JP3871222B2

JP3871222B2 - Novel oligosaccharide, food added with novel oligosaccharide, production method thereof, non-cariogenic food composition, and bifidobacteria growth composition

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Publication number: JP3871222B2
Application number: JP2006141688A
Authority: JP
Inventors: 秀紀岡田; 昭山森; 直樹川添; 徳夫塩見; 秀一小野寺; 潤川端; 江里福士; 政則菊地
Original assignee: 大高酵素株式会社
Priority date: 2005-05-25
Filing date: 2006-05-22
Publication date: 2007-01-24
Anticipated expiration: 2026-05-22
Also published as: JP2007001973A

Description

本発明は、新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加した食品、新規オリゴ糖の製造方法及びその機能性に関し、詳しくはグルコースの６位にフルクトースがピラノース型でβ結合した新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加してなる食品、グルコースとフルクトースあるいはラミナリビオースとフルクトースの高濃度液にβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることによって得られる新規オリゴ糖の製造方法、及び該オリゴ糖を含有する非う蝕性食品組成物、ビフィズス菌増殖組成物に関する。 The present invention relates to a novel oligosaccharide, a food to which a novel oligosaccharide is added, a method for producing the novel oligosaccharide, and the functionality thereof, and more specifically, a novel oligosaccharide in which fructose is β-bonded in a pyranose form at position 6 of glucose. , A method for producing a novel oligosaccharide obtained by allowing β-fructofuranosidase to act on a high-concentration solution of glucose and fructose or laminaribiose and fructose, and a non-containing composition containing the oligosaccharide The present invention relates to a carious food composition and a bifidobacteria growth composition.

末端のフルクトース残基がピラノース構造のオリゴ糖はいくつか報告されているが、グルコースと結合したフルクトース残基がピラノース構造をとるものは少なく、ツラノース、ロイクロースが知られている程度である。又、末端のフルクトース残基がピラノース構造のオリゴ糖の機能性についての報告も知られていない。またβ−フルクトフラノシダーゼを、高糖濃度のグルコースとフルクトースの条件下で作用させると、グルコースの６位にピラノース型でフルクトースを結合させる反応は報告されていない。 Several oligosaccharides having a terminal fructose residue having a pyranose structure have been reported. However, few fructose residues bound to glucose have a pyranose structure, and turanose and leucorose are only known. There is also no known report about the functionality of oligosaccharides having a terminal fructose residue having a pyranose structure. In addition, when β-fructofuranosidase is allowed to act under the conditions of glucose and fructose at high sugar concentrations, no reaction has been reported for binding fructose in the pyranose form at the 6-position of glucose.

ところで、ネオケストースを部分加水分解することにより、グルコースとフルクトースが２−６結合したオリゴ糖として、β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−α−Ｄ−グルコピラノースが得られることは非特許文献１により知られているが、該オリゴ糖はフルクトース部分がフラノース型となっており、ピラノース型ではない。 By the way, by partially hydrolyzing neokestose, β-D-fructofuranosyl- (2 → 6) -α-D-glucopyranose can be obtained as an oligosaccharide in which glucose and fructose are linked by 2-6. Is known from Non-Patent Document 1, but the fructose part of the oligosaccharide is furanose type and not pyranose type.

ビフィズス菌の効用として、腸内腐敗菌による腐敗の抑制作用、発ガン抑制作用、毒性アミンの産生防止作用、病原菌による感染症に対する抑止作用等が広く知られている。腸内でビフィズス菌を増殖させるためには、摂取されてから途中で消化されずに回腸や大腸に到達すること、ビフィズス菌以外の菌に利用されないことおよびビフィズス菌が良く利用することの諸条件を満たすことが必要であることが知られている。 As an effect of bifidobacteria, an inhibitory action against rot by intestinal rot bacteria, an inhibitory action against carcinogenesis, an action to prevent production of toxic amines, an inhibitory action against infectious diseases caused by pathogenic bacteria, and the like are widely known. In order to grow bifidobacteria in the intestine, it is necessary to reach the ileum and large intestine without being digested in the middle after being ingested, not to be used for bacteria other than bifidobacteria, and to be used frequently by bifidobacteria It is known that it is necessary to satisfy.

近年、いわゆる虫歯と呼ばれるう蝕の原因が、口腔内でう蝕原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans, St. mutans）やストレプトコッカス・ソブリナス（St. sobrinus）によって産生されるグルコース転移酵素（glucosyltransferase, GTase）の作用によって、蔗糖から不溶性でかつ付着性のあるグルカンが生成され、この不溶性付着性グルカンが歯牙に結合した後、さらにミュータンス菌などの細菌をグルカンの中に引き込んで歯垢を形成し、この歯垢内の細菌が酸を生成することにあることが明らかにされている。甘味、物理的性状の点で優れており、甘味料として広く飲食物に使用されている蔗糖は、歯質を脱灰する酸の基質となるだけでなく、歯垢中に酸を停滞させ、脱灰を持続させる働きを有する不溶性付着性グルカンの基質ともなるものであり、ミュータンス菌のう蝕原因性因子の多くが、蔗糖の存在によって発現されることが証明されている。
Journal of Chromatography A, 920(2001)299-308 In recent years, the cause of dental caries, called so-called caries, has been caused by glucose transferase produced by Streptococcus mutans ( St. mutans ) and Streptococcus sobrinus ( St. sobrinus ), which are caries-causing bacteria in the oral cavity. Glucan, which is insoluble and adherent, is produced from sucrose by the action of glucosyltransferase (GTase), and after the insoluble adherent glucan binds to the teeth, bacteria such as mutans bacteria are further drawn into the glucan and plaque And the bacteria in this plaque have been shown to produce acid. Sucrose, which is excellent in terms of sweetness and physical properties, is widely used in foods and drinks as a sweetener, not only serves as a substrate for acids that demineralize teeth, but also stagnates acid in plaque, It also serves as a substrate for an insoluble adherent glucan having a function of sustaining decalcification, and it has been proved that many caries-causing factors of mutans bacteria are expressed by the presence of sucrose.
Journal of Chromatography A, 920 (2001) 299-308

本発明は、新規な構造を持つオリゴ糖を提供することを課題とする。また本発明は、ピラノース型でフルクトース転移活性を有する酵素の反応を利用して新規オリゴ糖の製造方法を確立することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an oligosaccharide having a novel structure. Another object of the present invention is to establish a method for producing a novel oligosaccharide by utilizing a reaction of a pyranose type enzyme having fructose transfer activity.

さらに本発明は、人体に難消化性で、ビフィズス菌にのみ特異的に消化されるビフィズス菌増殖用組成物を提供することを目的とする。さら本発明は、虫歯形成の予防に有用な非う蝕性食品組成物を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a composition for growing Bifidobacteria that is indigestible to the human body and that is specifically digested only by Bifidobacteria. Furthermore, an object of the present invention is to provide a non-cariogenic food composition useful for preventing caries formation.

本発明者は、植物エキス発酵液中の新規オリゴ糖について検索し、分離し、ＴＯＦ−ＭＳ分析、メチル化糖のＧＣ−ＭＳ分析およびＮＭＲ分析した結果、いかなる標品とも一致しない未知のオリゴ糖を検出した。このオリゴ糖は植物エキス発酵液の発酵前ではほとんど見られず、発酵熟成後に検出される。 As a result of searching, separating, TOF-MS analysis, GC-MS analysis of methylated sugar, and NMR analysis of the novel oligosaccharide in the plant extract fermentation broth, the present inventor has found an unknown oligosaccharide that does not match any standard product. Was detected. This oligosaccharide is hardly seen before fermentation of the plant extract fermentation broth and is detected after fermentation ripening.

このオリゴ糖はピラノース型フルクトースがグルコースに２−６結合したオリゴ糖を基本骨格とする。 This oligosaccharide is based on an oligosaccharide in which pyranose-type fructose is bound to glucose by 2-6.

ところで、前記背景技術で示したように、ネオケストースを部分加水分解することにより得られるオリゴ糖は、β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−α−Ｄ−グルコピラノースである（非特許文献１）が、該オリゴ糖はフルクトース部分がフラノース型となっており、本発明のオリゴ糖の基本骨格におけるフルクトース部分がピラノース型であるものとは、異なる。 By the way, as shown in the background art, the oligosaccharide obtained by partially hydrolyzing neokestose is β-D-fructofuranosyl- (2 → 6) -α-D-glucopyranose ( Non-patent document 1) is different from the oligosaccharide in which the fructose moiety is furanose type and the fructose moiety in the basic skeleton of the oligosaccharide of the present invention is pyranose type.

即ち、本発明の新規オリゴ糖は、下記一般式（１）で表される化合物である。 That is, the novel oligosaccharide of the present invention is a compound represented by the following general formula (1).

（式中、Ｒ¹は、水素原子、又は位置番号３で結合するグルコース、Ｒ²は、水素原子、又は位置番号１で結合するグルコースを表し、Ｒ ¹ とＲ ² は同時にグルコースではない。）

(In the formula, R ^1, glucose, R ² is bonded with hydrogen atom, or a position number 3, and display the glucose binds a hydrogen atom, or a position number 1, R ¹ and R ² are not glucose simultaneously. )

前記一般式（１）に属する具体的な本発明のオリゴ糖は、下記式（２）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｄ−グルコピラノースである。 The specific oligosaccharide of the present invention belonging to the general formula (1) is β-D-fructopyranosyl (2 → 6) -D-glucopyranose represented by the following formula (2).

前記一般式（１）に属する本発明の別の具体的なオリゴ糖は、下記式（３）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ο−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）−Ｄ−グルコピラノースである。下記式（３）のオリゴ糖は、ラミナリビオースの非還元末端のグルコース残基の６位にフルクトースがピラノース型で結合した化合物に相当する。 Another specific oligosaccharide of the present invention belonging to the general formula (1) is β-D-fructopyranosyl (2 → 6) -Ο-β-D- represented by the following formula (3). Glucopyranosyl (1 → 3) -D-glucopyranose. The oligosaccharide of the following formula (3) corresponds to a compound in which fructose is bonded in a pyranose form to the 6-position of the glucose residue at the non-reducing end of laminaribiose.

前記一般式（１）に属する本発明のさらに別の具体的なオリゴ糖は、下記式（４）で表されるβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ο−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］−Ｄ−グルコピラノースである。下記式（４）の化合物は、ラミナリビオースの還元末端のグルコース残基の６位にフルクトースがピラノース型で結合した化合物に相当する。 Still another specific oligosaccharide of the present invention belonging to the general formula (1) is β-D-fructopyranosyl (2 → 6) -Ο- [β- represented by the following formula (4): D-glucopyranosyl (1 → 3)]-D-glucopyranose. The compound of the following formula (4) corresponds to a compound in which fructose is bonded in a pyranose form to the 6-position of the glucose residue at the reducing end of laminaribiose.

本発明のオリゴ糖の製造方法は、植物を切断したものに原料重量の１／１０量以上２倍量以下、好ましくは、１／５量以上２倍量以下、最も好ましくは、１／４量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に前記式（１）〜式（４）で表される本発明の何れかのオリゴ糖を生成させ、得られた植物発酵エキス中からオリゴ糖を採取することを特徴とする。 The oligosaccharide production method of the present invention is obtained by cutting a plant into 1/10 to 2 times the raw material weight, preferably 1/5 to 2 times, most preferably 1/4. Add sucrose so that it contains more than twice the amount of saccharide, extract using osmotic pressure of sucrose to obtain an extract, and ferment the extract naturally. Any one of the oligosaccharides of the present invention represented by the above formulas (1) to (4) is produced, and the oligosaccharide is collected from the obtained fermented plant extract.

植物発酵エキスは、以下の様に製造される。植物原料としては、リンゴ、ニンジン、大根、キャベツ、セロリ、キュウリ、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草、ナシ、ミカンの皮、トマト、ピーマン、ブラックマッペモヤシ、ナス、レンコン、カボチャ、シイタケ、ショウガ、レタス、ニンニク、三つ葉、ウド、アスパラガス、熊笹、クローバー、昆布、フキノトウ、タンポポ、オオバコ、エンドウモヤシ、スギ葉、パセリ、カブ、パイナップル、ブドウ、イチゴ、イタドリの若芽、アサツキ、白菜、エノキタケ、サラダ菜、シュンギク、ヨモギ、セリ、ニラ、トドマツ葉、青シソ、ワカメ等が挙げられ、これらの植物原料のうち２種以上、好ましくは、多種類が用いられる。 The fermented plant extract is produced as follows. Plant materials include apple, carrot, radish, cabbage, celery, cucumber, banana, onion, burdock, spinach, pear, citrus peel, tomato, pepper, black maple palm, eggplant, lotus root, pumpkin, shiitake, ginger, lettuce , Garlic, trefoil, udo, asparagus, bear, clover, kelp, cypress, dandelion, psyllium, peas, cedar leaves, parsley, turnip, pineapple, grape, strawberry, weed sprouting, chives, Chinese cabbage, enokitake, salad vegetables, Examples include sengoku, mugwort, seri, leek, todomatsu leaf, green perilla, and wakame. Among these plant materials, two or more, preferably many, are used.

上記植物原料の配合割合として、例えばリンゴでは植物原料総重量の０．１から５０％、ニンジンでは０．１から５０％、大根では０．０５から４０％、キャベツでは０．０５から４０％、セロリやキュウリでは０．０１から３０％、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草では０．０１から３０％とすることが望ましいが、特に制限されるものではない。 The blending ratio of the above plant materials is, for example, 0.1 to 50% of the total weight of plant materials for apples, 0.1 to 50% for carrots, 0.05 to 40% for radishes, 0.05 to 40% for cabbage, It is desirable that the content is 0.01 to 30% for celery and cucumber, and 0.01 to 30% for banana, onion, burdock and spinach, but there is no particular limitation.

これらの植物原料を１〜５ｃｍ幅、好ましくは１〜４ｃｍ幅、最も好ましくは２〜３ｃｍ幅に切断し、全ての原料を杉樽中に入れ、これに、ショ糖を混合し、圧搾せずに浸透圧を利用して、３日間から３週間抽出する。ショ糖の混合割合については、全体として１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにし、好ましくは、植物原料とほぼ等量のショ糖を添加して混合することが望ましい。同時に、数ｐｐｍ程度の濃度となるように若干量の食塩を添加混合してもよい。 Cut these plant materials into 1-5 cm width, preferably 1-4 cm width, most preferably 2-3 cm width, put all the raw materials in cedar barrels, mix this with sucrose, without pressing Extract for 3 to 3 weeks using osmotic pressure. As for the mixing ratio of sucrose, it is desirable to include 1/10 amount or more and 2 times or less amount of saccharide as a whole, and it is preferable to add and mix almost equal amount of sucrose with plant raw material. At the same time, a slight amount of sodium chloride may be added and mixed so that the concentration is about several ppm.

圧搾せずに回収した抽出エキスを３７℃で暗所で保存すると主として酵母（例えば、Saccharomyces 属に属する微生物）および乳酸球菌（例えば、Leuconostoc 属に属する微生物）により自然発酵する。発酵後、さらに３７℃で約半年間以上熟成させると褐色、粘稠性液体の植物発酵エキスが得られる。得られた植物発酵エキスから以下のようにして、本発明のオリゴ糖を採取することができる。或いは、得られた植物発酵エキスを食品とすることができる。 When the extract extracted without pressing is stored at 37 ° C. in the dark, it is naturally fermented mainly by yeast (for example, microorganisms belonging to the genus Saccharomyces ) and lactic acid cocci (for example, microorganisms belonging to the genus Leuconostoc ). After fermentation, further ripening at 37 ° C. for about half a year or more yields a brown, viscous liquid plant fermentation extract. The oligosaccharide of the present invention can be collected from the obtained fermented plant extract as follows. Or the obtained plant fermented extract can be used as a food.

植物発酵エキスをカラムクロマトグラフィーに通し、溶出することにより本発明のオリゴ糖を採取することができる。得られたオリゴ糖をさらにＨＰＬＣにかけることにより分離、精製し、凍結乾燥することにより、精製された粉末状の本発明のオリゴ糖を得ることができる。 The oligosaccharide of the present invention can be collected by passing the plant fermentation extract through column chromatography and eluting it. The obtained oligosaccharide is further subjected to HPLC to be separated, purified, and lyophilized, whereby a purified powdery oligosaccharide of the present invention can be obtained.

植物発酵エキスを製造しない、効率的な本発明のオリゴ糖の製造方法は、１０質量％以上８０質量％以下、好ましくは、２０質量％以上８０質量％以下、最も好ましくは、２５質量％以上８０質量％以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより前記式（１）〜式（４）で表される新規オリゴ糖を生成させ、該溶液中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。 An efficient method for producing the oligosaccharide of the present invention that does not produce a fermented plant extract is 10% by mass or more and 80% by mass or less, preferably 20% by mass or more and 80% by mass or less, and most preferably 25% by mass or more and 80% by mass. A novel oligosaccharide represented by the above formulas (1) to (4) is produced by allowing β-fructofuranosidase to act on a substrate solution containing carbohydrates of mass% or less, and from the solution The novel oligosaccharide is collected.

本発明のオリゴ糖の製造方法で使用するβ−フルクトフラノシダーゼについては、市販のβ−フルクトフラノシダーゼを使用することができ、或いは、β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する酵母、乳酸菌等から抽出し、精製した酵素が用いられる。市販のβ−フルクトフラノシダーゼには、例えば、β−フルクトフラノシダーゼ（シグマ社製、ＩｎｖｅｒｔａｓｅｆｒｏｍＢａｋｅｒ’ｓｙｅａｓｔＧｒａｄｅ VII:商品名）を用いることができる。β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物については、酵母及び乳酸菌から選ばれた１種以上を用いることができる。 Regarding β-fructofuranosidase used in the method for producing an oligosaccharide of the present invention, commercially available β-fructofuranosidase can be used, or yeast or lactic acid bacteria having β-fructofuranosidase producing ability An enzyme extracted and purified from the above is used. As commercially available β-fructofuranosidase, for example, β-fructofuranosidase (manufactured by Sigma, Invertase from Baker's yeast Grade VII: trade name) can be used. About the microorganisms which have beta-fructofuranosidase production ability, 1 or more types chosen from yeast and lactic acid bacteria can be used.

本発明で使用することができる酵母としては、Saccharomyces 属に属する微生物、Pichia属に属する微生物、Candida 属に属する微生物、Hansenula 属に属する微生物が挙げられる。さらに具体的な酵母の種としては、Saccharomyces cerevisiae、Pichia anomalaが挙げられる。さらに具体的な酵母の菌株としては、Pichia anomala（ＦｅｒｍＰ−２０５０４）、Pichia anomala ＪＣＭ３５８５が挙げられる。 Examples of yeast that can be used in the present invention include microorganisms belonging to the genus Saccharomyces , microorganisms belonging to the genus Pichia, microorganisms belonging to the genus Candida, and microorganisms belonging to the genus Hansenula . More specific yeast species include Saccharomyces cerevisiae and Pichia anomala . More specific yeast strains include Pichia anomala (Ferm P- 20504) and Pichia anomala JCM3585.

本発明で使用することができる乳酸菌としては、Leuconostoc 属に属する微生物、Bifidobacterium 属に属する微生物、Lactobacillus 属に属する微生物、Streptococcus 属に属する微生物、Pediocuccus 属に属する微生物、Lactocossus 属に属する微生物が挙げられる。さらに具体的な乳酸菌の種としては、Leuconostoc mesenteroides が挙げられる。ができる。 Examples of lactic acid bacteria that can be used in the present invention include microorganisms belonging to the genus Leuconostoc , microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium , microorganisms belonging to the genus Lactobacillus , microorganisms belonging to the genus Streptococcus , microorganisms belonging to the genus Pediocuccus , microorganisms belonging to the genus Lactocossus . More specific examples of lactic acid bacteria include Leuconostoc mesenteroides . Can do.

また、本発明のオリゴ糖の製造方法は、前記精製した酵素を用いたオリゴ糖の製造方法において、精製した酵素に代えて、前記β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物からβ−フルクトフラノシダーゼを抽出し、粗精製した酵素を用いて、同様にオリゴ糖を製造することができる。即ち、本発明のオリゴ糖の製造方法は、１０質量％以上８０質量％以下、好ましくは、２０質量％以上８０質量％以下、最も好ましくは、２５質量％以上８０質量％以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られたβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有する粗精製酵素を作用させることにより前記式（１）〜式（４）で表される新規オリゴ糖を生成させ、該溶液中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。 The oligosaccharide production method of the present invention is the same as the oligosaccharide production method using the purified enzyme, except that the purified enzyme is replaced by β-fructofuranosidase-producing microorganism having β-fructofuranosidase production ability. An oligosaccharide can be produced in the same manner by using the enzyme obtained by extracting furanosidase and roughly purifying it. That is, the oligosaccharide production method of the present invention includes 10% by mass to 80% by mass, preferably 20% by mass to 80% by mass, and most preferably 25% by mass to 80% by mass. By reacting a crudely purified enzyme having β-fructofuranosidase activity obtained from a microorganism that produces β-fructofuranosidase with the substrate solution, it is expressed by the above formulas (1) to (4). The novel oligosaccharide is produced, and the novel oligosaccharide is collected from the solution.

またさらに別の効率的な本発明のオリゴ糖の製造方法は、精製したβ−フルクトフラノシダーゼ或いは粗精製のβ−フルクトフラノシダーゼを用いずに、直接、β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物を用いる方法であり、即ち、１０質量％以上８０質量％以下、好ましくは、２０質量％以上８０質量％以下、最も好ましくは、２５質量％以上８０質量％以下の糖質を含む培地溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させて発酵させ、培地中に前記式（１）〜式（４）で表される新規オリゴ糖を生成させ、該培地中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。 Yet another efficient method for producing the oligosaccharide of the present invention is to directly produce β-fructofuranosidase without using purified β-fructofuranosidase or crude β-fructofuranosidase. A medium containing 10% by mass or more and 80% by mass or less, preferably 20% by mass or more and 80% by mass or less, and most preferably 25% by mass or more and 80% by mass or less. A microorganism producing β-fructofuranosidase is allowed to act on the solution and fermented to produce a novel oligosaccharide represented by the above formulas (1) to (4) in the medium. The novel oligosaccharide is collected.

粗精製酵素を製造する方法には、例えば、培養液を遠心分離して菌体を集め超音波で破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して菌体を集め乳鉢で破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して菌体を集めてビーズビーダーで破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して、その上澄みを透析した内液を回収する方法が挙げられる。 Methods for producing the crude purified enzyme include, for example, centrifuging the culture solution and collecting the bacterial cells and crushing with ultrasonic waves, and further centrifuging to collect the supernatant, or centrifuging the culture solution and culturing the bacteria. Collect the body and crush it in a mortar and further centrifuge to collect the supernatant, or centrifuge the culture solution to collect the cells and crush them with a bead beader, and centrifuge further to collect the supernatant, Alternatively, a method of centrifuging the culture solution and recovering the internal solution obtained by dialyzing the supernatant can be mentioned.

精製した酵素を製造する方法には、粗精製酵素を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを１種類以上を組み合わせて精製する方法があげられる。 Examples of the method for producing the purified enzyme include a method in which a crude purified enzyme is purified by combining one or more kinds of ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, and affinity chromatography.

該微生物を用いる方法において使用するβ−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物は、前記に列挙したβ−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物を用いることができる。 As the microorganism producing β-fructofuranosidase used in the method using the microorganism, the microorganisms having the ability to produce β-fructofuranosidase listed above can be used.

前記培養による本発明のオリゴ糖の製造方法において用いる糖質としてはショ糖が好ましい。前記のオリゴ糖の製造方法において、微生物の培溶液、或いは酵素の基質溶液等の出発原料の糖濃度は、通常の発酵プロセスにおいて培養液中に含まれる糖濃度に比べて、本発明の場合は極めて高濃度であり、本発明において特有な範囲である。基質溶液或いは培養液の糖濃度が１０質量％未満ではオリゴ糖の合成量が少なく効率的ではなく、７０質量％を超えると酵母の増殖が困難となる。これは、高糖濃度による高浸透圧となるからと考えられる。 Sucrose is preferable as the sugar used in the method for producing the oligosaccharide of the present invention by the culture. In the above oligosaccharide production method, the sugar concentration of the starting material such as a microorganism culture solution or enzyme substrate solution is compared with the sugar concentration contained in the culture solution in the normal fermentation process. This is a very high concentration and is a characteristic range in the present invention. If the sugar concentration of the substrate solution or the culture solution is less than 10% by mass, the amount of oligosaccharide synthesized is small and not efficient, and if it exceeds 70% by mass, the growth of yeast becomes difficult. This is thought to be due to the high osmotic pressure due to the high sugar concentration.

図１は、糖質としてグルコースとフルクトースの質量比を１：１とし、種々の糖濃度の溶液を調製し、該溶液１ｍＬに対してβ−フルクトフラノシダーゼ２０ユニットを添加し、３７℃で１６８時間反応させたときの各種糖濃度（横軸）に対するオリゴ糖の相対合成量（縦軸）を表すグラフである。図１における相対合成量については、糖濃度が８０％のとき、オリゴ糖の合成量が最大となったので、これを相対合成量１００％と定義した。 FIG. 1 shows that the mass ratio of glucose to fructose as a carbohydrate is 1: 1, and solutions with various sugar concentrations are prepared. 20 units of β-fructofuranosidase is added to 1 mL of the solution at 37 ° C. It is a graph showing the relative synthetic amount (vertical axis) of the oligosaccharide with respect to various sugar concentration (horizontal axis) when it is made to react for 168 hours. About the relative synthesis amount in FIG. 1, since the synthesis amount of the oligosaccharide became the maximum when the sugar concentration was 80%, this was defined as the relative synthesis amount of 100%.

図１のグラフによれば、糖濃度が低ければ、本発明のオリゴ糖の合成量は少ないが、糖濃度が高ければ、合成されるオリゴ糖も、糖濃度が８０％迄は比例して多くなり、８０％が最大の合成量となるが、９０質量％となるとオリゴ糖の合成量が低下することがわかる。 According to the graph of FIG. 1, if the sugar concentration is low, the synthesis amount of the oligosaccharide of the present invention is small, but if the sugar concentration is high, the synthesized oligosaccharide is also proportionally increased up to 80%. Thus, 80% is the maximum synthesis amount, but when it is 90% by mass, the synthesis amount of the oligosaccharide decreases.

本発明の式（１）又は式（２）で表されるオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖用組成物の有効成分、或いは非う蝕性食品組成物の有効成分である。 The oligosaccharide represented by formula (1) or formula (2) of the present invention is an active ingredient of a composition for bifidobacteria growth or an active ingredient of a non-cariogenic food composition.

本発明のオリゴ糖の製造方法で使用する糖質については、植物を切断したものを原料とする場合には、植物中に含まれる糖と、添加するショ糖が用いられる。また、基質溶液又は培地を原料とする場合には、これらに添加する糖には、グルコースとフルクトースの組み合わせ、或いはラミナリビオースとフルクトースの組み合わせが用いられる。 As the saccharide used in the method for producing an oligosaccharide of the present invention, when a material obtained by cutting a plant is used as a raw material, sugar contained in the plant and sucrose to be added are used. In addition, when a substrate solution or a medium is used as a raw material, a combination of glucose and fructose or a combination of laminaribiose and fructose is used as a sugar to be added thereto.

本発明の培養によるオリゴ糖の製造方法で使用する、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物については、前記した微生物を用いることができる。 The microorganisms described above can be used for the microorganisms producing β-fructofuranosidase used in the method for producing oligosaccharides by culturing according to the present invention.

本発明は前記新規なオリゴ糖を添加した食品又は飼料としても有用である。食品又は飼料に添加される本発明のオリゴ糖の添加量は、食品又は飼料に含まれる消化性糖の全質量の０．０５以上３０質量％以下となるように添加することが、食品又は飼料中に含まれる消化性糖の過剰摂取を防止する目的のために好ましい。 The present invention is also useful as a food or feed to which the novel oligosaccharide is added. The addition amount of the oligosaccharide of the present invention added to food or feed is 0.05 to 30% by mass of the total mass of digestible sugar contained in the food or feed. It is preferable for the purpose of preventing excessive intake of digestible sugar contained therein.

本発明の食品の製造方法の別の方法は、植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスにβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。 Another method for producing a food according to the present invention is to add sucrose to a cut plant so that it contains 1/10 to 2 times the amount of sugar, and use the osmotic pressure of sucrose. In this method, an extract is obtained by extraction, and β-fructofuranosidase is allowed to act on the extract to produce the oligosaccharide to produce a food containing the oligosaccharide.

本発明の食品の製造方法のさらに別の方法は、植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して、抽出することにより抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製酵素を作用させることにより、前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。 Still another method for producing a food according to the present invention is to add sucrose to a cut plant so that it contains 1/10 to 2 times the amount of sugar, and use the osmotic pressure of sucrose. Extract to obtain an oligosaccharide by producing an oligosaccharide by allowing a crude enzyme obtained from a microorganism producing β-fructofuranosidase to act on the extract. A method for producing a food containing

本発明の食品の製造方法のさらに別の製造方法は、植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、抽出エキス中に前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。 Still another production method of the food production method according to the present invention is to add sucrose to a plant that has been cut so that it contains 1/10 to 2 times the amount of sugar, and use the osmotic pressure of sucrose. To obtain an extract, and a microorganism producing β-fructofuranosidase is allowed to act on the extract to produce the oligosaccharide in the extract to produce a food containing the oligosaccharide. Is the method.

本発明のオリゴ糖は、酵素反応液又は培養液を濾過、精製して液状で使用することも、また、濃縮してシラップ状で利用することも、更に、乾燥し固体状で用いることもできる。さらに、精製工程を経て、夾雑糖類を除去して本発明のオリゴ糖の高含有画分を採取したもの、或いはさらに精製し、粉末化或いは結晶化したものを用いることができる。粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型して使用することもできる。 The oligosaccharide of the present invention can be used in a liquid state after filtering and purifying an enzyme reaction solution or culture solution, or it can be concentrated and used in a syrup form, or it can be dried and used in a solid state. . Further, it is possible to use a product obtained by removing contaminating saccharides through a purification step and collecting a fraction containing a high content of the oligosaccharide of the present invention, or a product further purified and powdered or crystallized. Powdered products can be used as they are or mixed with extenders, excipients, binders, etc., and molded into various shapes such as granules, spheres, short bars, plates, cubes, tablets, etc. You can also

式（１）で表されるオリゴ糖は、ショ糖の甘味度の約１／５程度であり、乳糖やβ−ガラクトースに近い甘味であり、概ねさっぱりとした甘味である。 The oligosaccharide represented by the formula (1) is about 1/5 of the sweetness of sucrose, has a sweetness close to that of lactose and β-galactose, and has a generally refreshing sweetness.

本発明のオリゴ糖は、新規化合物として有用である。本発明の式（１）、式（２）で表されるオリゴ糖は、難消化性であるので、高血糖症状及び高血糖に起因する肥満症や糖尿病など種々の疾患の改善に有用である。 The oligosaccharide of the present invention is useful as a novel compound. Since the oligosaccharides represented by the formulas (1) and (2) of the present invention are indigestible, they are useful for the improvement of various diseases such as hyperglycemia and obesity and diabetes caused by hyperglycemia. .

本発明の式（１）、式（２）で表されるオリゴ糖はビフィズス菌増殖作用を有するので、該オリゴ糖を添加した食品は、腸内腐敗菌による腐敗の抑制、発ガン抑制、毒性アミンの産生防止、病原菌による感染症に対する抑止等に用いることができる。 Since the oligosaccharides represented by the formulas (1) and (2) of the present invention have a bifidobacterial proliferating action, foods to which the oligosaccharide has been added can be used to suppress decay due to enteric spoilage bacteria, to suppress carcinogenesis, and toxicity. It can be used for prevention of amine production, suppression of infectious diseases caused by pathogenic bacteria, and the like.

本発明の式（１）、式（２）で表されるオリゴ糖はう蝕誘発菌などによって発酵されにくく、う蝕誘発菌による蔗糖からの不溶性グルカン合成を阻害するので、虫歯を起こしにくいオリゴ糖として、う蝕抑制剤（非抗蝕剤）などに有利に利用できる。 The oligosaccharides represented by the formulas (1) and (2) of the present invention are not easily fermented by caries-inducing bacteria and the like and inhibit insoluble glucan synthesis from sucrose by caries-inducing bacteria. As sugar, it can be advantageously used as a caries inhibitor (non-corrosive).

また、本発明の式（１）、式（２）で表されるオリゴ糖は甘味料として利用可能である。 Moreover, the oligosaccharide represented by Formula (1) of this invention and Formula (2) can be utilized as a sweetener.

さらに、本発明の式（１）、式（２）で表されるオリゴ糖は、肥満症や糖尿病など種々の疾患の改善作用、ビフィズス菌増殖作用、非う蝕作用を付与する機能性食品として食品素材、医薬品素材、口腔用組成物への利用が可能である。 Furthermore, the compounds of formula (1), represented Luo oligosaccharides in formula (2), the functional foods to impart improved effects of various diseases such as obesity, diabetes, bifidogenic effect, a non-caries action As a food material, a pharmaceutical material, and an oral composition.

植物発酵エキスの調製
植物抽出エキスの原料として以下の配合の材料を２〜３ｃｍ幅に切断したものを使用した。 Preparation of plant fermented extract As a raw material for the plant extract, a material having the following composition was cut into a width of 2 to 3 cm.

リンゴ植物原料総重量の２０％
ニンジン同１６％
大根同１２％
キャベツ同１０％
セロリ同９％
キュウリ同９％
バナナ同６％
玉ねぎ同６％
ゴボウ同６％
ホウレン草同６％ 20% of apple plant material total weight
Carrot 16%
12% radish
Cabbage 10%
Celery 9%
9% cucumber
Banana 6%
Onion 6%
Burdock 6%
6% of spinach

これらの植物原料全重量に対して、当量のショ糖を加えて一週間抽出し、抽出液を上記微生物により自然発酵させた後、３７℃で約半年間熟成させることにより、褐色の粘稠性の液状の植物発酵エキスを得た。 An equivalent amount of sucrose is added to the total weight of these plant raw materials and extracted for one week. The extract is naturally fermented with the above microorganisms, and then aged for about half a year at 37 ° C. Liquid plant fermented extract was obtained.

オリゴ糖の測定
植物エキス発酵液の発酵前及び発酵後の液１０μＬにＡＢＥＥ標識試薬（Ｊ−オイルミルズ社製）４０μＬ加え、８０℃１時間反応させた。２００μＬ蒸留水及び２００μＬクロロホルムを加えよく撹拌した後、遠心分離しその上清を適当に希釈した。標識化された糖をＨｏｎｅｎｐａｋＣ１８カラム（Ｊ−オイルミルズ）を用いたＨＰＬＣ（カラムサイズ：４．６ｍｍ×７．５ｃｍ、溶出：０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、カラム温度：室温、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ３０５ｎｍ）により分析した。その結果をＨＰＬＣのチャートとして図２に示す。図２によれば、発酵前と発酵後を比較すると、発酵後のチャートでは糖の溶出時間の経過において、フルクトースとグルコースの間にはどの標品とも一致しない、未知の糖が増加していることが確認できた。 Measurement of oligosaccharide 40 μL of ABEE labeling reagent (manufactured by J-Oil Mills) was added to 10 μL of the fermented liquid of the plant extract before and after fermentation, and reacted at 80 ° C. for 1 hour. 200 μL distilled water and 200 μL chloroform were added and stirred well, and then centrifuged to appropriately dilute the supernatant. The labeled sugar was subjected to HPLC using a Honenpak C18 column (J-Oil Mills) (column size: 4.6 mm × 7.5 cm, elution: 0.1 M ammonium acetate buffer, column temperature: room temperature, flow rate: 0.00. (5 mL / min, detection: UV 305 nm). The results are shown in FIG. 2 as an HPLC chart. According to FIG. 2, when comparing before fermentation and after fermentation, in the chart after fermentation, in the elution time of sugar, unknown sugars that do not match any standard between fructose and glucose increase. I was able to confirm.

未知の糖成分の分画、精製
発酵後の植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィー（４．５ｃｍ×３５ｃｍ）に添加し、エタノールのステップワイズグラジエントで溶出した。未知の糖１は、５％エタノールで溶出され、未知の糖２及び未知の糖３は１５％エタノールで順次溶出された。さらにＡｍｉｄｅ−８０（東ソー：カラムサイズ：４．６ｍｍ×２５ｃｍ、溶出：８０％アセトニトリル、カラム温度：８０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）およびＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（東ソー：カラムサイズ：４．６ｍｍ×２５ｃｍ、溶出：蒸留水、カラム温度: 室温、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）を用いたＨＰＬＣによりさらに、糖１、糖２、糖３を各々分離、精製し、各々の凍結乾燥粉末を得た。 Fractionation of unknown sugar component and plant fermentation broth after purified fermentation were added to activated carbon celite column chromatography (4.5 cm × 35 cm) and eluted with ethanol stepwise gradient. Unknown sugar 1 was eluted with 5% ethanol, and unknown sugar 2 and unknown sugar 3 were sequentially eluted with 15% ethanol. Further, Amide-80 (Tosoh: column size: 4.6 mm × 25 cm, elution: 80% acetonitrile, column temperature: 80 ° C., flow rate: 1 mL / min, detection: differential refractometer) and ODS-80Ts column (Tosoh: column size) : 4.6 mm × 25 cm, elution: distilled water, column temperature: room temperature, flow rate: 0.5 mL / min, detection: differential refractometer), and then sugar 1, sugar 2, and sugar 3 were separated from each other. Purification was performed to obtain each lyophilized powder.

化学構造の決定
前記工程において分離、精製した糖１、糖２、糖３の各々について、機器分析を行い、その化学構造を以下のように決定した。これらの糖をＰｏｓｉｔｉｖｅイオンモードで質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）した結果、糖１は３６５の〔Ｍ＋Ｎａ〕⁺のイオンピークを与えた（図３）。糖２及び糖３は５２７の〔Ｍ＋Ｎａ〕⁺のイオンピークを与えた（図４）。糖１を酸加水分解後、ＨＰＡＥＣ分析し、構成糖を調査したところ、グルコースとフルクトースのみから構成され、モル比は１：１であった。従って糖１はグルコース１分子とフルクトース１分子からなる２糖類であると決定した。糖２及び糖３を同様に調査した結果、グルコースとフルクトースのみから構成され、モル比は２：１であった。従って糖２及び糖３はグルコース２分子とフルクトース１分子からなる３糖類であると決定した。 Determination of chemical structure Each of sugar 1, sugar 2 and sugar 3 separated and purified in the above step was subjected to instrumental analysis, and the chemical structure was determined as follows. As a result of mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) of these sugars in the positive ion mode, sugar 1 gave 365 [M + Na] ⁺ ion peaks (FIG. 3). Sugar 2 and sugar 3 gave an ion peak of 527 [M + Na] ⁺ (FIG. 4). After sugar 1 was acid hydrolyzed, HPAEC analysis was performed and the constituent sugars were examined. As a result, the sugar was composed only of glucose and fructose, and the molar ratio was 1: 1. Therefore, sugar 1 was determined to be a disaccharide composed of one glucose molecule and one fructose molecule. As a result of examining sugar 2 and sugar 3 in the same manner, it was composed only of glucose and fructose, and the molar ratio was 2: 1. Therefore, sugar 2 and sugar 3 were determined to be trisaccharides composed of 2 glucose molecules and 1 fructose molecule.

糖１はβ−フルクトフラノシダーゼ、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼいずれによっても分解されなかった。糖１をＨａｋｏｍｏｒｉの方法でメチル化しメタノール分解した試料をＧＣ−ＭＳ分析した結果、ｍｅｔｈｙｌ２，３，４−ｔｒｉ−Ｏ−
ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ｍｅｔｈｙｌ１，３，４，５−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｉｄｅが検出され（図５）、ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメントパターンは、いずれもピラノース型のシグナルと一致した。 Sugar 1 was not degraded by any of β-fructofuranosidase, α-glucosidase and β-glucosidase. As a result of GC-MS analysis of a sample in which sugar 1 was methylated and decomposed with methanol by the method of Hakomori, methyl 2,3,4-tri-O—
methyl-D-glucoside, methyl 1,3,4,5-tetra-O-methyl-D-fructoside were detected (FIG. 5), and the fragment pattern of MS / MS analysis was consistent with the pyranose-type signal. .

糖１のＮＭＲ解析は、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＨＭＢＣ、ｃｔ−ＨＭＢＣ、Ｊ−ｒｅｓＨＭＢＣの２次元ＮＭＲで行った（図６−図１１）。糖２は、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＣＨ2 −ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ｃｔ−ＨＭＢＣの２次元ＮＭＲで行った（図１２−図１６）。糖３は、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＨＭＢＣ、ｃｔ−ＨＭＢＣの２次元ＮＭＲで行った（図１７−図２１）。 The NMR analysis of sugar 1 was performed by two-dimensional NMR of COSY, HSQC, HSQC-TOCSY, HMBC, ct-HMBC, and J-res HMBC (FIGS. 6 to 11). Sugar 2 was obtained by two-dimensional NMR of COSY, HSQC, HSQC-TOCSY, CH2-HSQC-TOCSY, and ct-HMBC (FIGS. 12 to 16). Sugar 3 was performed by two-dimensional NMR of COSY, HSQC, HSQC-TOCSY, HMBC, and ct-HMBC (FIGS. 17 to 21).

また糖１のケミカルシフトを表１に、糖２及び糖３のケミカルシフトを表２及び表３に示す。 The chemical shifts of sugar 1 are shown in Table 1, and the chemical shifts of sugar 2 and sugar 3 are shown in Tables 2 and 3.

以上の結果から糖１は、前記式（２）に示すβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）Ｄ−グルコピラノース、糖２は、前記式（３）に示すβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）Ｄ−グルコピラノース、糖３は、前記式（４）に示すβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］Ｄ−グルコピラノースであると決定した。 From the above results, saccharide 1 is β-D-fructopyranosyl (2 → 6) D-glucopyranose represented by the formula (2), and saccharide 2 is β-D-flux represented by the formula (3). Ctopyranosyl (2 → 6) -O-β-D-glucopyranosyl (1 → 3) D-glucopyranose, sugar 3 is β-D-fructopyranosyl (2 → 6) It was determined to be -O- [β-D-glucopyranosyl (1 → 3)] D-glucopyranose.

製造方法１−１：市販酵素を用いた糖１の製造方法
２０％グルコース（シグマ社製）及び２０％フルクトース（シグマ社製）を含む水溶液１００ｍＬに、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、１０ｍＬ）に溶解したβ−フルクトフラノシダーゼ（シグマ社製、ＩｎｖｅｒｔａｓｅｆｒｏｍＢａｋｅｒ’ｓ
ｙｅａｓｔＧｒａｄｅ VII ：商品名）２０００ユニットを添加した。さらに少量のトルエンを防腐のため加えた。３７℃で２４時間以上加温し反応生成物を得た。反応生成物を前記実施例１と同様にして精製して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥品を前記実施例１と同様にしてＴＯＦ−ＭＳおよびＮＭＲ解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式（２）で表される糖１のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）Ｄ−グルコピラノースであった。 Production method 1-1: Production method of sugar 1 using commercially available enzyme In 100 mL of an aqueous solution containing 20% glucose (manufactured by Sigma) and 20% fructose (manufactured by Sigma), 0.2 M acetate buffer (pH 5.0, Β-fructofuranosidase (Sigma, Invertase from Baker's) dissolved in 10 mL)
2000 (Year Grade VII: trade name) was added. A small amount of toluene was added for preserving. The reaction product was obtained by heating at 37 ° C. for 24 hours or more. The reaction product was purified in the same manner as in Example 1 to obtain a lyophilized powder. The structure of the reaction product of the obtained freeze-dried product was confirmed by TOF-MS and NMR analysis in the same manner as in Example 1. As a result, β-D-fruct of saccharide 1 represented by the above formula (2) was obtained. It was pyranosyl (2 → 6) D-glucopyranose.

製造方法１−２：市販酵素を用いた糖２及び糖３の製造方法
２０％ラミナリビオース（シグマ社製）及び２０％フルクトース（シグマ社製）を含む水溶液１００ｍＬに０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、１０ｍＬ）に溶解したβ−フルクトフラノシダーゼ（シグマ社製、ｉｎｖｅｒｔａｓｅｆｒｏｍＢａｋｅｒ’ｓｙｅａｓｔＧｒａｄｅ VII：商品名）２０００ユニットを添加した。さらに少量のトルエンを防腐のため加えた。３７℃で２４時間以上加温し反応生成物を得た。反応生成物を前記実施例１と同様にして精製して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥品を前記実施例１と同様にしてＴＯＦ−ＭＳおよびＮＭＲ解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式（３）で表される糖２のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）Ｄ−グルコピラノース、及び前記式（４）で表される糖３のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］Ｄ−グルコピラノースであった。 Production Method 1-2: Production Method of Sugar 2 and Sugar 3 Using Commercial Enzymes 0.2M acetate buffer solution (100 mL) containing 20% laminaribiose (manufactured by Sigma) and 20% fructose (manufactured by Sigma) 2000 units of β-fructofuranosidase (produced by Sigma, inverted from Baker's yeast Grade VII: trade name) dissolved in pH 5.0 and 10 mL) was added. A small amount of toluene was added for preserving. The reaction product was obtained by heating at 37 ° C. for 24 hours or more. The reaction product was purified in the same manner as in Example 1 to obtain a lyophilized powder. When the structure of the reaction product of the obtained lyophilized product was confirmed by TOF-MS and NMR analysis in the same manner as in Example 1, β-D-fruct of saccharide 2 represented by the formula (3) was obtained. Pyranosyl (2 → 6) -O-β-D-glucopyranosyl (1 → 3) D-glucopyranose and β-D-fructopyranosyl (2) of sugar 3 represented by the formula (4) → 6) -O- [β-D-glucopyranosyl (1 → 3)] D-glucopyranose.

製造方法２−１：市販菌を用いた発酵による製造方法
グルコース４０ｇ、ポリぺプトン（日本製薬製）４ｇ、酵母エキス（オリエンタル酵母) ２ｇに蒸留水を加えて１００ｍＬとし、オートクレーブで滅菌後、除菌濾過した４０％フルクトース溶液１００ｍＬと混合し培養液とした。これにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪＣＭ１４９９（独立行政法人理化学研究所により頒布）を一白金耳添加して３０℃で４８時間以上培養し、培養液を得た。培養液を前記実施例１と同様に分離精製して反応生成物を得た。前実施例１と同様にしてＴＯＦ−ＭＳおよびＮＭＲ解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式（２）で表される糖１のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）Ｄ−グルコピラノース、前記式（３）で表される糖２のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）Ｄ−グルコピラノース、及び前記式（４）で表される糖３のβ−Ｄ−フルクトピラノシル（２→６）−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）］Ｄ−グルコピラノースであった。 Production Method 2-1: Production Method by Fermentation Using Commercial Bacteria Glucose 40 g, Polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 4 g, Yeast Extract (Oriental Yeast) 2 g with distilled water to 100 mL, sterilized by autoclave, then removed The culture solution was mixed with 100 mL of 40% fructose solution filtered with bacteria. To this was added one platinum loop of Saccharomyces cerevisiae JCM 1499 (distributed by RIKEN) and cultured at 30 ° C. for 48 hours or longer to obtain a culture solution. The culture solution was separated and purified in the same manner as in Example 1 to obtain a reaction product. When the structure of the reaction product was confirmed by TOF-MS and NMR analysis in the same manner as in Example 1, β-D-fructopyranosyl (2 → 6) of sugar 1 represented by the above formula (2) was confirmed. ) D-glucopyranose, β-D-fructopyranosyl (2 → 6) -O-β-D-glucopyranosyl (1 → 3) D-glucopyranose of sugar 2 represented by the formula (3), And β-D-fructopyranosyl (2 → 6) -O- [β-D-glucopyranosyl (1 → 3)] D-glucopyranose of sugar 3 represented by the formula (4).

製造方法２−２：分離菌株を用いた発酵による製造方法
前記実施例４において、微生物として菌株ＰｉｃｈｉａａｎｏｍａｌａＦｅｒｍ
Ｐ−２０５０４（２００５年４月１３日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託）を用いた以外は前記実施例４と同じようにして培養し、培養液から本発明の糖１、糖２、糖３を得た。該菌株は、伊達市北稀府町１２１番地の大高酵素株式会社伊達工場内の発酵タンク内の発酵液から採取し、分離したものである。 Production method 2-2: Production method by fermentation using an isolated strain In Example 4 described above, the strain Pichia anomala Ferm was used as the microorganism.
P-20504 (deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) on April 13, 2005) was used in the same manner as in Example 4 above, and the saccharide of the present invention was obtained from the culture solution. 1, sugar 2 and sugar 3 were obtained. The strain was collected from the fermentation broth in the fermentation tank in the Odaka Enzyme Date Factory, 121 Kitafufu-machi, Date City, and separated.

製造方法３−１：粗精製酵素液を用いた製造方法
ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪＣＭ１４９９をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）で７２時間培養した液を９，０００×ｇで遠心分離した。得られた沈殿に０．９％食塩水を加えて撹拌し遠心分離し、この操作を２回繰り返した。沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し超音波破砕した後、遠心分離し上清を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対し透析した。得られた液を粗精製酵素液とした。 Production Method 3-1: Production Method Using Crude Purified Enzyme Solution
Saccharomyces cerevisiae JCM 1499 YPD medium (1% yeast extract, peptone 2%, glucose 2%) and the solution was incubated for 72 hours at centrifuged at 9,000 × g. 0.9% saline solution was added to the resulting precipitate, stirred and centrifuged, and this operation was repeated twice. The precipitate was suspended in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), sonicated, centrifuged, and the supernatant was dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.0). The obtained liquid was used as a roughly purified enzyme solution.

２０％グルコース（シグマ社製）及び２０％フルクトース（シグマ社製）を含む水溶液１００ｍＬに前記工程で得られた粗精製酵素液１０ｍＬと加え、３７℃で２４時間以上加温し反応生成物を得た。前記実施例１と同様にして得られた反応生成物を精製して本発明の糖１を得た。 To 100 mL of an aqueous solution containing 20% glucose (manufactured by Sigma) and 20% fructose (manufactured by Sigma), add 10 mL of the roughly purified enzyme solution obtained in the above step, and warm at 37 ° C. for 24 hours or more to obtain a reaction product. It was. The reaction product obtained in the same manner as in Example 1 was purified to obtain Sugar 1 of the present invention.

本発明の糖１を添加したバターロールの製造例
以下の材料を用いて常法によりバターロールを製造した。 Production Example of Butter Roll to which Sugar 1 of the Present Invention was Added A butter roll was produced by a conventional method using the following materials.

強力粉５００ｇ
食塩５ｇ
牛乳１５０ｍＬ
卵黄１０ｇ
前記式（２）で表されるオリゴ糖（糖１）２０ｇ
生イースト１２．５ｇ Powerful powder 500g
5g salt
150ml milk
10g yolk
20 g of oligosaccharide represented by the formula (2) (sugar 1)
12.5g raw yeast

本発明の糖１を添加したハードキャンディーの製造例
ショ糖１１０ｇに蒸留水４３．５ｇを加え、３０分間で１７７℃まで加熱した。その後１００℃に保ち、前記式（２）で表されるオリゴ糖（糖１）の２．５ｇを３回に分け加え、よく撹拌した。その後あらかじめ用意した型に流し込み放冷することにより、ハードキャンディーを得た。 Production Example of Hard Candy Added with Sugar 1 of the Invention 43.5 g of distilled water was added to 110 g of sucrose and heated to 177 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the temperature was kept at 100 ° C., and 2.5 g of the oligosaccharide (sugar 1) represented by the formula (2) was added in three portions and stirred well. Thereafter, it was poured into a mold prepared in advance and allowed to cool to obtain a hard candy.

本発明の糖１を添加した産卵鶏用飼料の製造例
トウモロコシ１００ｇ、大麦１２０ｇ、小麦１００ｇ、コウリャン１１０ｇ、米糠１１０ｇ、ふすま２００ｇ、大麦ふすま１００ｇ、大豆かす３０ｇ、魚粉７０ｇ、炭酸カルシウム５４．５ｇ、食塩５ｇ、粉末肝油０．５ｇに前記式（２）で表されるオリゴ糖（糖１）を２％となるように添加し混合することにより産卵鶏用飼料を得た。 Example of production of feed for laying hens added with sugar 1 of the present invention Corn 100 g, barley 120 g, wheat 100 g, cucumber 110 g, rice bran 110 g, bran 200 g, barley bran 100 g, soybean meal 30 g, fish meal 70 g, calcium carbonate 54.5 g, An oligosaccharide (sugar 1) represented by the above formula (2) was added to 5 g of sodium chloride and 0.5 g of powdered liver oil so as to be 2% and mixed to obtain a feed for laying hens.

本発明の糖１の消化性
人工胃液、ラット小腸アセトン粉末、酵母由来α−グルコシダーゼによる本発明の糖１の分解性について下記のように試験した。 The degradability of sugar 1 of the present invention by digestible artificial gastric juice of the present invention , rat small intestine acetone powder, and yeast-derived α-glucosidase was tested as follows.

人工胃液による分解性は、２％本発明の糖１の５０μＬと５０ｍＭＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ２．０）２５μＬを加えて、３７℃で１００分間反応後、１０ｍＭＮａＯＨを３０μＬ添加し中和した。混合後、直ちに中和したものを対照とした。この反応液をＨＰＬＣ分析し、分解物を調べた。 Degradability by artificial gastric juice was neutralized by adding 50 μL of 2% saccharide 1 of the present invention and 25 μL of 50 mM HCl / KCl buffer (pH 2.0) and reacting at 37 ° C. for 100 minutes, and then adding 30 μL of 10 mM NaOH. . The control was immediately neutralized after mixing. This reaction solution was subjected to HPLC analysis to examine decomposition products.

ラット小腸アセトン粉末の調製は、ラット小腸アセトン粉末（ｓｉｇｍａ社製）３００ｍｇに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．７ｍＬを加えてガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、１０，０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心分離し、得られた上澄みを酵素液とした。マルターゼ活性として１ｍＬあたり４ユニットとなるように希釈した酵素液２５μＬ、４％の本発明の糖１を２５μＬ、水５０μＬを加えて、３７℃１０分間反応させ１００℃で５分間加熱し、反応を停止した。 Rat small intestine acetone powder was prepared by adding 2.7 mL of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) to 300 mg of rat small intestine acetone powder (manufactured by Sigma), homogenizing using a glass homogenizer, 10,000 × g for 15 minutes. Centrifugation was performed at 0 ° C., and the resulting supernatant was used as an enzyme solution. 25 μL of enzyme solution diluted to 4 units per mL as maltase activity, add 25 μL of 4% of the sugar 1 of the present invention and 50 μL of water, react at 37 ° C. for 10 minutes, heat at 100 ° C. for 5 minutes, and react Stopped.

酵母由来のα−グルコシダーゼも同様に、１ｍＬあたり４ユニットとなるように調製したα―グルコシダーゼ２５μＬ、水５０μＬを加えて、３７℃１０分間反応させ１００℃で５分間加熱し、反応を停止した。 Similarly, α-glucosidase derived from yeast was added with 25 μL of α-glucosidase prepared to 4 units per mL and 50 μL of water, reacted at 37 ° C. for 10 minutes and heated at 100 ° C. for 5 minutes to stop the reaction.

これらの試験の結果、全ての反応において本発明の糖１は殆ど分解されなかった。したがって、本発明の糖１は、難消化性糖質であることがわかる。 As a result of these tests, sugar 1 of the present invention was hardly degraded in all reactions. Therefore, it can be seen that the sugar 1 of the present invention is an indigestible carbohydrate.

本発明の糖１のう蝕性
宮村（歯学、６０、７１７〜７３１、１９７３）の方法に準じ、水１ｍＬ、又は、各１．２５％の本発明の糖１、グルコース又はパラチノース各１ｍＬに、それぞれハートインフージョンブイヨン１ｍＬと新鮮唾液３ｍＬを添加してなる４種類の溶液について、３７℃におけるｐＨの経時変化を調べた。また、該方法において、新鮮唾液の代わりに、
Streptococcus mutans JCM5705を接種したものについても同様にpHの経時変化を調べた。この結果を新鮮唾液に関しては図２２、Streptococcus mutans JCM5705を接種したものについて図２３に横軸に時間縦軸にｐＨをとったグラフにして示す。 Cariogenicity of the sugar 1 of the present invention According to the method of Miyamura (dentistry, 60, 717-731, 1973), 1 mL of water or 1.25% of the sugar 1, glucose or palatinose of the present invention. The changes over time of pH at 37 ° C. were examined for four types of solutions obtained by adding 1 mL of heart infusion bouillon and 3 mL of fresh saliva to each 1 mL. In the method, instead of fresh saliva,
Similarly, the time-dependent change in pH was examined for those inoculated with Streptococcus mutans JCM5705. The results are shown in FIG. 22 for fresh saliva, and a graph in which Streptococcus mutans JCM5705 is inoculated, with the horizontal axis representing pH and the time vertical axis representing pH.

これらのグラフによれば、グルコースでは培養１０時間前後から酸の産生によるｐＨの低下が認められたのに対して、本発明の糖１ではｐＨの低下が殆どなく、その低下は非う蝕性糖質であるパラチノースとほぼ同等であった。 According to these graphs, in glucose, a pH decrease due to acid production was observed from about 10 hours in culture, whereas in the sugar 1 of the present invention, there was almost no pH decrease, and the decrease was non-cariogenic. It was almost equivalent to palatinose, which is a carbohydrate.

本発明の糖１のヒト由由来腸内細菌の代表株による資化性
ヒト由来腸内細菌の代表株を用い、本発明の糖１の資化性について次のようにして試験を行った。なお、比較のため、グルコース、スクロース、ラクトース、メリビオース、パラチノース、ツラノース、ラフィノース、１−ケストースも同様に試験を行った。供試菌株は、Bifidobacterium 属に属する微生物５株（B.adolescentis、B.bifidum、B.breve、
B.infantis、B.longum）、Lactobacillus属に属する微生物３株（L.acidophilus、
L.casei、L.fermentum)、その他の微生物株４株（Enterobacter cloacae、Echerichia
coli、Enterococcus faecalis、Clostridium perfringens)を用いた。 Utilization of a representative strain of human-derived enteric bacteria of sugar 1 of the present invention by a representative strain of human-derived enteric bacteria Using the representative strain of human-derived enteric bacteria, the utilization of sugar 1 of the present invention was tested as follows. For comparison, glucose, sucrose, lactose, melibiose, palatinose, turanose, raffinose, and 1-kestose were also tested. The test strains consisted of five strains belonging to the genus Bifidobacterium ( B. adolescentis , B. bifidum , B. breve ,
B. infantis , B. longum ), three microorganisms belonging to the genus Lactobacillus ( L. acidophilus ,
L. casei , L. fermentum ) and four other microorganism strains ( Enterobacter cloacae , Echerichia)
coli , Enterococcus faecalis , Clostridium perfringens ).

各菌株の前培養には、炭素源を０．５％グルコースとしたＬＢ培地を用いた。次にＬＢ培地を用いて資化性試験を行った（「腸内菌の世界」、光岡知足著、叢文社発行の方法に準じた。） For the preculture of each strain, an LB medium containing 0.5% glucose as a carbon source was used. Next, an assimilability test was performed using LB medium (according to a method published by “The World of Enteric Bacteria”, by Tomochi Mitsuoka, published by Sobunsha).

ＬＢ培地の組成は、Proteose peptone No.3（１０ｇ）、Trypticase（５ｇ）、Yeast extract（３ｇ）、Tween 80（１ｇ）、Solution B（５ｍＬ）、L-cysteine HCl・H₂O（０．２ｇ）、寒天（１．５ｇ）をBacto-Liver浸出液１Ｌに溶解し、ｐＨ７．２に調製後、滅菌処理した。 The composition of LB medium is: Proteose peptone No. 3 (10 g), Trypticase (5 g), Yeast extract (3 g), Tween 80 (1 g), Solution B (5 mL), L-cysteine HCl · H ₂ O (0.2 g) ), Agar (1.5 g) was dissolved in 1 L of Bacto-Liver leachate, adjusted to pH 7.2, and then sterilized.

前記Solution Bとは、４．０％MgSO₄・7H₂O、０．２％FeSO₄・7H₂O、０．２％NaCl、０．１３５％Mn SO₄となるように精製水に溶解したものである。 The solution B was dissolved in purified water to 4.0% MgSO ₄ .7H ₂ O, 0.2% FeSO ₄ .7H ₂ O, 0.2% NaCl, 0.135% Mn SO ₄ . Is.

前記Bacto-Liver浸出液とは、Bacto-Liver５．５ｇに１０５０ｍＬの精製水を加え、５０〜６０℃の温浴中で時々撹拌しながら１時間浸出した後、濾紙でろ過したものである。 The Bacto-Liver leachate is obtained by adding 1050 mL of purified water to 5.5 g of Bacto-Liver, leaching for 1 hour with occasional stirring in a 50-60 ° C. warm bath, and then filtering with filter paper.

本実施例で用いたＬＢ培地は、滅菌処理後、最終濃度が０．５％になるように前記各糖を加えた。前記各糖は、メンブランフィルターでろ過して滅菌処理を行った。一方、前培養した各菌株は、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）し、得られた沈殿に、０．８％生理食塩水を２ｍＬ加え、よく撹拌して洗菌し、同様の条件で遠心分離した。この作業を２度繰返し、最終段階で、各菌株濃度が同じになるように生理食塩水を加え、ＬＢ培地に接種した。接種したＬＢ培地は、嫌気ジャーを用い、窒素ガス下で嫌気的に３７℃で、７２時間培養した。 Each saccharide was added to the LB medium used in this example so that the final concentration would be 0.5% after sterilization. Each sugar was sterilized by filtration through a membrane filter. On the other hand, each pre-cultured strain is centrifuged (3000 rpm, 15 minutes), 2 mL of 0.8% physiological saline is added to the resulting precipitate, and the mixture is thoroughly stirred to wash the bacteria, and centrifuged under the same conditions. did. This operation was repeated twice, and at the final stage, physiological saline was added so that each strain had the same concentration, and the LB medium was inoculated. The inoculated LB medium was anaerobically cultured at 37 ° C. under nitrogen gas for 72 hours using an anaerobic jar.

発酵試験培地に前記各種菌株を接種し、７２時間の培養後、３０℃のウォーターバス内で加温しながら培地のｐＨを測定した。資化性の有無、または強弱はｐＨの低下で判定した。糖を加えていない培地に菌株を接種したもののｐＨを対照として、判定基準は、ｐＨが４．５未満のものを（＋＋＋）、ｐＨが４．５以上５．０未満のものを（＋＋）、ｐＨが５．０以上５．５未満のものを（＋）、ｐＨが５．５以上６．０未満のものを（±）、ｐＨが６．０以上のものを（−）とした。
資化性の結果を下記の表４に示す。 The various strains were inoculated into the fermentation test medium, and after culturing for 72 hours, the pH of the medium was measured while heating in a 30 ° C. water bath. The presence / absence or strength of assimilation was determined by a decrease in pH. With the pH of a medium inoculated with a strain in a medium not added with sugar as a control, the criterion is (+++) when the pH is less than 4.5, and (++) when the pH is 4.5 or more and less than 5.0 A sample having a pH of 5.0 or more and less than 5.5 was defined as (+), a sample having a pH of 5.5 or more and less than 6.0 was represented by (±), and a sample having a pH of 6.0 or more was represented by (−).
The results of assimilation are shown in Table 4 below.

表４によれば、本発明の糖１はBifidobacterium属に属する数種の菌種によってのみ利用され、他の属に属する菌種では資化されにくい糖質であることがわかる。したがって、本発明の糖１は、ビフィズス菌増殖用の糖質として利用できることがわかる。 According to Table 4, it can be seen that the sugar 1 of the present invention is a saccharide which is used only by several species belonging to the genus Bifidobacterium and is hardly assimilated by other species belonging to the genus. Therefore, it can be seen that the sugar 1 of the present invention can be used as a carbohydrate for the growth of bifidobacteria.

甘味度及び甘味の質
本発明の糖１の５％溶液と、０．５％〜３．０％のショ糖溶液を調製し、５人の被験者による官能試験により甘味度と甘味の質を判定した。その結果、ショ糖の甘味度を１００とした場合、本発明の糖１の甘味度は約２０であった。この甘味度は乳糖及びβ−ガラクトースに近いものであり、概ね、さっぱりとした甘味であった。 Sweetness and quality of sweetness 5% solution of sugar 1 of the present invention and 0.5% to 3.0% sucrose solution were prepared, and the sweetness level and quality of sweetness were determined by sensory test with five subjects. did. As a result, when the sweetness of sucrose was 100, the sweetness of sugar 1 of the present invention was about 20. This sweetness was close to that of lactose and β-galactose, and was generally a refreshing sweetness.

本発明のオリゴ糖は難消化性の甘味料として有用である。さらに、本発明のオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖作用、非う蝕作用を付与する機能性食品として食品素材、或いは医薬品素材、口腔用組成物として有用である。 The oligosaccharide of the present invention is useful as an indigestible sweetener. Furthermore, the oligosaccharide of the present invention is useful as a food material, a pharmaceutical material, or an oral composition as a functional food that imparts bifidobacteria growth and non-cariogenic effects.

糖質としてグルコースとフルクトースの質量比を１：１とし、種々の糖濃度の液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを反応させて得られた本発明のオリゴ糖の相対合成量を求めた結果を示すグラフである。Relative synthesis amount of the oligosaccharide of the present invention obtained by reacting β-fructofuranosidase with liquids of various sugar concentrations with a mass ratio of glucose and fructose of 1: 1 as a saccharide was determined. It is a graph which shows a result. 本発明のオリゴ糖をＨＰＬＣにより分析したＨＰＬＣのチャートを表す。The HPLC chart which analyzed the oligosaccharide of this invention by HPLC is represented. 本発明の糖１をＰｏｓｉｔｉｖｅイオンモードで質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）した結果のチャートを表す。The chart of the result of having carried out the mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) of the sugar 1 of this invention in Positive ion mode is represented. 本発明の糖２及び糖３をＰｏｓｉｔｉｖｅイオンモードで質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）した結果のチャートを表す。The chart of the result of having carried out the mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) of the saccharide | sugar 2 and the saccharide | sugar 3 of this invention by Positive ion mode is represented. 糖１をＨａｋｏｍｏｒｉの方法でメチル化しメタノール分解した試料をＧＣ−ＭＳ分析した結果のチャートを表す。The chart of the result of having carried out GC-MS analysis of the sample which methylated saccharide | sugar 1 by the method of Hakomori and decomposed into methanol is represented. 糖１をＣＯＳＹによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of having carried out the two-dimensional NMR analysis of the sugar 1 by COSY is represented. 糖１のＨＳＱＣによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of 2-dimensional NMR analysis of sugar 1 by HSQC is shown. 糖１をＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of having carried out the two-dimensional NMR analysis of saccharide | sugar 1 by HSQC-TOCSY is represented. 糖１をＨＭＢＣによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of carrying out the two-dimensional NMR analysis of saccharide | sugar 1 by HMBC is represented. 糖１をｃｔ−ＨＭＢＣによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of carrying out the two-dimensional NMR analysis of saccharide | sugar 1 by ct-HMBC is represented. 糖１をＪ−ｒｅｓＨＭＢＣによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of having carried out the two-dimensional NMR analysis of the saccharide | sugar 1 by J-res HMBC is represented. 糖２をＣＯＳＹによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of carrying out the two-dimensional NMR analysis of the saccharide | sugar 2 by COSY is represented. 糖２をＨＣＱＣによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of having carried out the two-dimensional NMR analysis of saccharide | sugar 2 by HCQC is represented. 糖２をＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of having carried out the two-dimensional NMR analysis of saccharide | sugar 2 by HSQC-TOCSY is represented. 糖２をＣＨ2 −ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of carrying out the two-dimensional NMR analysis of the saccharide | sugar 2 by CH2-HSQC-TOCSY is represented. 糖２をｃｔ−ＨＭＢＣによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of carrying out the two-dimensional NMR analysis of the saccharide | sugar 2 by ct-HMBC is represented. 糖３をＣＯＳＹによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of carrying out the two-dimensional NMR analysis of the saccharide | sugar 3 by COSY is represented. 糖３をＨＣＱＣによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of carrying out the two-dimensional NMR analysis of saccharide | sugar 3 by HCQC is represented. 糖３をＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of having carried out the two-dimensional NMR analysis of saccharide | sugar 3 by HSQC-TOCSY is represented. 糖３をＨＭＢＣによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of carrying out the two-dimensional NMR analysis of saccharide | sugar 3 by HMBC is represented. 糖３をｃｔ−ＨＭＢＣによる２次元ＮＭＲ解析した結果のチャートを表す。The chart of the result of having carried out the two-dimensional NMR analysis of saccharide | sugar 3 by ct-HMBC is represented. 糖１について新鮮唾液を用いたう蝕性試験の結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of the caries test which used fresh saliva about sugar 1. 糖１についてStreptococcus mutans JCM5705を用いたう蝕性試験の結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of the caries property test using Streptococcus mutans JCM5705 about sugar 1.

Claims

An oligosaccharide represented by the following general formula (1).

The oligosaccharide according to claim 1 is β-D-fructopyranosyl (2 → 6) -D-glucopyranose represented by the following formula (2).

The oligosaccharide according to claim 1 is represented by the following formula (3): β-D-fructopyranosyl (2 → 6)-ノ -β-D-glucopyranosyl (1 → 3) -D-glucopyranose .

The oligosaccharide according to claim 1 is represented by the following formula (4): β-D-fructopyranosyl (2 → 6) -Ο- [β-D-glucopyranosyl (1 → 3)]-D— Glucopyranose.

By producing β-fructofuranosidase on a substrate solution containing 10% by mass or more and 80% by mass or less of a saccharide, the oligosaccharide according to any one of claims 1 to 4 is produced, A method for producing an oligosaccharide, wherein the oligosaccharide is obtained from the solution.

The method for producing an oligosaccharide according to claim 5, wherein the β-fructofuranosidase is a crude purified β-fructofuranosidase obtained from a microorganism producing β-fructofuranosidase.

The oligosaccharide according to any one of claims 1 to 4, wherein a microorganism containing β-fructofuranosidase is allowed to act on a medium containing 10% by mass or more and 80% by mass or less of a saccharide, and the medium is allowed to act. And producing the oligosaccharide from the medium.

The method for producing an oligosaccharide according to any one of claims 5 to 7, wherein the carbohydrate contains glucose and fructose.

The method for producing an oligosaccharide according to any one of claims 5 to 7, wherein the carbohydrate contains laminaribiose and fructose.

The method for producing an oligosaccharide according to claim 6 or 7, wherein the microorganism is one or more selected from yeast and lactic acid bacteria.

The method for producing an oligosaccharide according to claim 10, wherein the yeast is a microorganism belonging to the genus Saccharomyces or a microorganism belonging to the genus Pichia.

The method for producing an oligosaccharide according to claim 10, wherein the yeast is a microorganism belonging to Saccharomyces cerevisiae.

The method for producing an oligosaccharide according to claim 10, wherein the yeast is Saccharomyces cerevisiae JCM1499.

The method for producing an oligosaccharide according to claim 10, wherein the yeast is a microorganism belonging to Pichia anomala.

The method for producing an oligosaccharide according to claim 10, wherein the yeast is Pichia anomala Ferm P- 20504.

The method for producing an oligosaccharide according to claim 10, wherein the yeast is Pichia anomala JCM3585.

A sucrose is added to the cut plant so that it contains 1/10 to 2 times the amount of sugar, and extraction is performed using the osmotic pressure of sucrose to obtain an extract. A method for producing an oligosaccharide, wherein the oligosaccharide according to any one of claims 1 to 4 is produced in the extract by fermentation and the produced oligosaccharide is collected.

A sucrose is added to the cut plant so that it contains 1/10 to 2 times the amount of sugar, and extraction is performed using the osmotic pressure of sucrose to obtain an extract. A method for producing a food comprising producing the oligosaccharide according to any one of claims 1 to 4 in the extract by fermenting to produce a food containing the oligosaccharide.

Sucrose is added to the cut plant so that it contains 1/10 to 2 times the amount of saccharide, and extraction is performed using the osmotic pressure of sucrose to obtain an extract. A method for producing a food product comprising producing an oligosaccharide according to any one of claims 1 to 4 by causing fructofuranosidase to act to produce a food product containing the oligosaccharide.

A sucrose is added to the cut plant so that it contains 1/10 to 2 times the amount of saccharide, and extracted using the osmotic pressure of sucrose to obtain an extract, Then, a crude purified enzyme obtained from a microorganism that produces β-fructofuranosidase is allowed to act to produce the oligosaccharide according to any one of claims 1 to 4 to produce a food containing the oligosaccharide. A method for producing a food, characterized by producing.

A sucrose is added to the cut plant so that it contains 1/10 to 2 times the amount of saccharide, and extracted using the osmotic pressure of sucrose to obtain an extract, Producing a food containing an oligosaccharide by allowing a microorganism producing β-fructofuranosidase to act and generating the oligosaccharide according to any one of claims 1 to 4 in the extract. A method for producing a food.

A food obtained by the production method selected from any one of claims 18 to 21.

A composition for growing bifidobacteria comprising the oligosaccharide according to claim 1 or 2 as an active ingredient.

A non-cariogenic food composition comprising the oligosaccharide according to claim 1 or 2 as an active ingredient.

A food or drink comprising one or more oligosaccharides selected from the oligosaccharides according to claim 1, 2, 3, and 4.

A feed comprising one or more oligosaccharides selected from the oligosaccharides according to claim 1, 2, 3, and 4.

A non-cariogenic composition for oral cavity comprising the oligosaccharide according to claim 1 or 2 as an active ingredient.