JP3926103B2

JP3926103B2 - Cooling holder and scanning electron microscope

Info

Publication number: JP3926103B2
Application number: JP2001006090A
Authority: JP
Inventors: 木武雄鈴; 部隆服
Original assignee: Jeol Ltd
Current assignee: Jeol Ltd
Priority date: 2001-01-15
Filing date: 2001-01-15
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2021-01-15
Also published as: JP2002214091A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水分を含んだ試料の観察に用いて最適な冷却ホルダ並びに走査電子顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
水分を含んだ生物試料を走査電子顕微鏡（SEM：Scanning Electron Microscope）で観察する際、その試料はできるだけ生体時に近い状態に維持する必要がある。しかし、生物試料はその７０〜９０数％が水分であり、試料を摘出後そのまま走査電子顕微鏡内に挿入すれば装置内が真空のため、水分が気化し乾燥による収縮変形を起こすことが多い。
【０００３】
そこで、現在、生物試料を走査電子顕微鏡で観察する場合、液体窒素で試料を冷却する機構を備えた走査電子顕微鏡を用意し、その走査電子顕微鏡で生物試料を凍結乾燥させながら観察することが行われている。この場合、試料中の水分は凍結されたままとなり長時間形態を維持し観察できる利点がある。
【０００４】
しかしながら、このような走査電子顕微鏡では、液体窒素で試料を冷却する機構を備えなければならず、その分コストアップとなる。さらに、この走査電子顕微鏡では、凍結試料表面に付着した霜を除去するためのヒーターを備えているが、このようなヒーターの設置もコストアップにつながっている。
【０００５】
ところで、このような問題を解決する発明として特公昭５１−１６２５２がある。この発明は、生物試料を試料ホルダ上に保持して試料ホルダと共に液体窒素に浸して凍結させ、その液体窒素中で凍結試料を蓋体で包囲し、その後蓋体で包囲された凍結試料を走査電子顕微鏡の予備室に導入し、その予備室において蓋体を開けるようにしたものである。この発明を利用すれば、走査電子顕微鏡に試料冷却機構を備える必要はなく、また、霜取り用のヒーターも走査電子顕微鏡に備える必要はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、特公昭５１−１６２５２の発明においては、生物試料を液体窒素に完全に浸して凍結させるので、液体窒素中で生物試料が試料ホルダから外れてしまうことがある。
【０００７】
また、特公昭５１−１６２５２の発明においては、前記蓋体は試料ホルダから取外せないようになっており、試料観察中においても蓋体は試料ホルダに付いたままである。このため、試料傾斜を行ったときに蓋体が対物レンズなどに当たってしまい、試料傾斜において制限を受けたり、場合によっては対物レンズや試料ホルダが破損してしまう。
【０００８】
さらに、特公昭５１−１６２５２の発明においては、冷却された試料ホルダと、試料観察室の試料ステージ間の断熱対策は行われていない。このため、試料ステージ側の熱が試料ホルダに伝わると、試料中の水分が急激に気化し、長時間にわたって水分を含んだ状態での試料観察を行えなくなる。一方、試料ホルダ側の熱が試料ステージに伝わって試料ステージが冷却されると、試料ステージが熱ドリフトし、観察視野が大きく変動してしまう。
【０００９】
本発明はこのような点に鑑みて成されたもので、その目的は、生物試料を霜を付着させずに安全に凍結させることができ、良好な走査電子顕微鏡観察を行うことができる冷却ホルダ並びに走査電子顕微鏡を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成する本発明の冷却ホルダは、試料を取付けるための冷却ホルダ本体と、その冷却ホルダ本体に取付けられる試料を覆うために、その冷却ホルダ本体に取外し可能に取付けられるキャップと、前記冷却ホルダ本体の表面に取付けられた断熱部材を備えた冷却ホルダであって、前記キャップをはめ込むためのキャップ用溝が前記冷却ホルダ本体に形成されていることを特徴としている。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を用いて本発明の実施の形態について説明する。
【００１２】
図１は、本発明の冷却ホルダの一例を示したものである。
【００１３】
図１において、１は冷却ホルダ本体であり、冷却ホルダ本体１の形状は円柱状であって、冷却ホルダ本体１は蓄熱性が良いたとえば黄銅（真ちゅう）で作られている。そして、リング状のキャップ用溝２が冷却ホルダ本体１の上面に形成されており、この溝２の内側上面Ｓは粗めのサンドペーパーでこすられて、カーボンテープ剥離防止溝３がその上面Ｓに形成されている。
【００１４】
一方、冷却ホルダ本体１の底面には、先端の尖った３本の断熱ピン（断熱部材）４ａ，４ｂ，４ｃ（４ｃは図１に示されていない）が取付けられている。これら３本の断熱ピンは、熱絶縁部材であるたとえばテフロンで作られている。
【００１５】
さらに、冷却ホルダ本体１の側面には、先端の尖った２本の断熱ピン（断熱部材）５ａ，５ｂとビス受け５ｃが取付けられている。これら２本の断熱ピンとビス受け５ｃは、熱絶縁部材であるたとえばテフロンで作られている。また、冷却ホルダ本体１の側面には、２つのピンセット差込穴６が開けられている。
【００１６】
図２は、冷却ホルダ本体１を底面側から見た図であり、前記断熱ピン５ａ，５ｂとビス受け５ｃは、冷却ホルダ本体１の側面に１２０度間隔で取付けられている。
【００１７】
また、図１において７はキャップである。このキャップ７の径は前記溝２の径とほぼ同じであり、キャップ７は溝２にはめ込めるようになっている。そして、中空状のキャップ７は蓄熱性が良いたとえばＳＵＳ（ステンレススチール）で作られており、つまみ８がキャップ７の上面中央部分に取付けられている。このつまみ８は、磁性材であるたとえば鉄で作られている。図３はキャップ７の断面を示したものであり、この図に示すように、キャップ内面は凹凸ができるように加工されている。
【００１８】
以上の１〜８の構成で、本発明の冷却ホルダが構成されている。なお、図１において、９はカーボンの両面テープ、１０はカビなどの生物試料、１１は液体窒素１２を入れた容器、１３はピンセットである。
【００１９】
以下に、図１の冷却ホルダを用いた試料凍結の手順について説明する。
【００２０】
まず、オペレータは、図１に示すように、カーボンの両面テープ９を冷却ホルダ本体１のキャップ用溝２の内側上面Ｓに張り付ける。次にオペレータは、その張り付けたカーボンテープ９の上に生物試料１０を取付ける。
【００２１】
このようにして試料の冷却ホルダ本体への取付けがすむと、オペレータは、キャップ７のつまみ８をピンセット１３でつまんで、キャップ７を容器１１中の液体窒素１２に浸す。そしてオペレータは、適当な時間を待ってからキャップ７を液体窒素１２中から取り出し、冷却されたキャップ７を図４に示すように、冷却ホルダ本体１のキャップ用溝２にはめ込む。
【００２２】
こうして、試料１０がキャップ７で覆われると、キャップ７内の試料まわり雰囲気中に存在している水分子は、冷却されたキャップ７の内面にトラップ（吸着）される。このとき、図３に示したように、キャップ内面は表面積が増すように凹凸に加工されているので、キャップ７内のほぼ全ての水分子がキャップ内面にトラップされる。また、冷却されたキャップ７によって、キャップ７の外側面に対向するキャップ用溝２の表面も冷却されるので、キャップ７の外の水分子がキャップ７内に侵入しようとしても、その水分子は全て溝２の表面またはキャップ７の外面でトラップされる。
【００２３】
次にオペレータは、冷却ホルダ本体１のピンセット差込穴６にピンセット１３を差込み、冷却されているキャップ７が取付けられた冷却ホルダ本体１をピンセット１３を用いて液体窒素１２に浸す。図５は、冷却ホルダ本体１が液体窒素１２に浸されている状態を示した図であり、この図に示すように、冷却ホルダ本体１の中間位までが液体窒素１２に浸されている。
【００２４】
こうして冷却ホルダ本体１は液体窒素１２で液体窒素温度に冷却され、そして試料１０は凍結する。
【００２５】
以上、図１の冷却ホルダを用いた試料凍結の手順について説明したが、この凍結方法によれば、試料１０を覆うように冷却されたキャップ７を冷却ホルダ本体１に取付け、キャップ内の水分子をそのキャップ内面にトラップさせた後で冷却ホルダ本体１を冷却するようにしているので、試料が凍結してもその試料表面に霜が付くことはない。
【００２６】
また、図１の冷却ホルダにおいては、冷却ホルダ本体表面にカーボンテープ剥離防止溝３が形成されていて、カーボンテープ９はその溝３にしっかりと食い込んでいる。このため、冷却ホルダ本体１が液体窒素で冷やされてカーボンテープ９が冷却されても、カーボンテープ９が冷却ホルダ本体１から剥がれることはない。逆にこのような溝３を設けないと、冷却されたカーボンテープ９は粘着性を失って、金属の冷却ホルダ本体１から簡単に剥がれてしまう。
【００２７】
また、図１の冷却ホルダを用いた凍結方法によれば、試料を液体窒素に全く浸さずに凍結させるので、液体窒素中で試料が冷却ホルダから外れるということはない。
【００２８】
以上説明したように、図１の冷却ホルダを用いた本発明の凍結方法によれば、生物試料を霜を付着させずに安全に凍結させることができる。
【００２９】
さて、これより、図５の状態にある冷却ホルダを走査電子顕微鏡で観察するまでの手順について説明する。
【００３０】
まず、オペレータは、図４のピンセット１３を用いて冷却ホルダ本体１を液体窒素１２から取り出し、冷却ホルダを図６に示すように試料ホルダ１４に取付ける。
【００３１】
このとき、冷却ホルダ本体１のビス受け５ｃが試料ホルダ１４のビス穴１５に一致するように冷却ホルダが試料ホルダ１４に取付けられ、オペレータは、ビス１６をビス穴１５にねじ込んでビス受け５ｃに当接させる。このようなビス固定により、冷却ホルダ本体１は試料ホルダ１４に固定される。この固定状態においては、冷却ホルダ本体１は、前記断熱ピン（４ａ〜４ｃ，５ａ，５ｂ）とビス受け５ｃによって試料ホルダ１４と熱絶縁されているので、試料ホルダ側の熱は冷却ホルダ本体１に伝わらない。
【００３２】
また、試料ホルダ１４の側面にはネジ穴（図６には示されていない）が設けられており、図６に示すように、交換棒（キャップ取外し手段）１７の先端がそのネジ穴にねじ込まれて取付けられている。交換棒１７の先端には電磁石１８が設けられており、この電磁石１８は、交換棒の内部に引かれた電線１９を介して電源２０に電気的に接続されている。この電源２０は交換棒の取手部分に取付けられていて、内部に電池を備えると共に電磁石への通電をオンオフするスイッチＳＷを備えている。
【００３３】
こうして、オペレータは冷却ホルダを試料ホルダに取付けると、図７に示すように、試料ホルダ１４を保持した交換棒１７を走査電子顕微鏡の予備室チャンバ２１に取付ける。このとき、試料ホルダ１４は、予備室２２に設けられた受け台２３に取付けられる。
【００３４】
前記予備室チャンバ２１は走査電子顕微鏡の観察室チャンバ２４に取付けられており、前記予備室２２は、観察室チャンバ２４の仕切弁２５が開けられると観察室２６に連通するようになっている。これら予備室２２と観察室２６は、図示していない排気装置によって排気されるように構成されている。
【００３５】
さて、オペレータは、図７に示すように交換棒１７を予備室チャンバ２１に取付けると、予備室２２を排気する排気装置を動作させると共に、交換棒１７を回転させて試料ホルダ１４から外す。なお、このとき、仕切弁２５は閉じられている。
【００３６】
そして、予備室２２が所定圧力に達すると、オペレータは電源スイッチＳＷをオンにし、交換棒１７を操作して、磁化された電磁石１８をキャップ７のつまみ８上に持ってくる。すると、つまみ８は磁性材で作られているので、つまみ８は電磁石１８に吸着される。そしてオペレータは、交換棒１７を操作してキャップ７を冷却ホルダ本体１から取外し、取外したキャップ７を台２７上に置いてから電源スイッチＳＷをオフにする。
【００３７】
次にオペレータは、再び交換棒１７を試料ホルダ１４に取付け、前記仕切弁２５を開けて、交換棒１７を操作して試料ホルダ１４を観察室２６の試料ステージ（図示せず）に取付ける。その後、交換棒１７が試料ホルダ１４から外され、交換棒１７が観察室２６から引き出されてから仕切弁２５が閉じられる。
【００３８】
こうして、試料ホルダ１４が観察室２６の試料ステージに取付けられると、低真空状態にある観察室２６において試料のＳＥＭ観察が行われる。この際、上述したように、冷却ホルダ本体１は、前記断熱ピン（４ａ〜４ｃ，５ａ，５ｂ）とビス受け５ｃによって試料ホルダ１４と熱絶縁されているので、試料ステージ側の熱が試料ホルダ１４を介して冷却ホルダ本体１に伝わることはない。このため、試料１０中の水分はかなり長い時間をかけて気化し、長時間にわたって水分を含んだ生体時の状態での試料観察を行うことができる。
【００３９】
また、冷却ホルダ本体１は試料ホルダ１４と熱絶縁されているので、冷却ホルダ本体１側の熱が試料ホルダ１４を介して試料ステージに伝わることはない。このため、試料ステージが冷却されて熱ドリフトすることはなく、良好な試料観察および写真撮影を行うことができる。
【００４０】
また、この例では、図１に示したように、試料１０はカーボンテープ９に取付けられているが、カーボンは導電性があってイオンをためない。このため、電子線照射時にカーボンテープはチャージアップせず、良好な試料像を得ることができる。
【００４１】
また、試料を直に冷却ホルダ本体１に取付けると、電子線照射を行ったときに、金属である冷却ホルダ本体１からの反射電子量が試料からの反射電子量よりもかなり多くなり、得られた試料部分の反射電子像が暗くなることがある。一方、カーボンテープを用いると、冷却ホルダ本体１からの反射電子放出を抑えることができ、試料に関する良好なコントラストの反射電子像を得ることができる。
【００４２】
以上、本発明の一例を説明したが、本発明はこの例に限定されるものではなく、種々の変形が考えられる。
【００４３】
たとえば、図１に示した冷却ホルダ本体１の代わりに、図８に示すような冷却ホルダ本体２８を用いるようにしても良い。
【００４４】
たとえば黄銅で作られた冷却ホルダ本体２８には、ホルダ取付穴２９が中央に開けられていると共に、その穴２９に直交および通ずるようなビス穴３０が開けられている。そして、この冷却ホルダ本体２８を用いた冷却ホルダにおいては、たとえば黄銅またはアルミニウムで作られた円筒状の試料ブロック（試料保持ホルダ）３１が用意されており、試料ブロック３１の上面Ｓ_０は粗めのサンドペーパーでこすられてカーボンテープ剥離防止溝が形成されている。この試料ブロック３１は前記ホルダ取付穴２９に落とし込まれて、ビス３２によって冷却ホルダ本体２８に固定される。
【００４５】
なお、図８において、図１に示した構成と同じものには図１と同じ番号が付けられている。
【００４６】
さて、図８に示した冷却ホルダを用いた場合には、生物試料はカーボン両面テープによって前記試料ブロック上面Ｓ_０に取付けられ、前記図４〜７を用いて説明した手順で試料凍結およびＳＥＭ観察が行われる。
【００４７】
また、図８に示した冷却ホルダを用いて生物試料を凍結乾燥させるときには、オペレータは、生物試料が取付けられた冷却ホルダ本体２８を液体窒素に浸して試料を凍結させ、その冷却された冷却ホルダ本体２８を試料ホルダにセットしてからＳＥＭ観察室の試料ステージに装着し、観察室を排気するという手順で試料を凍結乾燥させる。この場合にも、冷却ホルダ本体２８は試料ホルダと熱絶縁され、また、小型の試料ブロック３１は冷却ホルダ本体２８からの冷熱によって低温に冷却されるので、乾燥時に冷熱を長時間必要とする生物試料の凍結乾燥を容易に行うことができる。
【００４８】
さらに、試料の乾燥終了後、試料ブロック３１を冷却ホルダ本体２８から外して試料に真空蒸着を行えば、試料を高真空ＳＥＭで観察することができる。
【００４９】
また、上述した試料ブロック３１の代わりに、フィルターを備えると共に注射器で吸引可能な試料保持ホルダを用いるようにしても良い。この場合にオペレータは、生物試料をフィルター上に置いて試料保持ホルダを注射器に取付け、注射器で水分を吸引して生物試料をフィルター上に固定し、注射器から試料保持ホルダを外して図８に示したホルダ取付穴２９にセットする。そして、上述した手順で、凍結した試料のＳＥＭ観察や生物試料の凍結乾燥、または真空蒸着後における高真空ＳＥＭでの観察が行われる。
【００５０】
また、変形例として、図１と図８における冷却ホルダ本体の内部を中空状に形成し、その空間に保冷剤（例えばポリアクリル酸誘導体）を充填するようにしても良い。このようにすれば、試料を更に長い時間冷却しておくことができる。
【００５１】
また、上記例では、冷却ホルダ本体の底面に３本の断熱ピンが設けられているが、この本数はこれに限定されるものではなく、たとえば４本設けるようにしても良い。同様に、冷却ホルダ本体の側面に設けられる断熱ピンについてもその本数は２本に限定されるものではなく、たとえば９０度間隔に３本設けるようにしても良い。
【００５２】
以上、本発明について説明したが、本発明によれば、生物試料を霜を付着させずに安全に凍結させることができ、良好な走査電子顕微鏡観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の冷却ホルダの一例を示した図である。
【図２】図１の冷却ホルダを説明するために示した図である。
【図３】図１のキャップ７を説明するために示した図である。
【図４】試料凍結の手順を説明するために示した図である。
【図５】試料凍結の手順を説明するために示した図である。
【図６】試料観察の手順を説明するために示した図である。
【図７】試料観察の手順を説明するために示した図である。
【図８】本発明の冷却ホルダの他の例を示した図である。
【符号の説明】
１，２８…冷却ホルダ本体、２…キャップ用溝、３…カーボンテープ剥離防止溝、４ａ，４ｂ，４ｃ，５ａ，５ｂ…断熱ピン、５ｃ…ビス受け、６…ピンセット差込穴、７…キャップ、８…つまみ、９…カーボンテープ、１０…試料、１１…容器、１２…液体窒素、１３…ピンセット、１４…試料ホルダ、１５，３０…ビス穴、１６，３２…ビス、１７…交換棒、１８…電磁石、１９…電線、２０…電源、２１…予備室チャンバ、２２…予備室、２３…受け台、２４…観察室チャンバ、２５…仕切弁、２６…観察室、２７…台、２８…冷却ホルダ本体、２９…ホルダ取付穴、３１…試料ブロック[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to optimum cooling holder and scanning electron microscope using the observation of the sample containing water.
[0002]
[Prior art]
When observing a biological sample containing moisture with a scanning electron microscope (SEM), it is necessary to maintain the sample as close to the living body as possible. However, 70 to 90% of the biological sample is moisture, and if the sample is inserted into the scanning electron microscope as it is after the sample is removed, the inside of the apparatus is vacuum, so that the moisture is evaporated and shrinkage deformation due to drying often occurs.
[0003]
Therefore, currently, when observing a biological sample with a scanning electron microscope, a scanning electron microscope equipped with a mechanism for cooling the sample with liquid nitrogen is prepared, and the biological sample can be observed while freeze-dried with the scanning electron microscope. It has been broken. In this case, there is an advantage that the moisture in the sample remains frozen and can be observed while maintaining its form for a long time.
[0004]
However, in such a scanning electron microscope, a mechanism for cooling the sample with liquid nitrogen must be provided, which increases the cost accordingly. Furthermore, this scanning electron microscope is provided with a heater for removing frost adhering to the frozen sample surface, but the installation of such a heater also leads to an increase in cost.
[0005]
Incidentally, Japanese Patent Publication No. 51-16252 is an invention for solving such a problem. In this invention, a biological sample is held on a sample holder and immersed in liquid nitrogen together with the sample holder to freeze, and the frozen sample is surrounded by the lid in the liquid nitrogen, and then the frozen sample surrounded by the lid is scanned. It is introduced into a spare room of an electron microscope, and a lid is opened in the spare room. If this invention is utilized, it is not necessary to provide a sample cooling mechanism in the scanning electron microscope, and it is not necessary to provide a heater for defrosting in the scanning electron microscope.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the invention of Japanese Patent Publication No. 51-16252, since the biological sample is completely immersed in liquid nitrogen and frozen, the biological sample may come off from the sample holder in liquid nitrogen.
[0007]
Further, in the invention of Japanese Patent Publication No. 51-16252, the lid cannot be removed from the sample holder, and the lid remains attached to the sample holder even during sample observation. For this reason, when the sample is tilted, the lid hits the objective lens and the like, and the sample tilt is limited, or the objective lens and the sample holder are damaged in some cases.
[0008]
Further, in the invention of Japanese Examined Patent Publication No. 51-16252, no heat insulation measures are taken between the cooled sample holder and the sample stage in the sample observation chamber. For this reason, when the heat on the sample stage side is transmitted to the sample holder, the moisture in the sample is rapidly vaporized, and the sample cannot be observed in a state containing moisture for a long time. On the other hand, when the heat on the sample holder side is transmitted to the sample stage and the sample stage is cooled, the sample stage is thermally drifted and the observation field of view is greatly changed.
[0009]
The present invention has been made in view of the above problems, its object can be safely frozen without adhering frost biological sample, Ru can perform good scanning electron microscopy cold It is to provide a rejection holder and a scanning electron microscope.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The cooling holder of the present invention that achieves this object includes a cooling holder main body for attaching a sample, a cap removably attached to the cooling holder main body to cover the sample attached to the cooling holder main body, and the cooling holder. A cooling holder provided with a heat insulating member attached to the surface of the holder main body, wherein a cap groove for fitting the cap is formed in the cooling holder main body .
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0012]
FIG. 1 shows an example of the cooling holder of the present invention.
[0013]
In FIG. 1, 1 is a cooling holder main body, the shape of the cooling holder main body 1 is a column shape, and the cooling holder main body 1 is made from brass (brass) with good heat storage. A ring-shaped cap groove 2 is formed on the upper surface of the cooling holder body 1, the inner upper surface S of the groove 2 is rubbed with a rough sandpaper, and the carbon tape peeling prevention groove 3 is formed on the upper surface S. Is formed.
[0014]
On the other hand, three heat insulation pins (heat insulation members) 4a, 4b, 4c (4c are not shown in FIG. 1) with sharp tips are attached to the bottom surface of the cooling holder body 1. These three heat insulating pins are made of, for example, Teflon which is a heat insulating member.
[0015]
Further, two heat insulating pins (heat insulating members) 5 a and 5 b with sharp tips and screw receivers 5 c are attached to the side surface of the cooling holder main body 1. These two heat insulating pins and the screw receiver 5c are made of, for example, Teflon which is a heat insulating member. Two tweezer insertion holes 6 are formed in the side surface of the cooling holder body 1.
[0016]
FIG. 2 is a view of the cooling holder body 1 as seen from the bottom side, and the heat insulating pins 5a and 5b and the screw receivers 5c are attached to the side surface of the cooling holder body 1 at intervals of 120 degrees.
[0017]
In FIG. 1, reference numeral 7 denotes a cap. The diameter of the cap 7 is almost the same as the diameter of the groove 2, and the cap 7 can be fitted in the groove 2. The hollow cap 7 is made of, for example, SUS (stainless steel) with good heat storage, and a knob 8 is attached to the center portion of the upper surface of the cap 7. The knob 8 is made of a magnetic material such as iron. FIG. 3 shows a cross section of the cap 7. As shown in FIG. 3, the inner surface of the cap is processed so as to be uneven.
[0018]
The cooling holder of this invention is comprised by the structure of the above 1-8. In FIG. 1, 9 is a double-sided carbon tape, 10 is a biological sample such as mold, 11 is a container containing liquid nitrogen 12, and 13 is tweezers.
[0019]
Hereinafter, a procedure for freezing the sample using the cooling holder of FIG. 1 will be described.
[0020]
First, as shown in FIG. 1, the operator attaches the carbon double-sided tape 9 to the inner upper surface S of the cap groove 2 of the cooling holder body 1. Next, the operator attaches the biological sample 10 onto the carbon tape 9 that has been attached.
[0021]
When the sample is attached to the cooling holder body in this way, the operator pinches the knob 8 of the cap 7 with the tweezers 13 and immerses the cap 7 in the liquid nitrogen 12 in the container 11. Then, after waiting for an appropriate time, the operator takes out the cap 7 from the liquid nitrogen 12, and inserts the cooled cap 7 into the cap groove 2 of the cooling holder body 1 as shown in FIG.
[0022]
Thus, when the sample 10 is covered with the cap 7, water molecules present in the atmosphere around the sample in the cap 7 are trapped (adsorbed) on the inner surface of the cooled cap 7. At this time, as shown in FIG. 3, the inner surface of the cap is processed to be uneven so as to increase the surface area, so that almost all water molecules in the cap 7 are trapped on the inner surface of the cap. Further, the surface of the cap groove 2 facing the outer surface of the cap 7 is also cooled by the cooled cap 7, so that even if water molecules outside the cap 7 try to enter the cap 7, All are trapped on the surface of the groove 2 or the outer surface of the cap 7.
[0023]
Next, the operator inserts the tweezers 13 into the tweezer insertion hole 6 of the cooling holder main body 1 and immerses the cooling holder main body 1 to which the cooled cap 7 is attached in the liquid nitrogen 12 using the tweezers 13. FIG. 5 is a view showing a state in which the cooling holder main body 1 is immersed in the liquid nitrogen 12. As shown in FIG. 5, the intermediate portion of the cooling holder main body 1 is immersed in the liquid nitrogen 12.
[0024]
Thus, the cooling holder body 1 is cooled to the liquid nitrogen temperature with the liquid nitrogen 12 and the sample 10 is frozen.
[0025]
The sample freezing procedure using the cooling holder of FIG. 1 has been described above. According to this freezing method, the cap 7 cooled so as to cover the sample 10 is attached to the cooling holder main body 1, and the water molecules in the cap are Since the cooling holder body 1 is cooled after being trapped on the inner surface of the cap, frost does not form on the sample surface even if the sample is frozen.
[0026]
Further, in the cooling holder of FIG. 1, the carbon tape peeling prevention groove 3 is formed on the surface of the cooling holder main body, and the carbon tape 9 bites into the groove 3 firmly. For this reason, even if the cooling holder body 1 is cooled with liquid nitrogen and the carbon tape 9 is cooled, the carbon tape 9 is not peeled off from the cooling holder body 1. Conversely, if such a groove 3 is not provided, the cooled carbon tape 9 loses its adhesiveness and easily peels off from the metal cooling holder body 1.
[0027]
Further, according to the freezing method using the cooling holder of FIG. 1, the sample is frozen without being immersed in liquid nitrogen at all, so that the sample is not detached from the cooling holder in liquid nitrogen.
[0028]
As described above, according to the freezing method of the present invention using the cooling holder of FIG. 1, it is possible to safely freeze a biological sample without attaching frost.
[0029]
Now, the procedure until the cooling holder in the state of FIG. 5 is observed with a scanning electron microscope will be described.
[0030]
First, the operator takes out the cooling holder body 1 from the liquid nitrogen 12 using the tweezers 13 of FIG. 4 and attaches the cooling holder to the sample holder 14 as shown in FIG.
[0031]
At this time, the cooling holder is attached to the sample holder 14 so that the screw receiver 5c of the cooling holder body 1 is aligned with the screw hole 15 of the sample holder 14, and the operator screwes the screw 16 into the screw hole 15 to the screw receiver 5c. Make contact. The cooling holder main body 1 is fixed to the sample holder 14 by such screw fixing. In this fixed state, the cooling holder body 1 is thermally insulated from the sample holder 14 by the heat insulating pins (4a to 4c, 5a, 5b) and the screw receivers 5c. Not communicated to.
[0032]
Further, a screw hole (not shown in FIG. 6) is provided in the side surface of the sample holder 14, and the tip of the exchange rod (cap removing means) 17 is screwed into the screw hole as shown in FIG. Installed. An electromagnet 18 is provided at the tip of the exchange rod 17, and this electromagnet 18 is electrically connected to a power source 20 via an electric wire 19 drawn inside the exchange rod. This power source 20 is attached to the handle portion of the exchange rod, and includes a switch SW that is provided with a battery and that turns on / off the energization of the electromagnet.
[0033]
Thus, when the operator attaches the cooling holder to the sample holder, the exchange rod 17 holding the sample holder 14 is attached to the spare chamber 21 of the scanning electron microscope, as shown in FIG. At this time, the sample holder 14 is attached to a cradle 23 provided in the preliminary chamber 22.
[0034]
The preliminary chamber 21 is attached to the observation chamber 24 of the scanning electron microscope, and the preliminary chamber 22 communicates with the observation chamber 26 when the gate valve 25 of the observation chamber 24 is opened. The preliminary chamber 22 and the observation chamber 26 are configured to be exhausted by an exhaust device (not shown).
[0035]
When the operator attaches the exchange rod 17 to the spare chamber 21 as shown in FIG. 7, the operator operates the exhaust device for exhausting the spare chamber 22 and rotates the exchange rod 17 to remove it from the sample holder 14. At this time, the gate valve 25 is closed.
[0036]
When the reserve chamber 22 reaches a predetermined pressure, the operator turns on the power switch SW and operates the exchange rod 17 to bring the magnetized electromagnet 18 onto the knob 8 of the cap 7. Then, since the knob 8 is made of a magnetic material, the knob 8 is attracted to the electromagnet 18. Then, the operator operates the exchange rod 17 to remove the cap 7 from the cooling holder main body 1, puts the removed cap 7 on the base 27, and then turns off the power switch SW.
[0037]
Next, the operator attaches the exchange rod 17 to the sample holder 14 again, opens the gate valve 25 and operates the exchange rod 17 to attach the sample holder 14 to the sample stage (not shown) in the observation chamber 26. Thereafter, the exchange rod 17 is removed from the sample holder 14, and after the exchange rod 17 is pulled out from the observation chamber 26, the gate valve 25 is closed.
[0038]
Thus, when the sample holder 14 is attached to the sample stage of the observation chamber 26, SEM observation of the sample is performed in the observation chamber 26 in a low vacuum state. At this time, as described above, the cooling holder main body 1 is thermally insulated from the sample holder 14 by the heat insulating pins (4a to 4c, 5a, 5b) and the screw receiver 5c. 14 is not transmitted to the cooling holder body 1 via 14. For this reason, the water | moisture content in the sample 10 vaporizes over a considerably long time, and can observe the sample in the state at the time of the living body containing water | moisture content over a long time.
[0039]
Further, since the cooling holder body 1 is thermally insulated from the sample holder 14, the heat on the cooling holder body 1 side is not transmitted to the sample stage through the sample holder 14. For this reason, the sample stage is not cooled and the thermal drift does not occur, and good sample observation and photography can be performed.
[0040]
Further, in this example, as shown in FIG. 1, the sample 10 is attached to the carbon tape 9, but the carbon is conductive and does not accumulate ions. For this reason, the carbon tape is not charged up at the time of electron beam irradiation, and a good sample image can be obtained.
[0041]
Further, when the sample is directly attached to the cooling holder body 1, the amount of reflected electrons from the cooling holder body 1 which is a metal becomes considerably larger than the amount of reflected electrons from the sample when the electron beam is irradiated. The reflected electron image of the sample part may become dark. On the other hand, when the carbon tape is used, the emission of reflected electrons from the cooling holder body 1 can be suppressed, and a reflected electron image having a good contrast with respect to the sample can be obtained.
[0042]
Although an example of the present invention has been described above, the present invention is not limited to this example, and various modifications can be considered.
[0043]
For example, instead of the cooling holder body 1 shown in FIG. 1, a cooling holder body 28 as shown in FIG. 8 may be used.
[0044]
For example, the cooling holder main body 28 made of brass is provided with a holder mounting hole 29 in the center, and a screw hole 30 that is perpendicular to and communicates with the hole 29. Then, this in the cooling holder with cooling holder body 28, for example made of brass or aluminum cylindrical sample block (the sample holding holder) 31 are prepared, the upper surface S ₀ of the sample block 31 is coarse The carbon tape peeling prevention groove is formed by rubbing with sandpaper. The sample block 31 is dropped into the holder mounting hole 29 and fixed to the cooling holder main body 28 with screws 32.
[0045]
In FIG. 8, the same components as those shown in FIG.
[0046]
Now, in the case of using a cooling holder shown in FIG. 8, the biological sample mounted on the sample block upper surface S ₀ by the carbon double-sided tape, sample freezing and SEM observation in the procedure described with reference to FIG 4-7 Is done.
[0047]
When the biological sample is freeze-dried using the cooling holder shown in FIG. 8, the operator freezes the sample by immersing the cooling holder main body 28 to which the biological sample is attached in liquid nitrogen, and the cooled cooling holder. The sample is freeze-dried by a procedure in which the main body 28 is set on the sample holder, mounted on the sample stage in the SEM observation chamber, and the observation chamber is evacuated. Also in this case, the cooling holder main body 28 is thermally insulated from the sample holder, and the small sample block 31 is cooled to a low temperature by the cold heat from the cooling holder main body 28. The sample can be easily freeze-dried.
[0048]
Furthermore, after the sample is dried, the sample can be observed with a high vacuum SEM by removing the sample block 31 from the cooling holder body 28 and performing vacuum deposition on the sample.
[0049]
Further, instead of the sample block 31 described above, a sample holding holder that includes a filter and can be sucked with a syringe may be used. In this case, the operator places the biological sample on the filter, attaches the sample holding holder to the syringe, sucks moisture with the syringe to fix the biological sample on the filter, removes the sample holding holder from the syringe, and is shown in FIG. Set in the holder mounting hole 29. Then, the SEM observation of the frozen sample, the lyophilization of the biological sample, or the observation with the high vacuum SEM after the vacuum deposition is performed by the procedure described above.
[0050]
As a modification, the inside of the cooling holder main body in FIGS. 1 and 8 may be formed in a hollow shape, and the space may be filled with a cooling agent (for example, polyacrylic acid derivative). In this way, the sample can be cooled for a longer time.
[0051]
In the above example, three heat insulation pins are provided on the bottom surface of the cooling holder body. However, the number is not limited to this, and for example, four heat insulation pins may be provided. Similarly, the number of the heat insulating pins provided on the side surface of the cooling holder main body is not limited to two, and for example, three may be provided at intervals of 90 degrees.
[0052]
As mentioned above, although this invention was demonstrated, according to this invention, a biological sample can be frozen safely, without attaching frost, and a favorable scanning electron microscope observation can be performed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing an example of a cooling holder of the present invention.
FIG. 2 is a view for explaining the cooling holder of FIG. 1;
3 is a view for explaining a cap 7 of FIG. 1; FIG.
FIG. 4 is a diagram shown for explaining a procedure for freezing a sample.
FIG. 5 is a view for explaining a sample freezing procedure;
FIG. 6 is a diagram shown for explaining a sample observation procedure;
FIG. 7 is a view shown for explaining a sample observation procedure;
FIG. 8 is a view showing another example of the cooling holder of the present invention.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1,28 ... Cooling holder main body, 2 ... Cap groove, 3 ... Carbon tape peeling prevention groove, 4a, 4b, 4c, 5a, 5b ... Thermal insulation pin, 5c ... Screw receiver, 6 ... Tweezer insertion hole, 7 ... Cap 8 ... Knob, 9 ... Carbon tape, 10 ... Sample, 11 ... Container, 12 ... Liquid nitrogen, 13 ... Tweezers, 14 ... Sample holder, 15, 30 ... Screw hole, 16, 32 ... Screw, 17 ... Exchange rod, DESCRIPTION OF SYMBOLS 18 ... Electromagnet, 19 ... Electric wire, 20 ... Power supply, 21 ... Preliminary chamber, 22 ... Preliminary chamber, 23 ... Receptacle, 24 ... Observation chamber, 25 ... Gate valve, 26 ... Observation chamber, 27 ... Stand, 28 ... Cooling holder body, 29 ... Holder mounting hole, 31 ... Sample block

Claims

A cooling holder body for mounting a sample;
A cap removably attached to the cooling holder body to cover the sample attached to the cooling holder body;
A cooling holder comprising a heat insulating member attached to the surface of the cooling holder body ,
A cooling holder, wherein a cap groove for fitting the cap is formed in the cooling holder body .

The heat insulating member is a sharp insulation pin tip, the cooling holder according to claim 1, wherein the insulation pin, characterized in that respectively attached more on the side surface and the bottom surface of the cooling holder body.

The cooling holder according to claim 1 or 2, wherein a cooling agent is filled in the cooling holder main body.

In a scanning electron microscope equipped with a spare chamber communicating with the sample observation chamber,
A cooling holder having the following configurations (a) to (c) is provided,
(A) A cap groove for fitting a cap is formed, and a cooling holder main body to which a sample is attached. (B) In order to cover the sample attached to the cooling holder main body, it is detachably attached to the cooling holder main body. Cap (c) A heat insulating member attached to the surface of the cooling holder body When the cooling holder is placed in the spare chamber, a cap removing means for removing the cap from the cooling holder body is provided in the spare chamber. A scanning electron microscope characterized by that.

The cap removing means has an electromagnetic attracting function, the cap is made of a magnetic material, and the cap is attracted by the cap removing means and removed from the cooling holder body. 4. The scanning electron microscope according to 4 .