離し、ワーリングブレンダーで破砕し、破砕液を４層のガーゼで濾過し、濾液を遠心分画及びショ糖密度勾配遠心によりクロマフィン顆粒画分を調製した。得られたクロマフィン顆粒画分を低張処理し、遠心分画によってクロマフィン顆粒膜画分を得た。
【００２０】
このようにして得られたクロマフィン顆粒膜のＶ−ＡＴＰase を図６に示される濃度のシクロプロジギオシン塩酸塩で10分間刺激し、アクリジンオレンジの蓄積を指標としてプロトンポンプ活性を測定した。一方、ＡＴＰase 活性をＡＴＰから遊離される無機リンの量を定量することによって行なった。
この結果を図６に示す。図６に示されるようにプロトンポンプ輸送活性は、シクロプロジギオシン塩酸塩10nMで完全に阻害される。これに対し、Ｖ−ＡＴＰase 活性はシクロプロジギオシン塩酸塩を1000倍量用いても全く阻害されなかった。
【００２１】
さらに、シクロプロジギオシン塩酸塩の上記Ｖ−ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ活性阻害作用に基づく破骨細胞の骨吸収活性に対する効果を調べた。
すなわち、1994年11月10日共立出版 (株) 発行大野忠夫編著、「動物実験代替法マニュアル培養細胞を用いた理論と応用」第 102頁象牙質切片を用いた破骨細胞の骨吸収能の測定法(J. Bona Miner. Ris., 8, 953-960(1993)) に従ってシクロプロジギオシン塩酸塩の破骨細胞の形成能に対する影響を調べた。
【００２２】
すなわち、マウスの骨髄細胞と骨芽細胞をコラーゲンゲル上で活性型ビタミンＤ₃10^-8M の存在下で共存培養した。培養６日目に培養プレートをコラケナーゼで処理し、形成された破骨細胞画分を回収した。破骨細胞画分を象牙切片( 直径:4mm) にまき、シクロプロジギオシン塩酸塩(0.1〜100nM)(n＝4)の溶液の存在下で８〜24時間培養した。培養終了後、切片上の細胞を除き、破骨細胞で形成された吸収窩をマイヤーのヘマトキシリン染色液で染色した。破骨細胞が形成する吸収窩は赤染色に染色される。従って、この吸収窩の面積を測定し、シクロプロジギオシン塩酸塩で処理していないものの面積を 100とし、破骨細胞の吸収窩面積比を求めた。その結果を表１に示した。
【００２３】
【表１】

【００２４】
表に示されるようにシクロプロジギオシン塩酸塩は 100nMにおいて破骨細胞の吸収窩形成能を強力に抑制した。従って、このシクロプロジギオシン塩酸塩は破骨細胞の骨吸収機能を強力に抑制するので、この活性を利用して骨粗鬆症治療薬とすることができる。
【００２５】
このように、シクロプロジギオシン塩酸塩は (1)のリン脂質平面膜法でイオノフォア活性がなく、(2) のクロマフィン顆粒膜による実験でＶ−ＡＴＰase の脱共役 H⁺ポンプ活性のみを特異的に阻害する。このような性質はバフィロマイシン等の従来のＶ−ＡＴＰase 活性阻害剤には認められず、シクロプロジギオシンの作用は従来のＶ−ＡＴＰase 阻害剤とは全く異なる作用様式によるものと考えられる。
本発明におけるシクロプロジギオシン塩酸塩は、Ｖ−ＡＴＰase 活性を阻害することなく、Ｖ−ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ活性を特異的に阻害する。従って、この活性阻害作用に基づいて次の用途に用いることが挙げられる。
【００２６】
(1) 酸性化オルガネラが関与する現象の解析に用いる試薬
酸性化オルガネラにおいて、実験１に示すようにオルガネラにより中性化の有効濃度が異なることより、各小器官における中性化を誘導することができ、それに伴う現象を解析する試薬として用いることができる。
【００２７】
(2) 骨粗鬆症治療薬
加齢にともなって、血清カルシウムの濃度は変化を受けず一定に保たれるが、カルシウム代謝ホルモンの分泌は、大きく変わってくる。副甲状腺ホルモンは、破骨細胞の動員により骨からの細胞外液にカルシウムの動員を促す働きをしているが、このホルモンの血中濃度は上昇し、その拮抗ホルモンであるカルシトニンは、破骨細胞の作用を抑制して、カルシウム動員を減少させるホルモンは、逆に低下する。また活性型ビタミンＤの血中濃度も低下するといわれている。これらホルモンの変化は、骨からカルシウムを遊離させ、そのカルシウムが血清カルシウム濃度を一定に保つとともに、血管内壁に沈着し、動脈硬化の引き金になるといわれている。
従って、酸性pHを中性化することにより、Ca²⁺の遊離を抑制することで、骨粗鬆症治療薬としての作用が期待される。
【００２８】
(3) 動脈硬化阻害剤
また、Ｖ−ＡＴＰase 阻害剤がコレステロールエステルの蓄積を阻害することが報告されていることから、動脈硬化阻害剤としての作用も期待される。
(4) 制癌剤効果増強剤
ガン細胞が、複数の制癌剤に耐性になる現象が知られているが、これは原形質膜にＰ糖蛋白質とよばれる薬剤排出ポンプが存在しているためである。こうした薬剤排出機構にＶ−ＡＴＰase が関与している可能性が指摘されているが、Ｖ−ＡＴＰase 阻害剤として知られているバフィロマイシンの添加によりＰ糖蛋白質の基質となる抗癌剤のダウノマイシンが細胞外へ排出されにくくなり、同時にダウノマイシンに対する感受性が増加するという報告がある。
すなわち、Ｖ−ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ阻害剤であるシクロプロジギオシン塩酸塩も、薬剤排出を阻害し、制癌剤増強効果が期待できる。
【００２９】
(5) 抗生物質
ジフテリア毒素の毒性発現過程やウィルスの動物細胞感染過程にはエンドソームのV-ATPaseを介するエンドソーム内の酸性化が関与していることが明らかとなっている。従って、V-ATPase脱共役 H⁺ポンプ阻害剤であるシクロプロジギオシン塩酸塩も、新しい阻害効果のある抗ウィルス剤として期待できる。また、マラリア感染にV-ATPaseが関与する可能性が示されていることから、シクロプロジギオシン塩酸塩は有効な抗マラリア剤としても期待できる。
(6) 鎮静剤
Ｈ⁺ポンプを阻害することにより神経伝達物質の輸送系が阻害される。従って、シクロプロジギオシン塩酸塩もこの輸送系を阻害することにより、鎮静剤として期待できる。
【００３０】
本発明でこれらの医薬として用いるときは、これらを単独で用いてもよいし他の医薬と併用してもよい。特に、骨粗鬆症治療薬として用いるときは、カルシトニン、ビタミンＤあるいは無機カルシウム塩と併用するとよい。また、制癌剤増強剤として用いるとき、制癌剤と併用してもよい。さらに、試薬として用いるときは、アクリジンオレンジなどを併用してキットの形にすることもできる。
【００３１】
これらを医薬として用いるときは、シクロプロジギオシン、シクロプロジギオシン塩酸塩あるいはその他の塩は、これをそのままあるいは他の薬剤と併用して用いることができる。通常は、賦形剤、その他の補助剤とともに適当な製剤の形にして経口あるいは非経口の形で投与される。経口剤としては、粉剤、顆粒剤、錠剤、糖衣剤、丸剤、カプセル剤、ドリンク剤等がある。また、非経口製剤には、坐剤、パップ剤、注射剤等がある。注射剤は、筋肉注射、動脈注射あるいは静脈注射の形の剤型とするとよい。
これらの賦形剤その他の補助剤としては、乳糖、しょ糖、各種のでん粉、ぶどう糖、セルロースあるいはその誘導体、ステアリン酸マグネシウム、タルク等が用いられる。また、蒸留水等の溶媒を用いることができる。これらは、製剤手段として通常知られている手段で経口あるいは非経口の製剤にすることができる。
投与量は、症状、年齢、性別等によって相違するが、経口投与の場合は、シクロプロジギオシンあるいはその塩酸塩その他の塩を１日当り 0.1〜0.5/体重kg、非経口投与の場合は、注射剤で１日当り 0.1〜0.5mg/体重kgを投与することが望ましい。
【００３２】
これらの化合物の毒性については、シクロプロジギオシン塩酸塩をＩＣＲ雌性マウス（５週令、体重25〜29g)の腹腔内に投与したところ LD₅₀値は10mg以上であった。
また、シクロプロジギオシン塩酸塩を前記のようにリン脂質平面膜法で比抵抗を測定したところイオノフォア活性が認められなかったことからみて、毒性がきわめて低いものと判断される。
【００３３】
本発明のシクロプロジギオシン塩酸塩の製造例を示す。
バクトペプトン(Difco)2.5g 、バクトイーストエクストラクト(Difco)0.5g 及びリン酸鉄(III)n水和物（和光純薬)0.1g を天然海水1L中に溶解した後、滅菌し、その 3ml中に、シュードアルテロモナス・デニトリフィカンス(Pseudoalteromonas denitrificans) AK-1株 (FERM P-15771) を、接種し、15〜20℃で１日間振盪培養を行なった。得られた培養物を上記組成の培地 600mlに移し、１日間培養を行なった。
【００３４】
このようにして培養された培地を22,000 rpmで20分間遠心分離し、菌体を回収した。菌体は５〜10g が回収された。この菌体にアセトン- ジエチルエーテル(4:1) 混液を加え200 振盪/minで色素 (シクロプロジギオシン塩酸塩) を抽出した。抽出液を12,000 rpmで10分間遠心分離して上清液を得た。この上清液に無水硫酸マグネシウムを加えて水分を吸着除去し、この硫酸マグネシウムを濾過して除去した。濾液を乾固するまで濃縮し、これを薄層クロマトグラフィーによって分析した(Kieselgel 60 F₂₅₄; 展開溶媒ベンゼン: エーテル＝1:1)。Rf 0.20 に単一のスポットが得られた。この濃縮物を塩化メチレン5ml に溶解し、この溶液から温度差を利用して再結晶した。生成した結晶をペンタンで洗浄し、吸引濾過して結晶 5mgを採取した。
この結晶は、赤色の金属光沢をもった針状結晶であって、融点はなく、約 230℃で分解した。この結晶を、元素分析し、またその Mass スペクトル、UVスペクトル、IRスペクトル、 H-NMRスペクトルを解析したところ、シクロプロジギオシン塩酸塩（化II) のそれと一致し（Tetrahedron Letters, 24 (26), 2701-2704(1983)) 、同化合物であることが同定された。
【００３５】
このようにして得られたシクロプロジギオシン塩酸塩 5mgを塩化メチレン10mlに溶解し、シリカゲルカラム (口径 1.5cm，長さ12cm, 流速1.2ml/min)を通過させ、溶媒を留去して遊離シクロプロジギオシン 4mgを得た。この物質が遊離シクロプロジギオシンであることは N-NMR等のデータによって確認された。
【００３６】
次に実施例として製剤例を示す。
【実施例１】
シクロプロジギオシン塩酸塩 0.5g
乳糖 400 g
バレイショ澱粉 100 g
結晶セルロース 30 g
軽質無水ケイ酸 30 g
シクロプロジギオシン0.5g, 乳糖400mg, バイレショ澱粉100mg,結晶セルロース30mg及び軽質無水ケイ酸30mgを混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース20mgをメタノールに溶解した溶液 (ヒドロキシプロピルセルロース10重量％) を加えて混練し、造粒した。
次にこれを径0.8 mmのスクリーンで押出し、顆粒とし、乾燥後、ステアリン酸マグネシウム10mgを加え、200mg ずつ打錠して錠剤とした。
【００３７】
【実施例２】
シクロプロジギオシン塩酸塩 20 mg
Tween 80 0.4 g
蒸留水 200 ml
シクロプロジギオシン塩酸塩20mgをTween 80 0.4g とともに蒸留水 200mlに溶解し、20mlのアンプルに充填し、加熱殺菌して静脈注射剤を調製した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、シクロプロジギオシンあるいはその塩酸塩等のシクロプロジギオシン塩のＶ−ＡＴＰase 脱共役 H⁺ポンプ阻害作用を利用してこれらの化合物を化学試薬、骨粗鬆症治療薬、動脈硬化治療薬、抗生物質、制癌剤増強剤、鎮静剤等として有効に用いることができる。そして得られた剤は、医薬として用いる場合は、経口または非経口で投与することによりこれらの疾病の治療効果が期待できる。また、試薬して用いる場合はキットとして用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験１のシクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞あるいは処理しないＰＣ12細胞の蛍光顕微鏡写真を示す (倍率 400倍) 。
【符号の説明】
Ａ：ＮＧＦで分化誘導し、シクロプロジギオシン塩酸塩処理しないＰＣ12細胞
Ｂ：前記分化誘導し、シクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞
【図２】実験１のシクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞あるいは処理しないＰＣ12細胞の蛍光顕微鏡写真を示す (倍率 400倍) 。
【符号の説明】
Ｃ：前記分化誘導せず、シクロプロジギオシン塩酸塩処理しないＰＣ12細胞
Ｄ：前記分化誘導せず、シクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞
【図３】実験１のシクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞あるいは処理しないＰＣ12細胞の位相差顕微鏡写真を示す (倍率 400倍) 。
【符号の説明】
Ａ：ＮＧＦで分化誘導し、シクロプロジギオシン塩酸塩処理しないＰＣ12細胞
Ｂ：前記分化誘導し、シクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞
【図４】実験１のシクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞あるいは処理しないＰＣ12細胞の位相差顕微鏡写真を示す (倍率 400倍) 。
【符号の説明】
Ｃ：前記分化誘導せず、シクロプロジギオシン塩酸塩処理しないＰＣ12細胞
Ｄ：前記分化誘導せず、シクロプロジギオシン塩酸塩処理したＰＣ12細胞
【図５】実験２(1) のシクロプロジギオシン塩酸塩のリン脂質平面膜の比抵抗を示す。
【図６】実験２(2) のシクロプロジギオシン塩酸塩のＶ−ＡＴＰase 活性及びＶ−ＡＴＰase 活性に対する影響を示す。
【符号の説明】
−○− Ｖ−ＡＴＰase 共役 H⁺ポンプ活性
−×− Ｖ−ＡＴＰase 活性[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to V-ATPase uncoupled H ⁺ pump inhibitors. V- ATPase uncoupling H ⁺ pump inhibitor of the present invention, V-ATPase present in organelles within the cell - not inhibit the activity of (vacuolar ATPase, vacuolar H ⁺ also called ATPase), H ⁺ (protons ) Only the pump activity is inhibited, and osteoporosis and other various diseases caused by the activity can be treated or prevented.
[0002]
[Prior art]
Organelles belonging to the central vacuolar system such as synaptic vesicles, Golgi bodies, vacuoles, and lysosomes contain ATPases that transport a group of protons. This ATPase is called V-ATPase (vacuolar ATPase, vacuolar-type ATPase) after its location. V-ATPase is an ATP synthase that exists in mitochondria, etc., and P-ATPase that exists in the gastric mucosa and controls acidification of the gastric juice is structurally and sensitive to various drugs. But it is a different enzyme.
The function of V-ATPase is to couple H ⁺ to the inside of the organelle coupled with hydrolysis of ATP, to form an electrochemical potential difference of H ⁺ inside and outside, or to make the internal pH acidic. . The electrochemical potential difference and acidic pH of H ⁺ formed are closely linked to the functions inherent to each organelle. Examples include degradation of foreign substances in lysosomes and concentration of neurotransmitters in synaptic vesicles. It is also said to be involved in receptor recycling and protein sorting. Bowman et al. Found that a macrolide antibiotic, bafilomain, is a potent inhibitor of V-ATPase (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85 , 7972-7976 (1988)).
[0003]
Bifilomycin was found to inhibit acid secretion from macrophages, indicating that V-ATPase present in the plasma membrane regulates intracellular and extracellular pH (J. Biol. Chem. , 265, 7645-7654 (1990)). Furthermore, it was also confirmed that V-ATPase is involved in acid secretion from osteoclasts (J. Cell Biol., 111, 1305-1311 (1990)). That is, V-ATPase not only makes the inside of the granules acidic, but also exists in the plasma membrane, releases H ⁺ out of the cell, and creates an acidic field locally outside the cell. In particular, V-ATPase is present in the plasma membrane called the ruffled border of osteoclasts, and releases H ⁺ into the Howship fossa, the site of bone resorption, with a pH of about 4 at that site. Its acidic pH facilitates the release of Ca ²⁺ from bone tissue and activates protease to promote collagen degradation.
[0004]
In addition, it has been reported that V-ATPase inhibitors such as bafilomycin inhibit the accumulation of cholesterol esters (Eur. J. Biochem., 207, 383-389 (1992)). It is expected that a substance having an acidification inhibitory activity of acidic organelles will be used as a medicament for treating or preventing arteriosclerosis.
In addition, a phenomenon in which cancer cells become resistant to a plurality of anticancer agents at the same time is known. This is thought to be because there is a drug efflux pump called P-glycoprotein (multidrug resistant factor MDR) in the plasma membrane of cancer cells, and V-ATPase is involved in this drug efflux mechanism. (Biochem. Pharmacol. 36 , 2879-2887 (1988)). That is, the anticancer agent daunomycin, which is a substrate for P-glycoprotein, is concentrated in an acidic organelle, which is considered to be a lysosome of drug-resistant strain cells. Increases the sensitivity of cells to (J. Natl, Cancer Inst, 83 , 1098-1102 (1991)). Therefore, in view of this, the acidification inhibitory activity of acidified organelles by the V-ATPase inhibitor has an anticancer agent enhancing action and is expected to be used as a medicine.
Further, diphtheria toxin is considered to be cleaved by a protease in the endosome to become an active form and enter the cytoplasm to exhibit toxicity. Addition of bafilomycin with V-ATPase inhibitory activity to cultured cells effectively inhibits the proteolysis of the inner membrane system involved in endocytosis, resulting in fragmentation, resulting in the manifestation of diphtheria toxin toxicity (J. Biol. Chem. 265 , 21940-21945 (1990)). Viruses such as vesicular stomatitis virus and influenza virus are known to enter the cell as endosomes after binding to receptors on the surface of animal cells, and V-ATPase is involved in this process. (J. Gen. Virol. 75 , 2595-2606 (1994); J. Virol. 70 , 576-579 (1996)). Therefore, it can be considered that V-ATPase inhibitors are used as effective antiviral agents.
In addition, malaria is a disease caused by infection with Plasmodium, but it has recently been revealed that intracellular acidification is involved in the process of invasion and proliferation of Plasmodium host hepatocytes and erythrocytes. Furthermore, V-ATPase is also present in the cell membrane of Plasmodium, and it has been pointed out that this activity may be involved during infection. These may be able to protect against malaria infection by using appropriate inhibitors of V-ATPase.
Synaptic vesicles are minute organelles with a diameter of about 50 nm that are present at many nerve terminals and are important for chemical transmission of nerves. That is, a high concentration of neurotransmitter contained in the vesicle is released into the synaptic cleft by stimulation. V-ATPase accounts for approximately 10% or more of the total protein of synaptic vesicles, and transports H ⁺ therein (J. Exp. Biol. 172, 92-99 (1992)). The formed H ⁺ electrochemical potential difference drives the transport of the transmitters present in the vesicle membrane (monoamine transport, glutamate transport, γ-aminobutyric acid, acetylcholine transport) (Biochem. Biophys. Res. Commun. 173 , 443-448 (1991)). Inhibiting V-ATPase also inhibits the transport system (ibid). Thus, inhibiting the V-ATPase H ⁺ pump would be expected as a sedative.
[0005]
The present inventors have investigated the V-ATPase inhibitory effect using various compounds in order to develop a novel substance having a V-ATPase inhibitory action such as bafilomycin. The red substance cycloprodigiosin hydrochloride produced by Pseudoalteromona s denitrificans AK-1 strain (FERM P-15771) has V-ATPase uncoupling H ⁺ pump inhibitory activity. I found it. And it investigated about using this compound as an active ingredient of a V-ATPase uncoupling H ^<+> pump inhibitor. It was also found that free cycloprodigiosin from which hydrogen chloride was removed from this compound had the same effect.
Therefore, the present invention utilizes such V-ATPase uncoupled H ⁺ pump inhibitory activity of cycloprodigiosin or salts to treat osteoporosis, arteriosclerosis, antibiotics, anticancer agents, sedatives, etc. It relates to the use of a drug or organelle as a reagent that induces neutrality.
Conventionally, it is known that cycloprodigiosin has antibacterial activity and antifungal activity (Tetrahedron Letters 30 (13) 1725 (1989)). However, cycloprodigiosin and its inhibitory activity as described above. Is not known at all.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above, an object of the present invention is to provide a novel V-ATPase uncoupled H ⁺ pump inhibitor.
Furthermore, the subject of this invention is providing the novel use of cycloprodigiosin and its salt.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and comprises V-ATPase containing cycloprodigiosin (formula I) or cycloprodigiosin hydrochloride (formula II) or other salt as an active ingredient. Uncoupled H ⁺ pump inhibitor.
[0008]
[Chemical 1]

[0009]
[Chemical 2]

[0010]
Examples of such compounds include cycloprodigiosin or cycloprodigiosin hydrochloride, phosphate, sulfate, perchlorate, carboxylate (for example, acetate, citrate, oxalate, etc.), Examples thereof include iodate, bromate, picrate, sulfonate, tetrafluoroborate salt and the like.
[0011]
Cycloprodigiosin is the marine bacterium Alteromonas rubra (Tetrahedron Letters 24 (26), 2701-2704 (1983)) or Benekea gazogenes (ibid. 24 (27), 2797- 2798 (1983)), and a method for synthesizing 2-methylcyclohexanone as a starting material through the following steps is also known (Tetrahedron Letters 25 , (13) 1387-1388 (1984)). ).
[0012]
[Chemical 3]

[0013]
Said compounds such as cycloprodigiosin hydrochloride can be obtained by converting the cycloprodigiosin thus obtained into a salt form. As a means for forming a salt, a usual salt forming means can be used.
However, cycloprodigiosin obtained from these marine bacteria produces several kinds of prodigiosins in the form of a refreshing product, so it is cumbersome to isolate cycloprodigiosin alone from the extract. Necessitated an isolated operation.
In addition, the method for producing cycloprodigiosin by the chemical synthesis requires complicated steps over many steps.
[0014]
The present inventors were examining the metabolite of marine bacteria, Pseudoalteromonas denitrificans AK-1 strain (FERM P-15771) is cycloprodigiosin hydrochloride, It was found to be produced without the inclusion of other prodigiosins. Accordingly, when the cells are cultured, cycloprodigiosin hydrochloride is produced and accumulated in large amounts in the cells and in the medium, and can be produced in large amounts with high purity. This cycloprodigiosin hydrochloride can easily remove hydrogen chloride by column chromatography to obtain free cycloprodigiosin without hydrochloride. Then, this free cycloprodigiosin (referred to as a compound represented by the formula (I) in which hydrogen chloride is removed from cycloprodigiosin hydrochloride) is treated with an acid such as phosphoric acid or sulfuric acid to obtain the aforementioned salts. be able to.
Cycloprodigiosin hydrochloride and other salts used in the present invention are soluble in water and can be used by dissolving in distilled water or the like. Therefore, it can be used as an injection, a drink and the like.
[0015]
The present invention has been made on the basis of the finding that cycloprodigiosin or cycloprodigiosin hydrochloride and other salts have V-ATPase uncoupling H ⁺ pump inhibitory activity.
[0016]
Cycloprodigiosin or a salt thereof according to the present invention is uncoupled from V-ATPase.
It was confirmed by the following experiment that it had an H ⁺ pump inhibitory action.
[Experiment 1]
PC12 cells (rat adrenal medullary cells) with or without differentiation induced by nerve growth factor (NGF) were cultured in 10% HS5% FBS-DMEM medium. The cells were added with 50 nM cycloprodigiosin hydrochloride and cultured for 1 hour. The change in pH in the cell granules was observed with a fluorescence microscope (FIGS. 1 and 2) and a phase contrast microscope (FIGS. 3 and 4) using acridine orange accumulation as an index. The results are shown in FIGS. That is, FIG. 1 and FIG. 3 show the state of cells obtained by first inducing differentiation of PC12 cells with NGF. Moreover, the state of the cell which has not induced differentiation is shown in FIGS. The state of cells treated with the cycloprodigiosin hydrochloride is shown as B and D. A and C are controls that are not treated with cycloprodigiosin hydrochloride.
In the control, as shown by the arrows, the nerve terminal-like processes formed by differentiation are stained with acridine orange. This is considered to be a synaptic vesicle that is an acidic vesicle. In addition, granules that appear to be relatively large lysosomes are stained around the cell nucleus. On the other hand, when treated with the cycloprodigiosin hydrochloride, the acridine orange staining of the protruding portion disappears, indicating that the acidic environment of this portion has disappeared.
[0017]
On the other hand, lysosomes were not significantly affected by this concentration of cycloprodigiosin hydrochloride, but staining of acridine orange in lysosomes was completely eliminated by increasing the concentration of cycloprodigiosin hydrochloride to 1 μM.
From this, it was found that cycloprodigiosin hydrochloride neutralized the interior of synaptic vesicles, which are acidic organelles, and also neutralized the interior of lysosomes at 1 μM.
[0018]
[Experiment 2]
(1) Phospholipid planar membrane method using cycloprodigiosin hydrochloride at the concentration shown in Fig. 5 (published on July 10, 1992 by Tokyo Chemical Co., Ltd., Japan Biochemical Society, New Chemistry Laboratory) The phospholipid monolayer is bonded by the bonding method of “Biological membranes and membrane transport (top)”, pages 181-187), a specific voltage is applied to the membrane, and the specific resistance is obtained by measuring the current. It was. An increase in the specific resistance value indicates direct damage to the membrane.
As a control, carbonylcyanide-P-trifluoromethoxyphenylhydrazone was used. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 5, carbonylcyanide-P-trifluoromethoxyphenylhydrazone remarkably increases with increasing concentration, whereas cycloprodigiosin hydrochloride increases in specific resistance. And very little direct damage to the membrane. This also suggests that cycloprodigiosin hydrochloride does not show ionophore activity and is extremely toxic.
[0019]
(2) The medulla portion was isolated from bovine adrenal gland, crushed with a Waring blender, the crushed liquid was filtered with 4 layers of gauze, and the chromaffin granule fraction was prepared by centrifugal fractionation and sucrose density gradient centrifugation. The obtained chromaffin granule fraction was subjected to hypotonic treatment, and a chromaffin granule membrane fraction was obtained by centrifugal fractionation.
[0020]
The V-ATPase of the chromaffin granule membrane thus obtained was stimulated with cycloprodigiosin hydrochloride at the concentration shown in FIG. 6 for 10 minutes, and the proton pump activity was measured using accumulation of acridine orange as an index. On the other hand, ATPase activity was performed by quantifying the amount of inorganic phosphorus released from ATP.
The result is shown in FIG. As shown in FIG. 6, the proton pumping activity is completely inhibited by cycloprodigiosin hydrochloride 10 nM. In contrast, V-ATPase activity was not inhibited at all even when 1000 times the amount of cycloprodigiosin hydrochloride was used.
[0021]
Further, the effect of cycloprodigiosin hydrochloride on the bone resorption activity of osteoclasts based on the V-ATPase uncoupling H ⁺ pump activity inhibitory action was examined.
That is, November 10, 1994, published by Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., edited by Tadao Ohno, “Animal Experiment Alternative Method Theory and Application Using Cultured Cells”, page 102. According to the measurement method (J. Bona Miner. Ris., 8, 953-960 (1993)) , the influence of cycloprodigiosin hydrochloride on the osteoclast-forming ability was examined.
[0022]
That is, mouse bone marrow cells and osteoblasts were co-cultured on collagen gel in the presence of active vitamin D ₃ 10 ⁻⁸ M. On the sixth day of culture, the culture plate was treated with collagenase, and the formed osteoclast fraction was collected. The osteoclast fraction was seeded on ivory sections (diameter: 4 mm) and cultured in the presence of a solution of cycloprodigiosin hydrochloride (0.1-100 nM) (n = 4) for 8-24 hours. After completion of the culture, cells on the sections were removed, and the resorption pits formed of osteoclasts were stained with Mayer's hematoxylin staining solution. The resorption pits formed by osteoclasts are stained red. Therefore, the area of the resorption pit was measured, and the area of the non-treated cycloprodigiosin hydrochloride was taken as 100, and the resorption pit area ratio of osteoclasts was determined. The results are shown in Table 1.
[0023]
[Table 1]

[0024]
As shown in the table, cycloprodigiosin hydrochloride strongly suppressed the ability of osteoclasts to form resorption pits at 100 nM. Therefore, since this cycloprodigiosin hydrochloride strongly suppresses the bone resorption function of osteoclasts, this activity can be used as a therapeutic agent for osteoporosis.
[0025]
Thus, cycloprodigiosin hydrochloride has no ionophore activity in the phospholipid planar membrane method of (1), and only the uncoupled H ⁺ pump activity of V-ATPase is specific in the experiment with the chromaffin granule membrane of (2). To inhibit. Such properties are not observed in conventional V-ATPase activity inhibitors such as bafilomycin, and the action of cycloprodigiosin is considered to be due to a completely different mode of action from conventional V-ATPase inhibitors.
Cycloprodigiosin hydrochloride in the present invention specifically inhibits V-ATPase uncoupling H ⁺ pump activity without inhibiting V-ATPase activity. Therefore, based on this activity inhibitory action, it can be used for the next application.
[0026]
(1) In the reagent acidified organelle used for the analysis of the phenomenon involving acidified organelles, neutralization in each organelle is induced by different effective concentrations of neutralization depending on the organelle as shown in Experiment 1. And can be used as a reagent for analyzing the accompanying phenomenon.
[0027]
(2) Osteoporosis drug With the aging of serum, the calcium concentration of serum remains unchanged, but the secretion of calcium-metabolizing hormone changes greatly. Parathyroid hormone works to promote the mobilization of calcium into the extracellular fluid from the bone by the recruitment of osteoclasts, but the blood concentration of this hormone increases, and its antagonist hormone calcitonin is Hormones that suppress cell action and reduce calcium mobilization are conversely reduced. It is also said that the concentration of active vitamin D in the blood will also decrease. Changes in these hormones are said to release calcium from the bone, which keeps the serum calcium concentration constant, deposits on the inner wall of the blood vessel, and triggers arteriosclerosis.
Therefore, by neutralizing the acidic pH and suppressing the release of Ca ²⁺ , an action as an osteoporosis therapeutic agent is expected.
[0028]
(3) Arteriosclerosis inhibitor Since it has been reported that a V-ATPase inhibitor inhibits the accumulation of cholesterol ester, an action as an arteriosclerosis inhibitor is also expected.
(4) Anticancer effect enhancing agent It is known that cancer cells become resistant to a plurality of anticancer agents, because a drug efflux pump called P-glycoprotein exists in the plasma membrane. It has been pointed out that V-ATPase may be involved in such a drug excretion mechanism, but daunomycin, an anticancer agent that becomes a substrate of P-glycoprotein by the addition of bafilomycin known as a V-ATPase inhibitor, is There is a report that it becomes difficult to be discharged to the outside and at the same time the sensitivity to daunomycin increases.
That is, cycloprodigiosin hydrochloride, which is a V-ATPase uncoupled H ⁺ pump inhibitor, also inhibits drug excretion and can be expected to have an anticancer drug enhancing effect.
[0029]
(5) It has been clarified that endosomal acidification via endosomal V-ATPase is involved in the toxic expression process of the antibiotic diphtheria toxin and the viral animal cell infection process. Therefore, cycloprodigiosin hydrochloride, a V-ATPase uncoupled H ⁺ pump inhibitor, can also be expected as a new inhibitory antiviral agent. Moreover, since the possibility that V-ATPase is involved in malaria infection has been shown, cycloprodigiosin hydrochloride can be expected as an effective antimalarial agent.
(6) The neurotransmitter transport system is inhibited by inhibiting the sedative H ⁺ pump. Therefore, cycloprodigiosin hydrochloride can also be expected as a sedative by inhibiting this transport system.
[0030]
When used as these medicaments in the present invention, these may be used alone or in combination with other medicaments. In particular, when used as a therapeutic agent for osteoporosis, it may be used in combination with calcitonin, vitamin D or an inorganic calcium salt. Further, when used as an anticancer agent enhancer, it may be used in combination with an anticancer agent. Furthermore, when used as a reagent, acridine orange or the like can be used together to form a kit.
[0031]
When these are used as pharmaceuticals, cycloprodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride or other salts can be used as they are or in combination with other drugs. Usually, it is administered orally or parenterally in the form of an appropriate formulation together with excipients and other adjuvants. Oral agents include powders, granules, tablets, dragees, pills, capsules, drinks and the like. Parenteral preparations include suppositories, cataplasms, injections and the like. The injection may be in the form of intramuscular injection, arterial injection or intravenous injection.
As these excipients and other auxiliary agents, lactose, sucrose, various starches, glucose, cellulose or derivatives thereof, magnesium stearate, talc and the like are used. A solvent such as distilled water can be used. These can be made into oral or parenteral preparations by means commonly known as preparation means.
The dose varies depending on symptoms, age, sex, etc., but in the case of oral administration, 0.1 to 0.5 / kg body weight of cycloprodigiosin or its hydrochloride or other salt per day, and in the case of parenteral administration, injection It is desirable to administer 0.1 to 0.5 mg / kg body weight per day as an agent.
[0032]
Regarding the toxicity of these compounds, when cycloprodigiosin hydrochloride was administered intraperitoneally to ICR female mice (5 weeks old, body weight 25-29 g), the LD ₅₀ value was 10 mg or more.
In addition, when the specific resistance of cycloprodigiosin hydrochloride was measured by the phospholipid planar membrane method as described above, it was judged that the toxicity was extremely low because no ionophore activity was observed.
[0033]
The manufacture example of the cycloprodigiosin hydrochloride of this invention is shown.
Dissolve 2.5 g of bactopeptone (Difco), 0.5 g of bacto yeast extract (Difco) and 0.1 g of iron (III) phosphate hydrate (Wako Pure Chemical Industries) in 1 liter of natural seawater, sterilize, 3 ml Inside, Pseudoalteromonas denitrificans AK-1 strain (FERM P-15771) was inoculated and cultured at 15 to 20 ° C. for 1 day. The obtained culture was transferred to 600 ml of the medium having the above composition and cultured for 1 day.
[0034]
The culture medium cultured in this manner was centrifuged at 22,000 rpm for 20 minutes, and the cells were collected. 5-10 g of cells were recovered. A mixture of acetone-diethyl ether (4: 1) was added to the cells, and the dye (cycloprodigiosin hydrochloride) was extracted at 200 shaking / min. The extract was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant. Anhydrous magnesium sulfate was added to the supernatant to adsorb and remove moisture, and the magnesium sulfate was removed by filtration. The filtrate was concentrated to dryness and analyzed by thin layer chromatography (Kieselgel 60 F ₂₅₄ ; developing solvent benzene: ether = 1: 1). A single spot was obtained at Rf 0.20. This concentrate was dissolved in 5 ml of methylene chloride and recrystallized from this solution using the temperature difference. The produced crystals were washed with pentane and suction filtered to collect 5 mg of crystals.
This crystal was a needle-like crystal having a red metallic luster, had no melting point, and decomposed at about 230 ° C. Elemental analysis of this crystal and analysis of its mass spectrum, UV spectrum, IR spectrum and 1 H-NMR spectrum revealed that it was consistent with that of cycloprodigiosin hydrochloride (Chemical II) (Tetrahedron Letters, 24 (26) , 2701-2704 (1983)), and was identified as the same compound.
[0035]
5 mg of the cycloprodigiosin hydrochloride thus obtained is dissolved in 10 ml of methylene chloride, passed through a silica gel column (diameter 1.5 cm, length 12 cm, flow rate 1.2 ml / min), and the solvent is distilled off to release. 4 mg of cycloprodigiosin was obtained. It was confirmed by data such as N-NMR that this substance was free cycloprodigiosin.
[0036]
Next, formulation examples are shown as examples.
[Example 1]
Cycloprodigiosin hydrochloride 0.5g
Lactose 400 g
Potato starch 100 g
Crystalline cellulose 30 g
Light anhydrous silicic acid 30 g
Cycloprodigiosin 0.5g, lactose 400mg, baile starch 100mg, crystalline cellulose 30mg and light anhydrous silicic acid 30mg were mixed, and then a solution of hydroxypropylcellulose 20mg dissolved in methanol (hydroxypropylcellulose 10wt%) was added. Kneaded and granulated.
Next, this was extruded through a screen having a diameter of 0.8 mm to form granules, dried, 10 mg of magnesium stearate was added, and 200 mg was tableted into tablets.
[0037]
[Example 2]
Cycloprodigiosin hydrochloride 20 mg
Tween 80 0.4 g
Distilled water 200 ml
Cycloprodigiosin hydrochloride (20 mg) was dissolved in distilled water (200 ml) together with Tween 80 (0.4 g), filled into a 20 ml ampule, and heat-sterilized to prepare an intravenous injection.
[0038]
【The invention's effect】
According to the present invention, these compounds are converted into chemical reagents, osteoporosis therapeutic agents, arteriosclerotic treatments by utilizing the V-ATPase uncoupling H ⁺ pump inhibitory action of cycloprodigiosin salts such as cycloprodigiosin or its hydrochloride. It can be effectively used as a drug, antibiotic, anticancer agent potentiator, sedative and the like. And when using the obtained agent as a medicine, the therapeutic effect of these diseases can be expected by oral or parenteral administration. Moreover, when using as a reagent, you may use as a kit.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows fluorescence micrographs of PC12 cells treated with cycloprodigiosin hydrochloride or untreated PC12 cells in Experiment 1 (magnification 400 times).
[Explanation of symbols]
A: PC12 cells induced to differentiate with NGF and not treated with cycloprodigiosin hydrochloride B: PC12 cells treated with cycloprodigiosin hydrochloride treated with cycloprodigiosin hydrochloride FIG. 2 was treated with cycloprodigiosin hydrochloride treated in Experiment 1 Fluorescence micrographs of PC12 cells or untreated PC12 cells are shown (400 times magnification).
[Explanation of symbols]
C: PC12 cells not induced by differentiation and not treated with cycloprodigiosin hydrochloride D: PC12 cells treated without treatment and treated with cycloprodigiosin hydrochloride [FIG. 3] Cycloprodigiosin hydrochloride treated in Experiment 1 A phase contrast micrograph of the treated PC12 cells or untreated PC12 cells is shown (magnification 400 times).
[Explanation of symbols]
A: PC12 cells induced to differentiate with NGF and not treated with cycloprodigiosin hydrochloride B: PC12 cells treated with cycloprodigiosin hydrochloride treated with cycloprodigiosin hydrochloride FIG. 4 was treated with cycloprodigiosin hydrochloride treated in Experiment 1 A phase contrast photomicrograph of PC12 cells or untreated PC12 cells is shown (magnification 400 times).
[Explanation of symbols]
C: PC12 cell not induced by differentiation and treated with cycloprodigiosin hydrochloride D: PC12 cell treated without treatment and treated with cycloprodigiosin hydrochloride [FIG. 5] Cycloprodigiosin of Experiment 2 (1) The specific resistance of the phospholipid planar membrane of hydrochloride is shown.
FIG. 6 shows the influence of cycloprodigiosin hydrochloride of Experiment 2 (2) on V-ATPase activity and V-ATPase activity.
[Explanation of symbols]
-○-V-ATPase conjugate H ⁺ pump activity- ×-V-ATPase activity

Claims

A V-ATPase (vacuolar ATPase) uncoupled H ⁺ pump inhibitor comprising cycloprodigiosin or a salt thereof as an active ingredient.

The inhibitor according to claim 1, wherein the active ingredient is cycloprodigiosin.

The inhibitor according to claim 1, wherein the active ingredient is cycloprodigiosin hydrochloride.