JP3929576B2

JP3929576B2 - Microorganism producing enzyme acting on phosphorylated 1,5-anhydroglucitol, enzyme produced by the microorganism, and method for quantifying phosphorylated 1,5-anhydroglucitol using the same

Info

Publication number: JP3929576B2
Application number: JP30364297A
Authority: JP
Inventors: 広司早出; 徹郎濱藤; 吉史渡津
Original assignee: 広司早出
Priority date: 1996-10-16
Filing date: 1997-10-16
Publication date: 2007-06-13
Anticipated expiration: 2017-10-16
Also published as: JPH10179143A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な微生物、それが産生する酵素及び当該酵素を使用した１，５−アンヒドログルシトールの定量方法に関する。より詳細には、リン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール類に作用する酵素を産生する微生物及び当該微生物が産生し、リン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール類を酸化し得る酵素、並びに当該酵素を使用したリン酸化１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの定量方法に関し、かかる酵素及び定量方法は、臨床検査などにおける１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（以下、１，５−ＡＧという）の定量に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
１，５−ＡＧはグルコース類似の構造を有するポリオールであり、ヒトでは血液、髄液、尿などに存在し、糖尿病患者では１，５−ＡＧ濃度が低下することが知られており、糖尿病の重要なマーカーとして注目されている。
従来、１，５−ＡＧはガスクロマトグラフィーにより定量されていた（検査と技術、21巻、No.6、407〜412、1982年）。しかし、この方法で定量するには特別な装置が必要であり、また操作が繁雑で熟練を要するため、臨床検査の分野で多数の検体を測定するには支障があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、操作性の改善を目的として１，５−ＡＧの定量に酵素を用いた方法が報告されている。例えば特開昭６３−１８５３９７号には１，５−ＡＧを酸化する酵素を用いて過酸化水素を産生させて１，５−ＡＧを定量する方法が開示されている。しかし、このような酸化酵素を用いる方法は、生体試料中のビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物質の影響を受けるという問題がある。更に、使用する酵素の１，５−ＡＧに対する基質特異性が低いため、臨床検査のような各種／多量の糖類を含む試料から微量の１，５−ＡＧのみを測定することは困難で、各種糖類の測定値に与える影響が大きい。特に、グルコースの正の影響が大きいため、これらの対策として、たとえば前記特開昭６３−１８５３９７号や特開平７−２３１７９６号では、強塩基性陰イオン交換樹脂やホウ酸処理法が開示されている。また特開平５−３０４９９６号では同様にｐＨを７．２〜８．５に調整する方法が開示されている。しかし、これらの方法はいずれも操作が繁雑であるという欠点があり、自動分析装置を用いて多数の検体を迅速に測定するには難点を持っていた。
【０００４】
このような臨床検査における実状を考慮して、自動化に適した検査方法の開発が行われ、特開平６−３０３９９５号、特開平６−１８９７５５号あるは特開平６−２３９７０４号に示すように、酸化還元酵素を用いた１，５−ＡＧの測定方法が検討されてきた。しかし、各種／多量の糖類を含む臨床検体試料中から微量の１，５−ＡＧを分別測定することは困難であった。特に、酸化酵素、例えば、ピラノースオキシダーゼを用いた方法では混在する糖類の測定値に与える影響が指摘されている（臨床化学、第２３巻、第２号、188〜194、1994年）。このような実状は精密かつ高精度を要求される臨床検査の分野では改善されなければならない問題である。
【０００５】
本発明者等はこのような従来の方法を改良して、臨床検査における検体試料の測定に適応できる方法、特に自動分析装置に利用できる方法について鋭意研究を行った。その結果、リン酸化１，５−ＡＧに作用する微生物を見出し、またこの微生物からリン酸化１，５−ＡＧに作用し得る酸化還元酵素の分離に成功した。そして、この酵素を、電子受容体の存在下にリン酸化１，５−ＡＧに作用させて、その酸化還元物を測定することにより、リン酸化１，５−ＡＧの測定が可能になることが確認され、更にその反応を利用することによって、１，５−ＡＧを高精度で測定できることを見出した。詳しくは、リン酸基供与体の存在下で、１，５−ＡＧにリン酸化酵素を作用させてリン酸化１，５−ＡＧを生成し、次いで本発明の酵素を作用させることにより１，５−ＡＧの測定が可能になる。
これらの方法は操作が繁雑でなく、反応条件が穏和なため自動分析装置での測定が可能となり、日常の臨床検査で多数の試料測定に有用であることが分かり、本発明を完成するに至った。本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、リン酸化１，５−ＡＧに作用する酸化還元酵素を産生する微生物及び当該微生物が産生する酸化還元酵素並びに当該酵素を使用したリン酸化１，５−ＡＧの定量方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明の要旨は、
▲１▼リン酸化１，５−ＡＧに作用する酸化還元酵素を産生するデレヤ属に属する微生物；
▲２▼微生物が、デレヤエスピー α-１５（ＦＥＲＭＢＰ−６１４０）である上記▲１▼記載の微生物；
▲３▼下記の理化学的性質及び生化学的性質を有する酵素；
ａ）リン酸化１，５−ＡＧに作用する；
ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約６７ｋＤａである；
ｃ）ゲル濾過法による推定分子量が約５５ｋＤａである；
ｄ）１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ型樹脂ゲルに吸着し、０．３ＭＮａＣｌを含有する同緩衝液で溶出する；
▲４▼リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに、電子受容体の存在下、上記▲３▼記載の酵素を作用させることを特徴とするリン酸化１，５−アンヒドログルシトールの定量方法；
▲５▼１，５−アンヒドログルシトールをリン酸化し、生成したリン酸化１，５−アンヒドログルシトールに、電子受容体の存在下、上記▲３▼記載の酵素を作用させることを特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの定量方法；
にある。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明による上記の微生物は、リン酸化１，５−ＡＧに作用する酸化還元酵素を産生する。当該酵素はリン酸化１，５−ＡＧ及び１，５−ＡＧの定量に有用である。
本発明の微生物の具体例であるデレヤエスピー α-１５株の菌学的性質は以下のとおりである。
(a)形態学的性状
1. 細胞の形及び大きさ：カン菌
2. 細胞の多形性の有無：なし
3. 運動性の有無：あり
4. 胞子の有無：なし
5. グラム染色性：陰性
【０００８】
(b)各培地における生育状態
1. 肉汁寒天平板培養：乳白色／良好
2. 肉汁寒天斜面培養：乳白色／良好
3. 肉汁液体培養：乳白色／良好
【０００９】
(c)生理学的性質
1. 硝酸塩の還元：陽性
2. 脱窒反応：陰性
3. ＶＰ反応：陰性
4. インドールの生成：陰性
5. 硫化水素の生成：陰性
6. クエン酸の利用：陰性
7. 色素の生成：陰性
8. ウレアーゼ：陰性
9. オキシダーゼ：陰性
10. カタラーゼ：陽性
11. 生育の範囲：ｐＨ６．０〜８．０／３０℃付近
12. 酸素に対する態度：好気性
13. Ｏ-Ｆテスト: 無変化型
14. 下記の糖類からの酸の生成
Ｌ−アラビノース：陽性
Ｄ−キシロース：陽性
Ｄ−グルコース：陽性
Ｄ−マンノース：陰性
Ｄ−フルクトース：陽性
Ｄ−ガラクトース：陽性
麦芽糖：陽性
ショ糖：陽性
乳糖：陽性
トレハロース：陽性
Ｄ−ソルビット：陽性
Ｄ−マンニット：陽性
イノシット：陽性
グリセリン：陽性
【００１０】
(d)その他の諸性質
1. β-ガラクトシダーゼ：陽性
2. アルギニンジヒドラーゼ：陰性
3. リジンデカルボキシラーセ：陰性
4. オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性
5. トリプトファンデアミナーゼ：陰性
6. ゼラチナーゼ：陰性
7. α−メチル−Ｄ−グルコシドでの増殖：陽性
8. ＮａＣｌの要求性：陽性
【００１１】
以上の菌学的性質から、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Ninth Edition)に基づいて検索したところ、本菌株はデレヤ(Deleya)属の細菌に比較的類似しているが、上記の諸性質と一致するものは見出されなかった。そこで、本発明菌はデレヤ属に属する新種の菌株と判断し、デレヤエスピー α-１５(Deleya sp. α-15)と命名した。また、この菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に「受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６１４０」として寄託されている。
【００１２】
本発明菌の培養は、当該菌株が良好に生育できるものであれば、いかなる培地及び培養条件であってもよく、かかる培養により増殖させて必要量の菌体を得ることができる。上記の培地は、適当な炭素源、窒素源、無機イオン及びその他必要な成分を含有させることができる。
培地の炭素源としては、グルコース、α−メチル−Ｄ−グルコシドなどが利用できる。また、窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が利用できる。更に、無機イオンとしては、リン酸イオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、銅イオン、マンガンイオンなどが利用できる。また、必要に応じて、培地には、ビタミン類、細胞増殖因子などの成分を添加することもできる。
【００１３】
本発明菌の培養方法としては、常法に準じ、振盪培養法などの液体培地を用いる培養方法、寒天培地などの固体培地を用いる培養方法が利用でき、好気的条件下に行われる。培養温度は２５〜４０℃、好ましくは３０℃付近、培養途中のｐＨは６〜８、好ましくは７付近にて行われる。培養日数としては、菌体量、培地組成などに応じて適宜設定できるが、通常１〜２日、好ましくは１日である。
【００１４】
本発明の酵素は、本発明の微生物の粉砕物の水溶性画分から得ることができる。即ち、本発明の酵素は、培養した本発明の微生物を適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等、ｐＨ６程度）中で慣用の方法（例えば、フレンチプレス等）で粉砕し、次いで遠心分離して夾雑物を除去した水溶性画分に含まれている。
上記の水溶性画分からの本発明の酵素の分離・精製は、慣用の蛋白質精製法（例えば、塩析、透析、遠心分離、電気泳動、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等）に準じて行うことができる。より具体的には、上記の水溶性画分に硫酸アンモニウム等の塩を加え、夾雑蛋白を塩析して除去し、次いで透析により塩を除去し；得られた水溶液をＤＥＡＥ型イオン交換クロマトグラフィーで精製し；溶出液をゲル濾過法で精製することにより、精製された本発明の酵素を得ることができる。
【００１５】
かくして得られた本発明の酵素（以下、α−１５ＧＤＨという）は、下記の理化学的性質及び生化学的性質を有していた。
ａ）リン酸化１，５−ＡＧに作用する；
ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約６７ｋＤａである；
ｃ）ゲル濾過法による推定分子量が約５５ｋＤａである；
ｄ）１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ型樹脂ゲルに吸着し、０．３ＭＮａＣｌを含有する同緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出する。
【００１６】
本発明におけるリン酸化１，５−ＡＧの定量方法は、リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに、電子受容体の存在下、前記のα−１５ＧＤＨを作用させることからなり、その酵素反応を反応式（１）に示す。
【００１７】
【化１】

【００１８】
本発明に使用される電子受容体としては特に制限はなく、例えば、酸素、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、メトキシ−ＰＭＳ（ｍ-ＰＭＳ）、ジクロロフェノールインドフェノール(ＤＣＩＰ）、フェロセン、フェロセン誘導体、ニトロテトラブルーテトラゾリウム塩（ＮＴＢ）、チトクロームＣ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤ（Ｐ））、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などが例示される。
【００１９】
本発明の方法を、下記の反応式（２）に示す例をもってより具体的に説明する。この反応において、リン酸化１，５−ＡＧはα−１５ＧＤＨの作用により酸化されると共に共存するｍ-ＰＭＳは還元され、生成した還元型ｍ-ＰＭＳでＮＴＢを還元してフォルマザンを生成させて、これを波長５７０ｎｍの吸光度で測定することにより、リン酸化１，５−ＡＧの定量を行うことができる。
なお、リン酸化１，５−ＡＧは、例えば、下記の反応式（３）、（４）又は（５）に示す方法を用いて、１，５−ＡＧをリン酸基供与体の存在下でリン酸化することにより生成することができる。反応式（３）又は（４）に示す酵素反応は公知の反応であり、従来法に準じて実施することができ、使用される試薬組成物、反応条件などは従来法に準じて設定することができる。また、反応式（５）に示す反応は、文献(例えば、The Journal of Biological Chemistry Vol.269, No.26, 17537-17541, 1994; 同誌 Vol.270, No.51, 30453-30457, 1995)に記載されているADP-dependent Hexokinase(以下、ADP-dependent ＨＫという)を用いる方法で、本反応では特に効率よく１，５−ＡＧをリン酸化することができることを本発明者らは見出した。
【００２０】
【化２】

【００２１】
【化３】

【００２２】
【化４】

【００２３】
【化５】

【００２４】
また、下記の反応式（６）に示される反応は本発明の他の例を示すもので、この例ではα−１５ＧＤＨの作用によりリン酸化１，５−ＡＧは酸化されると共に共存するＤＣＩＰは還元されるので、波長６００ｎｍの吸光度で測定することにより、リン酸化１，５−ＡＧの定量を行うことができる。
【００２５】
【化６】

【００２６】
本発明のリン酸化１，５−ＡＧの定量方法は、適当な緩衝液中で行われ、用いられる酵素の使用量は、試料中のリン酸化１，５−ＡＧ濃度などに応じて適宜調整することができる。
この酵素反応に使用される試薬組成物の好ましい例としては、ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ５．５）、０．１ｍＭｍ-ＰＭＳ、０．０１〜２．００ｍＭＤＣＩＰ、０．０１〜１０％ＢＳＡ、１〜１０Ｕ／ｍｌ α−１５ＧＤＨなどが挙げられる。
また、１，５−ＡＧをリン酸化する酵素反応で使用される試薬組成物の好ましい例としては、５０〜１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）、０．１〜１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０〜３０ｍＭＫＣｌ、２〜５ｍＭＡＴＰ、０．１〜５０ｍＭＰＥＰ（フォスホエノールピルビン酸）、１〜２０Ｕ／ｍｌＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、１０〜１０００Ｕ／ｍｌＨＫ（又はＧＫ）；又は５０〜１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１〜１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０〜３０ｍＭＫＣｌ、２〜１０ｍＭＡＤＰ若しくはＣＤＰ、１〜１０００Ｕ／ｍｌ ADP-dependent ＨＫなどが挙げられる。
【００２７】
反応式（１）、（２）及び（６）の基質であるリン酸化１，５−ＡＧは、反応式（３）、（４）又は（５）に示されるように、常法に準じ１，５−ＡＧにグルコキナーゼ（ＧＫ）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はADP-dependent ＨＫを作用させることにより生成させることができる。従って、反応式（３）、（４）又は（５）により、１，５−ＡＧからリン酸化１，５−ＡＧを生成させ、ついで反応式（１）、（２）又は（６）によりリン酸化１，５−ＡＧを測定することにより１，５−ＡＧを測定することが可能になる。
【００２８】
上記の方法に用いるリン酸化酵素ＨＫ(Hexokinase, EC 2.7.1.1)、ADP-dependent ＨＫ(EC登録なし)及びＧＫ(Glucokinase, EC 2.7.1.2)は特に限定されないが、Alternaria sp., Bacillus sp., Aerobacter aerogenes, Aspergillus oryzae, Bacillus stearothermopilus, Collectotrichum trifolii, Collectotrichum trunctum, Escherichia coli, Fusarium roseum, Gibberella fujikuroi, Leuconostoc mesenteroides, Saccharomyces cerevisiae, Pyrococcus furiosusなど微生物由来の酵素が適する。
また、血清などの試料中の１，５−ＡＧを測定する場合は、特開平５−７６３９７号に示す試料中のグルコースの消去法を用いることにより、多量のグルコースを含む血清試料中の１，５−ＡＧを正確に測定することもできる。なお、血清試料中のグルコースの消去に関する方法はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
【発明の効果】
本発明菌はリン酸化１，５−ＡＧを炭素源として利用できるので、本発明菌の産生する酵素はリン酸化１，５−ＡＧに作用しリン酸化１，５−ＡＧの酵素定量、ひいては１，５−ＡＧの酵素定量法に有用である。
また、本発明の方法によれば、リン酸化１，５−ＡＧ及び１，５−ＡＧを簡便にして且つ高精度で定量することができ、更に自動分析装置による測定が可能であるので、多数の試料を迅速に処理することができるという効果を奏する。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
菌株の取得
唯一の炭素源としてα−メチル−Ｄ−グルコシドを添加したＭ９培地寒天プレート（培地１リットル当り、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ６ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ３ｇ、ＮａＣｌ３０ｇ、ＮＨ₄Ｃｌ１ｇ、α−メチル−Ｄ−グルコシド４ｇ、ＭｇＳＯ₄ １ｍＭ、ＣａＣｌ₂ ０．１ｍｌ、寒天１５ｇを含有）に、日本各地で採取した海水試料を加え、３０℃で好気的に培養した。コロニーを単離し、下記のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）活性試験に付し、ＧＤＨ活性を有するコロニーを選択・分離した。
ＧＤＨ活性試験は、各コロニーの細胞を１０ｍＭリン酸緩衝液（３％ＮａＣｌ含有、ｐＨ６．０）で３回洗浄した後、０．７５ｍＭ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、０．７５ｍＭフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び１００ｍＭ α−メチル−Ｄ−グルコシドを含有する２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に加え、ＤＣＩＰの消色を観察し、消色が認められたコロニーはＧＤＨ活性を有すると判断した。
その結果、幾つかのＧＤＨ活性を有するコロニーが見出され、そのうちＧＤＨ活性が特に強い株を単離した（デレヤエスピー α-１５株）。
【００３１】
実施例２
デレヤエスピー α - １５株の培養
上記の菌株を、１リットル当り１０ｇポリペプトン、１ｇ酵母抽出物、３０ｇＮａＣｌ、２ｇＫ₂ＨＰＯ₄、１０ｇ α−メチル−Ｄ−グルコシドを含有する培地(ｐＨ７．０)中で、３０℃にて１２〜４８時間好気的に培養した。培養細胞を分離し、３％ＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ６．０)で洗浄した。１リットルの培養液から約１０ｇ(湿潤重量)の細胞を得た。
【００３２】
実施例３
酵素（α−１５ＧＤＨ）の分離・精製
後期対数期にある上記の培養細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で粉砕した後、超遠心（４℃、６９８００×ｇ、９０分間）して上清の水溶性画分（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を分離した。この画分に硫酸アンモニウムを３０％となるように添加して析出物を廃棄し、水溶液は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて透析した。透析後の水溶液は、ＤＥＡＥ−トヨパールカラム（内径２２ｍｍ×２０ｃｍ）に付し、更に１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（内径５ｍｍ×５ｃｍ）に付した。０〜０．４５ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた直線勾配法で溶出したところ、目的物質は０．３ＭＮａＣｌにて溶出した。
溶出液を、０．３ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌＧ３０００カラム（内径８ｍｍ×３０ｃｍ）に付し、ＧＤＨ活性画分を分離して本発明の酵素を含む溶液を得た。
得られた酵素液を、８−２５％ポリアクリルアミド勾配ゲル（ファルマシア社製、PhastGel gradient 8-25）を用いたＳＤＳ−電気泳動法（硝酸銀染色）で分子量を測定したところ、約６７ｋＤａであった。
また、前述のＴＳＫｇｅｌＧ３０００を用いたゲル濾過法で分子量を測定したところ、約５５ｋＤａであった。なお、分子量標準として、低分子量スタンダードキット（ファルマシア社製）を使用した。
【００３３】
実施例４
本発明の酵素（α−１５ＧＤＨ）を用いたリン酸化１，５−ＡＧの定量
本発明の酵素の存在下、リン酸化１，５−ＡＧを酸化すると共にＤＣＩＰを還元する酵素反応（反応式６）を利用し、種々の濃度のリン酸化１，５−ＡＧを試料として検量線を作成した。即ち、本発明の酵素溶液２０μｌと５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に０．１ｍＭＤＣＩＰ、０．１％ＢＳＡを含む試薬３００μｌを混和して３７℃で５分間予備加温した後、生理的食塩水に種々の濃度のリン酸化１，５−ＡＧを溶解した試料８０μｌを添加して消費されるＤＣＩＰを６００ｎｍの吸光度で測定した。リン酸化１，５−ＡＧ濃度と吸光度の関係を図１に示す。図１に示されるように、本発明の酵素を用いた測定法は良好な直線性を示した。
【００３４】
実施例５
本発明の酵素（α−１５ＧＤＨ）を用いた１，５−ＡＧの定量
ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）を用いて１，５−ＡＧをリン酸化する酵素反応（反応式４）と、本発明の酵素を用いてリン酸化１，５−ＡＧを酸化する酵素反応（反応式２）を組み合わせ、種々の濃度の１，５−ＡＧを用いて検量線を作成した。即ち、０．１％トリトンＸ−１００、０．１％ＢＳＡ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＰＥＰ（フォスホエノールピルビン酸）、２０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＡＴＰ、５００Ｕ／ｍｌＨＫ、１０Ｕ／ｍｌＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、１．３ｍＭＮＴＢ（ニトロテロラブルーテトラゾリウム塩）及び０．１３ｍＭｍ-ＰＭＳ（メトキシ-フェナジンメトサルフェート）を含む５０ｍＭトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の第一試薬３２０μに１，５−ＡＧ試料２０μｌを加え、３７℃下で５分間予備加温した後、０．１％トリトンＸ−１００、０．１％ＢＳＡ、６０Ｕ／ｍｌの本発明の酵素を含む５０ｍＭトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の第二試薬８０μｌを加え５分間加温した。その後、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。図２にその検量線を示す。図２に示されるように、本発明の酵素を用いた測定法は良好な直線性を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素を用いたリン酸化１，５−ＡＧの定量における検量線を示す図である。
【図２】本発明の酵素を用いた１，５−ＡＧの定量における検量線を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel microorganism, an enzyme produced by the microorganism, and a method for quantifying 1,5-anhydroglucitol using the enzyme. More specifically, a microorganism that produces an enzyme that acts on phosphorylated 1,5-anhydro-D-glucitols, and an enzyme that the microorganism can produce to oxidize phosphorylated 1,5-anhydro-D-glucitols, And a method for quantifying phosphorylated 1,5-anhydro-D-glucitol using the enzyme, the enzyme and the quantification method include 1,5-anhydro-D-glucitol (hereinafter referred to as 1,5-AG) in clinical tests and the like. It is useful for quantitative determination of
[0002]
[Prior art]
1,5-AG is a polyol having a glucose-like structure, and is present in blood, cerebrospinal fluid, urine and the like in humans, and 1,5-AG concentration is known to decrease in diabetic patients. It is attracting attention as an important marker.
Conventionally, 1,5-AG has been quantified by gas chromatography (Inspection and Technology, Vol. 21, No. 6, 407-412, 1982). However, this method requires a special device, and the operation is complicated and requires skill, which hinders measurement of a large number of specimens in the field of clinical examination.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In recent years, a method using an enzyme for quantifying 1,5-AG has been reported for the purpose of improving operability. For example, JP-A-63-185397 discloses a method for quantifying 1,5-AG by producing hydrogen peroxide using an enzyme that oxidizes 1,5-AG. However, such a method using an oxidase has a problem that it is affected by a reducing substance such as bilirubin and ascorbic acid in a biological sample. Furthermore, since the substrate specificity of the enzyme used for 1,5-AG is low, it is difficult to measure only a trace amount of 1,5-AG from a sample containing various / a large amount of sugars such as clinical tests. The influence on the measured value of saccharide is large. In particular, since the positive influence of glucose is large, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-185397 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-231796 disclose a strongly basic anion exchange resin and a boric acid treatment method. Yes. Japanese Patent Laid-Open No. 5-304996 similarly discloses a method of adjusting the pH to 7.2 to 8.5. However, each of these methods has a drawback that the operation is complicated, and it has been difficult to quickly measure a large number of samples using an automatic analyzer.
[0004]
In consideration of the actual situation in such clinical examinations, the development of examination methods suitable for automation has been carried out. As shown in JP-A-6-303955, JP-A-6-189755, or JP-A-6-239704, Methods for measuring 1,5-AG using oxidoreductase have been studied. However, it was difficult to fractionally measure a trace amount of 1,5-AG from clinical specimen samples containing various / a large amount of saccharides. In particular, it has been pointed out that the method using an oxidase, for example, pyranose oxidase, has an influence on the measured value of saccharides mixed (Clinical Chemistry, Vol. 23, No. 2, 188-194, 1994). Such a situation is a problem that must be improved in the field of clinical tests that require high precision and high accuracy.
[0005]
The inventors of the present invention have made extensive studies on methods that can be applied to the measurement of specimen samples in clinical examinations, particularly methods that can be used in automatic analyzers, by improving such conventional methods. As a result, a microorganism acting on phosphorylated 1,5-AG was found, and an oxidoreductase capable of acting on phosphorylated 1,5-AG was successfully separated from this microorganism. Then, by allowing this enzyme to act on phosphorylated 1,5-AG in the presence of an electron acceptor and measuring the redox product thereof, phosphorylated 1,5-AG can be measured. It was confirmed that by using the reaction, 1,5-AG can be measured with high accuracy. Specifically, phosphoric acid is allowed to act on 1,5-AG in the presence of a phosphate group donor to produce phosphorylated 1,5-AG, and then the enzyme of the present invention is allowed to act. -Measurement of AG becomes possible.
These methods are not complicated in operation, and the reaction conditions are mild, so that it is possible to perform measurement with an automatic analyzer, which is useful for measuring a large number of samples in daily clinical tests, and the present invention has been completed. It was. The present invention has been made on the basis of such knowledge. A microorganism producing an oxidoreductase acting on phosphorylated 1,5-AG, an oxidoreductase produced by the microorganism, and phosphorylated 1,5 using the enzyme. -It aims at providing the determination method of AG.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The gist of the present invention made to solve the above problems is as follows.
(1) A microorganism belonging to the genus Delea that produces an oxidoreductase that acts on phosphorylated 1,5-AG;
(2) The microorganism according to the above (1), wherein the microorganism is Delea sp. Α-15 (FERM BP-6140);
(3) Enzymes having the following physicochemical and biochemical properties;
a) acts on phosphorylated 1,5-AG;
b) The estimated molecular weight by SDS-PAGE is about 67 kDa;
c) the estimated molecular weight by gel filtration method is about 55 kDa;
d) Adsorbed on DEAE type resin gel equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) and eluted with the same buffer containing 0.3 M NaCl;
(4) Phosphorylated 1,5-anhydroglucitol is characterized in that the enzyme described in (3) above is allowed to act on phosphorylated 1,5-anhydroglucitol in the presence of an electron acceptor. Quantification method;
(5) Phosphorylating 1,5-anhydroglucitol and allowing the enzyme according to (3) to act on the resulting phosphorylated 1,5-anhydroglucitol in the presence of an electron acceptor. A method for quantifying 1,5-anhydroglucitol characterized by:
It is in.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The above microorganism according to the present invention produces an oxidoreductase that acts on phosphorylated 1,5-AG. The enzyme is useful for quantifying phosphorylated 1,5-AG and 1,5-AG.
The mycological properties of Delea sp. Strain α-15, which is a specific example of the microorganism of the present invention, are as follows.
(a) Morphological properties
1. Shape and size of cells: fungi
2. Presence or absence of cell polymorphism: None
3. Existence of motility: Yes
4. With or without spores: None
5. Gram staining: Negative [0008]
(b) Growth state in each medium
1. Meat broth agar plate culture: milky white / good
2. Meat broth agar slope culture: milky white / good
3. Meat broth liquid culture: milky white / good
(c) Physiological properties
1. nitrate reduction: positive
2. Denitrification reaction: negative
3. VP reaction: negative
4. Indole production: negative
5. Production of hydrogen sulfide: negative
6. Use of citric acid: negative
7. Dye formation: Negative
8. Urease: Negative
9. Oxidase: negative
10. Catalase: positive
11. Range of growth: around pH 6.0-8.0 / 30 ° C
12. Attitude toward oxygen: aerobic
13. OF test: unchanged
14. Production of acids from the following saccharides L-arabinose: positive D-xylose: positive D-glucose: positive D-mannose: negative D-fructose: positive D-galactose: positive maltose: positive sucrose: positive lactose: positive Trehalose: Positive D-Sorbit: Positive D-Mannit: Positive Inosit: Positive glycerin: Positive
(d) Other properties
1. β-galactosidase: positive
2. Arginine dihydrase: negative
3. Lysine decarboxylase: negative
4. Ornithine decarboxylase: negative
5. Tryptophan deaminase: negative
6. Gelatinase: negative
7. Growth with α-methyl-D-glucoside: positive
8. Requirement of NaCl: Positive
Based on the above bacteriological properties, a search based on Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Ninth Edition) revealed that this strain is relatively similar to the bacteria of the genus Deleya, but is consistent with the above properties. Nothing was found. Therefore, the bacterium of the present invention was judged as a new strain belonging to the genus Dereya, and was named Deleya sp. Α-15. In addition, this strain has been deposited as “Accession Number FERM BP-6140” at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0012]
The culture of the bacterium of the present invention may be any medium and culture conditions as long as the strain can grow well, and can be grown by such culture to obtain a necessary amount of cells. The above medium can contain a suitable carbon source, nitrogen source, inorganic ions and other necessary components.
As the carbon source of the medium, glucose, α-methyl-D-glucoside and the like can be used. As the nitrogen source, organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract and meat extract, and inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate and ammonium nitrate can be used. Furthermore, as the inorganic ions, phosphate ions, potassium ions, calcium ions, magnesium ions, iron ions, copper ions, manganese ions, and the like can be used. Moreover, components, such as vitamins and a cell growth factor, can also be added to a culture medium as needed.
[0013]
As a method for culturing the bacterium of the present invention, a culture method using a liquid medium such as a shaking culture method or a culture method using a solid medium such as an agar medium can be used according to a conventional method, and the method is performed under aerobic conditions. The culture temperature is 25 to 40 ° C., preferably around 30 ° C., and the pH during the culture is 6 to 8, preferably around 7. Although it can set suitably as a culture | cultivation day according to a microbial cell quantity, a culture medium composition, etc., it is normally 1-2 days, Preferably it is 1 day.
[0014]
The enzyme of the present invention can be obtained from the water-soluble fraction of the pulverized product of the microorganism of the present invention. That is, the enzyme of the present invention is obtained by pulverizing the cultured microorganism of the present invention in a suitable buffer solution (for example, phosphate buffer solution, pH about 6) by a conventional method (for example, French press) and then centrifuging. It is contained in the water-soluble fraction from which impurities are removed.
Separation / purification of the enzyme of the present invention from the above water-soluble fraction should be carried out according to conventional protein purification methods (eg, salting out, dialysis, centrifugation, electrophoresis, gel filtration, ion exchange chromatography, etc.). Can do. More specifically, a salt such as ammonium sulfate is added to the above water-soluble fraction, and the contaminating protein is salted out and removed, and then the salt is removed by dialysis; the resulting aqueous solution is subjected to DEAE-type ion exchange chromatography. Purified; The purified enzyme of the present invention can be obtained by purifying the eluate by gel filtration.
[0015]
The enzyme of the present invention thus obtained (hereinafter referred to as α-15 GDH) had the following physicochemical properties and biochemical properties.
a) acts on phosphorylated 1,5-AG;
b) The estimated molecular weight by SDS-PAGE is about 67 kDa;
c) the estimated molecular weight by gel filtration method is about 55 kDa;
d) Adsorbed on DEAE type resin gel equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) and eluted with the same buffer (pH 6.0) containing 0.3 M NaCl.
[0016]
The method for quantifying phosphorylated 1,5-AG according to the present invention comprises allowing the α-15 GDH to act on phosphorylated 1,5-anhydroglucitol in the presence of an electron acceptor. The reaction is shown in reaction formula (1).
[0017]
[Chemical 1]

[0018]
The electron acceptor used in the present invention is not particularly limited. For example, oxygen, phenazine methosulfate (PMS), methoxy-PMS (m-PMS), dichlorophenolindophenol (DCIP), ferrocene, ferrocene derivatives, nitro Examples include tetrablue tetrazolium salt (NTB), cytochrome C, nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) oxidized form (NAD (P)), and flavin mononucleotide (FMN).
[0019]
The method of the present invention will be described more specifically with an example shown in the following reaction formula (2). In this reaction, phosphorylated 1,5-AG is oxidized by the action of α-15 GDH and the coexisting m-PMS is reduced. NTB is reduced by the generated reduced m-PMS to form formazan. The phosphorylated 1,5-AG can be quantified by measuring the absorbance at a wavelength of 570 nm.
Phosphorylated 1,5-AG can be obtained by, for example, converting 1,5-AG in the presence of a phosphate group donor using the method shown in the following reaction formula (3), (4) or (5). It can be produced by phosphorylation. The enzyme reaction shown in the reaction formula (3) or (4) is a known reaction and can be carried out according to the conventional method, and the reagent composition to be used, reaction conditions, etc. should be set according to the conventional method. Can do. In addition, the reaction shown in the reaction formula (5) can be performed according to literature (for example, The Journal of Biological Chemistry Vol. 269, No. 26, 17537-17541, 1994; Vol. 270, No. 51, 30453-30457, 1995). The present inventors have found that 1,5-AG can be phosphorylated particularly efficiently in this reaction by the method using ADP-dependent Hexokinase (hereinafter referred to as ADP-dependent HK) described in 1).
[0020]
[Chemical 2]

[0021]
[Chemical 3]

[0022]
[Formula 4]

[0023]
[Chemical formula 5]

[0024]
The reaction shown in the following reaction formula (6) shows another example of the present invention. In this example, phosphorylated 1,5-AG is oxidized by the action of α-15 GDH, and DCIP coexists. Since is reduced, phosphorylated 1,5-AG can be quantified by measuring the absorbance at a wavelength of 600 nm.
[0025]
[Chemical 6]

[0026]
The method for quantifying phosphorylated 1,5-AG of the present invention is carried out in an appropriate buffer, and the amount of enzyme used is appropriately adjusted according to the phosphorylated 1,5-AG concentration in the sample. be able to.
Preferable examples of the reagent composition used for this enzyme reaction include MES-NaOH buffer (50 mM, pH 5.5), 0.1 mM m-PMS, 0.01 to 2.00 mM DCIP, 0.01 to 10 % BSA, 1 to 10 U / ml α-15 GDH, and the like.
Preferred examples of the reagent composition used in the enzymatic reaction to phosphorylate the 1,5-AG is, 50 to 100 mM phosphate buffer _{(pH7.3), 0.1~10mM MgCl 2,} 10~30mM KCl, 2-5 mM ATP, 0.1-50 mM PEP (phosphoenolpyruvate), 1-20 U / ml PK (pyruvate kinase), 10-1000 U / ml HK (or GK); or 50-100 mM Examples include Tris-HCl buffer (pH 8.0), 0.1 to 10 mM MgCl2, 10 to 30 mM KCl, _{2 to} 10 mM ADP or CDP, and 1 to 1000 U / ml ADP-dependent HK.
[0027]
Phosphorylated 1,5-AG which is a substrate of reaction formulas (1), (2) and (6) is 1 according to a conventional method as shown in reaction formula (3), (4) or (5). , 5-AG can be produced by acting glucokinase (GK), hexokinase (HK) or ADP-dependent HK. Therefore, phosphorylated 1,5-AG is produced from 1,5-AG by reaction formula (3), (4) or (5), and then phosphorylated by reaction formula (1), (2) or (6). By measuring oxide 1,5-AG, it becomes possible to measure 1,5-AG.
[0028]
Phosphorylase HK (Hexokinase, EC 2.7.1.1), ADP-dependent HK (No EC registration) and GK (Glucokinase, EC 2.7.1.2) used in the above method are not particularly limited, but Alternaria sp., Bacillus sp. , Aerobacter aerogenes, Aspergillus oryzae, Bacillus stearothermopilus, Collectotrichum trifolii, Collectotrichum trunctum, Escherichia coli, Fusarium roseum, Gibberella fujikuroi, Leuconostoc mesenteroides, Saccharomyces cerevisiae, suitable enzymes derived from microorganisms such as Pyrococcus furiosus.
When measuring 1,5-AG in a sample such as serum, the method for eliminating glucose in the sample shown in JP-A-5-76397 is used to determine 1,5-AG in a serum sample containing a large amount of glucose. It is also possible to accurately measure 5-AG. In addition, the method regarding elimination | eradication of glucose in a serum sample is not limited to these.
[0029]
【The invention's effect】
Since the bacterium of the present invention can use phosphorylated 1,5-AG as a carbon source, the enzyme produced by the bacterium of the present invention acts on the phosphorylated 1,5-AG to determine the enzyme amount of phosphorylated 1,5-AG. , 5-AG enzyme assay method.
Further, according to the method of the present invention, phosphorylated 1,5-AG and 1,5-AG can be quantified easily and with high accuracy, and further, measurement by an automatic analyzer is possible. There is an effect that the sample can be processed quickly.
[0030]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
Example 1
Acquisition of strain M9 medium agar plate supplemented with α-methyl-D-glucoside as the sole carbon source (6 g Na ₂ HPO ₄ , ₃ g KH ₂ PO ₄ , 30 g NaCl, NH ₄ Cl per liter of medium) 1 g, α-methyl-D-glucoside 4 g, MgSO ₄ 1 mM, CaCl ₂ 0.1 ml, and agar 15 g) were added with seawater samples collected in various places in Japan and cultured at 30 ° C. aerobically. Colonies were isolated and subjected to the following glucose dehydrogenase (GDH) activity test, and colonies having GDH activity were selected and separated.
In the GDH activity test, cells of each colony were washed 3 times with 10 mM phosphate buffer (containing 3% NaCl, pH 6.0), and then 0.75 mM 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP), 0.75 mM. In addition to 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing phenazine methosulfate (PMS) and 100 mM α-methyl-D-glucoside, DCIP decolorization was observed. It was judged to have.
As a result, several colonies having GDH activity were found, and among them, a strain having particularly strong GDH activity was isolated (Deleya sp α-15 strain).
[0031]
Example 2
Dereya SP Cultivation of α - 15 strain The above strain was cultured in a medium (pH 7.0) containing 10 g polypeptone, 1 g yeast extract, 30 g NaCl, 2 g K ₂ HPO ₄ , 10 g α-methyl-D-glucoside per liter. ) In aerobic culture at 30 ° C. for 12 to 48 hours. The cultured cells were separated and washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 3% NaCl. About 10 g (wet weight) of cells were obtained from 1 liter of culture solution.
[0032]
Example 3
Enzyme (α-15 Separation and purification of GDH) The above cultured cells in the late log phase were pulverized with a French press (1500 kgf), and then ultracentrifuged (4 ° C., 69800 × g, 90 minutes) to dissolve the supernatant in water. Fractions (10 mM potassium phosphate buffer, pH 6.0) were separated. Ammonium sulfate was added to this fraction to 30% to discard the precipitate, and the aqueous solution was dialyzed using 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0). The aqueous solution after dialysis was applied to a DEAE-Toyopearl column (inner diameter 22 mm × 20 cm) and further to a DEAE-5PW column (inner diameter 5 mm × 5 cm) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0). . When eluted with a linear gradient method using 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0 to 0.45 M NaCl, the target substance was eluted with 0.3 M NaCl.
The eluate was applied to a TSKgel G3000 column (inner diameter 8 mm × 30 cm) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.3 M NaCl, and the GDH active fraction was separated. A solution containing the enzyme was obtained.
When the molecular weight of the resulting enzyme solution was measured by SDS-electrophoresis (silver nitrate staining) using 8-25% polyacrylamide gradient gel (Pharmacia, PhastGel gradient 8-25), it was about 67 kDa. .
Moreover, it was about 55 kDa when the molecular weight was measured by the gel filtration method using above-mentioned TSKgel G3000. In addition, a low molecular weight standard kit (manufactured by Pharmacia) was used as a molecular weight standard.
[0033]
Example 4
Enzyme of the present invention (α-15 Quantification of phosphorylated 1,5-AG using GDH) In the presence of the enzyme of the present invention, an enzymatic reaction (Scheme 6) that oxidizes phosphorylated 1,5-AG and reduces DCIP is used. A calibration curve was prepared using phosphorylated 1,5-AG at various concentrations as samples. That is, 20 μl of the enzyme solution of the present invention and 50 mM MES buffer (pH 5.5) were mixed with 300 μl of a reagent containing 0.1 mM DCIP and 0.1% BSA, pre-warmed at 37 ° C. for 5 minutes, DCIP consumed by adding 80 μl of a sample in which various concentrations of phosphorylated 1,5-AG were dissolved in saline was measured at an absorbance of 600 nm. The relationship between phosphorylated 1,5-AG concentration and absorbance is shown in FIG. As shown in FIG. 1, the measurement method using the enzyme of the present invention showed good linearity.
[0034]
Example 5
Enzyme of the present invention (α-15 Determination of 1,5-AG using GDH) An enzymatic reaction (Scheme 4) for phosphorylating 1,5-AG using hexokinase (HK) or glucokinase (GK), An enzyme reaction (reaction formula 2) for oxidizing phosphorylated 1,5-AG using an enzyme was combined, and a calibration curve was prepared using various concentrations of 1,5-AG. That is, 0.1% Triton X-100,0.1% BSA, 10mM MgCl 2, 20mM PEP ( Foss pyruvate), 20mM KCl, 5mM ATP, 500 U / ml HK, 10 U / ml PK ( pyruvate Acid kinase), 1.3 mM NTB (nitrotelola blue tetrazolium salt) and 0.13 mM m-PMS (methoxy-phenazine methosulfate) in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), After adding 20 μl of 5-AG sample and pre-warming at 37 ° C. for 5 minutes, 50 mM Tris-HCl containing 0.1% Triton X-100, 0.1% BSA, 60 U / ml of the enzyme of the present invention 80 μl of the second reagent in buffer (pH 8.0) was added and warmed for 5 minutes. Thereafter, the absorbance at 570 nm was measured. FIG. 2 shows the calibration curve. As shown in FIG. 2, the measurement method using the enzyme of the present invention showed good linearity.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a calibration curve in quantification of phosphorylated 1,5-AG using the enzyme of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a calibration curve in quantification of 1,5-AG using the enzyme of the present invention.

Claims

Dereya belonging to Dereya genus producing oxidoreductases acting on phosphorylated 1,5-anhydro -D- glucitol SP α - 15 (FERM BP-6140) .

An enzyme having the following physicochemical and biochemical properties.
a) oxidizing phosphorylated 1,5-anhydro-D-glucitol in the presence of an electron acceptor ;
b) The estimated molecular weight by SDS-PAGE is about 67 kDa;
c) the estimated molecular weight by gel filtration method is about 55 kDa;
d) Adsorbed on DEAE type resin gel equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) and eluted with the same buffer containing 0.3 M NaCl.

A method for quantifying phosphorylated 1,5-anhydroglucitol, wherein the enzyme according to claim 2 is allowed to act on phosphorylated 1,5-anhydroglucitol in the presence of an electron acceptor.

The enzyme according to claim 2 is allowed to act on phosphorylated 1,5-anhydroglucitol produced by phosphorylating 1,5-anhydroglucitol in the presence of an electron acceptor. A method for quantifying 1,5-anhydroglucitol.