JP3935093B2 - Highly engrafted regenerative corneal epithelial cell sheet, production method and use thereof - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
【０００１】
本発明は、生物学、医学等の分野における高生着性再生角膜上皮細胞シート、製造方法及びそれらを利用した治療法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
医療技術の著しい発展により、近年、治療困難となった臓器を他人の臓器と置き換えようとする臓器移植が一般化してきた。対象となる臓器も皮膚、角膜、腎臓、肝臓、心臓等と実に多様で、また、術後の経過も格段に良くなり、医療の一技術としてすでに確立されつつある。一例として角膜移植をあげると、約４０年前に日本にもアイバンクが設立され移植活動が始められた。しかしながら、未だにドナー数が少なく、国内だけでも角膜移植の必要な患者が年間約２万人出てくるのに対し、実際に移植治療が行える患者は約１／１０の２０００人程度でしかないといわれている。角膜移植というほぼ確立された技術があるにもかかわらず、ドナー不足という問題のため、次なる医療技術が求められているのが現状である。
【０００３】
このような背景のもと、以前より、人工代替物や細胞を培養して組織化させたものをそのまま移植しようという技術が注目されている。その代表的な例として、人工皮膚及び培養皮膚があげられよう。しかしながら、合成高分子を用いた人工皮膚は拒絶反応等が生じる可能性があり、移植用皮膚としては好ましくない。一方、培養皮膚は本人の正常な皮膚の一部を所望の大きさまで培養したものであるため、これを使用しても拒絶反応等の心配がなく、最も自然なマスキング剤と言える。
【０００４】
従来、そのような細胞培養は、ガラス表面上あるいは種々の処理を行った合成高分子の表面上にて行われていた。例えば、ポリスチレンを材料とする表面処理、例えばγ線照射、シリコーンコーティング等を行った種々の容器等が細胞培養用容器として普及している。このような細胞培養用容器を用いて培養・増殖した細胞は、トリプシンのような蛋白分解酵素や化学薬品により処理することで容器表面から剥離・回収される。
【０００５】
しかし、上述のような化学薬品処理を施して増殖した細胞を回収する場合、処理工程が煩雑になり、不純物混入の可能性が多くなること、及び増殖した細胞が化学的処理により変成若しくは損傷し細胞本来の機能が損なわれる例があること等の欠点が指摘されていた。かかる欠点を克服するために、これまでいくつかの技術が提案されている。
【０００６】
特公平２−２３１９１号公報には、ヒト新生児由来角化表皮細胞を、ケラチン組織の膜が容器の表面上に形成される条件下にて、培養容器中で培養し、ケラチン組織の膜を酵素を用いて剥離させることを特徴とするケラチン組織の移植可能な膜を製造する方法、が記載されている。具体的には、３Ｔ３細胞をフィーダーレイヤーとして増殖、重層化させ、蛋白質分解酵素であるディスパーゼを用いて細胞シートを回収する技術が開示されている。しかしながら、当該公報に記載されている方法は次のような欠点を有していた。
（１）ディスパーゼは菌由来のものであり、回収された細胞シートを十分に洗浄する必要性があること。
（２）培養された細胞ごとにディスパーゼ処理の条件が異なり、その処理に熟練が必要であること。
（３）ディスパーゼ処理により培養された表皮細胞が病理学的に活性化されること。
（４）ディスパーゼ処理により細胞外マトリックスが分解されること。
（５）そのためその細胞シートを移植された患部は感染され易いこと。
【０００７】
上述したような従来法の欠点に加えて、本発明の対象とする角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、及び結膜上皮細胞などの前眼部関連細胞は、皮膚細胞ほど細胞・細胞間の結合が強くないため、上記ディスパーゼをもってしても、培養後、1枚のシートとして剥離、回収することはできなかった、という欠点を有していた。
【０００８】
かかる課題を解決するために、最近、スポンジ層と上皮層を除去した羊膜上で、角膜上皮細胞や結膜上皮細胞を培養、組織化させ、その羊膜ごと移植用細胞片とする技術が考案された（特開２００１−１６１３５３号）。羊膜は、十分な膜強度を持っていること、さらに抗原性を持っていないことから、移植用細胞片の支持体として好都合だが、羊膜というものがもともと眼内になく、より精密に眼内組織を構築していくためには、やはり眼内の細胞だけで十分な強度を持ったシートの作製が望まれていた。
【０００９】
また、特願２００１−２２６１４１号では、水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃である温度応答性高分子を基材表面に被覆した細胞培養支持体上で前眼部関連細胞を培養し、必要に応じて常法により培養細胞層を重層化させ、支持体の温度を変えるだけで培養した細胞シートを剥離させることで、十分な強度を持った細胞シートの作製が可能となった。また、この細胞シートには基底膜様蛋白質も保持しており、上述したディスパーゼ処理したものに比べ、組織への生着性も明らかに改善されている。しかしながら、実際の患者の負担軽減を考えると、その生着性にさらに改善が望まれていた。
【００１０】
さらに、最近、医療現場においてもさまざまな方法が提案されている。たとえば、ＷＯ９８／３１３１６においては近視治療のためにＰＲＫ法、ＬＡＳＩＫ法を行う際、培養した角膜上皮細胞シートを利用する技術が提案している。しかしながら、ここでの培養角膜上皮シートは、上述のディスパーゼによって剥離されたものであり、レーザーで削られた角膜組織への付着性が悪く、顕著な治療効果も望めない問題点があった。
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、前眼部組織への付着性が良好な高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを提供することを目的とする。また、本発明は、その製造法、並びに利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、温度応答性ポリマーで基材表面を被覆した特定条件の細胞培養支持体上で角膜上皮細胞を特定条件下で培養し、その後、培養液温度を上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とし、培養した再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを特定のキャリアに密着させ、細胞シートの収縮を抑えながら、そのままキャリアと共に剥離することにより、生体組織に極めて付着性の良い高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートが得られることを見いだした。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１３】
すなわち、本発明は、前眼部組織への付着性が良好な、キャリアに密着させた、高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを提供する。
【００１４】
また、本発明は、水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃である温度応答性高分子で基材表面を被覆した細胞培養支持体上で細胞を培養し、必要に応じて常法により培養細胞層を重層化させ、その後、
（１）培養液温度を上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とし、
（２）培養した角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートをキャリアに密着させ、
（３）そのままキャリアと共に剥離する
ことを特徴とする高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートの製造方法を提供する。
【００１５】
加えて、本発明は、深部まで欠損及び／または創傷した組織を治療するための上記高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを提供する。
【００１６】
更に加えて、本発明は、深部まで欠損及び／または創傷した組織に対し、上記高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを移植することを特徴とする治療法を提供する。
【００１７】
更に、本発明は医療分野のみならず、化学物質、毒物、或いは医薬品の安全性評価用細胞として有用な高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の前眼部関連細胞シートまたは３次元構造体の作製に使用される好適な細胞として角膜上皮細胞、及びその幹細胞が挙げられるが、その種類は、何ら制約されるものではない。本発明において、高生着性再生角膜上皮細胞シートとは、上記した各種細胞が培養支持体上で単層状に培養され、その後、支持体より剥離されたシートを意味し、その重層化シートとは、その高生着性再生角膜上皮細胞シートが単独若しくは他の細胞からなるシートと組み合わされた状態で重層化されたシートを意味する。
【００１９】
本発明における高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートは培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、基材から剥離された高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートは、細胞−細胞間のデスモソーム構造が保持され、構造的欠陥が少なく、強度の高いものである。また、本発明のシートは培養時に形成される細胞−基材間の基底膜様蛋白質も酵素による破壊を受けていない。このことにより、移植時において患部組織と良好に接着することができ、効率良い治療を実施することができるようになる。以上のことを具体的に説明すると、トリプシン等の通常の蛋白質分解酵素を使用した場合、細胞−細胞間のデスモソーム構造及び細胞、基材間の基底膜様蛋白質等は殆ど保持されておらず、従って、細胞は個々に分かれた状態となって剥離される。その中で、蛋白質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞−細胞間のデスモソーム構造については１０〜６０％保持した状態で剥離させることができることで知られているが、細胞−基材間の基底膜様蛋白質等を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートは強度の弱いものである。これに対して、本発明の細胞シートは、デスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に８０％以上残存された状態のものであり、上述したような種々の効果を得ることができるものである。
【００２０】
本発明における高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートは生体組織である前眼部組織に極めて良好に生着する。その性質は、支持体表面から剥離させた再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートの収縮を抑えることで実現されることを見いだした。その際、再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートの収縮率はシート内の何れの方向における長さにおいても２０％以下であることが望ましく、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下であることが好ましい。シートの何れかの方向の長さにおいて２０％以上となると、剥離した細胞シートはたるんでしまって、その状態で生体組織に付着させても組織に密着させられず、本発明で示すところの高生着性は望めない。
【００２１】
再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを収縮させない方法は、細胞シートを収縮させない方法であれば何ら制約されるものではないが、例えば、支持体から再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを剥離させる際、これらの細胞シートに中心部を切り抜いたリング状のキャリアなどを密着させ、そのキャリアごと細胞シートを剥離する方法などが挙げられる。
【００２２】
高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを密着させる際に使用するキャリアは、本発明の細胞シートが収縮しないように保持するための構造物であり、例えば高分子膜または高分子膜から成型された構造物、金属性治具などを使用することができる。例えば、キャリアの材質として高分子を使用する場合、その具体的な材質としてはポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロース及びその誘導体、紙類、キチン、キトサン、コラーゲン、ウレタン等を挙げることができる。
【００２３】
本発明において密着という場合、細胞シートが収縮しないように、細胞シートとキャリアとの境界面において、キャリア上で細胞シートがずれたり移動したりしない状態のことをいい、物理的に結合することにより密着していても、両者のあいだに存在する液体（例えば培養液、その他の等張液）を介して密着していてもよい。
【００２４】
キャリアの形状は、特に限定されるものではないが、例えば得られた高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを移植する際に、キャリアの一部に移植部位と同程度もしくは移植部位より大きく切り抜いたものを利用すると、細胞シートは切り抜かれたの周囲の部分だけに固定され、切り抜かれた部分にある細胞シートを移植部位に当てるだけで良く、好都合である。
【００２５】
また、本発明における再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートの特徴である生体組織への高い生着性は、特定の培養条件下で実現される。すなわち、本発明の細胞シートまたは重層化シートは、支持体表面上に角膜上皮細胞を播種後、培養することで得られるが、支持体表面上で細胞がコンフルエント（満杯な状態）になってから２１日以下、好ましくは１５日以下、さらに１０日以下であることが好ましいことが判明した。２１日より多いと剥離した再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートの最下層の細胞の活性が低下し、そのため付着性も低減してしまい、本発明でである高生着性は望めなくなる。
【００２６】
本発明の前眼部組織とは、前眼部であれば特に限定されるものではないが、一般には、角膜上皮組織、ボーマン組織、角膜実質組織などが挙げられる。
【００２７】
本発明における高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートは、以上に示すように、生体組織である前眼部組織に極めて良好に付着できる細胞シートであり、従来技術からでは全く得られなかったものである。
【００２８】
細胞培養支持体において基材の被覆に用いられる温度応答性ポリマーは、水溶液中で上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度０℃〜８０℃、より好ましくは２０℃〜５０℃を有する。上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が８０℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。また、上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が０℃より低いと一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため、やはり好ましくない。
【００２９】
本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。
【００３０】
被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
【００３１】
温度応答性ポリマーの支持体への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されている方法に従ってよい。すなわち、かかる被覆は、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。
【００３２】
温度応答性高分子の被覆量は、０．４〜４．５μｇ／ｃｍ２の範囲が良く、好ましくは０．７〜３．５μｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは０．９〜３．０μｇ／ｃｍ２である。０．２μｇ／ｃｍ２より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該高分子上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に４．５μｇ／ｃｍ２以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。
【００３３】
本発明における支持体の形態は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサートなどが挙げられる。その中で、特にセルインサートについては、例えば角膜上皮細胞を重層化させる際に必要な３Ｔ３フィーダー細胞を角膜上皮細胞と分けて培養できるため好都合である。その際、角膜上皮細胞はセルインサート側にあっても、セルインサートが装着されるディッシュ側にあっても良く、少なくとも角膜上皮細胞が培養される表面には温度応答性高分子が被覆されている必要性がある。
【００３４】
本発明において、細胞の培養は上述のようにして製造された細胞培養支持体上で行われる。培地温度は、基材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。
【００３５】
本発明の方法において、培養した細胞を支持体材料から剥離回収するには、培養された高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートをキャリアに密着させ、細胞の付着した支持体材料の温度を支持体基材の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって、そのままキャリアとともに剥離することができる。なお、シートを剥離することは細胞を培養していた培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。
【００３６】
本発明では、細胞シートを患部に当てた後、細胞シートをキャリアからはがせば良い。そのはがし方は、何ら制約されるものではないが、例えば、キャリアを濡らしてキャリアと細胞シートの密着性を弱めてはがす方法、或いはメス、はさみ、レーザー光、プラズマ波などの治具を用いても切断する方法でも良い。例えば上述したような一部を切り抜いたキャリアに密着した細胞シートを用いた場合、レーザー光などを用いて患部の境界線に沿って切断すると患部以外の余計なところへの細胞シートの付着を避けられ好都合である。
【００３７】
本発明で示すところの高生着性再生角膜上皮細胞シート、その重層化シートと生体組織との固定方法は特に限定されるものではなく、細胞シートと生体組織を縫合しても良く、或いは本発明で示すところの高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートは生体組織と速やかに生着するため、患部に付着させた細胞シートは生体側と縫合しなくても良い。特に後者の場合、移植した細胞シートを保護する意味でコンタクトレンズを併用しても良い。
【００３８】
本発明における重層化シートの製造法は特に限定されるものではないが、例えば、一般的に知られている３Ｔ３細胞をフィーダーレイヤーとして増殖、重層化させる方法、或いは上記のキャリアに密着した高生着性再生角膜上皮細胞シートを利用することで製造する方法等を挙げることができる。具体的には、次のような方法が例示される。
（１）キャリアと密着した細胞シートを細胞培養支持体に付着させ、その後培地を加えることでキャリアを細胞シートからはがし、そして更に別のキャリアと密着した細胞シートを付着させることを繰り返すことで細胞シートを重層化させる方法。
（２）キャリアと密着した細胞シートを反転させ細胞培養支持体上でキャリア側で固定させ、細胞シート側に別の細胞シートを付着させ、その後培地を加えることでキャリアを細胞シートからはがし、再び別の細胞シートを付着させる操作を繰り返すことで細胞シートを重層化させる方法。
（３）キャリアと密着した細胞シート同士を細胞シート側で密着させる方法。
（４）キャリアと密着した細胞シートを生体の患部に当て、細胞シートを生体組織に付着させた後、キャリアをはがし、再び別の細胞シートを重ねていく方法。
【００３９】
本発明における重層化シートは、必ずしも角膜上皮細胞だけからなるものでなくても良い。例えば、角膜上皮細胞シートと同様に操作して作製した角膜内皮細胞シート及び／または結膜上皮細胞シートを重ね合わせることも可能である。生体内の前眼部組織により近いものとする上でこのような技術は極めて有効である。
【００４０】
高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを高収率で剥離、回収する目的で、細胞培養支持体を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。加えて、必要に応じて培養細胞は等張液等で洗浄して剥離回収してもよい。
【００４１】
本発明に示される高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートの用途は何ら制約されるものではないが、例えば角膜びらん、角膜潰瘍、或いはエキシマレーザーを中央部に照射して角膜表面を削り、角膜の屈折力を減少させて近視を矯正するピーアールケー（ＰＲＫ）法、マイクロケラトームによって１６０μｍの厚さで角膜実質層を切断しフラップを作製した後、フラップをめくり、エキシマレーザーで角膜実質層を削り取り、表面を整え、最後にフラップを元の位置に戻すレーシック（ＬＡＳＩＫ）法、アルコールを点眼し角膜表面を柔らかくし、マイクロケラトームを使わずに角膜上皮の５０μｍの厚さで切除してフラップを作製し、エキシマレーザーで角膜実質層を削り取り、表面を整え、最後にフラップを元の位置に戻すレーゼック（ＬＡＳＥＫ）法などの屈折矯正に有効である。
【００４２】
上述の方法により得られた高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートは、従来の方法により得られたものに比べて、剥離の際の非侵襲性の点で極めて優れており、移植用角膜等の臨床応用が強く期待される。特に、本発明の高生着性再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートは従来の移植シートとは異なり、生体組織との高い生着性を有するため、極めて速く生体組織に生着する。このことは、患部の治療効率の向上、更には患者の負担の軽減もはかられ極めて有効な技術と考えられる。なお、本発明の方法において使用される細胞培養支持体は繰り返し使用が可能である。
【実施例】
【００４３】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００４４】
実施例１、２
市販の６ウェル用セルインサート（ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）社製 ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）３０９０）上に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマーを３０％(実施例１)、３５％（実施例２）になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを０．０８ｍｌ塗布した。０．２５ＭＧｙの強度の電子線を照射し、培養皿表面にＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を固定化した。照射後、イオン交換水により培養皿を洗浄し、残存モノマーおよび培養皿に結合していないＰＩＰＡＡｍを取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、エチレンオキサイドガスで滅菌することで細胞培養支持体材料を得た。基材表面における温度応答性高分子量を測定したところ、それぞれ１．３μｇ／ｃｍ2（実施例１）、１．５μｇ／ｃｍ2（実施例２）被覆されていることが分かった。得られた細胞培養支持体材料上にて、常法により正常ウサギ角膜上皮細胞を培養した（使用培地：コルネパック（クラボウ（株）製。３７℃、５％ＣＯ２下）。その結果、何れの細胞培養支持体材料上の角膜上皮細胞においても正常に付着し、増殖した。
【００４５】
培養７日後に培養した細胞はコンフルエントの状態となり、さらに７日間培養した細胞の上に直径１．５ｃｍの円状に切り抜いた直径２．１ｃｍのポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜から成型したキャリアをかぶせ、培地を静かに吸引し、細胞培養支持体材料ごと２０℃で３０分インキュベートし冷却することで、何れの細胞培養支持体材料上の細胞もかぶせたキャリアと共に剥離させられた。得られた細胞シートは収縮率５％以下の１枚のシートとして十分に強度を持ったものであった。
【００４６】
なお、上記各実施例において、「低温処理」は２０℃で３０分インキュベートという条件下で行われたが、本発明において「低温処理」はこれらの温度及び時間に限定されない。本発明における「低温処理」として好ましい温度条件は０℃〜３０℃であり、好ましい処理時間は２分〜１時間である。
【００４７】
実施例１、２で得られた角膜上皮細胞シートを角膜上皮組織部が欠損した角膜びらん疾病モデルであるウサギに常法に従い移植した。角膜上皮細胞シートを創傷部へ１５分間付着させ、その後、メスを用いて患部以外のところに重なる細胞シートを切除した。その際、細胞シートと生体側の縫合は行わなかった。また、実施例２については移植後、患部にコンタクトレンズを装着させた。3週間後、患部を観察したところ、実施例１、２共に角膜上皮細胞シートは眼球に良好に生着していた。
【００４８】
実施例３
実施例１の細胞培養支持体上で、培地をマイトマイシンＣを含む通常のグリーンらの培地（ＤＭＥＭ＋ＡＢ（フィーダーレイヤー作製用）、ヒト新生児由来角化表皮細胞用）に変更する以外は同様な方法で正常ウサギ角膜上皮細胞を培養させた。その結果、培養支持体材料上の角膜上皮細胞は正常に付着し、増殖した。
【００４９】
培養６日後にコンフルエントな状態となり、さらに６日間培養して重層化させた。次に、直径１．５ｃｍの円状に切り抜いた直径２．１ｃｍのポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜から成型したキャリアをかぶせ、培地を静かに吸引し、細胞培養支持体材料ごと２０℃で３０分インキュベートし冷却することで、細胞培養支持体材料上の細胞シートをかぶせたキャリアと共に剥離させられた。さらに細胞培養支持体材料ごと２０℃で３０分インキュベートし冷却することで重層化角膜上皮細胞を剥離させられた。剥離された重層化シートは収縮率５％以下の１枚のシートとして十分に強度を持ったものであった。
【００５０】
実施例３で得られた角膜上皮細胞重層化シートを角膜上皮組織部が欠損した角膜びらん疾病モデルであるウサギに常法に従い移植した。角膜上皮細胞シートを創傷部へ１５分間付着させ、その後、レーザー光を用いて患部以外のところに重なる細胞シートを切除した。その際、細胞シートと生体側の縫合は行わなかった。3週間後、患部を観察したところ、角膜上皮細胞重層化シートは眼球に良好に生着していた。
【００５１】
比較例１
実施例１で角膜上皮細胞シートを作製し、キャリアを使わずに細胞シートを剥離させ、収縮させること以外は実施例１と同様に角膜上皮細胞シートを製造した。その際の収縮率は、４２％であった。
【００５２】
実施例１と同様に得られた角膜上皮細胞シートを角膜上皮組織部を欠損させたウサギに常法に従い移植した。角膜上皮細胞シートを創傷部へ１５分間付着させ、その後、メスを用いて患部以外のところに重なる細胞シートを切除した。その際、細胞シートと生体側の縫合は行わなかった。移植１日後に患部を観察したところ、角膜上皮細胞シートの眼球への生着性は悪く、患部より脱落しかけていた。
【００５３】
比較例２
実施例３で角膜上皮細胞重層化シートを作製し、細胞培養支持体から剥離するまでの期間をコンフルエントに達してから２８日後としたこと以外は実施例３と同様に角膜上皮細胞重層化シートを製造した。得られたシートの収縮率は５％以下であり、１枚の膜として十分に強度のあるものであった。
【００５４】
次に、実施例３と同様に得られた角膜上皮細胞重層化シートを角膜上皮組織部を欠損させたウサギに常法に従い移植した。角膜上皮細胞シートを創傷部へ１５分間付着させ、その後、メスを用いて患部以外のところに重なる細胞シートを切除した。その際、細胞シートと生体側の縫合は行わなかった。移植１日後に患部を観察したところ、角膜上皮細胞シートの眼球への生着性は悪く、患部より脱落しかけていた。
【００５５】
実施例４
実施例３に示す方法と全く同様な方法でキャリアに密着した角膜上皮細胞重層化シートを作製した。このものを近視治療法として知られるレーシック（ＬＡＳＩＫ）法における角膜上皮フラップの代替になるものかどうかを検討した。
【００５６】
具体的には、まずウサギ角膜に対しマイクロケラトームによって１６０μｍの厚さで角膜実質層を切断しフラップを作製した後、そのフラップを除去し、さらにエキシマレーザーで角膜実質層を削り取り、表面を整え、最後に本来フラップを戻す場所に実施例３で得られたキャリアに密着した角膜上皮細胞重層化シートを付着させた。レーザー光で患部と同じ大きさに角膜上皮細胞重層化シートを切断し、移植を完了した。縫合は行わなかった。3週間後、患部を観察したところ、角膜上皮細胞重層化シートは眼球に良好に生着しており、本発明の角膜上皮細胞重層化シートはレーシック法にも有効であると考えた。
【００５７】
実施例５
実施例３に示す方法と全く同様な方法でキャリアに密着した角膜上皮細胞重層化シートを作製した。このものを近視治療法として知られるレーゼック（ＬＡＳＥＫ）法における角膜上皮フラップの代替になるものかどうかを検討した。
【００５８】
具体的には、まずウサギ角膜に対しアルコールを点眼し角膜表面を柔らかくし、マイクロケラトームを使わずに角膜上皮の５０μｍの厚さで切除してフラップを作製した後、そのフラップを除去し、エキシマレーザーで角膜実質層を削り取り、表面を整え、最後に本来フラップを戻す場所に実施例３で得られたキャリアに密着した角膜上皮細胞重層化シートを付着させた。レーザー光で患部と同じ大きさに角膜上皮細胞重層化シートを切断し、移植を完了した。縫合は行わなかった。3週間後、患部を観察したところ、角膜上皮細胞重層化シートは眼球に良好に生着しており、本発明の角膜上皮細胞重層化シートはレーゼック法にも有効であると考えた。
【００５９】
以上の結果より、本技術によれば、前眼部組織への付着性が良好な高生着性再生角膜上皮細胞シート、その重層化シートの作成が可能であることがわかった。このことは、治療の簡便化、効率化による患者の負担軽減という点において極めて有効な技術と考えられる。
【発明の効果】
【００６０】
本発明で得られる高生着性再生角膜上皮細胞シート、その重層化シートは生体組織への生着性が極めて高く、たとえば角膜移植、角膜疾患治療、近視治療等の臨床応用が強く期待される。したがって、本発明は細胞工学、医用工学、などの医学、生物学等の分野における極めて有用な発明である。[Industrial application fields]
[0001]
The present invention relates to a highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet in the fields of biology, medicine, etc., a production method, and a therapeutic method using them.
[Prior art]
[0002]
Due to the remarkable development of medical technology, in recent years, organ transplants that attempt to replace difficult-to-treat organs with other organs have become common. The target organs are very diverse, such as skin, cornea, kidney, liver, heart, etc., and the progress after surgery has improved remarkably, and has already been established as a medical technology. Taking corneal transplantation as an example, an eye bank was established in Japan about 40 years ago and transplantation activities began. However, the number of donors is still small, and there are about 20,000 patients who need corneal transplantation in Japan alone, whereas only about 1/10 patients who can actually undergo transplantation treatment are about 2000. It is said. Despite the almost established technology of corneal transplantation, the current situation is that the next medical technology is required due to the shortage of donors.
[0003]
Against this background, techniques for transplanting artificial substitutes or cells that have been cultured and organized have attracted attention. Representative examples thereof include artificial skin and cultured skin. However, artificial skin using a synthetic polymer may cause rejection and the like, and is not preferable as skin for transplantation. On the other hand, since the cultured skin is obtained by culturing a part of the normal skin of the person to a desired size, even if it is used, there is no concern about rejection or the like, and it can be said to be the most natural masking agent.
[0004]
Conventionally, such cell culture has been performed on the surface of a synthetic polymer subjected to various treatments. For example, various containers and the like subjected to surface treatment using polystyrene as a material, for example, γ-ray irradiation, silicone coating, and the like are widely used as cell culture containers. Cells cultured and proliferated using such a cell culture container are peeled and collected from the container surface by treatment with a protease such as trypsin or a chemical.
[0005]
However, when recovering cells grown by chemical treatment as described above, the treatment process becomes complicated, the possibility of contamination is increased, and the grown cells are altered or damaged by chemical treatment. Disadvantages have been pointed out that there are cases where the original function of cells is impaired. In order to overcome such drawbacks, several techniques have been proposed so far.
[0006]
In Japanese Patent Publication No. 2-23191, keratinized epidermis cells derived from human newborns are cultured in a culture container under the condition that a keratinous tissue film is formed on the surface of the container. A method for producing an implantable membrane of keratinous tissue, characterized in that it is exfoliated using Specifically, a technique is disclosed in which 3T3 cells are grown and layered as a feeder layer, and a cell sheet is recovered using dispase, which is a proteolytic enzyme. However, the method described in the publication has the following drawbacks.
(1) Dispase is derived from bacteria, and the collected cell sheet needs to be thoroughly washed.
(2) Dispase treatment conditions differ for each cultured cell, and skill is required for the treatment.
(3) The epidermal cells cultured by dispase treatment are pathologically activated.
(4) The extracellular matrix is degraded by dispase treatment.
(5) Therefore, the affected part transplanted with the cell sheet is easily infected.
[0007]
In addition to the disadvantages of the conventional methods as described above, the anterior ocular segment-related cells such as corneal epithelial cells, corneal endothelial cells, and conjunctival epithelial cells that are the subject of the present invention have stronger cell-cell connections as skin cells. Therefore, even with the above dispase, it was disadvantageous that it could not be peeled and collected as a single sheet after culturing.
[0008]
In order to solve this problem, recently, a technique has been devised in which corneal epithelial cells and conjunctival epithelial cells are cultured and organized on the amniotic membrane from which the sponge layer and the epithelial layer have been removed, and the amnion is used as a cell piece for transplantation. (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-161353). Amniotic membrane is convenient as a support for transplanted cell debris because it has sufficient membrane strength and is not antigenic. However, amniotic membrane is not originally in the eye and more precisely in the intraocular tissue. In order to construct a sheet, it was desired to produce a sheet having sufficient strength with only cells in the eye.
[0009]
In Japanese Patent Application No. 2001-226141, an anterior ocular segment-related cell is cultured on a cell culture support in which a temperature-responsive polymer having an upper or lower critical solution temperature in water of 0 to 80 ° C. is coated on the substrate surface. However, if necessary, it is possible to produce a cell sheet with sufficient strength by layering the cultured cell layer by a conventional method and peeling the cultured cell sheet simply by changing the temperature of the support. . In addition, this cell sheet also retains a basement membrane-like protein, and the engraftment to the tissue is clearly improved as compared with the above-mentioned dispase-treated one. However, considering the reduction of actual patient burden, further improvement in the engraftment has been desired.
[0010]
Recently, various methods have been proposed in the medical field. For example, WO98 / 31316 proposes a technique that utilizes a cultured corneal epithelial cell sheet when performing the PRK method and the LASIK method for myopia treatment. However, the cultured corneal epithelial sheet here has been peeled off by the above-mentioned dispase, has poor adhesion to a corneal tissue scraped with a laser, and has a problem that a remarkable therapeutic effect cannot be expected.
[Problems to be solved by the invention]
[0011]
The present invention has been made with the intention of solving the problems of the prior art as described above. That is, an object of the present invention is to provide a highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or a multilayered sheet thereof that has good adhesion to the anterior segment tissue. Moreover, an object of this invention is to provide the manufacturing method and its utilization method.
[Means for Solving the Problems]
[0012]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have studied and developed from various angles. As a result, corneal epithelial cells are cultured under specific conditions on a cell culture support with specific conditions coated with a temperature-responsive polymer, and then the culture solution temperature is equal to or higher than the upper critical solution temperature or lower critical solution temperature. Adhering the cultured regenerated corneal epithelial cell sheet or its stratified sheet to a specific carrier and exfoliating it with the carrier as it is while suppressing the contraction of the cell sheet. It has been found that a regenerated corneal epithelial cell sheet or a multilayered sheet thereof can be obtained. The present invention has been completed based on such findings.
[0013]
That is, the present invention provides a highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or a multilayered sheet thereof that has good adhesion to an anterior segment tissue and is in close contact with a carrier.
[0014]
In the present invention, cells are cultured on a cell culture support having a base surface coated with a temperature-responsive polymer having an upper or lower critical solution temperature in water of 0 to 80 ° C. Layer the cultured cell layer, and then
(1) The culture solution temperature is set to the upper critical solution temperature or higher or the lower critical solution temperature or lower,
(2) Adhering the cultured corneal epithelial cell sheet or its multilayered sheet to a carrier,
(3) Peel off with carrier as it is
A highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or a multilayered sheet thereof is provided.
[0015]
In addition, the present invention provides the highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or a stratified sheet thereof for treating a tissue that has been deeply damaged and / or wounded.
[0016]
In addition, the present invention provides a therapeutic method characterized by transplanting the highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or a stratified sheet thereof to a tissue that has been deeply damaged and / or wounded.
[0017]
Furthermore, the present invention provides not only a medical field but also a highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or a multilayered sheet thereof useful as a cell for safety evaluation of chemical substances, toxic substances, or pharmaceuticals.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of suitable cells used in the preparation of the anterior segment-related cell sheet or three-dimensional structure of the present invention include corneal epithelial cells and stem cells thereof, but the types are not limited. In the present invention, the highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet means a sheet in which various cells described above are cultured in a single layer on a culture support and then peeled off from the support. The highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet means a sheet laminated in a state where it is used alone or in combination with a sheet composed of other cells.
[0019]
The highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or the stratified sheet according to the present invention is not damaged by proteolytic enzymes such as dispase and trypsin during culture. For this reason, the highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or its multi-layered sheet peeled from the substrate retains the cell-cell desmosome structure, has few structural defects, and has high strength. In addition, in the sheet of the present invention, the basement membrane-like protein between the cell and the substrate formed during the culture is not damaged by the enzyme. As a result, it is possible to adhere well to the affected tissue at the time of transplantation, and an efficient treatment can be performed. Specifically, when using a normal proteolytic enzyme such as trypsin, the cell-cell desmosome structure and the cell, the basement membrane-like protein between the substrates is hardly retained, Therefore, the cells are separated and separated in an individual state. Among them, dispase, a proteolytic enzyme, is known to be able to be detached in a state where the cell-cell desmosome structure is maintained at 10 to 60%. The obtained cell sheet is weak because it almost destroys the protein. In contrast, the cell sheet of the present invention is in a state where 80% or more of the desmosome structure and the basement membrane-like protein remain, and can obtain various effects as described above.
[0020]
The highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or its multi-layered sheet in the present invention engrafts very well on the anterior ocular tissue which is a living tissue. It has been found that this property is realized by suppressing the shrinkage of the regenerated corneal epithelial cell sheet peeled from the support surface or its multilayered sheet. At that time, the contraction rate of the regenerated corneal epithelial cell sheet or the multilayered sheet thereof is desirably 20% or less, preferably 10% or less, more preferably 5% or less, in the length in any direction within the sheet. Preferably there is. When the length in any direction of the sheet is 20% or more, the detached cell sheet is sagging, and even if it adheres to the living tissue in that state, it does not adhere to the tissue. I can't expect wearing.
[0021]
The method of not shrinking the regenerated corneal epithelial cell sheet or its multilayered sheet is not limited as long as it does not shrink the cell sheet. For example, the regenerated corneal epithelial cell sheet or its multilayered sheet is removed from the support. When peeling, a method of peeling a cell sheet together with the carrier, such as a ring-shaped carrier with a central portion cut out, may be mentioned.
[0022]
The carrier used when closely adhering the highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or the multilayered sheet thereof is a structure for holding the cell sheet of the present invention so as not to contract, such as a polymer film or a polymer film. It is possible to use a structure, a metallic jig, etc. molded from the above. For example, when a polymer is used as the carrier material, specific examples of the material include polyvinylidene difluoride (PVDF), polypropylene, polyethylene, cellulose and derivatives thereof, papers, chitin, chitosan, collagen, urethane, and the like. Can be mentioned.
[0023]
In the present invention, close contact refers to a state in which the cell sheet does not shift or move on the carrier at the boundary surface between the cell sheet and the carrier so that the cell sheet does not contract. Even if they are in close contact, they may be in close contact via a liquid (for example, a culture solution or other isotonic solution) existing between the two.
[0024]
The shape of the carrier is not particularly limited. For example, when transplanting the obtained highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or a stratified sheet thereof, a part of the carrier is similar to the transplant site or the transplant site. When a larger cutout is used, the cell sheet is fixed only to the peripheral portion of the cutout, and it is only necessary to apply the cellsheet in the cutout portion to the transplantation site.
[0025]
Moreover, the high engraftment property to the living tissue, which is a feature of the regenerated corneal epithelial cell sheet or the multilayered sheet in the present invention, is realized under specific culture conditions. That is, the cell sheet or the layered sheet of the present invention can be obtained by seeding and culturing corneal epithelial cells on the support surface, but after the cells become confluent (full state) on the support surface. It has been found that it is preferably 21 days or less, preferably 15 days or less, and more preferably 10 days or less. If it is longer than 21 days, the activity of the peeled regenerated corneal epithelial cell sheet or the lowermost layer of the multi-layered sheet is lowered, so that the adherence is also reduced, and the high engraftment according to the present invention cannot be expected.
[0026]
The anterior ocular tissue of the present invention is not particularly limited as long as it is an anterior ocular segment, and generally includes corneal epithelial tissue, Bowman tissue, corneal parenchymal tissue, and the like.
[0027]
As described above, the highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or the stratified sheet according to the present invention is a cell sheet that can adhere to an anterior ocular tissue which is a living tissue, and is completely obtained from the prior art. It was not.
[0028]
The temperature-responsive polymer used for coating the substrate in the cell culture support has an upper critical solution temperature or a lower critical solution temperature of 0 ° C to 80 ° C, more preferably 20 ° C to 50 ° C in an aqueous solution. If the upper critical lysis temperature or the lower critical lysis temperature exceeds 80 ° C., the cells may die, which is not preferable. Further, if the upper critical lysis temperature or the lower critical lysis temperature is lower than 0 ° C., the cell growth rate is generally extremely reduced or cells are killed, which is also not preferable.
[0029]
The temperature-responsive polymer used in the present invention may be either a homopolymer or a copolymer. Examples of such a polymer include polymers described in JP-A-2-21865. Specifically, for example, it can be obtained by homopolymerization or copolymerization of the following monomers. Examples of the monomer that can be used include a (meth) acrylamide compound, an N- (or N, N-di) alkyl-substituted (meth) acrylamide derivative, or a vinyl ether derivative. Two or more of these can be used. Furthermore, copolymerization with monomers other than the above monomers, grafting or copolymerization of polymers, or a mixture of polymers and copolymers may be used. Moreover, it is also possible to crosslink within a range that does not impair the original properties of the polymer.
[0030]
Examples of the base material to be coated include substances that can generally give form, such as glass, modified glass, polystyrene, polymethylmethacrylate, and the like, which are usually used for cell culture, such as polymers other than those described above. All compounds, ceramics, etc. can be used.
[0031]
The method for coating the support with the temperature-responsive polymer is not particularly limited, and may be, for example, the method described in JP-A-2-21865. That is, such coating is performed by applying a substrate and the above monomer or polymer to one of electron beam irradiation (EB), γ-ray irradiation, ultraviolet irradiation, plasma treatment, corona treatment, organic polymerization reaction, or physical application such as coating and kneading. It can be performed by, for example, mechanical adsorption.
[0032]
The coating amount of the temperature-responsive polymer is 0.4 to 4.5 μg / cm. 2 The range is good, preferably 0.7 to 3.5 μg / cm 2 And more preferably 0.9 to 3.0 μg / cm 2 It is. 0.2 μg / cm 2 When the coating amount is smaller, the cells on the polymer are not easily detached even if a stimulus is given, and the working efficiency is remarkably deteriorated. Conversely, 4.5 μg / cm 2 If it is as described above, it is difficult for the cells to adhere to the region, and it becomes difficult to sufficiently attach the cells.
[0033]
The form of the support in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a dish, a multiplate, a flask, and a cell insert. Among them, cell inserts are particularly advantageous because, for example, 3T3 feeder cells necessary for stratifying corneal epithelial cells can be cultured separately from corneal epithelial cells. At that time, the corneal epithelial cells may be on the cell insert side or on the dish side on which the cell insert is mounted, and at least the surface on which the corneal epithelial cells are cultured is coated with a temperature-responsive polymer. There is a need.
[0034]
In the present invention, cells are cultured on the cell culture support produced as described above. The culture medium temperature is not particularly limited as long as the polymer coated on the substrate surface has an upper critical solution temperature or lower, and when the polymer has a lower critical solution temperature or higher, the temperature is not particularly limited. However, it goes without saying that culturing in a low temperature range where cultured cells do not proliferate or in a high temperature range where cultured cells die is inappropriate. The culture conditions other than the temperature may be in accordance with conventional methods and are not particularly limited. For example, the medium to be used may be a medium to which serum such as known fetal calf serum (FCS) is added, or a serum-free medium to which such serum is not added.
[0035]
In the method of the present invention, in order to peel and recover the cultured cells from the support material, the cultured highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or a multilayered sheet thereof is brought into close contact with the carrier, and the support material to which the cells are attached By setting the temperature to the upper limit critical dissolution temperature or lower limit critical dissolution temperature of the support polymer of the support substrate, it can be peeled off with the carrier as it is. Note that peeling of the sheet can be performed in a culture solution in which cells are cultured or in another isotonic solution, and can be selected according to the purpose.
[0036]
In the present invention, after the cell sheet is applied to the affected area, the cell sheet may be peeled off from the carrier. The method of peeling is not limited at all, but for example, a method of wetting the carrier to weaken the adhesion between the carrier and the cell sheet, or using a knife such as a knife, scissors, laser light, plasma wave, etc. Also, a method of cutting may be used. For example, when using a cell sheet that is in close contact with a carrier that has been partially cut out as described above, cutting along the boundary line of the affected area using laser light or the like avoids attachment of the cell sheet to an extra area other than the affected area. It is convenient.
[0037]
The highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet as shown in the present invention, the method for fixing the multilayered sheet and the living tissue are not particularly limited, and the cell sheet and the living tissue may be sutured, or the present invention Since the highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet or the layered sheet thereof is rapidly engrafted with living tissue, the cell sheet attached to the affected area does not have to be sutured to the living body side. In particular, in the latter case, a contact lens may be used in combination to protect the transplanted cell sheet.
[0038]
The production method of the multilayered sheet in the present invention is not particularly limited. For example, a generally known method of proliferating and stratifying 3T3 cells as a feeder layer, or high engraftment in close contact with the above carrier The method etc. which manufacture by using a sex regenerated corneal epithelial cell sheet can be mentioned. Specifically, the following method is exemplified.
(1) A cell sheet adhered to a carrier is adhered to a cell culture support, and then the medium is added to peel the carrier from the cell sheet, and further, a cell sheet adhered to another carrier is repeatedly adhered to the cell. A method of layering sheets.
(2) The cell sheet in close contact with the carrier is inverted and fixed on the carrier side on the cell culture support, another cell sheet is attached to the cell sheet side, and then the medium is added to peel off the carrier from the cell sheet. A method of layering cell sheets by repeating the operation of attaching another cell sheet.
(3) A method in which cell sheets in close contact with a carrier are brought into close contact with each other on the cell sheet side.
(4) A method in which a cell sheet in close contact with a carrier is applied to an affected part of a living body, the cell sheet is attached to a living tissue, the carrier is peeled off, and another cell sheet is stacked again.
[0039]
The stratified sheet in the present invention does not necessarily need to be composed only of corneal epithelial cells. For example, a corneal endothelial cell sheet and / or a conjunctival epithelial cell sheet prepared by operating in the same manner as the corneal epithelial cell sheet can be overlapped. Such a technique is extremely effective in making it closer to the anterior ocular tissue in the living body.
[0040]
For the purpose of exfoliating and collecting the highly engrafted regenerative corneal epithelial cell sheet or its stratified sheet with high yield, the cell culture support is tapped or shaken, and the medium is stirred using a pipette. The methods and the like may be used alone or in combination. In addition, the cultured cells may be separated and recovered by washing with an isotonic solution or the like as necessary.
[0041]
The use of the highly engrafted regenerative corneal epithelial cell sheet or the stratified sheet shown in the present invention is not limited at all. For example, corneal erosion, corneal ulcer, or excimer laser is irradiated to the central part to irradiate the corneal surface. The PRK method, which reduces the refractive power of the cornea and corrects myopia, cuts the corneal stroma with a thickness of 160 μm using a microkeratome, turns the flap, turns the flap, and excimer lasers the corneal stroma The layer is shaved, the surface is trimmed, and the LASIK method is used to return the flap to its original position. The alcohol is instilled to soften the corneal surface, and the corneal epithelium is cut to a thickness of 50 μm without using a microkeratome. Create a flap, scrape off the corneal stroma with an excimer laser, prepare the surface, and finally return the flap to its original position. This is effective for refractive correction such as the LASEK method.
[0042]
The highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet obtained by the above-mentioned method or its stratified sheet is extremely superior in terms of non-invasiveness at the time of exfoliation compared to those obtained by the conventional method. Clinical applications such as corneas are strongly expected. In particular, unlike the conventional transplanted sheet, the highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet of the present invention or its multi-layered sheet has a high engraftability with the living tissue, and thus engrafts the living tissue very quickly. This is considered to be an extremely effective technique that improves the treatment efficiency of the affected area and further reduces the burden on the patient. The cell culture support used in the method of the present invention can be used repeatedly.
【Example】
[0043]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but these do not limit the present invention in any way.
[0044]
Examples 1 and 2
30% of N-isopropylacrylamide monomer (Example 1) and 35% (Example 2) on a commercially available 6-well cell insert (Falcon 3090 manufactured by Becton Dickinson Labware) Then, 0.08 ml of a solution dissolved in isopropyl alcohol was applied. An electron beam with an intensity of 0.25 MGy was irradiated to immobilize N-isopropylacrylamide polymer (PIPAAm) on the surface of the culture dish. After irradiation, the culture dish was washed with ion-exchanged water to remove residual monomer and PIPAAm not bound to the culture dish, dried in a clean bench, and sterilized with ethylene oxide gas to obtain a cell culture support material. . When the temperature-responsive high molecular weight on the substrate surface was measured, it was 1.3 μg / cm respectively. 2 (Example 1), 1.5 μg / cm 2 (Example 2) It was found to be coated. On the obtained cell culture support material, normal rabbit corneal epithelial cells were cultured by a conventional method (medium used: Cornepack (Kurabo Co., Ltd., 37 ° C., 5% CO 2 under). As a result, the corneal epithelial cells on any cell culture support material adhered and proliferated normally.
[0045]
Cells cultured after 7 days of culture become confluent, and a carrier molded from a polyvinylidene difluoride (PVDF) film with a diameter of 2.1 cm cut into a 1.5 cm diameter circle on the cells cultured for 7 days. The medium was gently aspirated, and the cell culture support material was incubated at 20 ° C. for 30 minutes and cooled, so that the cells on any of the cell culture support materials were detached together with the covered carrier. The obtained cell sheet was sufficiently strong as a single sheet having a shrinkage rate of 5% or less.
[0046]
In each of the above examples, “low temperature treatment” was performed under the condition of incubation at 20 ° C. for 30 minutes. However, in the present invention, “low temperature treatment” is not limited to these temperatures and times. A preferable temperature condition for the “low temperature treatment” in the present invention is 0 ° C. to 30 ° C., and a preferable treatment time is 2 minutes to 1 hour.
[0047]
The corneal epithelial cell sheets obtained in Examples 1 and 2 were transplanted according to a conventional method to a rabbit which is a corneal erosion disease model in which the corneal epithelial tissue part was defective. The corneal epithelial cell sheet was allowed to adhere to the wounded part for 15 minutes, and then the cell sheet that overlapped the area other than the affected part was excised using a scalpel. At that time, the cell sheet and the living body were not sutured. In Example 2, a contact lens was attached to the affected area after transplantation. After 3 weeks, the affected area was observed, and in both Examples 1 and 2, the corneal epithelial cell sheet was well engrafted in the eyeball.
[0048]
Example 3
In the same manner as in Example 1, except that the medium is changed to a normal Green et al. Medium (DMEM + AB (for feeder layer preparation), for human neonatal keratinized epidermal cells) containing mitomycin C on the cell culture support of Example 1. Normal rabbit corneal epithelial cells were cultured. As a result, the corneal epithelial cells on the culture support material adhered normally and proliferated.
[0049]
After 6 days of culturing, the cells became confluent and were further cultivated for 6 days to be layered. Next, a carrier molded from a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane having a diameter of 2.1 cm cut out into a circular shape having a diameter of 1.5 cm is covered, the medium is gently aspirated, and the whole cell culture support material is heated at 20 ° C. By incubating for 30 minutes and cooling, the cell sheet on the cell culture support material was peeled off with the carrier covered. Further, the stratified corneal epithelial cells were detached by incubating the whole cell culture support material at 20 ° C. for 30 minutes and cooling. The peeled multilayered sheet was sufficiently strong as a single sheet having a shrinkage rate of 5% or less.
[0050]
The corneal epithelial cell stratified sheet obtained in Example 3 was transplanted to a rabbit, which is a corneal erosion disease model in which the corneal epithelial tissue part was defective, according to a conventional method. The corneal epithelial cell sheet was allowed to adhere to the wounded part for 15 minutes, and then the cell sheet that overlapped the part other than the affected part was excised using a laser beam. At that time, the cell sheet and the living body were not sutured. After 3 weeks, when the affected area was observed, the corneal epithelial cell layered sheet satisfactorily engrafted in the eyeball.
[0051]
Comparative Example 1
A corneal epithelial cell sheet was produced in the same manner as in Example 1, except that a corneal epithelial cell sheet was prepared in Example 1, and the cell sheet was peeled and contracted without using a carrier. The shrinkage at that time was 42%.
[0052]
The corneal epithelial cell sheet obtained in the same manner as in Example 1 was transplanted to a rabbit lacking the corneal epithelial tissue according to a conventional method. The corneal epithelial cell sheet was allowed to adhere to the wounded part for 15 minutes, and then the cell sheet that overlapped the area other than the affected part was excised using a scalpel. At that time, the cell sheet and the living body were not sutured. When the affected part was observed one day after transplantation, the corneal epithelial cell sheet had poor engraftment on the eyeball, and had fallen off from the affected part.
[0053]
Comparative Example 2
A corneal epithelial cell multilayered sheet was prepared in Example 3, and the corneal epithelial cell multilayered sheet was prepared in the same manner as in Example 3 except that the period until it was detached from the cell culture support was 28 days after reaching confluence. Manufactured. The shrinkage rate of the obtained sheet was 5% or less, and was sufficiently strong as one film.
[0054]
Next, the corneal epithelial cell stratified sheet obtained in the same manner as in Example 3 was transplanted to a rabbit deficient in the corneal epithelial tissue according to a conventional method. The corneal epithelial cell sheet was allowed to adhere to the wounded part for 15 minutes, and then the cell sheet that overlapped the area other than the affected part was excised using a scalpel. At that time, the cell sheet and the living body were not sutured. When the affected part was observed one day after transplantation, the corneal epithelial cell sheet had poor engraftment on the eyeball, and had fallen off from the affected part.
[0055]
Example 4
A corneal epithelial cell layered sheet adhered to the carrier was produced in the same manner as in Example 3. We examined whether this could be a substitute for the corneal epithelial flap in the LASIK method known as a myopia treatment method.
[0056]
Specifically, first, the rabbit cornea was cut by a microkeratome with a thickness of 160 μm to cut the corneal stroma layer to produce a flap, then the flap was removed, the excimer laser was further shaved off, and the surface was prepared, Finally, a corneal epithelial cell layered sheet adhered to the carrier obtained in Example 3 was attached to the place where the flap was originally returned. The corneal epithelial cell layered sheet was cut to the same size as the affected area with laser light, and the transplantation was completed. No suturing was performed. After 3 weeks, when the affected area was observed, the corneal epithelial cell stratified sheet satisfactorily adhered to the eyeball, and the corneal epithelial cell stratified sheet of the present invention was considered effective for the LASIK method.
[0057]
Example 5
A corneal epithelial cell layered sheet adhered to the carrier was produced in the same manner as in Example 3. We examined whether this could be a substitute for the corneal epithelial flap in the LAZEK method known as a myopia treatment method.
[0058]
Specifically, alcohol is first applied to the rabbit cornea to soften the cornea surface, and a flap is prepared by excising the corneal epithelium with a thickness of 50 μm without using a microkeratome, and then the excimer is removed. The corneal stroma was scraped off with a laser, the surface was prepared, and finally the corneal epithelial cell layered sheet adhered to the carrier obtained in Example 3 was attached to the place where the flap was originally returned. The corneal epithelial cell layered sheet was cut to the same size as the affected area with laser light, and the transplantation was completed. No suturing was performed. After 3 weeks, when the affected area was observed, the corneal epithelial cell stratified sheet satisfactorily engrafted in the eyeball, and the corneal epithelial cell stratified sheet of the present invention was considered to be effective for the Roseck method.
[0059]
From the above results, it has been found that according to the present technology, it is possible to produce a highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet having good adhesion to the anterior segment tissue and a multilayered sheet thereof. This is considered to be an extremely effective technique in terms of reducing the burden on the patient by simplifying treatment and increasing efficiency.
【The invention's effect】
[0060]
The highly engrafted regenerated corneal epithelial cell sheet obtained by the present invention and its multi-layered sheet have extremely high engraftability to living tissues, and are expected to be clinically applied, for example, for corneal transplantation, corneal disease treatment, myopia treatment and the like. Therefore, the present invention is extremely useful in the fields of medicine, biology, etc., such as cell engineering and medical engineering.
Claims (17)
（１）培養液温度を上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とし、
（２）培養した角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートを中心部を切り抜いた形状のキャリアに密着させ、
（３）そのままキャリアと共に剥離する
ことを特徴とする、再生角膜上皮細胞シートまたはその重層化シートの製造方法。Corneal epithelial cells or their stem cells are cultured on a cell culture support whose surface is coated with a temperature-responsive polymer having an upper or lower critical dissolution temperature in water of 0 to 80 ° C. Layer the cultured cell layer, then
(1) The culture solution temperature is set to the upper critical solution temperature or higher or the lower critical solution temperature or lower,
(2) Adhering the cultured corneal epithelial cell sheet or the multilayered sheet thereof to a carrier having a shape obtained by cutting out the center,
(3) A method for producing a regenerated corneal epithelial cell sheet or a multilayered sheet thereof, wherein the sheet is peeled off together with the carrier.
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