JP3890544B2

JP3890544B2 - New indole glycosides

Info

Publication number: JP3890544B2
Application number: JP11330497A
Authority: JP
Inventors: 道徳久保; 雅之吉川; 秀秋松田; 久司松田; 敏之村上; ひろみ島田; 哲生櫻間; 学野邨
Original assignee: Nomura Co Ltd
Current assignee: Nomura Co Ltd
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2007-03-07
Anticipated expiration: 2017-03-25
Also published as: JPH10265492A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エビネラン（ＣａｌａｎｔｈｅｄｉｓｃｏｌｏｒＬｉｎｄｌ．）から単離したインドール配糖体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
エビネランのアルコール溶液抽出物が、発毛・育毛剤として著効を示すことは知られている（特開平５−２９４８１３号公報）。しかしながら、エビネラン抽出液含有成分は、まだ十分に解明されてなく、有効成分の特定にいたっていない現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、エビネランからのアルコール抽出液の分画成分を精査し、生理的に有用な活性をもつ新規インドール配糖体を単離することに成功し、本発明にいたった。
【０００４】
すなわち、本発明は、エビネランから単離した血流促進作用及び美白作用のある新規インドール配糖体を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成した本発明の新規インドール配糖体は、化１で示す３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルインドール（３−ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１→６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｙｌｉｎｄｏｌ）（以下「カラントサイドＡ／ｃａｌａｎｔｈｏｓｉｄｅＡ」という）からなることを特徴としている。
【０００６】
【化１】
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のカラントサイドＡは、次のようにして製造できる。エビネランの根茎を細切りした後、例えばメタノールで熱時抽出し、メタノール抽出エキスを得る。得られたメタノール抽出エキスを酢酸エチルと水（１：１）で分配抽出する。次いで水移行部を逆相シリカゲルカラムクロマトガラフィーに付し、水、メタノールで順次溶出し、メタノール溶出部を得る。メタノール溶出部を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、さらに順相シリカゲルカラムガスクロマトグラフィーで分画し、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて繰り返し分離することにより、カラントサイドＡが単離される。
【０００８】
カラントサイドＡは、後述する試験例１から明らかなように、ラットの皮膚血流促進作用を有意に増加させることが明らかとなり、育毛剤等の用途が期待できる。また皮膚美白作用は、皮膚が黒くなるのを防ぐ意味で、皮膚でのメラミン産生の抑制をみるのがひとつの指標となる。メラニンはチロシンあるいはドーパからチロシナーゼという酵素によって産生されるので、この酵素活性を抑制することが美白につながる。後述の試験例２に示すように、この酵素活性を抑制する抗チロシナーゼ活性を測定した結果、カラントサイドＡは、比較的強い抗チロシナーゼ効果を示し、美白乳液、クリーム等の化粧料としての利用が期待できる。
【０００９】
【実施例】
（単離）
宮崎産エビネ新鮮根茎（７．５ｋｇ）を細切りした後、ＭｅＯＨ（１８リットル）で熱時抽出を計３回おこなった。ＭｅＯＨ抽出液３回分をあわせて減圧下溶媒留去し、ＭｅＯＨ抽出エキス（３３０ｇ，４．４％）を得た。エビネＭｅＯＨ抽出工キス（３００ｇ）をＡｃＯＥｔ−Ｈ_２Ｏ（１：１）で分配して、ＡｃＯＥｔ層移行部（７５ｇ，１．０％）、Ｈ_２Ｏ層移行部（２２５ｇ，３．０％）を得た。得られたＨ_２Ｏ層移行部エキスを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１．０ｋｇ，Ｈ_２Ｏ→ＭｅＯＨ］で糖除去し、ＭｅＯＨ流出部エキス（１３ｇ，１．７％）を得た。ＭｅＯＨ流出部エキス１３ｇを順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー｛１．０ｋｇ，［ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ＝１０：１→３：１→１：１］→［ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝６５：３５：１０（下層）→６：４：１］→ＭｅＯＨ｝で分離し、Ｆｒ．１（１７０ｍｇ，０．００２３％）、Ｆｒ．２（４１ｍｇ，０．０００５％）、Ｆｒ．３（４８ｍｇ，０．０００６％）、Ｆｒ．４（２３４ｍｇ，０．００３１％）、Ｆｒ．５（４１００ｍｇ，０．０５５％）、Ｆｒ．６（２７００ｍｇ，０．０３６％）、Ｆｒ．７（２０００ｍｇ，０．０２７％）、Ｆｒ．８（４０００ｍｇ，０．０５３％）を得た。Ｆｒ．７（４３００ｍｇ，０．０５７％）を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［４０ｇ，ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝７：３：１（下層）→６５：３５：１０（下層）→６：４：１］で分画し、さらに逆相高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）［カラム；ＹＭＣ−ＰａｃｋＲ＆ＤＯＤＳ−５（２５０×２０ｍｍｉ．ｄ．），溶媒；ＭｅＣＮ−Ｈ_２Ｏ（３０：７０，ｖ／ｖ），流速；９．０ｍｌ／ｍｉｎ］、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［カラム；ＹＭＣ−ＰａｃｋＲ＆ＤＯＤＳ−５（２５０×２０ｍｍｉ．ｄ．），溶媒；ＭｅＯＨ−Ｈ_２Ｏ（２５：７５，ｖ／ｖ），流速；９．０ｍｌ／ｍｉｎ］で繰り返し分離精製し、カラントサイドＡ（８１．９ｍｇ，０．００１１％）を得た。
【００１０】
【分析例１】
（同定）
カラントサイドＡは正の旋光性を示す淡黄色粉末で、分析結果は下記のとおりである。
カラントサイドＡ：非晶粉末
旋光性：［α］_Ｄ ^２５＋１６４．０゜（ｃ＝０．０１，ＭｅＯＨ）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）
次式計算値Ｃ_２０Ｈ_２８ＮＯ_１１（Ｍ＋Ｈ）^＋：４５８．１６３８
実測値：４５８．１６５０
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ^−１）：
３４９０，１６１８，１５５４，１４５８，１０２８
ＵＶ（ｃ＝０．０００６，ＭｅＯＨ，ｎｍ，ｌｏｇ ε）：
２８２（４．７），２２４（５．４）
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ，５００ＭＨｚ，δ）：
４．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１”−Ｈ），
４．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１’−Ｈ）
６．９７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．３，６．９，７．９Ｈｚ，５−Ｈ），
７．０７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．３，６．９，８．３Ｈｚ，６−Ｈ）
７．１５（１Ｈ，ｓ，２−Ｈ），
７．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．３，８．３Ｈｚ，７−Ｈ），
７．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．３，７．９Ｈｚ，４−Ｈ）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ，１２５ＭＨｚ，δｃ）：
Ｃ−１，Ｃ−２１１２．２，
Ｃ−３１３８．８，Ｃ−４１１８．６，
Ｃ−５１１９．５，Ｃ−６１２２．８，
Ｃ−７１１２．４，Ｃ−８１３５．４，
Ｃ−９１２１．３，Ｃ−１０，
Ｃ−１’ １０５．４Ｃ−２’ ７５．０，
Ｃ−３’ ７７．９Ｃ−４７１．５，
Ｃ−５’ ７７．３Ｃ−６’ ６９．９，
Ｃ−１” １０４．７Ｃ−２” ７５．１，
Ｃ−３” ７７．９Ｃ−４” ７１．５，
Ｃ−５” ７７．９Ｃ−６” ６２．７，
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｍｏｄｅＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：
４８０（Ｍ＋Ｎａ）^＋
Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｍｏｄｅＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：
４５６（Ｍ−Ｈ）⁻
【００１１】
【分析例２】
（糖の同定）
カラントサイドＡ（３ｍｇ）の５％Ｈ_２ＳＯ_４−ジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）（１：１，ｖ／ｖ，１．０ｍｌ）溶液を窒素気流下、加熱還流し、２時間攪拌した。反応液を陰イオン交換樹脂ＩＲＡ−４００（ＯＨ⁻ｆｏｒｍ）で中和し、樹脂を濾別後、溶媒を減圧留去し、粗生成物（２．８ｍｇ）を得た。粗生成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．２ｇ，Ｈ_２Ｏ→ＭｅＯＨ）で分離精製し、溶媒を減圧留去し、粗生成物（１．０ｍｇ）を得た。得られた粗生成物のピリジン溶液に、Ｌ−システィンメチルエステルヒドロクロライド（０．３ｍｇ）を加え６０℃で１時間攪拌し、つづいてＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（０．３ｍｌ）を加え６０℃で１時間攪拌し、濾別後、ＧＣ用サンプルとして以下に示す条件でＧＣ分析を行った。
ＧＣ条件
ｃｏｌｕｍｎ：ＳｕｐｅｌｕｃｏＳＴＢ^ＴＭ−１（０．２５ｍｍ×３０ｍ）
Ｉｎｊｅｃｔｏｒｔｅｍｐ：２３０℃
Ｄｅｔｅｃｔｏｒｔｅｍｐ：２３０℃
Ｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐ：２３０℃
Ｈｅｆｌｏｗｒａｔｅ：１５ｍｌ／ｍｉｎ
保持時間（ｔ_ｒ）
Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ：２４．１５
Ｌ−Ｇｌｕｃｏｓｅ：２５．４６
【００１２】
前記分析例１及び分析例２から、カラントサイドＡは、ＦＡＢ−ＭＳ及び高分解能ＦＡＢ−ＭＳにより、分子式Ｃ_２０Ｈ_２７ＮＯ_１１を有することが明らかになった。またＩＲスペクトルにおいて、水酸基（３４９０ｃｍ^−１）及びピロール環（１５５４ｃｍ^−１）の存在が示唆され、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの解析により、β結合した２個のグルコース［δ４．４０（ｄ，Ｊ＝７．６），δｃ１０４．７］、［δ４．７４（ｄ，Ｊ＝７．３），δｃ１０５．４］の存在が確認された。カラントサイドＡを、Ｈ_２ＳＯ_４−ジオギサンで酸加水分解すると、ｄ−グルコース（ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）が得られ、カラントサイドＡの^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを文献記載の化２に示すインディカン（ｉｎｄｉｃａｎ）と比較すると、グルコースの６位炭素のシグナルが低磁場に、５位炭素のシグナルが高磁場にグルコシル化シフトしていたことから、カラントサイドＡは、化１に示すように、インディカンのグルコースの６位水酸基にもう１分子のグルコースが結合している化合物であることが示唆された。
【００１３】
またカラントサイドＡの^１Ｈ−^１Ｈ，^１３Ｃ−^１ＨＣＯＳＹ及び^１Ｈ−^１Ｈ，^１３Ｃ−^１ＨＯＨＡＨＡスペクトルの解析の結果、糖部のシグナルが完全に帰属され、糖の結合様式はアノメリック水素のカップリング定数及びアノメリック炭素の化学シフト［δ４．４０（ｄ，Ｊ＝７．６），δｃ１０４．７］、［δ４．７４（ｄ，Ｊ＝７．３），δｃ１０５．４］の考察から、２個のグルコースはともにβ結合していることが明らかとなった。さらに、ＨＭＢＣスペクトルにおいて、グルコースのアノメリック水素（δ４．７４，１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３）とインドール環部の３位炭素（δｃ１３８．８）、もう一方のグルコースのアノメリック水素（δ４．４０，１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６）とグルコース６’位炭素（δｃ６９．９）との間に相関が観測されたことから、カラントサイドＡはインディカンのグルコースの６’位にグルコースが結合した３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルインドール（化１）であると決定した。
【００１４】
【化２】
【００１５】
【参考例】
（単離）
宮崎産エビネ新鮮葉（２．９ｋｇ）をＭｅＯＨ（８リットル）で熱時抽出を計３回行った。ＭｅＯＨ抽出液の３回分をあわせて、減圧下溶媒流去し、ＭｅＯＨ抽出エキス（１５０ｇ，５．２％）を得た。エビネＭｅＯＨ抽出エキス（１５０ｇ）をＡｃＯＥｔ−Ｈ_２Ｏ（１：１）で分配し、ＡｃＯＥｔ移行部（６２ｇ，２．１％）を得た。得られたＡｃＯＥｔ移行部エキスを順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー｛１．０ｋｇ，ＣＨＣｌ_３→［ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ＝５０：１→１０：１→５：１］→ＭｅＯＨ｝で分離し、Ｆｒ．１（１０．５ｇ，０．３６％）、Ｆｒ．２（５．４ｇ，０．１９％）、Ｆｒ．３（１４．２ｇ，０．４９％）、Ｆｒ．４（８．０ｇ，０．２８％）、Ｆｒ．５（１０．７ｇ，０．３７％）、Ｆｒ．６（１０．３ｇ，０．３６％）を得た。Ｆｒ．３（１４．２ｇ）をさらに順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１５ｇ，ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ＝２０：１→１０：１→５：１→ＭｅＯＨ］、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１５ｇ，ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ＝２０：１→１０：１→５：１→ＭｅＯＨ］で順次分画し、インジルビン（ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、化３）（１２８．０ｍｇ，０．００４４％）、トリプタントリン（ｔｒｙｐｔａｎｔｈｒｉｎ）化４）（６．８ｍｇ，０．０００２％）を得た。Ｆｒ．５（１０．７ｇ）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１３０ｇ，ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ（４０：６０→５０：５０→８０：２０，ｖ／ｖ），逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋＲ＆ＤＯＤＳ−５（２５０×２０ｍｍｉ．ｄ．），溶媒；ＭｅＯＨ（４５：５５，ｖ／ｖ）流速；９．０ｍｌ／ｍｉｎ］で順次分画し、ヴォミフォリオール（ｖｏｍｉｆｏｌｉｏｌ、化５）（３８．６ｍｇ，０．００１３％）を得た。ここで得られた化合物は、^１Ｈ、^１３Ｃ−ＮＭＲデータ及びＴＬＣを比較し同定した結果、いずれも前述の既知化合物であることが明らかになった。
【００１６】
【化３】
【００１７】
【化４】
【００１８】
【化５】
【００１９】
【試験例１】
（ラット皮膚血流促進作用）
実験動物として、ＳＬｃ：ウィスター系雄性ラット（体重１８０〜２００ｇ）を用いた。皮膚血流量は、レーザードップラー血流計（ＬａｓｅｒＤｏｐｐｌｅｒＦｌｏｗｍｅｔｅｒＰＦ２Ｂ，Ｐｅｒｉｍｅｄ）を用いて測定した。ラットの背部を剪毛し、翌日にウレタン（１ｇ／ｋｇ）麻酔下でラットの皮膚血流量を測定し、前値とした。前値測定直後に被験液２５μｌ（５０％エタノール溶液）を前値測定部位に塗布し、その２０分、４０分、及び６０分後に塗布部位の皮膚血流量を再度測定し、前値に対する増加率を算出した。なお、対照群には５０％エタノール溶液を塗布した。被験液には、実施例のエビネＭｅＯＨ抽出エキス（ＣＤＭ−ｅｘｔ）（０．５％，２．０％）、本発明のカラントサイドＡ（ＣＤＨ２）（０．２％）、参考例の既知物質インジルビン（ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ）（０．２％）を用いた。結果を表１及び図１に示す。
【００２０】
【表１】

【００２１】
表１から明らかなように、エビネＭｅＯＨ抽出エキスは、０．５％、２．０％のいずれにおいても、ラット皮膚血流量を顕著に増加させた。また図１に示すように、本発明のカラントサイドＡは、２０分で皮膚血流量を有意に増加させた。インジルビンにも同様の促進作用は認められるが、有意ではなかった。
【００２２】
【試験例２】
（美白作用）
ＭａｓｏｎとＰｅｔｅｒｓｏｎの方法に準じて、以下の通り実験した。すなわち、被験液０．５ｍｌにＬ−ドーパ溶液（ｐＨ６．８ＰＢＳ中、０．０３％）０．５ｍｌを加え、２５℃、１０分間インベキュートし、さらにマッシュルーム由来のチロシナーゼ溶液（ｐＨ６．８ＰＢＳ中、４５Ｕ／ｍｌ）０．５ｍｌを添加し、２５℃５分間インベキュートした。反応後４７５ｎｍにおける吸光度（Ｄ１）を測定した。別に、Ｌ−ドーパ溶液を添加せずに同様な操作を行い、吸光度（Ｄ２）を測定し、被験薬無添加におけるドーパクロムの生成量としての吸光度（Ｄ３）を測定した。このＤ１、Ｄ２、Ｄ３を用いで、下記の式によりドーパクロム生成阻害率を求め、チロシナーゼ活性の指標とした。被験液には、実施例のエビネＭｅＯＨ抽出エキス（ＣＤＭ−ｅｘｔ）、実施例の酢酸エチル層移行部（ＡｃＯＥｔｐｈａｓｅ）、水層移行部（Ｈ_２Ｏｐｈａｓｅ）、本発明のカラントサイドＡ（ＣＤＨ２）、及び対照群として陽性対照薬のコウジ酸（ｋｏｊｉｃａｃｉｄ）を用いた。結果を表２に示す。
【００２３】
【式１】
【００２４】
【表２】

【００２５】
表２から明らかなように、エビネＭｅＯＨ抽出エキス、酢酸エチル層移行部、水層移行部は、ともに用量依存的に強い抗チロシナーゼ活性を示した。陽性対照群のコウジ酸も強い抗チロシナーゼ活性を示した。収率から考えあわせると、抗チロシナーゼ活性有効成分は、主として水層移行部にあると考えられるが、本発明のカラントサイドＡも、表３に示すように、比較的強い抗チロシナーゼ活性を示した。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、新規カラントサイドＡは皮膚血流促進作用を有し、育毛剤等の有用な用途が期待できる。また皮膚の美白作用も認められ、化粧料等への利用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】エビネランから単離されたカラントサイドＡとインジルビンのラット皮膚血流促進効果を示すグラフである。
【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

【数１】

【表１】

【表２】

【表３】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an indole glycoside isolated from Evinelane (Calenthe discol Lindl.).
[0002]
[Prior art]
It is known that an alcoholic solution extract of evinelan shows a remarkable effect as a hair growth / hair growth agent (Japanese Patent Laid-Open No. 5-294913). However, the component containing the ebinelan extract has not yet been fully elucidated, and the current status has not yet been determined.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The inventors of the present invention have succeeded in isolating a novel indole glycoside having a physiologically useful activity by examining the fraction components of an alcohol extract from ebinellan, and have arrived at the present invention.
[0004]
That is, an object of the present invention is to provide a novel indole glycoside having blood flow promoting action and whitening action isolated from ebinelan.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The novel indole glycoside of the present invention that has achieved the above object is a 3-o-β-D-glucopyranosyl (1 → 6) -β-D-glucopyranosylindole (3-o-β- It is characterized by comprising D-glucopyranosyl (1 → 6) -β-D-glucopyranyl indol (hereinafter referred to as “currantside A / calanthoside A”).
[0006]
[Chemical 1]
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The currant side A of the present invention can be produced as follows. Ebinelan rhizomes are chopped and then extracted with methanol, for example, to obtain a methanol extract. The obtained methanol extract is partitioned and extracted with ethyl acetate and water (1: 1). Next, the water transfer part is subjected to reverse phase silica gel column chromatography and eluted with water and methanol sequentially to obtain a methanol elution part. The methanol eluate is fractionated by normal phase silica gel column chromatography, further fractionated by normal phase silica gel column gas chromatography, and repeatedly separated using reverse phase high performance liquid chromatography to isolate currantside A. .
[0008]
As will be apparent from Test Example 1 described later, currant side A has been shown to significantly increase the skin blood flow promoting action in rats, and can be expected to be used as a hair restorer. In addition, the skin whitening effect is to prevent the skin from becoming dark, and one measure is to check the suppression of melamine production in the skin. Since melanin is produced from tyrosine or dopa by an enzyme called tyrosinase, inhibiting this enzyme activity leads to whitening. As shown in Test Example 2 to be described later, as a result of measuring the anti-tyrosinase activity that suppresses this enzyme activity, Currantside A shows a relatively strong anti-tyrosinase effect and can be used as a cosmetic such as whitening milky lotion and cream. I can expect.
[0009]
【Example】
(Isolation)
After shredding fresh shrimp from Miyazaki (7.5 kg), hot extraction with MeOH (18 liters) was performed three times in total. The three MeOH extracts were combined and evaporated under reduced pressure to give a MeOH extract (330 g, 4.4%). Ebine MeOH extraction kiss (300 g) was distributed with AcOEt-H ₂ O (1: 1), AcOEt layer transition part (75 g, 1.0%), H ₂ O layer transition part (225 g, 3.0%) ) The obtained H ₂ O layer transition part extract was subjected to sugar removal by reverse phase silica gel column chromatography [1.0 kg, H ₂ O → MeOH] to obtain a MeOH effluent part extract (13 g, 1.7%). 13 g of MeOH effluent extract was subjected to normal phase silica gel column chromatography {1.0 kg, [CHCl ₃ : MeOH = 10: 1 → 3: 1 → 1: 1] → [CHCl ₃ : MeOH: H ₂ O = 65: 35: 10 (lower layer) → 6: 4: 1] → MeOH}, Fr. 1 (170 mg, 0.0023%), Fr. 2 (41 mg, 0.0005%), Fr. 3 (48 mg, 0.0006%), Fr. 4 (234 mg, 0.0031%), Fr. 5 (4100 mg, 0.055%), Fr. 6 (2700 mg, 0.036%), Fr. 7 (2000 mg, 0.027%), Fr. 8 (4000 mg, 0.053%) was obtained. Fr. 7 (4300 mg, 0.057%) was subjected to normal phase silica gel column chromatography [40 g, CHCl ₃ : MeOH: H ₂ O = 7: 3: 1 (lower layer) → 65: 35: 10 (lower layer) → 6: 4: 1], and further reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) [column; YMC-Pack R & D ODS-5 (250 × 20 mmid)], solvent; MeCN-H ₂ O (30:70, v / V), flow rate: 9.0 ml / min], reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) [column; YMC-Pack R & D ODS-5 (250 × 20 mm id), solvent; MeOH—H ₂ O ( 25:75, v / v), flow rate; 9.0 ml / min], repeatedly and purified to obtain currantside A (81.9 mg, 0.0011%).
[0010]
[Analysis Example 1]
(Identification)
Currantside A is a light yellow powder exhibiting positive optical rotation, and the analysis results are as follows.
Currant side A: Amorphous powder optical rotation: [α] _D ²⁵ + 164.0 ° (c = 0.01, MeOH)
High resolution FAB-MS (m / z)
Calculated value of the following formula: C ₂₀ H ₂₈ NO ₁₁ (M + H) ⁺ : 458.1638
Actual value: 458.1650
IR (KBr, cm ⁻¹ ):
3490, 1618, 1554, 1458, 1028
UV (c = 0.006, MeOH, nm, log ε):
282 (4.7), 224 (5.4)
¹ H-NMR (CD ₃ OD, 500 MHz, δ):
4.40 (1H, d, J = 7.6 Hz, 1 ″ −H),
4.74 (1H, d, J = 7.3 Hz, 1′−H)
6.97 (1H, ddd, J = 1.3, 6.9, 7.9 Hz, 5-H),
7.07 (1H, ddd, J = 1.3, 6.9, 8.3 Hz, 6-H)
7.15 (1H, s, 2-H),
7.27 (1H, dd, J = 1.3, 8.3 Hz, 7-H),
7.67 (1H, dd, J = 1.3, 7.9 Hz, 4-H)
¹³ C-NMR (CD ₃ OD, 125 MHz, δc):
C-1, C-2 112.2,
C-3 138.8, C-4 118.6
C-5 119.5, C-6 122.8,
C-7 112.4, C-8 135.4
C-9 121.3, C-10,
C-1 ′ 105.4 C-2 ′ 75.0,
C-3 ′ 77.9 C-4 71.5,
C-5 ′ 77.3 C-6 ′ 69.9,
C-1 "104.7 C-2" 75.1,
C-3 "77.9 C-4" 71.5,
C-5 "77.9 C-6" 62.7,
Positive-mode FAB-MS (m / z):
480 (M + Na) ⁺
Negative-mode FAB-MS (m / z):
456 (M−H) ⁻
[0011]
[Analysis Example 2]
(Identification of sugar)
A solution of currantside A (3 mg) in 5% H ₂ SO ₄ -dioxane (1: 1, v / v, 1.0 ml) was heated to reflux under a nitrogen stream and stirred for 2 hours. The reaction solution was neutralized with an anion exchange resin IRA-400 (OH ^- form), the resin was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude product (2.8 mg). The crude product was separated and purified by reverse phase silica gel column chromatography (0.2 g, H ₂ O → MeOH), and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude product (1.0 mg). L-cysteine methyl ester hydrochloride (0.3 mg) was added to the resulting pyridine solution of the crude product and stirred at 60 ° C. for 1 hour, followed by N, O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (0.3 ml). ) And stirred at 60 ° C. for 1 hour, and after filtration, GC analysis was performed under the conditions shown below as a sample for GC.
GC condition column: Superluco STB ^TM -1 (0.25 mm x 30 m)
Injector temp: 230 ° C
Detector temp: 230 ° C
Column temp: 230 ° C
He flow rate: 15 ml / min
Holding time ( _tr )
D-Glucose: 24.15
L-Glucose: 25.46
[0012]
From analysis example 1 and analysis example 2, it was revealed that currant side A has molecular formula C ₂₀ H ₂₇ NO ₁₁ by FAB-MS and high resolution FAB-MS. In addition, in the IR spectrum, the presence of a hydroxyl group (3490 cm ⁻¹ ) and a pyrrole ring (1554 cm ⁻¹ ) is suggested, and analysis of ¹ H-NMR and ¹³ C-NMR spectra shows two β-bonded glucose [δ 4.40. The presence of (d, J = 7.6), δc104.7], [δ4.74 (d, J = 7.3), δc105.4] was confirmed. When the currantside A is hydrolyzed with H ₂ SO ₄ -diogisan, d-glucose (d-glucose) is obtained, and the ¹ H-NMR and ¹³ C-NMR spectra of currantside A are converted into the chemical formula 2 described in the literature. Compared to the indican shown, the 6th carbon signal of glucose was shifted to a low magnetic field and the 5th carbon signal was glucosylated to a high magnetic field. It was suggested that this is a compound in which another molecule of glucose is bonded to the 6-position hydroxyl group of glucose of indican.
[0013]
The ^{^{^{^{1 H- 1 H, 13 C- 1}}}} HCOSY and ^{^{^{^{1 H- 1 H, 13 C- 1}}}} HOHAHA result of the analysis of the spectrum of currant side A, the signal of the sugar portion is attributed completely binding modes sugar anomeric Coupling constants of hydrogen and chemical shifts of anomeric carbon [δ4.40 (d, J = 7.6), δc104.7], [δ4.74 (d, J = 7.3), δc105.4] Thus, it was revealed that the two glucoses were both β-bonded. Furthermore, in the HMBC spectrum, the anomeric hydrogen of glucose (δ 4.74, 1H, d, J = 7.3), the 3-position carbon (δc 138.8) of the indole ring portion, and the anomeric hydrogen of the other glucose (δ 4.40). , 1H, d, J = 7.6) and glucose 6'-position carbon (δc69.9), the current was bound to 6'-position of indican glucose. 3-o-β-D-glucopyranosyl (1 → 6) -β-D-glucopyranosylindole (Chemical Formula 1).
[0014]
[Chemical 2]
[0015]
[Reference example]
(Isolation)
Miyazaki-grown shrimp fresh leaves (2.9 kg) were extracted with MeOH (8 liters) with hot extraction three times. Three portions of the MeOH extract were combined, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain a MeOH extract (150 g, 5.2%). Ebine MeOH extract (150 g) was distributed with AcOEt-H ₂ O (1: 1) to obtain an AcOEt transition part (62 g, 2.1%). The obtained AcOEt transition part extract was separated by normal phase silica gel column chromatography {1.0 kg, CHCl ₃ → [CHCl ₃ : MeOH = 50: 1 → 10: 1 → 5: 1] → MeOH}. 1 (10.5 g, 0.36%), Fr. 2 (5.4 g, 0.19%), Fr. 3 (14.2 g, 0.49%), Fr. 4 (8.0 g, 0.28%), Fr. 5 (10.7 g, 0.37%), Fr. 6 (10.3 g, 0.36%) was obtained. Fr. 3 (14.2 g) was further subjected to normal phase silica gel column chromatography [15 g, CHCl ₃ : MeOH = 20: 1 → 10: 1 → 5: 1 → MeOH], normal phase silica gel column chromatography [15 g, CHCl ₃ : MeOH = 20: 1-> 10: 1-> 5: 1-> MeOH] in order, indirubin (chemical formula 3) (128.0 mg, 0.0044%), tryptanthrin (4) (6. 8 mg, 0.0002%) was obtained. Fr. 5 (10.7 g) was subjected to reverse phase silica gel column chromatography [130 g, MeOH: H ₂ O (40: 60 → 50: 50 → 80: 20, v / v), reverse phase high performance liquid chromatography [column: YMC- pack R & D ODS-5 (250 × 20 mm id), solvent; MeOH (45:55, v / v) flow rate; 9.0 ml / min], sequentially fractionated, and vomifoliol (chemical formula 5). ) (38.6 mg, 0.0013%). As a result of comparing and identifying ¹ H, ¹³ C-NMR data and TLC, it was revealed that all of the compounds obtained here were the aforementioned known compounds.
[0016]
[Chemical 3]
[0017]
[Formula 4]
[0018]
[Chemical formula 5]
[0019]
[Test Example 1]
(Rat skin blood flow promoting action)
As experimental animals, SLc: Wistar male rats (body weight 180 to 200 g) were used. The skin blood flow was measured using a laser Doppler flowmeter (Laser Doppler Flowmeter PF2B, Perimed). The rat's back was shaved and the skin blood flow of the rat was measured on the next day under urethane (1 g / kg) anesthesia to obtain the previous value. Immediately after measuring the previous value, apply 25 μl of the test solution (50% ethanol solution) to the previous value measurement site, measure the blood flow at the application site again 20 minutes, 40 minutes, and 60 minutes later, and increase rate relative to the previous value. Was calculated. A 50% ethanol solution was applied to the control group. In the test solution, Ebine MeOH extract of Example (CDM-ext) (0.5%, 2.0%), Currantside A (CDH2) (0.2%) of the present invention, known substance of Reference Example Indirubin (0.2%) was used. The results are shown in Table 1 and FIG.
[0020]
[Table 1]

[0021]
As is clear from Table 1, the extract of Ebine MeOH significantly increased rat skin blood flow in both 0.5% and 2.0%. Moreover, as shown in FIG. 1, the currant side A of the present invention significantly increased skin blood flow in 20 minutes. Indirubin has a similar stimulating effect but is not significant.
[0022]
[Test Example 2]
(Whitening effect)
According to the method of Mason and Peterson, the experiment was performed as follows. Specifically, 0.5 ml of L-dopa solution (0.03% in pH 6.8 PBS) was added to 0.5 ml of the test solution, incubated at 25 ° C. for 10 minutes, and further mushroom-derived tyrosinase solution (in pH 6.8 PBS, 45 U / ml) 0.5 ml was added and incubated at 25 ° C. for 5 minutes. Absorbance (D1) at 475 nm was measured after the reaction. Separately, the same operation was performed without adding the L-dopa solution, the absorbance (D2) was measured, and the absorbance (D3) as the amount of dopachrome produced without the addition of the test drug was measured. Using these D1, D2 and D3, the inhibition rate of dopachrome production was determined by the following formula and used as an index of tyrosinase activity. Examples of the test solution include Ebine MeOH extract of Example (CDM-ext), Ethyl acetate layer transfer part (AcOEtphase), Aqueous layer transfer part (H ₂ Ophase), Currantside A (CDH2) of the present invention, As a control group, the positive control drug kojic acid was used. The results are shown in Table 2.
[0023]
[Formula 1]
[0024]
[Table 2]

[0025]
As is clear from Table 2, the extract of Ebine MeOH, the ethyl acetate layer transition part, and the aqueous layer transition part all showed strong anti-tyrosinase activity in a dose-dependent manner. Kojic acid in the positive control group also showed strong anti-tyrosinase activity. Considering the yield, the active ingredient for anti-tyrosinase activity is considered to be mainly in the water layer transition part, but the currantside A of the present invention also showed relatively strong anti-tyrosinase activity as shown in Table 3. .
[0026]
【The invention's effect】
According to the present invention, the new currant side A has a skin blood flow promoting action, and useful applications such as a hair restorer can be expected. Moreover, the skin whitening effect is also recognized and the use for cosmetics etc. is also possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the rat skin blood flow promoting effect of currantside A and indirubin isolated from ebinelan.
[Chemical 1]

[Chemical 2]

[Chemical 3]

[Formula 4]

[Chemical formula 5]

[Expression 1]

[Table 1]

[Table 2]

[Table 3]