JP3910498B2 - measuring device - Google Patents

Description

すなわち、上記反射光強度が低下する入射角である全反射減衰角θspを知ることにより、被測定物質の誘電率ε_s 、つまりは屈折率に関連する特性を求めることができる。
【０００９】
なおこの種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角θ_ＳＰを精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００１０】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００１１】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、液体試料に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００１２】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００１３】
なお、表面プラズモン共鳴測定装置もしくは漏洩モード測定装置等の全反射を利用した測定装置としては、光を界面に全反射条件が得られる入射角で入射させ、その光によるエバネッセント波の発生により、界面で全反射した光の状態の変化を測定することにより被測定物質の特性分析等を行うに際して、前述の全反射減衰を生じる特定入射角の測定をする装置のほか、複数の波長の光ビームを界面に入射させ、角波長毎の全反射減衰の程度を検出する装置、あるいは、光ビームを界面に入射させるとともに、この光ビームの一部を、界面入射前に分割し、この分割した光ビームを界面で反射した光ビームと干渉させて、該干渉の状態を測定する装置等種々のタイプがある。
【００１４】
また、上述した表面プラズモン共鳴測定装置等の全反射光を利用した測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用される場合があり、効率よくスクリーニングを行うために、誘電体ブロックと試料保持部とが一体化した複数の測定チップと該複数の測定チップを一次元もしくは二次元状に支持する支持台とからなるセンサユニットや、誘電体ブロック自体が、該誘電体ブロックの上面に開口を有する検体ウェルを１次元状もしくは２次元状に複数備えたセンサウェルユニットを構成するもの、および、該センサユニットやセンサウェルユニットの複数の検体ウェルに対して並列的に複数の光ビームを入射させ、各測定チップ（もしくはウェル）の界面における反射光を個別に検出する測定装置が提案されている。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上記測定装置においては、測定チップが配置されている周囲の温度や湿度等の環境値が変化すると試料液の屈折率等が変化するため、環境値の変動により、本来同一の検出結果が得られるべき試料であっても、実際に検出される検出結果が異なるものとなる場合が生じ、検出結果の信頼性が低下するという問題がある。
【００１６】
この問題を解決するために、本出願人は、環境値を検知する環境値検知手段を備え、環境値に左右されない検出結果を得ることができる測定装置を既に提案している。しかしながら、複数の測定チップ（もしくはウェル）について同時に測定する測定装置の場合、測定チップの位置により環境値に差があるために、各測定チップ毎に環境値検知手段を備える必要が生じ、測定装置のコストアップおよび装置の複雑化を引き起こしかねないという問題がある。
【００１７】
本発明は上記の事情に鑑みて、コストアップ、装置の複雑化を抑制した、周囲の環境値に左右されずに、全反射光の状態を精度良く検出することができる信頼性の向上した測定装置を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明の測定装置は、光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる３以上の複数の測定チップと、該複数の測定チップを支持する支持体からなるセンサユニットと、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られる入射角で入射させる入射光学系と、
前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段とを備えてなる測定装置において、
前記センサユニット近傍における、２つ以上かつ前記複数の測定チップ数より少数箇所の環境値をそれぞれ検知する環境値検知手段と、
該環境値検知手段により検知された前記少数箇所の環境値から前記複数の測定チップの各々における環境値を求める環境値演算手段と、
該各測定チップの環境値に基づいて該各測定チップについての前記光検出手段による検出結果を補正する補正手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００１９】
前記センサユニットは、測定チップと支持体が別個に形成され、測定チップが支持体の測定チップ保持孔に保持されてなるものであってもよいし、測定チップと支持体が一体的に形成され、測定チップの試料保持部がウェル状に形成されたセンサウェルユニットであってもよい。
【００２０】
前記環境値は、複数個の環境値の組み合わせでもよいし、１つの環境値であってもよい。環境値としては、例えば温度あるいは湿度などが挙げられる。また、環境値は、温度や湿度そのものであっても、所定値からの差、変動量等であってもよい。
【００２１】
上記各全反射減衰を利用した測定装置において、「光検出手段による検出結果を補正する」とは、光ビームの強度に基づいて求められた値、例えば全反射減衰角の角度等を補正することも含むものである。また、多数の受光素子がアレイ状に設けられた光検出手段と、該受光素子の並設方向に関して微分する微分手段を用いる場合等には、該微分手段が出力する微分値を補正することも含むものである。
【００２２】
前記補正手段は、前記複数の測定チップのうち所定の測定チップの前記光検出手段による測定結果をリファレンスとして、他の測定チップについての測定結果を補正するものとすることができる。
【００２３】
あるいは、前記補正手段は、前記環境値と前記光検出手段の検出結果を対応させて記憶するルックアップテーブルを有し、該ルックアップテーブルに基づいて、補正を行うものとすることができる。
【００２４】
本発明の各測定装置は、前記薄膜層を、金属膜からなるものとし、前述の表面プラズモン共鳴による効果を利用して測定を行なうように構成されたものとしてもよい。
【００２５】
また、上記各測定装置は、前記薄膜層を、誘電体ブロックの前記上面に形成されたクラッド層と該クラッド層上に形成された光導波層からなるものとし、該光導波層における導波モードの励起による効果を利用して測定を行なうように構成されたものとしてもよい。
【００２６】
本発明による全反射光を利用した測定装置において、光検出手段により前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して試料の分析を行うには種々の方法があり、例えば、光ビームを前記界面で全反射条件が得られる種々の入射角で入射させ、各入射角に対応した位置毎に前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、全反射減衰により発生した暗線の位置（角度）を検出することにより試料分析を行ってもよいし、D.V.Noort,K.johansen,C.-F.Mandenius, Porous Gold in Surface Plasmon Resonance Measurement, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.585-588 に記載されているように、複数の波長の光ビームを前記界面で全反射条件が得られる入射角で入射させ、各波長毎に前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、各波長毎の全反射減衰の程度を検出することにより試料分析を行ってもよい。
【００２７】
また、P.I.Nikitin,A.N.Grigorenko,A.A.Beloglazov,M.V.Valeiko,A.I.Savchuk,O.A.Savchuk, Surface Plasmon Resonance Interferometry for Micro-Array Biosensing, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.235-238 に記載されているように、光ビームを前記界面で全反射条件が得られる入射角で入射させるとともに、この光ビームの一部を、この光ビームが前記界面に入射する前に分割し、この分割した光ビームを、前記界面で全反射した光ビームと干渉させて、その干渉後の光ビームの強度を測定することにより試料分析を行ってもよい。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の測定装置は、センサユニットの測定チップ数よりも少数の環境値から各測定チップにおける環境値を求める環境値演算手段と、各測定チップについての検出結果を環境値に応じて補正する補正手段とを備えているので、各測定チップ毎に環境値検知手段を備える必要がなく、各測定チップにそれぞれ環境値検知手段を備える場合と比較して、コストアップ、装置の複雑化を抑制しつつ、各測定チップについて、環境値に左右されない検出結果を得ることができ、測定装置の信頼性を向上させることができる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１と図２はそれぞれ、本発明の第１の実施の形態による表面プラズモン共鳴測定装置の平面形状、側面形状を示すものである。
【００３０】
本実施の形態の測定装置においては、誘電体ブロックの平坦な上面に開口する検体ウェル(液溜め）101が、該誘電体ブロックに１次元状に複数備えられ、該各検体ウェル101の内底面に薄膜層として金属膜12が形成されてなるセンサウェルユニット100が備えられている。センサウェルユニット100は、例えば透明樹脂等で構成されており、金属膜12上には特定物質と結合するセンシング物質14が固定されてなる。また上記ウェル101底面の各々に下方に突出した誘電体ブロックの光入出射部102が形成され、この光入出射部102と上記金属膜12との界面102ａに光ビームＬが入射されるようになっている。
【００３１】
さらに、本表面プラズモン共鳴測定装置は光ビームＬを出射するレーザ光源２と、該光源２から出射された光ビームＬをセンサウェルユニット100の矢印Ｐ方向に並んだ複数（本例では８個）のウェル101の底面に、並列的に入射させる光ビーム入射手段１と、各ウェル101の界面102aで反射した光ビームＬをそれぞれ受光する矢印Ｐ方向のウェル数と同数の８個の光検出手段17Ａ〜Ｈと、該光検出手段17Ａ〜Ｈからの出力を受ける信号処理部20と、該信号処理部20に接続された表示部25と、環境値検知手段である温度検知手段51〜54とを備えている。
【００３２】
光ビーム入射手段１は、レーザ光源２から発散光状態で発せられた光ビームＬを平行光とするコリメータレンズ３、光ビームＬを分岐するハーフミラー４ａ〜ｇおよびミラー４ｈ、分岐された光ビームＬを図２で示される面内のみで径を拡大するシリンドリカルビームエキスパンダ５ａ〜ｈ、光ビームＬを反射するミラー６ａ〜ｈ、該ミラー６ａ〜ｈで反射された光ビームＬを、図２に示される面内のみで集光するシリンドリカルレンズ７ａ〜ｈとを備えてなる。
【００３３】
光検出手段１７Ａ〜Ｈの各々は、多数の受光素子(フォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ・・・)が１列に配されてなるフォトダイオードアレイから構成されている。
【００３４】
温度検知手段51〜54は、センサウェルユニット100のウェル数（ここでは８個）より少ない数（ここでは４個）であり、それぞれセンサウェルユニット100の側面の異なる箇所に備えられており、それぞれの箇所における温度を検知するものである。温度検知手段51〜54としては、熱電対、サーミスタ等を用いることができる。
【００３５】
信号処理部20は、温度検知手段51〜54により検知された検知温度から各ウェル101における温度を求める温度演算手段21と、各ウェル101の温度に基づいて、測定値Ｓに対して後述の所定の処理を施し、補正出力信号Ｓ’を出力する補正手段22を備えてなるものである。
【００３６】
次に、測定原理を説明する。
【００３７】
図１に示す通り、１つのレーザ光源２から発散光状態で発せられた光ビームＬはコリメーターレンズ３で平行光とされた後、ハーフミラー４ａ〜ｇとミラー４ｈとによって８本に分岐され、分岐された８本の光ビームＬが各々ウェル101の底面、つまり光入出射部102と金属膜12との界面102ａに入射する。
【００３８】
このとき、分岐された各光ビームＬは、それぞれシリンドリカルビームエキスパンダ５ａ〜ｈにより図２に示される面内のみで径が拡大され、それぞれミラー６ａ〜ｈで反射して進行方向を変えた後、それぞれシリンドリカルレンズ７ａ〜ｈにより図２に示される面内のみで集光される。それにより各光ビームＬは、それぞれ光入出射部102と金属膜12との界面102ａに対して、種々の入射角成分を持った状態で入射する。なおレーザ光源２は、直線偏光である光ビームＬがｐ偏光状態で上記界面102ａに入射するようになる向きに配設されている。その他、光ビームＬを界面102ａに対してｐ偏光で入射させるには波長板で光ビームＬの偏光の向きを制御するようにしてもよい。
【００３９】
光ビームＬは、上述のように集光されるので、界面102ａに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なお、この入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そのため、界面102ａで全反射した反射光ビームＬには、種々の反射角で全反射された成分が含まれることになる。なお、上記光ビーム入射手段１は、光ビームＬを界面上に点状に集光させずにデフォーカス状態で入射させるように構成してもよい。そのようにすれば、界面上のより広い領域において光ビームＬが全反射されるので、全反射減衰の状態の検出誤差が平均化されて全反射解消角の測定精度を高めることができる。
【００４０】
界面102ａで全反射した光ビームＬは光検出手段17Ａ〜Ｈにより検出される。本例における各光検出手段17Ａ〜Ｈは、それぞれ複数のフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が１列に並設されてなるフォトダイオードアレイであり、図１の図示面内において、平行光化された光ビームＬの進行方向に対してフォトダイオード並設方向がほぼ直角となる向きに配設されている。したがって、上記界面102ａにおいて種々の反射角で全反射した光ビームＬの各成分を、それぞれ異なるフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が受光することになる。なお、下記の説明において、各検出手段17Ａ〜Ｈは単に光検出手段17と記載する。
【００４１】
図３は、（ａ）光ビームＬの界面102ａへの入射角θと上記光強度Ｉとの関係、および（ｂ）入射角θと光強度Ｉの微分値ｄＩとの関係を示すものである。図３（ａ）に示すように、界面102ａにある特定の入射角θ_ＳＰで入射した光は、金属膜12と試料との界面に表面プラズモンを励起させるので、この光については反射光強度Ｉが鋭く低下する。つまりθ_ＳＰが全反射減衰角であり、この角度θ_ＳＰにおいて反射光強度Ｉは最小値を取る。反射光強度Ｉの最小値の位置変動の経時的な変化、すなわち全反射減衰角の経時的な変化を測定することにより、試料液中の特定物質とセンシング物質14との結合の有無を得ることができる。また、図３（ｂ）に示すように、反射光強度Ｉの微分値ｄＩ＝０となる位置は、全反射減衰角の位置変動に伴い変動する。したがって、測定開始時に微分値ｄＩ＝０近傍であった測定点についての経時変化を観測することにより、間接的に全反射減衰角の変化を得ることができ、特定物質とセンシング物質14との結合の有無を得ることができる。
【００４２】
本実施形態の信号処理部20は、高精度の測定を行うため、上述のように反射光強度Ｉの微分値ｄＩを求め、該微分値ｄＩの経時変化を測定することにより、全反射減衰角の経時変化を間接的に観察し、特定物質とセンシング物質14との結合の有無を得るものである。ただし、ここでは、光検出手段17から得られた光強度Ｉの微分値ｄＩを測定値Ｓとし、補正手段22において、この測定値Ｓに対して所定の補正を施した補正値Ｓ’を求め、該補正値Ｓ’を真の微分値ｄＩ’として結合の有無を得て、検出結果を表示部25に出力する。
【００４３】
次に、上記構成の表面プラズモンセンサーにおける実際の測定方法について説明する。
【００４４】
まず、センサウェルユニット100の各ウェル101にそれぞれ試料液を分注する。このとき、８つのウェル101のうち検体ウェルＷ１〜Ｗ７には被検体を含む試料液を分注し、残りの１つのウェルＷｃには検体ウェルの注入される試料液の溶媒のみを注入する。このウェルＷｃは、各検体ウェルＷｎ（ｎ＝１、２、…７）における溶媒による屈折率の変化（バルク効果）を差し引くためのコントロールとして用いられる。
【００４５】
上述の測定原理で説明した通り、８つのウェルＷｎおよびＷｃの各界面102aに対して光ビームＬを並行して入射させ、該界面102aからの全反射光をそれぞれ光検出手段17で検出する。
【００４６】
光検出手段17が受光した光強度Ｉが信号処理部20に入力されるとともに、温度検出手段51〜54が検知した検知温度も信号処理部20に入力される。なお、光強度の測定および温度検知は、所定時間が経過する毎になされる。
【００４７】
信号処理部20は、まず、温度演算手段21において、温度検知手段51〜54により検知された検知温度から各ウェルＷｎおよびｗｃにおける擬似検知温度を求め、次に、補正手段22において、各ウェルＷｎおよびＷｃの温度に基づいて、光検出手段17から出力された光強度Ｉの微分値ｄＩを測定値Ｓとして該測定値Ｓに対し所定の補正を施し、補正値Ｓ’（＝真の微分値ｄＩ’）を得、該補正値Ｓ’に基づいて被検体とセンシング物質14との結合の有無を判定し、判定結果を表示部25に出力する。
【００４８】
以下、温度演算手段21および補正手段22の作用を説明する。
【００４９】
図４は、温度演算手段22による温度演算方法を説明するための図である。図４中のグラフの縦軸は温度Ｔ、横軸はセンサウェルユニット100のＰ方向位置を示す。温度演算手段22においては、温度検知手段51〜54により検知された検知温度、ここでは図４中○印で示した４つの測定点に基づいて、同図中実線で示すような２次近似曲線を求め、該２次近似曲線から同図中×印で示した各ウェルＷｎおよびＷｃにおける擬似検知温度Ｔｎ（ｎ＝１、２…７）およびＴｃを得る。この手法によれば、ウェル数よりも少ない温度検知手段で、各ウェルの温度を近似的に求めることができ、各ウェル毎に温度検知手段を備える必要がないため、コストアップおよび装置構成の複雑化を防ぐことができる。
【００５０】
図５は、温度Ｔに対するドリフトの傾きαの関係の一例を示すものである。表面プラズモン共鳴測定装置では、光検出器手段により検出される反射光が一定温度においても徐々に位置変化を示すドリフトという現象がみられる。図５に示すように、このドリフトの傾き（変化の度合い）は各温度毎で異なり、温度が高いほど傾きが大きくなる傾向にある。本実施形態のように、複数のウェルを備えたセンサウェルユニットにおいては、検体ウェルＷｎとコントロールウェルＷｃとの間に温度差が生じる場合があり、上述のように、温度が異なるとドリフトの傾きαが異なるため、バルク効果の除去の際にはこの温度差を考慮する必要がある。
【００５１】
補正手段22は、予め求められた温度とドリフト傾きとの関係を記憶しており、入力された測定値Ｓおよび各ウェル毎の温度ＴｎおよびＴｃに基づいて、補正式（１）に基づいた補正を行い、補正値Ｓoutを出力する。
【００５２】
Ｓout（Wn,t）=Ｓ(Wn,t)−Ｓ(Wc,t)・(α(Ｔn)／α(Ｔc)) ・・・（１）
ここで、Ｓout(Wn,t)はウェルＷｎの時刻ｔにおける補正値、Ｓ(Wn,t)はウェルＷｎの時刻ｔにおける測定値、Ｓ(Wc,t)はコントロールウェルＷｃの時刻ｔにおける測定値、α（Ｔ）は温度Ｔにおけるドリフトの傾き、ＴnはウェルＷｎの時刻ｔにおける温度、ＴcはコントロールウェルＷｃの時刻ｔにおける温度である。
【００５３】
上記補正式（１）により、検体ウェルＷｎとコントロールウェルＷｃとの温度差に対応したバルク効果除去を行うことができ、より高精度な測定結果を得ることができる。
【００５４】
次に、第２の実施形態の表面プラズモン共鳴測定装置について説明する。第２の実施形態の測定装置の概略構成は、図１および図２に示した測定装置と略同一である。以下では、上記実施の形態と異なる点にのみ言及し、同様の要素については詳細な説明を省略する。
【００５５】
第２の実施形態の測定装置においては、測定時にコントロールウェルを設けず、図１中の８つのウェル101全て検体ウェルとして用いる。また、信号処理部20の補正手段22が、センサーの製造時に予め補正データを記憶させたルックアップテーブルを備えている点で上記第１の実施形態と異なる。このルックアップテーブルは、各ウェルの温度と測定値Ｓを入力すれば、該ウェルの温度が２０℃である場合に出力される出力信号からのずれを補正した補正値Ｓ’を出力するものであり、試料液に含まれる溶媒の種類が異なると、測定値Ｓに対応する補正値Ｓ’が異なるため、各溶媒毎にルックアップテーブルを作成し、使用する試料液に含まれる溶媒に合わせて、使用者がルックアップテーブルを選択する。
【００５６】
温度演算手段21において、第１の実施形態の場合と同様にして、各ウェルにおける擬似検知温度を得る。その後、補正手段22において、ルックアップテーブルに、各ウェル毎の温度と測定値を入力して補正値Ｓ’を得る。補正値Ｓ’は、ウェルの環境温度変化に依存しない信号値であり、これを真の微分信号ｄＩ’としてセンシング物質と被検体との結合の有無を分析する。
【００５７】
測定値Ｓは、ウェルの環境温度の変化によって変化するために、ウェルの環境温度が変化すると、測定値Ｓの変化が被検体とセンシング物質との結合反応によるものか環境温度の変動によるものかの判定ができなくなり、測定精度が低下する場合が考えられるが、本実施形態はルックアップテーブルを備え、常にウェルの温度が２０℃である場合に出力される出力信号からのずれを補正した補正値Ｓ’を得るので、温度変動に左右されることなく、信頼性の高い測定を行うことが可能である。
【００５８】
図６は、第３の実施形態である表面プラズモン共鳴測定装置の側面図である。
【００５９】
ここでは、第１の実施形態の測定装置の温度検知手段に代えて、環境値検知手段として湿度検知手段61〜64を備えている。この湿度検知手段61〜64は、図２における温度検知手段51〜54と略同一箇所に備えられている。また、信号処理部20は、湿度演算手段26と、補正手段27を備えており、湿度演算手段26においては、上述の温度演算手段の場合と同様に、ウェル数より少ない数の湿度検知手段61〜64の測定点から２次近似曲線を求め、該曲線から各ウェルにおける擬似検知湿度を得る。
【００６０】
また、補正手段27は、予め用意された、湿度と測定値Ｓとを入力すれば、湿度６０％の時の出力との差を補正した補正値を出力するルックアップテーブルを備え、この場合も、第２の実施形態と同様にして各溶媒毎に用意された複数のルックアップテーブルから測定対象に応じて使用者が選択するものとする。
【００６１】
本実施形態においては、ウェル数より少ない数の湿度検知手段61〜64から各ウェルの湿度を求めるため、各ウェル毎に湿度検知手段を備える場合と比較して、コストアップ、装置の複雑化を抑えることができ、常に湿度６０％での出力となるよう測定値に補正を施すので、湿度変動に影響を受けない分析結果を得ることができ、測定精度を向上させることができる。
【００６２】
図７は、第４の実施形態である前述の漏洩モード測定装置の側面図である。なお同図においては、図２中に示されているものと同等の要素については同符号を付し、詳細な説明を省略する。ここでは、センサウェルユニットのみが前述の第１の実施形態の測定装置と異なる。
【００６３】
センサウェルユニット100’は、第１の実施形態で示したセンサウェルユニット100と略同一の形状の誘電体ブロックにより構成されており、ウェル102の底部内面に設けられた薄膜層が、クラッド層41とその上に設けられた光導波層42とからなる点でのみ異なる。このクラッド層41は、誘電体ブロックよりも低屈折率の誘電体や、金等の金属を用いて薄膜状に形成されている。また光導波層42は、クラッド層41よりも高屈折率の誘電体、例えばＰＭＭＡを用いて薄膜状に形成されている。クラッド層41の膜厚は、例えば金薄膜から形成する場合で36.5ｎｍ、光導波層42の膜厚は、例えばＰＭＭＡから形成する場合で700ｎｍ程度とされる。
【００６４】
図７に示す漏洩モード測定装置において、レーザ光源２から出射した光ビームＬを光入出射部102を通してクラッド層41に対して全反射角以上の入射角で入射させると、該光ビームＬが光入出射部102とクラッド層41との界面102aで全反射するが、クラッド層41を透過して光導波層42に特定入射角で入射した特定波数の光は、該光導波層42を導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層42に取り込まれるので、上記界面102aで全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。
【００６５】
光導波層42における導波光の波数は、該光導波層42の上の試料（ここではセンシング物質14の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、試料の屈折率や、それに関連する試料の特性を分析することができる。
【００６６】
なお、本実施形態においては、上記第１の実施形態と同様に光導波層42上に特定物質と結合するセンシング物質14を予め固定しており、このセンシング物質14上に被検体を含む液体試料11を滴下し、導波モードの励起による全反射減衰角θspの角度変化量、すなわち、反射光強度の微分値の変化量を測定することにより、センシング物質14と被検体の結合の有無を分析し、その分析結果を表示部25に出力する。
【００６７】
本実施形態においても、温度検知手段51〜54で検知された検知温度に基づいて、信号処理部20の温度演算手段21で検体ウェルＷｎおよびコントロールウェルＷｃの温度が求められ、補正手段22において、測定値Ｓに対して補正式（１）を用いた補正処理により補正値Ｓ’を得るので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００６８】
なお、上述の各実施形態の測定装置は、光源からの光ビームを界面に対して種々の角度で入射させ、該界面からの反射光を測定し暗線となる入射角度から全反射減衰の状態を測定して被検体とセンシング物質との結合状態を得るものであるが、光ビームの入射角度を界面で全反射条件を満たす所定の角度とし、種々の波長を有する光ビームを入射させる、もしくは入射させる光ビームの波長を変化させ、界面からの反射光を測定し、各波長毎の全反射減衰の状態により被検体とセンシング物質との結合状態を得るようにしてもよい。
【００６９】
また、さらに別の全反射光を利用した測定装置を第５の実施形態として以下に説明する。
【００７０】
図８に側面形状を示すように、本実施の形態の測定装置は、上述の第１の実施形態と同様の温度検知手段および信号処理部を備えているが、被検体とセンシング物質との結合状態を得る測定方法が上述の各実施形態と異なる。
【００７１】
センサウェルユニット100を挟んで光源334ａ〜ｈとＣＣＤ360ａ〜ｈとが配設されており、これら光源334ａ〜ｈとＣＣＤ360ａ〜ｈとの間には、コリメータレンズ350ａ〜ｈ、干渉光学系、集光レンズ355ａ〜ｈおよびアパーチャー356ａ〜ｈが配設されており、さらに第１の実施形態と同様の温度検知手段51〜54を備えている。
【００７２】
上記干渉光学系は、偏光フィルタ351ａ〜ｈ、ハーフミラー352ａ〜ｈ、ハーフミラー353ａ〜ｈおよびミラー354ａ〜ｈにより構成されている。
【００７３】
さらに、ＣＣＤ360ａ〜ｈは信号処理部361に接続されており、信号処理部361は表示部365に接続されている。
【００７４】
なお、信号処理部361は、温度演算手段362および補正手段363を備えている。
【００７５】
以下、本実施の形態の表面プラズモン共鳴測定装置における試料の測定について説明する。
【００７６】
光源334ａ〜ｈが駆動されてそれぞれ光ビーム330が発散光の状態で出射される。この光ビーム330はコリメータレンズ350ａ〜ｈにより平行光化されて偏光フィルタ351ａ〜ｈに入射する。偏光フィルタ351ａ〜ｈを透過して界面に対してｐ偏光で入射するようにされた光ビーム330は、ハーフミラー352ａ〜ｈにより一部がレファレンス光ビーム330Ｒとして分割され、ハーフミラー352ａ〜ｈを透過した残りの光ビーム330Ｓは界面に入射する。界面で全反射した光ビーム330Ｓおよびミラー354ａ〜ｈで反射したレファレンス光ビーム330Ｒはハーフミラー353ａ〜ｈに入射して合成される。合成された光ビーム330´は集光レンズ355ａ〜ｈにより集光され、アパーチャー356ａ〜ｈを通過してＣＣＤ360ａ〜ｈによって検出される。このとき、ＣＣＤ360ａ〜ｈで検出される光ビーム330´は、光ビーム330Ｓとレファレンス光ビーム330Ｒとの干渉の状態に応じて干渉縞を発生させる。
【００７７】
試料11分注後から継続的に複数回測定し、ＣＣＤ360ａ〜ｈにより検出される干渉縞の変化を検出することにより、試料中の特定物質とセンシング物質との結合の有無を検出することができる。つまりこの場合は、上記特定物質とセンシング物質14との結合状態に応じてセンシング物質14の屈折率が変化すると、界面で全反射した光ビーム330Ｓおよびレファレンス光ビーム330Ｒがハーフミラー353ａ〜ｈにより合成される際に、干渉の状態が変化するため、上記干渉縞の変化に応じて結合を検出することができる。
【００７８】
信号処理部361は、以上の原理に基づいて上記反応の有無を検出するが、この際、温度演算手段362において、第１の実施形態と同様にして、温度検知手段51〜54からの検知温度に基づいて各ウェルにおける擬似検知温度を得、補正手段363において、干渉縞の変化について補正を施し、該補正された干渉縞の変化に基づいて結合の有無の分析を行い、分析結果を表示部365に出力する。
【００７９】
本実施形態においても、ウェル数より少ない数の温度検知手段51〜54から各ウェルの温度を求めるため、各ウェル毎に湿度検知手段を備える場合と比較して、コストアップ、装置の複雑化を抑えることができ、測定値である干渉縞の変化に該温度に応じた補正を施すので、温度変動に影響を受けない分析結果を得ることができ、測定精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施形態による表面プラズモン共鳴測定装置の要部を示す平面図
【図２】本発明の第１の実施形態による表面プラズモン共鳴測定装置の要部を示す一部破断側面図
【図３】光ビーム入射角と検出光強度および強度微分値の関係を示す概略図
【図４】第１の実施形態の測定装置における、温度演算方法を説明するための図
【図５】温度Ｔに対するドリフトの傾きαの関係の一例を示す図
【図６】本発明の第３の実施形態による漏洩モード測定装置の要部を示す一部破断側面図
【図７】本発明の第４の実施形態による表面プラズモン共鳴測定装置の要部を示す一部破断側面図
【図８】本発明の第５の実施形態による測定装置の要部を示す一部破断側面図
【符号の説明】
１ 光ビーム入射手段
２ レーザ光源
３ コリメータレンズ
４ａ〜ｇ ハーフミラー
４ｈ ミラー
５ａ〜ｈ シリンドリカルビームエキスパンダ
６ａ〜ｈ ミラー
７ａ〜ｈ シリンドリカルレンズ
11 試料液
12 金属膜
14 センシング物質
17Ａ〜Ｈ 光検出手段
17a,b,c… フォトダイオード
20 信号処理部
21 温度演算手段
22 補正手段
25 表示部
41 クラッド層
42 光導波層
51〜54 温度検知手段
100、100' センサウェルユニット
101 ウェル
102 光入出射部
102ａ 界面
Ｗｎ（ｎ＝１，２…） 検体ウェル
Ｗｃ コントロールウェル[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a measuring apparatus using generation of evanescent waves by total reflected light, such as a surface plasmon measuring apparatus that analyzes the characteristics of a substance using generation of surface plasmons.
[0002]
[Prior art]
In the metal, free electrons collectively vibrate to generate a dense wave called a plasma wave. A quantized version of this dense wave generated on the metal surface is called surface plasmon.
[0003]
Conventionally, various surface plasmon measuring apparatuses for analyzing the characteristics of a substance to be measured have been proposed by utilizing the phenomenon that this surface plasmon is excited by a light wave. Among them, one that uses a system called Kretschmann arrangement is particularly well known (see, for example, JP-A-6-167443).
[0004]
A surface plasmon measuring apparatus using the above system basically includes a dielectric block formed in a prism shape, for example, and a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a substance to be measured such as a liquid sample. A light source that generates a light beam; an optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the metal film; and It comprises light detecting means for detecting the surface plasmon resonance state, that is, the state of total reflection attenuation by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
[0005]
In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be incident on the interface by changing the incident angle, or a component incident on the light beam at various angles is included. As described above, a relatively thick light beam may be incident on the interface in a convergent light state or a divergent light state. In the former case, a light beam whose reflection angle changes according to the change in the incident angle of the incident light beam is detected by a small photodetector that moves in synchronization with the change in the reflection angle, or the direction in which the reflection angle changes Can be detected by an area sensor extending along the line. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.
[0006]
In the surface plasmon measuring apparatus having the above configuration, when a light beam is incident on a metal film at a specific incident angle that is greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the measured substance in contact with the metal film. The evanescent wave excites surface plasmons at the interface between the metal film and the substance to be measured. When the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established, both are in a resonance state and the energy of the light is transferred to the surface plasmon. The intensity of the reflected light decreases sharply. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means. The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.
[0007]
If the wave number of the surface plasmon is known from the incident angle at which this total reflection attenuation (ATR) occurs, that is, the total reflection attenuation angle θsp, the dielectric constant of the substance to be measured can be obtained. That is, the wave number of surface plasmon is Ksp, the angular frequency of surface plasmon is ω, c is the speed of light in vacuum, ε_m And ε_s Are the metal and the dielectric constant of the substance to be measured, respectively, and the following relationship is established.
[0008]
[Expression 1]

That is, by knowing the total reflection attenuation angle θsp, which is the incident angle at which the reflected light intensity decreases, the dielectric constant ε of the substance to be measured_sThat is, the characteristic relating to the refractive index can be obtained.
[0009]
In this type of surface plasmon measurement device, the total reflection attenuation angle θ_SPIn order to measure the light intensity with high accuracy and with a large dynamic range, it is considered to use an arrayed light detection means as disclosed in JP-A-11-326194. This light detection means is provided with a plurality of light receiving elements arranged in a predetermined direction, and arranged so that different light receiving elements receive light beam components totally reflected at various reflection angles at the interface. Is.
[0010]
In that case, there is provided differential means for differentiating the light detection signals output from the light receiving elements of the arrayed light detection means with respect to the arrangement direction of the light receiving elements, and based on the differential value output by the differential means. In many cases, characteristics relating to the refractive index of the substance to be measured are obtained.
[0011]
Moreover, as a similar measuring device using total reflection attenuation (ATR), for example, “Spectroscopic Research” Vol. 47, No. 1, (1998), pages 21 to 23 and pages 26 to 27 are described. Devices are also known. This leakage mode measuring device is basically a dielectric block formed in a prism shape, for example, a clad layer formed on one surface of the dielectric block, and formed on the clad layer so as to be in contact with a liquid sample. Optical waveguide layer to be generated, a light source for generating a light beam, and the light beam to the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the cladding layer. The optical system includes an incident optical system and light detection means for detecting the excitation state of the waveguide mode, that is, the total reflection attenuation state by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
[0012]
In the leakage mode measuring apparatus having the above-described configuration, when a light beam is incident on the cladding layer through the dielectric block at an incident angle greater than the total reflection angle, the light waveguide layer transmits a specific wave number after passing through the cladding layer. Only light having a specific incident angle having a wave length propagates in the waveguide mode. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer, resulting in total reflection attenuation in which the intensity of light totally reflected at the interface is sharply reduced. Since the wave number of guided light depends on the refractive index of the substance to be measured on the optical waveguide layer, knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs, the refractive index of the substance to be measured and the measurement object related thereto The properties of the substance can be analyzed.
[0013]
In addition, as a measuring device using total reflection such as a surface plasmon resonance measuring device or a leakage mode measuring device, light is incident on the interface at an incident angle at which a total reflection condition is obtained, and an evanescent wave is generated by the light, thereby generating an interface. When measuring the characteristics of the substance to be measured by measuring the change in the state of the totally reflected light, the above-mentioned device that measures the specific incident angle that causes the total reflection attenuation, A device for detecting the degree of total reflection attenuation for each angular wavelength that is incident on the interface, or a light beam is incident on the interface, and a part of the light beam is divided before the incident on the interface. There are various types such as an apparatus for measuring the state of interference by interfering with the light beam reflected at the interface.
[0014]
In addition, measurement devices using total reflection light such as the above-described surface plasmon resonance measurement device may be used for random screening to find a specific substance that binds to a desired sensing substance in the field of drug discovery research, etc. In order to perform screening well, a sensor unit including a plurality of measurement chips in which a dielectric block and a sample holding unit are integrated and a support base that supports the plurality of measurement chips in a one-dimensional or two-dimensional manner, or a dielectric The block itself constitutes a sensor well unit including a plurality of one-dimensional or two-dimensional specimen wells having openings on the upper surface of the dielectric block, and a plurality of specimen wells of the sensor unit or sensor well unit A plurality of light beams are incident in parallel to each other, and the reflection at the interface of each measurement chip (or well) Detecting light individually measuring devices have been proposed.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
By the way, in the above measurement apparatus, when the environmental value such as the ambient temperature or humidity where the measurement chip is arranged changes, the refractive index of the sample liquid changes. Even in the case of a sample to be obtained, the detection result actually detected may be different, and there is a problem that the reliability of the detection result is lowered.
[0016]
In order to solve this problem, the present applicant has already proposed a measurement apparatus that includes an environmental value detection unit that detects an environmental value and can obtain a detection result that does not depend on the environmental value. However, in the case of a measurement apparatus that measures a plurality of measurement chips (or wells) simultaneously, there is a difference in environmental value depending on the position of the measurement chip, so that it is necessary to provide an environmental value detection means for each measurement chip. There is a problem that this may increase the cost and complexity of the apparatus.
[0017]
In view of the above circumstances, the present invention suppresses the cost increase and the complexity of the apparatus, and the measurement with improved reliability capable of accurately detecting the state of the totally reflected light without being influenced by the surrounding environmental values. An object is to provide an apparatus.
[0018]
[Means for Solving the Problems]
The measurement apparatus of the present invention includes a light source that generates a light beam,
A plurality of three or more measurements comprising a dielectric block transparent to the light beam, a thin film layer formed on one surface of the dielectric block, and a sample holding mechanism for holding the sample on the surface of the thin film layer A sensor unit comprising a chip and a support that supports the plurality of measurement chips;
An incident optical system that causes the light beam to be incident on the dielectric block at an incident angle at which a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the thin film layer;
In a measuring device comprising a light detecting means for detecting the intensity of a light beam totally reflected at the interface,
Environmental value detection means for detecting environmental values in the vicinity of the sensor unit at two or more and a smaller number of locations than the plurality of measurement chips;
Environmental value calculation means for obtaining an environmental value in each of the plurality of measurement chips from the environmental values of the small number of locations detected by the environmental value detection means;
And a correction unit that corrects a detection result of the light detection unit for each measurement chip based on an environmental value of each measurement chip.
[0019]
In the sensor unit, the measurement chip and the support may be formed separately, and the measurement chip may be held in the measurement chip holding hole of the support, or the measurement chip and the support may be formed integrally. A sensor well unit in which the sample holding portion of the measurement chip is formed in a well shape may be used.
[0020]
The environmental value may be a combination of a plurality of environmental values or a single environmental value. Examples of the environmental value include temperature or humidity. Further, the environmental value may be temperature, humidity itself, a difference from a predetermined value, a fluctuation amount, or the like.
[0021]
In the measurement apparatus using each total reflection attenuation, “correcting the detection result by the light detection means” means correcting a value obtained based on the intensity of the light beam, for example, the angle of the total reflection attenuation angle. Is also included. In addition, when using a photodetecting means in which a large number of light receiving elements are arranged in an array and a differentiating means for differentiating with respect to the direction in which the light receiving elements are arranged, the differential value output by the differentiating means may be corrected. Is included.
[0022]
The correction means may correct measurement results for other measurement chips with reference to a measurement result of the predetermined detection chip by the light detection means among the plurality of measurement chips.
[0023]
Alternatively, the correction unit may include a lookup table that stores the environment value and the detection result of the light detection unit in association with each other, and performs correction based on the lookup table.
[0024]
Each measuring apparatus of the present invention may be configured such that the thin film layer is made of a metal film and measurement is performed using the effect of the surface plasmon resonance described above.
[0025]
Further, each of the measuring devices includes the thin film layer including a clad layer formed on the upper surface of the dielectric block and an optical waveguide layer formed on the clad layer, and a waveguide mode in the optical waveguide layer. It is good also as what was comprised so that a measurement might be performed using the effect by excitation.
[0026]
In the measuring apparatus using total reflection light according to the present invention, there are various methods for analyzing the sample by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface by the light detection means. The incident light is incident at various incident angles at which the total reflection condition is obtained at the interface, and the intensity of the light beam totally reflected at the interface is measured for each position corresponding to each incident angle, and the position of the dark line generated by the total reflection attenuation ( Samples may be analyzed by detecting angle) or described in DVNoort, K. johansen, C.-F. Mandenius, Porous Gold in Surface Plasmon Resonance Measurement, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.585-588 As shown in the figure, a light beam having a plurality of wavelengths is incident at an incident angle at which the total reflection condition is obtained at the interface, and the intensity of the light beam totally reflected at the interface is measured for each wavelength. Sample analysis by detecting the degree of total reflection attenuation of It may be carried out.
[0027]
In addition, as described in PINikitin, ANGrigorenko, AA Beloglazov, MVValeiko, AISavchuk, OASavchuk, Surface Plasmon Resonance Interferometry for Micro-Array Biosensing, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.235-238 Is incident at an angle of incidence that provides a total reflection condition at the interface, and a part of the light beam is split before the light beam enters the interface, and the split light beam is totally reflected at the interface. Sample analysis may be performed by interfering with the reflected light beam and measuring the intensity of the light beam after the interference.
[0028]
【The invention's effect】
The measurement apparatus of the present invention includes an environmental value calculation means for obtaining an environmental value at each measurement chip from an environmental value smaller than the number of measurement chips of the sensor unit, and a correction for correcting the detection result for each measurement chip according to the environmental value. Therefore, it is not necessary to provide an environmental value detection means for each measurement chip, and compared to the case where each measurement chip is provided with an environmental value detection means, the cost is increased and the complexity of the apparatus is suppressed. On the other hand, for each measurement chip, a detection result that is not influenced by the environmental value can be obtained, and the reliability of the measurement apparatus can be improved.
[0029]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 and FIG. 2 show the planar shape and the side surface shape of the surface plasmon resonance measuring apparatus according to the first embodiment of the present invention, respectively.
[0030]
In the measurement apparatus according to the present embodiment, a plurality of specimen wells (reservoir) 101 opening on the flat upper surface of the dielectric block are provided in a one-dimensional manner on the dielectric block, and the inner bottom surface of each specimen well 101 is provided. Further, a sensor well unit 100 is provided in which a metal film 12 is formed as a thin film layer. The sensor well unit 100 is made of, for example, a transparent resin, and a sensing substance 14 that binds to a specific substance is fixed on the metal film 12. Further, a light incident / exit portion 102 of a dielectric block protruding downward is formed on each bottom surface of the well 101, and the light beam L is incident on the interface 102a between the light incident / exit portion 102 and the metal film 12. It has become.
[0031]
Furthermore, this surface plasmon resonance measuring apparatus includes a laser light source 2 that emits a light beam L, and a plurality (eight in this example) of light beams L emitted from the light source 2 arranged in the direction of arrow P of the sensor well unit 100. The light beam incident means 1 to be incident on the bottom surface of the well 101 in parallel and the eight light detection means having the same number as the number of wells in the direction of arrow P for receiving the light beam L reflected by the interface 102a of each well 101, respectively. 17A to H, a signal processing unit 20 that receives outputs from the light detection units 17A to 17H, a display unit 25 connected to the signal processing unit 20, and temperature detection units 51 to 54 that are environmental value detection units, It has.
[0032]
The light beam incident means 1 includes a collimator lens 3 that makes a light beam L emitted from a laser light source 2 in a divergent light state as parallel light, half mirrors 4a to 4g and a mirror 4h that branch the light beam L, and a branched light beam. The cylindrical beam expanders 5a to 5h whose diameter is enlarged only in the plane shown in FIG. 2, mirrors 6a to h for reflecting the light beam L, and the light beam L reflected by the mirrors 6a to h are shown in FIG. The cylindrical lenses 7a to 7h that collect light only in the plane shown in FIG.
[0033]
Each of the light detection means 17A to H is composed of a photodiode array in which a large number of light receiving elements (photodiodes 17a, 17b, 17c...) Are arranged in one row.
[0034]
The temperature detecting means 51 to 54 are smaller in number (four here) than the number of wells (here, eight) in the sensor well unit 100, and are provided at different locations on the side surface of the sensor well unit 100, respectively. The temperature at the point is detected. As the temperature detection means 51 to 54, a thermocouple, a thermistor, or the like can be used.
[0035]
The signal processing unit 20 obtains the temperature in each well 101 from the detected temperatures detected by the temperature detecting means 51 to 54, and the measurement value S based on a predetermined value to be described later based on the temperature of each well 101. The correction means 22 which performs the process and outputs the corrected output signal S ′ is provided.
[0036]
Next, the measurement principle will be described.
[0037]
As shown in FIG. 1, a light beam L emitted in a divergent light state from one laser light source 2 is converted into parallel light by a collimator lens 3, and then branched into eight beams by half mirrors 4a to 4g and a mirror 4h. The eight branched light beams L are incident on the bottom surface of the well 101, that is, the interface 102 a between the light incident / exiting portion 102 and the metal film 12.
[0038]
At this time, the branched light beams L are enlarged in diameter only in the plane shown in FIG. 2 by the cylindrical beam expanders 5a to 5h, reflected by the mirrors 6a to 6h, respectively, and changed their traveling directions. The light is condensed only by the cylindrical lenses 7a to 7h in the plane shown in FIG. Accordingly, each light beam L is incident on the interface 102a between the light incident / exiting portion 102 and the metal film 12 with various incident angle components. The laser light source 2 is arranged in a direction in which the light beam L which is linearly polarized light enters the interface 102a in the p-polarized state. In addition, in order to make the light beam L incident on the interface 102a as p-polarized light, the direction of polarization of the light beam L may be controlled by a wave plate.
[0039]
Since the light beam L is condensed as described above, the light beam L includes components incident on the interface 102a at various incident angles θ. In addition, this incident angle (theta) shall be an angle more than a total reflection angle. For this reason, the reflected light beam L totally reflected at the interface 102a includes components totally reflected at various reflection angles. The light beam incident means 1 may be configured to enter the light beam L in a defocused state without condensing the light beam L on the interface in the form of dots. By doing so, since the light beam L is totally reflected in a wider area on the interface, the detection error of the total reflection attenuation state is averaged, and the measurement accuracy of the total reflection elimination angle can be improved.
[0040]
The light beam L totally reflected by the interface 102a is detected by the light detection means 17A-H. Each of the light detection means 17A to H in this example is a photodiode array in which a plurality of photodiodes 17a, 17b, 17c,... Are arranged in a line. The direction in which the photodiodes are juxtaposed is substantially perpendicular to the traveling direction of the light beam L. Therefore, different photodiodes 17a, 17b, 17c,... Receive the respective components of the light beam L totally reflected at various reflection angles at the interface 102a. In the following description, each detection means 17A to 17H is simply referred to as light detection means 17.
[0041]
FIG. 3 shows (a) the relationship between the incident angle θ of the light beam L to the interface 102a and the light intensity I, and (b) the relationship between the incident angle θ and the differential value dI of the light intensity I. . As shown in FIG. 3A, a specific incident angle θ at the interface 102a_SPSince the light incident on the surface excites surface plasmons at the interface between the metal film 12 and the sample, the reflected light intensity I sharply decreases for this light. That is, θ_SPIs the total reflection attenuation angle, and this angle θ_SPThe reflected light intensity I takes a minimum value. Obtaining the presence or absence of binding between the specific substance in the sample liquid and the sensing substance 14 by measuring the change with time of the position fluctuation of the minimum value of the reflected light intensity I, that is, the change with time of the total reflection attenuation angle. Can do. Further, as shown in FIG. 3B, the position where the differential value dI = 0 of the reflected light intensity I varies with the position variation of the total reflection attenuation angle. Therefore, by observing the change over time at the measurement point that was near the differential value dI = 0 at the start of measurement, the change in the total reflection attenuation angle can be obtained indirectly, and the binding between the specific substance and the sensing substance 14 The presence or absence can be obtained.
[0042]
The signal processing unit 20 of the present embodiment obtains the differential value dI of the reflected light intensity I as described above in order to perform high-accuracy measurement, and measures the change over time of the differential value dI, thereby calculating the total reflection attenuation angle. Is obtained by indirectly observing the change with time in the presence or absence of binding between the specific substance and the sensing substance 14. However, here, the differential value dI of the light intensity I obtained from the light detection means 17 is used as the measurement value S, and the correction means 22 obtains a correction value S ′ obtained by performing a predetermined correction on the measurement value S. The correction value S ′ is used as a true differential value dI ′ to obtain the presence or absence of coupling, and the detection result is output to the display unit 25.
[0043]
Next, an actual measurement method in the surface plasmon sensor having the above configuration will be described.
[0044]
First, a sample solution is dispensed into each well 101 of the sensor well unit 100. At this time, among the eight wells 101, the sample wells W1 to W7 are dispensed with the sample solution containing the sample, and the remaining one well Wc is injected with only the solvent of the sample solution to be injected into the sample well. This well Wc is used as a control for subtracting the change in refractive index (bulk effect) due to the solvent in each sample well Wn (n = 1, 2,... 7).
[0045]
As described in the above measurement principle, the light beam L is incident on each of the interfaces 102a of the eight wells Wn and Wc in parallel, and the total reflected light from the interfaces 102a is detected by the light detection means 17, respectively.
[0046]
The light intensity I received by the light detection unit 17 is input to the signal processing unit 20, and the detected temperatures detected by the temperature detection units 51 to 54 are also input to the signal processing unit 20. The light intensity is measured and the temperature is detected every time a predetermined time elapses.
[0047]
First, the signal processing unit 20 obtains the pseudo detection temperature in each well Wn and wc from the temperature detected by the temperature detection means 51 to 54 in the temperature calculation means 21, and then in the correction means 22 in each well Wn. Based on the temperature of Wc and Wc, the differential value dI of the light intensity I output from the light detection means 17 is used as the measurement value S, and the measurement value S is subjected to a predetermined correction, and the correction value S ′ (= true differential value) dI ′) is obtained, and based on the correction value S ′, the presence or absence of binding between the subject and the sensing substance 14 is determined, and the determination result is output to the display unit 25.
[0048]
Hereinafter, the operation of the temperature calculation means 21 and the correction means 22 will be described.
[0049]
FIG. 4 is a diagram for explaining a temperature calculation method by the temperature calculation means 22. The vertical axis of the graph in FIG. 4 indicates the temperature T, and the horizontal axis indicates the position of the sensor well unit 100 in the P direction. In the temperature calculation means 22, a quadratic approximate curve as shown by a solid line in FIG. 4 based on the detected temperatures detected by the temperature detection means 51 to 54, here, four measurement points indicated by ◯ in FIG. And pseudo detection temperatures Tn (n = 1, 2,..., 7) and Tc in the wells Wn and Wc indicated by x in the figure are obtained from the quadratic approximate curve. According to this method, the temperature of each well can be obtained approximately with a temperature detection means smaller than the number of wells, and it is not necessary to provide a temperature detection means for each well. Can be prevented.
[0050]
FIG. 5 shows an example of the relationship of the drift slope α with respect to the temperature T. In the surface plasmon resonance measuring apparatus, there is a phenomenon called drift in which reflected light detected by the photodetector means gradually changes in position even at a constant temperature. As shown in FIG. 5, the slope of the drift (degree of change) differs for each temperature, and the slope tends to increase as the temperature increases. In the sensor well unit having a plurality of wells as in the present embodiment, there may be a temperature difference between the sample well Wn and the control well Wc. Since α is different, it is necessary to consider this temperature difference when removing the bulk effect.
[0051]
The correction means 22 stores the relationship between the temperature and the drift gradient obtained in advance, and based on the input measurement value S and the temperatures Tn and Tc for each well, correction based on the correction formula (1) And a correction value Sout is output.
[0052]
Sout (Wn, t) = S (Wn, t) −S (Wc, t) · (α (Tn) / α (Tc)) (1)
Here, Sout (Wn, t) is a correction value at time t of the well Wn, S (Wn, t) is a measurement value at time t of the well Wn, and S (Wc, t) is a measurement value at time t of the control well Wc. The value, α (T), is the drift slope at temperature T, Tn is the temperature of well Wn at time t, and Tc is the temperature of control well Wc at time t.
[0053]
By the correction equation (1), it is possible to remove the bulk effect corresponding to the temperature difference between the sample well Wn and the control well Wc, and to obtain a more accurate measurement result.
[0054]
Next, a surface plasmon resonance measuring apparatus according to the second embodiment will be described. The schematic configuration of the measurement apparatus of the second embodiment is substantially the same as the measurement apparatus shown in FIGS. Hereinafter, only points different from the above embodiment will be referred to, and detailed description of similar elements will be omitted.
[0055]
In the measurement apparatus of the second embodiment, no control well is provided at the time of measurement, and all eight wells 101 in FIG. 1 are used as specimen wells. Further, the correction means 22 of the signal processing unit 20 is different from the first embodiment in that the correction means 22 includes a lookup table in which correction data is stored in advance when the sensor is manufactured. This lookup table outputs a correction value S ′ that corrects a deviation from an output signal that is output when the temperature of each well is 20 ° C. when the temperature of each well and the measurement value S are input. Yes, if the type of solvent contained in the sample solution is different, the correction value S ′ corresponding to the measured value S is different. Therefore, a lookup table is created for each solvent, and is adjusted according to the solvent contained in the sample solution to be used. The user selects a lookup table.
[0056]
In the temperature calculation means 21, the pseudo detection temperature in each well is obtained in the same manner as in the first embodiment. Thereafter, the correction means 22 inputs the temperature and measurement value for each well into the lookup table to obtain a correction value S ′. The correction value S ′ is a signal value that does not depend on the environmental temperature change of the well, and this is used as a true differential signal dI ′ to analyze the presence or absence of binding between the sensing substance and the analyte.
[0057]
Since the measured value S changes due to a change in the environmental temperature of the well, whether the change in the measured value S is due to a binding reaction between the analyte and the sensing substance or a change in the environmental temperature when the environmental temperature of the well changes. However, in this embodiment, a lookup table is provided, and a correction for correcting a deviation from the output signal output when the well temperature is always 20 ° C. is possible. Since the value S ′ is obtained, highly reliable measurement can be performed without being influenced by temperature fluctuation.
[0058]
FIG. 6 is a side view of the surface plasmon resonance measuring apparatus according to the third embodiment.
[0059]
Here, in place of the temperature detection means of the measuring apparatus of the first embodiment, humidity detection means 61 to 64 are provided as environmental value detection means. The humidity detectors 61 to 64 are provided at substantially the same locations as the temperature detectors 51 to 54 in FIG. Further, the signal processing unit 20 includes a humidity calculating means 26 and a correcting means 27. In the humidity calculating means 26, as in the case of the temperature calculating means described above, the humidity detecting means 61 having a number smaller than the number of wells. A quadratic approximate curve is obtained from ˜64 measurement points, and the pseudo detected humidity in each well is obtained from the curve.
[0060]
Further, the correction means 27 includes a lookup table that outputs a correction value prepared by correcting a difference from an output when the humidity is 60% when a humidity and a measured value S are input. In the same manner as in the second embodiment, the user selects from a plurality of lookup tables prepared for each solvent according to the measurement target.
[0061]
In this embodiment, since the humidity of each well is obtained from the number of humidity detection means 61 to 64 that is smaller than the number of wells, compared to the case where the humidity detection means is provided for each well, the cost is increased and the apparatus is complicated. Since the measurement value is corrected so that the output is always at 60% humidity, an analysis result that is not affected by humidity fluctuations can be obtained, and the measurement accuracy can be improved.
[0062]
FIG. 7 is a side view of the above-described leakage mode measuring apparatus according to the fourth embodiment. In the figure, elements equivalent to those shown in FIG. 2 are given the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted. Here, only the sensor well unit is different from the measurement apparatus of the first embodiment described above.
[0063]
The sensor well unit 100 ′ is composed of a dielectric block having substantially the same shape as that of the sensor well unit 100 shown in the first embodiment, and a thin film layer provided on the inner surface of the bottom of the well 102 is a cladding layer 41. And the optical waveguide layer 42 provided thereon is different. The clad layer 41 is formed in a thin film shape using a dielectric having a lower refractive index than the dielectric block or a metal such as gold. The optical waveguide layer 42 is formed in a thin film shape using a dielectric having a higher refractive index than that of the cladding layer 41, for example, PMMA. The film thickness of the clad layer 41 is, for example, 36.5 nm when formed from a gold thin film, and the film thickness of the optical waveguide layer 42 is, for example, about 700 nm when formed from PMMA.
[0064]
In the leakage mode measuring apparatus shown in FIG. 7, when the light beam L emitted from the laser light source 2 is incident on the cladding layer 41 through the light incident / exiting portion 102 at an incident angle greater than the total reflection angle, the light beam L is emitted as light. Although light is totally reflected at the interface 102a between the incident / exit section 102 and the cladding layer 41, light of a specific wave number transmitted through the cladding layer 41 and incident on the optical waveguide layer 42 at a specific incident angle is guided through the optical waveguide layer 42. Propagate in mode. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer 42, and total reflection attenuation occurs in which the intensity of light totally reflected at the interface 102a sharply decreases.
[0065]
The wave number of guided light in the optical waveguide layer 42 depends on the sample on the optical waveguide layer 42 (here, the refractive index of the sensing substance 14, so knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs) The refractive index and related sample characteristics can be analyzed.
[0066]
In the present embodiment, a sensing material 14 that binds to a specific substance is fixed in advance on the optical waveguide layer 42 in the same manner as in the first embodiment, and a liquid sample containing an analyte on the sensing substance 14 11 is dropped, and the presence or absence of binding between the sensing substance 14 and the analyte is analyzed by measuring the amount of change in the total reflection attenuation angle θsp due to waveguide mode excitation, that is, the amount of change in the differential value of the reflected light intensity. The analysis result is output to the display unit 25.
[0067]
Also in the present embodiment, based on the detected temperatures detected by the temperature detecting means 51 to 54, the temperature calculating means 21 of the signal processing unit 20 obtains the temperatures of the sample well Wn and the control well Wc, and the correcting means 22 Since the correction value S ′ is obtained by the correction process using the correction formula (1) for the measurement value S, the same effect as in the first embodiment can be obtained.
[0068]
Note that the measurement apparatus of each of the above-described embodiments causes the light beam from the light source to enter the interface at various angles, measures the reflected light from the interface, and shows the state of total reflection attenuation from the incident angle that becomes a dark line. Measurement is performed to obtain the binding state between the subject and the sensing substance. The incident angle of the light beam is set to a predetermined angle that satisfies the total reflection condition at the interface, and light beams having various wavelengths are incident or incident. The reflected light from the interface may be measured by changing the wavelength of the light beam to be obtained, and the coupled state between the subject and the sensing substance may be obtained according to the total reflection attenuation state for each wavelength.
[0069]
Further, another measuring apparatus using total reflected light will be described below as a fifth embodiment.
[0070]
As shown in FIG. 8, the measurement apparatus of the present embodiment includes the temperature detection unit and the signal processing unit similar to those of the first embodiment described above, but the binding between the subject and the sensing substance. The measurement method for obtaining the state is different from the above-described embodiments.
[0071]
Light sources 334a-h and CCDs 360a-h are arranged across the sensor well unit 100, and between these light sources 334a-h and CCDs 360a-h, collimator lenses 350a-h, interference optical systems, light condensing. Lenses 355a-h and apertures 356a-h are disposed, and temperature detection means 51-54 similar to those of the first embodiment are further provided.
[0072]
The interference optical system includes polarization filters 351a-h, half mirrors 352a-h, half mirrors 353a-h, and mirrors 354a-h.
[0073]
Further, the CCDs 360 a to h are connected to the signal processing unit 361, and the signal processing unit 361 is connected to the display unit 365.
[0074]
The signal processing unit 361 includes a temperature calculation unit 362 and a correction unit 363.
[0075]
Hereinafter, measurement of a sample in the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present embodiment will be described.
[0076]
The light sources 334a-h are driven and the light beams 330 are emitted in a divergent light state. The light beam 330 is collimated by collimator lenses 350a to 350h and enters the polarization filters 351a to 351h. The light beam 330 transmitted through the polarizing filters 351a-h and incident on the interface with p-polarized light is partly divided as a reference light beam 330R by the half mirrors 352a-h, and the half mirrors 352a-h are separated. The remaining transmitted light beam 330S enters the interface. The light beam 330S totally reflected at the interface and the reference light beam 330R reflected by the mirrors 354a to 354h are incident on the half mirrors 353a to 353h and synthesized. The combined light beam 330 'is collected by the condenser lenses 355a-h, passes through the apertures 356a-h, and is detected by the CCDs 360a-h. At this time, the light beam 330 ′ detected by the CCDs 360 a to h generates interference fringes according to the state of interference between the light beam 330 S and the reference light beam 330 R.
[0077]
It is possible to detect the presence or absence of binding between a specific substance and a sensing substance in a sample by continuously measuring a plurality of times after dispensing 11 samples and detecting changes in interference fringes detected by the CCDs 360a to h. . That is, in this case, when the refractive index of the sensing material 14 changes according to the coupling state between the specific material and the sensing material 14, the light beam 330S and the reference light beam 330R totally reflected at the interface are combined by the half mirrors 353a to 353h. In this case, since the state of interference changes, the coupling can be detected according to the change in the interference fringes.
[0078]
The signal processing unit 361 detects the presence or absence of the reaction based on the above principle. At this time, the temperature calculation unit 362 detects the temperature detected from the temperature detection units 51 to 54 in the same manner as in the first embodiment. Based on the above, the pseudo detection temperature in each well is obtained, the correction means 363 corrects the interference fringe change, analyzes the presence / absence of coupling based on the corrected interference fringe change, and displays the analysis result on the display unit Output to 365.
[0079]
Also in this embodiment, since the temperature of each well is obtained from the temperature detection means 51 to 54 having a number smaller than the number of wells, the cost is increased and the apparatus is complicated as compared with the case where the humidity detection means is provided for each well. Since the correction according to the temperature is performed on the change of the interference fringe as the measurement value, an analysis result that is not affected by the temperature fluctuation can be obtained, and the measurement accuracy can be improved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a plan view showing a main part of a surface plasmon resonance measuring apparatus according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a partially broken side view showing the main part of the surface plasmon resonance measuring apparatus according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a schematic diagram showing a relationship between an incident angle of a light beam, a detected light intensity, and an intensity differential value.
FIG. 4 is a diagram for explaining a temperature calculation method in the measuring apparatus according to the first embodiment.
FIG. 5 is a diagram showing an example of the relationship between the drift slope α and the temperature T;
FIG. 6 is a partially broken side view showing the main part of a leakage mode measuring apparatus according to a third embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a partially broken side view showing the main part of a surface plasmon resonance measuring apparatus according to a fourth embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a partially broken side view showing the main part of a measuring apparatus according to a fifth embodiment of the present invention.
[Explanation of symbols]
1 Light beam incident means
2 Laser light source
3 Collimator lens
4a-g half mirror
4h mirror
5a-h Cylindrical beam expander
6a-h mirror
7a-h Cylindrical lens
11 Sample solution
12 Metal film
14 Sensing substances
17A-H Light detection means
17a, b, c… photodiode
20 Signal processor
21 Temperature calculation means
22 Correction means
25 Display
41 Clad layer
42 Optical waveguide layer
51-54 Temperature detection means
100, 100 'sensor well unit
101 well
102 Light input / output
102a interface
Wn (n = 1, 2,...) Sample well
Wc Control well

Claims (4)

A light source that generates a light beam;
A plurality of three or more measurements comprising a dielectric block transparent to the light beam, a thin film layer formed on one surface of the dielectric block, and a sample holding mechanism for holding the sample on the surface of the thin film layer A sensor unit comprising a chip and a support that supports the plurality of measurement chips;
An incident optical system that causes the light beam to be incident on the dielectric block at an incident angle at which a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the thin film layer;
In a measuring device comprising a light detecting means for detecting the intensity of the light beam totally reflected at the interface,
Environmental value detection means for detecting environmental values in two or more locations near the sensor unit and fewer than the plurality of measurement chips, respectively;
Environmental value calculation means for obtaining an environmental value in each of the plurality of measurement chips from the environmental values of the small number of locations detected by the environmental value detection means;
A measuring apparatus comprising: correction means for correcting a detection result by the light detection means for each measurement chip based on an environmental value of each measurement chip. The measuring apparatus according to claim 1, wherein the environmental value is temperature and / or humidity. 2. The correction means corrects the measurement results of other measurement chips by using, as a reference, the measurement result of the light detection means of a predetermined measurement chip among the plurality of measurement chips. Or the measuring apparatus of 2. The correction unit includes a lookup table that stores the environment value and the detection result of the light detection unit in association with each other, and performs correction based on the lookup table. The measuring apparatus according to 1 or 2.

Images