JP3948223B2

JP3948223B2 - 遺伝子配列の読み取り装置

Info

Publication number: JP3948223B2
Application number: JP2001161584A
Authority: JP
Inventors: 貴志夫日▲高▼; 昭浩宮内; 光男林原; 裕二宮原
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2001-05-30
Publication date: 2007-07-25
Anticipated expiration: 2021-05-30
Also published as: US20030156985A1; US6991932B2; JP2002350435A; US20020182109A1; US6555362B2

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検体である二本鎖のＤＮＡ(Deoxyribonucleic acid）を構成する一本鎖のＲＮＡ(Ribonucleic acid）にコード配列しているＡ，Ｃ，Ｇ、及びＵの四塩基それぞれに対して、その配列を読み取る遺伝子配列読み取り装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のＤＮＡシーケンサは、二本鎖のＤＮＡを構成する一本鎖のＲＮＡに配列しているＡ，Ｃ，Ｇ、及びＵの四塩基を酵素によって特定配列部分で切断し、切断端部に蛍光体を合成反応によって結合させ、電気泳動によってＤＮＡを一方向に泳がせてゆき、レーザ発光によって泳動に要した時間からＤＮＡの長さを推定していた。この方法では、切断に利用した酵素によって端部の塩基を特定できるが、残部の塩基はまったく不明であり、多種類の酵素を利用して同一ＤＮＡを様々に切断して端部をシーケンスしなければならず、かつ、大型計算機による当初のＤＮＡの復元をおこなわなければならなかった。
【０００３】
また、ＤＮＡチップでは、すでに既知の配列をしているＲＮＡをガラス基板上にスポッティングさせ、被検体のＤＮＡをスポッティング部分に混入させることで、既知の配列をしているＲＮＡと共通配列した場合のみ被検体ＤＮＡが既知配列したＲＮＡと結合する性質を利用している。つまり、多様な既知配列ＲＮＡをスポッティングさせ、被検体ＤＮＡとの結合の有無によって配列を推定した。いずれの場合も、被検体となるＤＮＡのコード配列を直接読み取ることはできない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術であるＤＮＡシーケンサおよびＤＮＡチップでは、当初のＤＮＡを寸断しなければならず、寸断されたＤＮＡの配列が部分的に判っても、当初のDNAに復元することは容易ではないという問題があった。したがって、トータルスループットに要する時間が長くかかり、復元したＤＮＡ配列に対する信頼性にも問題があった。上記問題を解決するために、本発明の目的は、酵素による切断の必要がなく、配列しているＡ，Ｃ，Ｇ、及びＵの四塩基をそれぞれ個別に検出し、遺伝子配列を特定することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための本発明の特徴は、二本鎖のＤＮＡを構成する一本鎖のＲＮＡにコード配列しているＡ，Ｃ，Ｇ、及びＵの四塩基それぞれに対して、四塩基中の一塩基のみと水素結合によって発生する引力を検出することにある。
【０００６】
又、本発明の他の特徴は、端子の先端に、直径が数ナノメートルと細束性の高いカーボンナノチューブを接合し、この接合されたカーボンナノチューブの一端に塩基，糖，りん酸から構成されるヌクレオチドを化学修飾する。被検体であるＲＮＡのコード配列の中から、塩基の相補性によりＡはＵと、ＧはＣとのみ結合する性質を利用して特定の塩基のみとの結合によって引力の発生を利用して、塩基を特定することにある。
【０００７】
又、さらに、本発明の他の特徴は、発生する引力は、端子の走査中に直上で発生する塩基の相補性による引力であり、これを検出し、二次元画像上の位置情報などの遺伝子情報として記録することにある。
【０００８】
さらに、本発明の他の特徴は、それぞれ別々な四種類の塩基に対する特異点、例えば、上記位置情報を一画像上に重ね合わせることによって一本のＲＮＡ中の塩基配列をすべて表示することにある。
【０００９】
【発明の実施の形態】
図１に本発明の装置基本構成および動作原理を示す。被検体である二本鎖の
ＤＮＡを構成する一本鎖のＲＮＡ（リボ核酸）を基板上(図１では雲母基板１９)に固定し、その直上にアデニンＡ，シトシンＣ，グアニンＧ、及びウラシルＵの四塩基の中の一塩基（以下、Ａ，Ｃ，Ｇ又はＵという）を化学修飾した金属探針（１０）を走査させる。
【００１０】
それぞれの塩基は相補性があり、任意の一塩基に対しては特定の一塩基のみが水素結合による引力を発生する。この引力はミクロニュートン以下の微小応力であるため、約２ナノメ−トル間隔で隣接している他の塩基からの外乱を無視できるので、位置の再現性は十分確保できる。
【００１１】
この微小引力を増幅するために、微小荷重でたわみやすく、かつ、無荷重で復元しやすい鉄などの高弾性金属の梁を用いて、その先端に金属探針を設置した。
【００１２】
そのため、例えばＡを金属探針先端に化学修飾して被検体である二本鎖のDNAを構成する一本鎖のＲＮＡ上を走査している時、一本鎖のＲＮＡ中のＵに遭遇すると直上で相補性による引力が働き、その金属探針が引力によって被検体ＲＮＡ上に引きつけられる。
【００１３】
これによって、金属探針を端部に設置した梁がたわむ。このたわみをさらに増幅させる目的で、梁の背面に光線を照射して鏡面反射させる。反射した光線を十分遠方で検出することにより、微小引力で発生したたわみを光の反射角度に変換させ、その光の反射角度の違いとして検出に十分な増幅が可能となる。このようにして、微小引力の検出感度は微小引力を梁のたわみに変換し、梁のたわみをさらに光の反射角度に変換することで向上させることができる。
【００１４】
ガリウムイオンを加速照射させる集束イオンビーム加工装置内部で、図２に示すような集束イオンビーム加工装置内部に試料室を設け、そこに傾斜式試料台とそれに対向する移動ステージを設けた。装置内部では、傾斜式試料台にカーボンナノチューブの付着したブレードを設置し、それに対向する移動ステージに金属探針を配置し、金属探針を移動させながらカーボンナノチューブの端部まで誘導した。
【００１５】
金属探針は縦・横・高さの三軸方向に移動可能なステージに取付けられており、対向するカーボンナノチューブは傾斜式の基板上に配置されたままの状態で設置した。集束イオンビーム加工装置は、従来の走査型電子顕微鏡における二次電子像と同様な倍率でイオン像が得られるので、画像を観察しながら、基板上のカーボンナノチューブに、金属探針を移動させることで、最適な長さおよび方位を向いたカーボンナノチューブを一本のみ選択することができる。
【００１６】
観察領域でカーボンナノチューブと金属探針の位置関係において最適な方位が得られない場合には、金属探針を移動させるステージは上下，左右および前後のそれぞれ三軸移動が独立して可能であり、それと対向するカーボンナノチューブの方位をある程度傾斜させることにより、金属探針とカーボンナノチューブとの最適方位を確保することが可能である。
【００１７】
このようにして、金属探針の先端部分とカーボンナノチューブの端部を接触させた後、ガス状のタングステンカルボニルを接触部分中心に導入管を通して吹きつける。同時に、ビーム状に加速させたガリウムイオンを金属探針の先端部分とカーボンナノチューブの端部の接触部分に制限照射する。この制限照射は、正に帯電したガリウムイオンを集束イオンビーム加工装置に設置してあるコイル状電磁石を用いて集束させるものである。これにより、ガス状のタングステンカルボニルをＷ(ＣＯ)６→Ｗ＋６ＣＯに化学分解させ、金属タングステンを金属探針の先端部分とカーボンナノチューブの端部の接触部分に堆積させて接合した。発生したＣＯガスは分解中に真空ポンプによって試料チャンバから排気した。接合した後、金属探針を集束イオンビーム加工装置から取り出し、三軸方向に移動可能なステージから取外した。
【００１８】
本発明は、信頼性の高い金属を溶接材料として接合に用いる点にある。カーボンナノチューブのナノメートルサイズという特異性を生かしたファンデルワールス力による付着が強力であるということを遺伝子の塩基を特定するための検出用の探針として用いることが新しく、これまでにはない技術的課題の解決手段になると考えられる。つまり、物理吸着的固定では信頼性が得られないので、本発明に示したような金属を溶接材料として利用したカーボンナノチューブと端子部の接合が発明の特徴となる。
【００１９】
電子ビーム照射装置内部で、図３に示すようなカーボンナノチューブが先端に接合した金属探針を電子ビームに対して垂直になるように配置し、炭素の結合エネルギーである２８５エレクトロンボルト以上の加速電圧である２０ｋＶを印加して電子ビーム照射を行った。電子ビームは、電子銃に電圧を印加し、引き出し電極によって電子を電子銃から引き出し、収束電極によって電子ビームを形成させる。電子線照射は残留ガスによる散乱を防ぐため、１０^-3Ｐａ以上の真空雰囲気で実施した。電子照射後、ただちに水蒸気の充満したチャンバ内部にカーボンナノチューブを先端に接合した金属探針を誘導し、電子ビーム照射によってカーボンナノチューブの先端部分のＣ−Ｃ共有結合を切断した部分に−ＣＯＯＨ基を形成させた。カーボンナノチューブは疎水性物質であるが、表面に−ＣＯＯＨ基を形成することで親水性に変化することが知られている。次に、親水性カーボンナノチューブをｐＨを８に調整し、ヌクレオチドを分散させてある水溶液中に２時間浸し、カーボンナノチューブへのヌクレオチドの化学修飾を実施した。
【００２０】
図４に示すように、走査プロ−ブによるＲＮＡ中の遺伝子配列の読み取りは読み取り装置を用いて実施した。平滑な表面の雲母基板上にＲＮＡを配置し、別々な金属探針にそれぞれ化学修飾したそれぞれの塩基を用いて実施した。金属探針は市販のばね定数ｋｚ＝３Ｎ／ｍのカンチレバーの先端部分に設置され、探針−試料間距離の最適設定およびレーザ光軸調整は従来方法に従った。１ミクロンメートル四方の探針走査によって、ＲＮＡ中で約２ナノメ−トルの間隔で配列している塩基から、ウラシルＵに対して金属探針に化学修飾させた相補性を有する塩基アデニンのみが引力を発生して力学的な引力を示す点として検出され、二次元画像上の特異点として表示された。それぞれ四種類のヌクレオチドについて、被検体であるＲＮＡ中の四種類のそれぞれ異なった特定塩基で相補性を持つものについてのみ引力による信号を検出することができた。これは被検体であるＲＮＡ中の各塩基の位置を一塩基ごとに明確にすることであり、それぞれの二次元画像上の特異点を重ね合わせることにより、被検体であるＲＮＡ中の塩基配列を決定できる。
【００２１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の読み取り装置は、金属探針の先端部分にカーボンナノチューブのような有機官能基との結合親和力の強いナノメートルオーダーのバインダを介して、金属探針の先端部分に遺伝子情報を持つ塩基を接合させることによって、従来不可能とされていたＲＮＡ中の塩基配列を読み取ることが可能となる。
【００２２】
従来のＤＮＡシーケンサでは、染色体を構成する二本鎖のＤＮＡを階層的に制限酵素を用いて特定の長さに切断し、その端部に蛍光体を修飾し、電気泳動で所定距離を泳ぐ時間の長さから切断ＤＮＡの長さを推定した。その端部の塩基のみが既知であるため、前記階層的切断を再合成するさいにも、大型計算機による合成の精度に問題があった。しかし、本発明では階層的に切断したＤＮＡに対して端部のみの塩基情報を与えるだけではなく、切断したＤＮＡ内部の塩基配列情報をすべて与えるものである。したがって、従来法において実施されている大型計算機による塩基配列情報の精度計算は不必要となる。また、ＤＮＡチップにおける蛍光発光のばらつきのような問題もない。さらに、遺伝子情報を持つＲＮＡ中の全塩基配列が読み取れると、その相補性を利用してもとのＤＮＡの全塩基配列を決定することが容易となる。ＤＮＡの全塩基配列が既知であれば、さらにそのＤＮＡの存在位置を染色体まで戻ることが可能となる。また、本発明を利用することで、染色体中の特定ＤＮＡ配列中で一塩基の配列の違いで発生する生体上の外形もしくは機能についての優位差など、遺伝子の配列に起因する多型解析および機能解析に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の遺伝子配列読み取り装置の概略構成。
【図２】カーボンナノチューブの金属探針への接合装置原理図。
【図３】カーボンナノチューブ化学修飾の原理図。
【図４】ＲＮＡ中の全ての塩基配列が判明するシステムの概略図。
【符号の説明】
１０…金属探針、１１…カーボンナノチューブ、１２…四種類のヌクレオチド中の一塩基、１３…リボ核酸、１４…レーザ発振器、１５…レーザ反射板、１６…検出器、１７…レーザビーム、１８…接合金属、１９…ＲＮＡ保持用雲母基板、２０…金属探針保持板、２１…金属探針はさみ、２２…上下移動用ボルト、２３…左右移動用ボルト、２４…前後移動用ボルト、２５…ボルト支持ケーシング、２６…カーボンナノチューブ保持用ブレード、２７…カーボンナノチューブ試料台、２８…試料台傾斜用ボルト、２９…ブレードはさみ、３０…電子銃、３１…引出電極、３２…収束電極、３３…金属探針支持部分、３４…アデニン、３５…シトシン、３６…グアニン、３７…ウラシル、３８…水素結合によって生じる金属探針のたわみ、３９…ウラシルの化学修飾で検出されたアデニンの位置、４０…シトシンの化学修飾で検出されたグアニンの位置、４１…グアニンの化学修飾で検出されたシトシンの位置、４２…アデニンの化学修飾で検出されたウラシルの位置、４３…四種類の塩基の位置を同一画像上に合成して明らかになった塩基配列。

Claims

先端にアデニン，シトシン，グアニン，ウラシルの何れかの一塩基を有するカーボンナノチューブと、前記カーボンナノチューブが接合される探針部と、を有するプローブと、
被検体の有する塩基と前記プローブの塩基との間に生じる引力を歪として検出する検出部と、
前記歪を増幅する増幅器と、
前記増幅器からの歪信号を記録する記録部と、
前記記録部に記録された情報に基づいて表示を行う表示部と、を有し、
前記カーボンナノチューブは、電子ビーム照射し、その後水蒸気と接触させる親水化処理をされていることを特徴とする遺伝子配列の読み取り装置。
前記記録部により記録される歪信号は二次元の位置情報を含み、
前記表示部は前記位置情報に基づいて二次元画像を表示することを特徴とする請求項１記載の遺伝子配列の読み取り装置。
前記先端に塩基を有するカーボンナノチューブを保持する探針は、複数あることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子読み取り装置。
前記被検体は塩基配列を有するＲＮＡであり、
前記カーボンナノチューブの直径は、前記ＲＮＡの塩基配列の間隔よりも小さいことを特徴とする請求項３記載の遺伝子読み取り装置。
先端に塩基たるアデニンが化学修飾されたカーボンナノチューブを保持する短針と、
先端に塩基たるシトシンが化学修飾されたカーボンナノチューブを保持する短針と、
先端に塩基たるグアニンが化学修飾されたカーボンナノチューブを保持する短針と、
先端に塩基たるウラシルが化学修飾されたカーボンナノチューブを保持する短針と、を有することを特徴とする請求項３記載の遺伝子読み取り装置。
前記記録部により記録される歪信号は一塩基ごとの二次元の位置情報を含み、
前記表示部は前記位置情報に基づいて二次元画像を表示することを特徴とする請求項３または５記載の遺伝子配列の読み取り装置。